Summary
Her beskriver vi en metode for å oppnå en ren populasjon av humane myoblaster fra voksen muskelvev. Disse cellene brukes til å studere in vitro skjelettmuskeldifferensiering og spesielt å studere proteiner involvert i Ca 2+ -signalering.
Abstract
Satellittceller (SC) er muskelstamceller plassert mellom plasmamembranen i muskelfibre og den omkringliggende basale lamina. De er essensielle for regenerering av muskler. Ved skade, som ofte forekommer i skjelettmuskler, aktiveres SC. De sprer seg som myoblaster og skiller seg for å reparere muskellesjoner. Blant mange hendelser som skjer under muskeldifferensiering, er cytosoliske Ca 2+ signaler av stor betydning. Disse Ca 2+ -signalene oppstår fra Ca 2+ -frigjøring fra interne Ca 2+ -butikker, samt fra Ca 2+ -oppføring fra det ekstracellulære rommet, særlig den store opererte Ca 2+ -inngangen (SOCE). Dette papiret beskriver en metode som brukes til å oppnå en ren populasjon av humane myoblaster fra muskelprøver samlet etter ortopedisk kirurgi. Vevet blir mekanisk og enzymatisk fordøyd, og cellene blir amplifisert og deretter sortert ved hjelp av flytcytometri i henhold til tilstedeværelsen av speciFic membran markører. Når man er oppnådd, blir menneskelige myoblaster utvidet og forpliktet til å differensiere ved å fjerne vekstfaktorer fra kulturmediet. Ekspresjonsnivåene av spesifikke transkripsjonsfaktorer og in vitro immunfluorescens brukes for å vurdere den myogene differensieringsprosessen i kontrollbetingelser og etter siling av proteiner involvert i Ca 2+ -signalering. Endelig beskriver vi bruken av Fura-2 som en ratiometrisk Ca 2+ -probe som gir pålitelige og reproducerbare målinger av SOCE.
Introduction
Menneskeskelettmuskulaturen består av grupper av kontraktile multinukleerte muskelfibre som er resultatet av fusjon av myogene forløperceller. Skelettmuskler har evne til å regenerere etter skade takket være forekomsten av SC, skjelettmuskelstamceller som ligger mellom plasmamembranen av myofibere (sarcolemma) og basallamina. I ubeskadigede muskler er SCs for det meste tilstede i en sovende tilstand. Som respons på mekanisk stress eller skade blir SCs aktivert (myoblaster), proliferere og undergå enten differensiering for å danne nye myofibere eller selvfornyelse for å fylle opp SC-bassenget 1 , 2 . Gjennom årene ble flere teknikker utviklet for å isolere SC og deres avkom, myoblaster, fra skjelettmuskelbiopsier. Med større forståelse av celleoverflate markørene uttrykt på disse cellene og metoden for fluorescensaktivert cellesortering (FACS) 3, 4 , 5 , er det nå mulig å isolere rene populasjoner av humane myoblaster fra muskelprøver.
Kalsiumsignaler regulerer skjelettmuskelutvikling, homeostase og regenerering. Spesielt er Ca 2+ -inngangen som aktiveres etter intracellulær butikkutslipp, kalt SOCE, av stor betydning 6 for disse prosessene. Ved cellestimulering reduseres Ca 2+ -nivået i endo / sarcoplasmisk retikulum (ER / SR), som igjen aktiverer plasmamembran Ca 2+ -kanaler som tillater Ca 2+ -oppføring å fylle ER / SR 7 igjen . De to hovedproteinene som er involvert i SOCE er ER / SR Ca 2+ -sensingstromal-interaksjonsmolekylet 1 (STIM1) -proteinet og plasmamembranen Ca 2+ -kanalen Orai1. Skjelettmuskulatur uttrykker i stor grad disse to proteinene, så vel som andre proteiner av samme familie (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 og flere Ca 2+ -permeable kanaler i den transiente reseptorpotensialkanoniske familien (TRPC) 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2+ oppføring gjennom SOCE-banen er av stor betydning for muskeldannelse / regenerering 14 . Mutasjoner av STIM1- eller Orai1-proteiner har skadelige virkninger på muskelfunksjon, som hovedsakelig fører til muskelhypotoni 15 . Dyremodeller med SOCE-svekkelse viser også redusert muskelmasse og kraft, sammen med forbedret tretthet 6 , 16 , 17 . Som nevnt uttrykkes andre STIM- og Orai-proteiner, så vel som mange TRPC-kanaler, i skjelettmuskulaturen, og deres respektive roller har ikke blitt bestemt til nå. Ved å banke på dEier deres uttrykksnivå, er det således mulig å undersøke deres implikasjoner i SOCE og deres roller under human skjelettmuskulær differensiering.
SOCE måling kan utføres ved hjelp av to forskjellige tilnærminger: elektrofysiologiske nåværende opptak og Ca 2+ målinger. Elektrofysiologi er absolutt en mer direkte metode, da den måler gjeldende interesse og tilhørende elektrofysiologisk signatur. Denne teknikken er imidlertid svært vanskelig å bruke på muskelceller, hovedsakelig på grunn av muskelcellens store størrelse og den lille størrelsen på den endogene SOCE-strømmen. Cytosolisk Ca 2+ avbildning er teknisk svært tilgjengelig, men målet er mer indirekte, da Ca 2+ -nivået målt i cytosolen reflekterer både opptaket av Ca 2+ og repumping ut av cellen eller i de interne butikkene.
En metode som inkluderer isolering av myoblaster fra små biter av menneskeskallEtalmuskel etter enzymatisk fordøyelse, amplifikasjon og FACS er forklart i dette papiret. Prosessen med muskeldifferensiering og immunfluorescensprotokollen for å følge uttrykket av differensieringsmarkører over tid er beskrevet 18 . Til slutt forklares målingen av SOCE og rollen av forskjellige ionkanaler i Ca 2+ signalering og skjelettmuskeldifferensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humane muskelprøver (vev oppnådd fra semitendinøse muskler) ble samlet under ortopedisk kirurgi hos friske pasienter som kirurgisk avfall. Alle metoder knyttet til den menneskelige studien ble utført i samsvar med retningslinjene og forskriftene fra de sveitsiske regulerende helseforetakene og godkjent av Kommisjonen Cantonale d'Etique de la Recherche fra Genèves kantonale myndigheter, Sveits (protokoll CER nr. 12-259) . Informert og skriftlig samtykke ble oppnådd fra alle voksne personer involvert i studien.
1. Isolering av Myoblasts fra Human Skeletal Muscle
- Under alle prosedyrer opprettholde sterile forhold ved å arbeide under en vevskulturkapsel i nivå II og ved bruk av sterilt medium og sterile buffere.
Merk: Denne prosedyren kan brukes på mange humane skjelettmuskler.
2. Dissociation Protocol
- Overfør muskelprøver (2 - 3 g) til en steril 6 cmtallerken.
- Vask muskelprøver med 5-10 ml fosfatbuffert saltvann (PBS). Gjenta vasken.
- Fjern bindevev og fettvev ved hjelp av buet saks og en klemme.
- Veie muskelprøven (se trinn 2.13) og overfør den til en ny, steril 6 cm plate.
- Tilsett 5 ml 0,05% trypsin-EDTA.
- Bruk saks, kutt og hakk muskelvevet til små biter (mindre enn 2 mm).
- Bruk en 10 ml serologisk pipette, overfør hakkemuskelen til en 200 ml dissosjonsflaske som inneholder en magnetisk bar. Gjenta dette trinnet til 90 ml 0,05% trypsin-EDTA er overført med all hakkemuskulatur til dissosjonsboksen. Lukk dissosjonsflasken og inkuber ved 37 ° C i 60 minutter under mild omrøring.
- Fjern dissosjonsflasken fra oppvarmingsbadet og stopp den enzymatiske reaksjonen ved å tilsette 10 ml føtalt kalveserum (FCS; 10% sluttvolum) til dissosjonsflasken. Homogeniser blandingen med en pipette.
- prepEr to 50 ml rør med en 70 μm celle sil på hver. Pass halvparten av cellesuspensjonen gjennom cellesilen på hvert rør ved pipettering opp og ned på filteret til suspensjonen passerer gjennom.
- Sentrifuger rørene ved 200 xg og 20 ° C i 5 minutter; Aspirere og kaste bort supernatanten.
- Resuspender cellene med 10 ml vekstmedium (GM; Tabell 1 ) og før cellene gjennom en 40 μm cellefilter plassert på ett 50 ml rør. Sentrifuger røret ved 200 xg og 20 ° C i 5 minutter; Aspirere og kaste bort supernatanten.
- Resuspender cellene med 10 ml GM og centrifuger røret ved 200 xg og 20 ° C i 5 minutter; Aspirere og kaste bort supernatanten.
- Resuspender cellene med 1 ml GM og teller cellene ved å bruke et Neubauer-kammer.
Merk: Vanligvis bør et utbytte på 3 x 10 5 celler per g muskel høstes. Utbyttet beregnes ved å dividere antall celler av vekten av muskelbiopSy (trinn 2.4). - Sett 2 x 10 5 celler i en steril 6-cm skål inneholdende 4 ml GM og inkuber ved 37 ° C og 7% CO2. Forbered så mange plater som nødvendig.
- Endre GM etter 3 dager.
Merk: Friskt dissocierte celler trenger tid til å feste til kulturplaten. Videre er den første myogencelledoblingstiden rundt 50 - 60 timer. Etter første divisjon er fordoblingstiden rundt 20 timer. - Etter 5-7 dager når celler når 70-80% sammenløp (ca. 1,5 x 10 6 celler / per 6 cm plate), begynner antistofffarging og cellesortering (trinn 3).
3. Antistofffarging og cellesortering
- Etter vasking en gang med PBS, inkuberes de adherente celler (i 6 cm-plate) med 1 ml av 0,05% trypsin-EDTA ved 37 ° C og 7% CO2 i 3 minutter (eller inkuberes ved 5% CO2). Stopp reaksjonen ved å legge 2 ml GM og samle cellene i 15 ml rør. Etter sentrifugering (200 xg i 5 min), resBruk celler i 1 ml GM.
- Telle cellene ved hjelp av et Neubauer-kammer.
- Utfør følgende prosedyrer på is.
Merk: Prosedyren for å sette riktig fluorescenskompensasjon på cytometeret er viktig og bør være lik på et hvilket som helst cytometer. Rør 1 og 2 brukes som negative kontroller. Rør 3 - 7 brukes til å sette kompensasjonen på cytometeret under det første eksperimentet ( tabell 2 ). Den endelige konsentrasjonen som brukes for hvert antistoff og tilhørende isotype, bør være det samme (rundt 1 μg / 10 6 celler). - Send 1 x 10 5 celler per rør (5 ml rør) for rør 1 - 7 ( tabell 2 ). Plasser den gjenværende cellesuspensjonen i røret 8 for celle sortering.
- Vask cellene med 1 ml kald FACS buffer (PBS-5% FCS). Lukk og sentrifuger rørene ved 200 xg og 4 ° C i 5 minutter; Aspirere og kaste bort supernatanten.
- Tilsett 200 μL FACS buffer per rør. Legg til antistoffer mot thE-rør ifølge tabell 2 . Inkubér på is i 30 minutter.
- Vask cellene: Legg 1 ml av FACS-bufferen til hvert rør. Lukk og sentrifuger rørene ved 200 xg og 4 ° C i 5 minutter. Aspirer og kast supernatanten. Gjenta dette trinnet en gang til.
- Resuspender cellene i 500 μl FACS buffer. Lukk rørene og hold dem på is til cellesortering. Forbered 4 rør av 1,5 ml, hver inneholdende 500 μL GM, som er nødvendig for å samle cellene under cellesortering. Hold dem på is.
- Sorter humane myoblaster ved hjelp av flytcytometri ( Figur 1 ). Etter å ha ekskludert CD45-positive hematopoietiske celler, separate CD45-negative celler basert på CD56-ekspresjon. Deretter er gate den CD56-positive populasjonen for CD34, CD144 og CD146 (humane myoblaster definert som CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-celler). Reanalysere en liten brøkdel av den sorterte cellepopulasjonen for å sjekke renheten.
- Bassengene rørene inneholder humant myoblaM i ett 15 ml rør og vask en gang ved å legge til 5 ml GM. Sentrifuger røret ved 200 xg og 20 ° C i 5 minutter; Aspirere og kaste bort supernatanten.
- Resuspender cellene i 1 ml GM og plater cellene på en ubelagt 6 cm plate som inneholder 4 ml GM (2 x 10 5 celler per plate). Inkuber ved 37 ° C og 7% CO2.
4. Cellevedlikehold
- Bytt halvparten av kulturmediet hver 2. dag. Fjern 2 ml gammelt GM fra kulturretten og tilsett 2 ml GM.
Merk: Myoblast produserer vekstfaktorer som er gunstige for kulturforholdene. - Trypsiniser cellene når de når 70 - 80% sammenløp for å unngå pre-differensiering. Etter vasking en gang med PBS, inkuberes de adherente celler (i 6 cm-plate) med 1 ml av 0,05% trypsin-EDTA ved 37 ° C og 7% CO2 i 3 min. Stopp reaksjonen ved å legge 2 ml GM og samle cellene i et 15 ml rør. Etter sentrifugering (200 xg i 5 min), resusPend cellene i 1 ml GM.
- Telle cellene og lag 6 cm plater med 2 x 10 5 celler per plate i 4 ml GM.
- Hold humane myoblasts opptil 6 passasjer eller frys dem i GM som inneholder 10% DMSO, 1 x 10 6 celler per ml. Frys cellene i en progressiv fryseboks (1 ° C / min); For langtidsoppbevaring, plasser cellene i flytende nitrogen.
5. Transfeksjon av humane myoblaster med siRNA
Merk: Myoblaster transfekteres ved bruk av kommersielt transfeksjonsreagens to dager før induksjon av differensiering. Effekten av spesifikk siRNA mot et gen blir alltid sammenlignet med effekten av en kontroll siRNA. SiRNA er dobbeltstrengede RNA som må holdes på is og manipuleres med hansker.
- Oppnå en 70 - 80% sammenflytende monolag av humane myoblaster i et 6-cm-plate (ca. 1,5 x 10 6 celler).
Merk: 5 x 10 5 celler per transfeksjon er nødvendig for å oppnå en konFlytende monolag av transfekterte myoblaster etter 2 dager i GM. - Klargjør glassdekselplater (beskrevet for kalsiumbilder i trinn 7).
- Varm GM, 0,05% trypsin-EDTA og PBS til 37 ° C.
- Utfør alle de følgende trinnene i en vevskulturhett på nivå II for å opprettholde sterilitet.
- I et 1,5 ml rør sendes 500 μl redusert serummedium, 3 μl transfeksjonsreagens og 1 μl siRNA ved 20 μM. Bland forsiktig og hold ved romtemperatur (RT) i 15 - 20 min.
- Under denne inkubasjonstiden skal du forberede myoblaster for transfeksjon. Etter vasking en gang med PBS, inkuberes de adherente celler (i 6 cm-plate) med 1 ml av 0,05% trypsin-EDTA ved 37 ° C og 7% CO2 i 3 min. Stopp reaksjonen ved å legge 2 ml GM og samle cellene i et 15 ml rør. Etter sentrifugering (200 xg i 5 minutter) resuspenderes cellene i 1 ml GM.
- Telle cellene ved hjelp av et Neubauer-kammer.
- Resuspender 5 x 10 5 cellerI 200 μl GM for hver transfeksjon ( dvs. for 2 transfeksjoner resuspenderes i 400 μl).
- Tilsett 200 μl av cellesuspensjonen til hver 500 μl siRNA-transfektantblanding. Pipetter opp og ned to ganger og inkuber i 5 minutter ved RT.
- Tilsett 700 μL (celler + siRNA-transfektant) til en 3,5 cm kulturskål som inneholder et glassdeksel. Legg til GM for å få et sluttvolum på 2 ml.
- Etter 24 timer ved 37 ° C og 7% CO2, helt erstatte mediet med 2 ml friskt GM. Etter ytterligere 24 timer er et konfluent monolag av transfekterte celler vanligvis tilstede; Hvis det er tilfelle, indusere myoblastdifferensiering ved å erstatte GM med 2 ml differensieringsmedium (DM; Tabell 1 ).
- Utfør kalsiumbildingseksperimenter 24 - 48 timer etter induksjon av differensiering eller på prolifererende myoblaster.
Merk: Immunofluorescens utføres vanligvis 48 timer etter induksjon av differensiering.
6. ImmUnofluorescence Staining of Differentiation Markers
Merk: Immunofluorescensfarging utføres etter 48 timer i DM, men det kan også utføres ved andre differensieringstider. Myogenin og MEF2 er bare kjerneproteiner uttrykt i differensierte celler (før fusjon i myotubes), og deres farging tillater vurdering av differensieringsprosessen. Myosin tungkjede (MyHC) uttrykkes kun i myotubes og brukes til å estimere myotube størrelse og fusjonsindeks (antall kjerner i myotubes / totalt antall kjerner).
- Etter 48 timer i DM vask det konfluente monolaget av differensierte celler to ganger med 1 ml PBS ved RT. Gjør dette nøye for å unngå å løsne myotubene.
- Fest cellene med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i 15 min ved RT. Vask cellene med PBS to ganger, i 5 minutter hver.
- Permeabiliser cellene med 1 ml PBS som inneholder 0,25% Triton X-100 i 45 minutter og vask 3 ganger med 1 ml PBS.
- Blokker unsSpesifikke bindingssteder ved inkubering av cellene i PBS tilsatt 0,2% Tween-10 og 2% geit serum (blokkoppløsning) i 30 minutter ved RT.
- Forbered primære antistoffer fortynnet i blokkoppløsning (600 μL per 3,5 cm plate).
Merk: Følgende primære antistoffer brukes: mus anti-myogenin (1: 600), kanin anti-MEF2 (1: 300) og anti-MyHC antistoff mot mus (MF20, 1: 1000). Det er mulig å blande i samme blokkerende løsning, mus anti-myosin tungkjede eller mus anti-myogenin, med kanin anti-MEF2. - Fjern blokkoppløsningen og tilsett 600 μL primære antistoffløsninger per 3,5 cm plate og inkuber natten over ved 4 ° C i et fuktet kammer.
- Vask cellene 3 ganger med 1 ml PBS. Inkubér i 1 time ved RT i et mørkt kammer med 600 ul av sekundære antistoffer fremstilt i blokkoppløsningen, som følger: geit-anti-mus Alexa 488 (1: 1000), geit-anti-kanin Alexa 546 (1: 1000) Og DAPI (1:50, stamløsning ved 15 uM).
CAUTION: DAPI er en giftig forbindelse som skal håndtere med hansker. - Aspirer og vaske cellene 3 ganger med 1 ml PBS.
- Monter glassdekselplater ved hjelp av polyvinylalkoholmonteringsmedium med antifatelløsning. Hold dem ved 4 ° C og beskyttet mot lys til bildebehandling av cellene.
7. Kalsiumimaging
- Forkultur, lag glassdæksler 25 mm i diameter. Legg dekselplatene i 70% etanol i 48 timer for å fjerne fett og smuss fra overflaten, noe som reduserer celleadhesjonen til dekslet.
- Etter å ha skyllet dekselvisene med vann, sett dem tilbake i vann og steriliser dem (autoklaveres).
- Sett en deksel på 3,5 cm kulturplate og la dem tørke. Oppbevar petriskålene for videre forsøk eller bruk dem umiddelbart.
- Legg de transfekterte myoblaster (5 - 6 x 10 5 celler) til glassdekselet.
Merk: Eksperimenter gjøres 24 - 48 timer etter induksjon av differensiaterPå, eller på proliferative myoblaster. - For å utføre Ca 2+ avbildning, vask cellene 2 ganger med PBS eller direkte med mediet som brukes til forsøkene (kalsiumholdig medium, tabell 3 ). Last opp cellene med 2 μM Fura-2 / AM pluss 1 μM pluronsyre i ca. 30 minutter i mørket ved RT.
Merk: Pluronsyre bidrar til å solubilisere Fura-2. Fura-2 / AM og pluronsyre oppløses i det kalsiumholdige medium. - Vask cellene to ganger i samme medium, men uten Fura-2 / AM og pluronsyre og la dem stå i mørket i ytterligere 10-15 minutter for å tillate deforestering av Fura-2 / AM.
- Hvis belastningseffektiviteten til Fura-2 er for lav, legg til mer Fura-2 ( f.eks. 4 μM) og / eller inkubere cellene i lengre tid ( f.eks. 40 min).
- Fjern dekselet fra kulturplaten og installer den i eksperimentkammeret. Tilsett ~ 1 ml kalsiumholdig medium (avhengig av volumet av eksperimentetMentale kammer). Installer den på mikroskopfasen og start opptaket.
Merk: Den fluorescerende Ca2 + -følsomme sonden Fura-2 blir opphisset vekselvis ved 340 nm og 380 nm, og utslippslyset oppsamles ved 510 nm. Da fluktuasjonene i Ca 2+ konsentrasjonen er relativt sakte, oppkjøp 1 forhold hver 2. s. - For å aktivere SOCE brukes følgende klassiske thapsigargin / Ca 2+ re-addisjon protokoll: la cellene stå i 2-3 minutter i kalsiumholdig medium. Bytt mediet med kalsiumfritt medium i 1-2 minutter.
- Tilsett 1 μM thapsigargin for å tømme de interne kalsiumbutikkene.
Merk: Thapsigargin er en irreversibel blokkering av sarco-endoplasmatisk retikulum Ca 2+ ATPase (SERCA) pumpeaktivitet. Etter 8 - 10 min, erstattes mediet raskt med kalsiumholdig medium. Ca 2+ kommer inn i cellene gjennom SOCE-kanalene. Vent ca 5 min før du avslutter forsøkene.
FORSIKTIG: Thapsigargin er en giftig forbindelse som skal håndteres med hansker.
- Tilsett 1 μM thapsigargin for å tømme de interne kalsiumbutikkene.
8. Ca 2+ måleanalyse
Merk: Utfør analysen med oppkjøpsprogramvaren.
- Åpne eksperimentet. Tegn region 1 i et område der det ikke er celler (bakgrunnsregion), og tegne de andre områdene i cytoplasmaet til cellene som skal analyseres (områdene kan tegnes på et hvilket som helst bilde: 340 nm, 380 nm, Eller forholdet bildet). Gå til "Kjør eksperimenter"> "referansebilder." Under 340- og 380-kanalene, velg "region 1" og klikk deretter på "Subtract background."
- Kjør hele eksperimentet (F4: fremover) for å sikre at ingenting forstyrrer bakgrunnsregionen, for eksempel et fluorescerende støvfelt som beveger seg gjennom bakgrunnsregionen, og at cellene ikke beveger seg i løpet av forsøkene.
Merk: De interesserte regionene som er valgtBør ikke inkludere mørke områder; Ellers vil forholdsverdien virke støyende, som en del av bakgrunnen vil bli inkludert i målingen. - Klikk på "Logg data" og spill hele eksperimentet på nytt.
Merk: Dette åpner et regneark der tiden og forholdet logges. Det er også mulig å lagre de individuelle bølgelengder på 340 nm og 380 nm. - For å få informasjon om SOCE, trekk ut de to viktige parametrene fra eksperimentet: amplituden til Ca 2+ -tilsetningen og hellingen til Ca 2+ -inngangsfasen ( figur 3 ).
- Hent amplitude ved å subtrahere forholdsverdien like før Ca 2+ re-addisjon fra den maksimale amplituden av Ca 2+ høyningen. Hent maksimal helling ved å tilpasse en lineær regresjon av de første sekundene etter Ca 2+ -tilsetning.
Merk: Arealet under kurven til tapsigargin-responsen er også en informativ parameter for ekstraksjonT, da det reflekterer mengden ledig kalsium lagret i SR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter den enzymatiske dissosiasjonen av en human muskelprøve ble celler amplifisert i GM. Humane myoblaster, definert som CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-celler, ble oppnådd etter FACS. Myoblast representerte mer enn 60% av den analyserte befolkningen ( Figur 1 ). Primære humane myoblaster ble replisert, dyrket til sammenløp og dyrket i DM i 48 timer. Etter immunostaining for ekspresjonen av transkripsjonsfaktoren MEF2 og den muskelspesifikke protein myosin tungkjeden (MyHC), observert vi at et flertall av celler dannet myotubes in vitro (MyHC-positive celler), med fusjonsindeksverdier på 60,9 ± 1,3% (N = 5; figur 2 ). Vi observerte også at rundt 40% av humane myoblaster, kalt reserveceller, unnslippe denne terminale differensiering og forblir utifferentierte mononukleerte celler. For funksjonelle studier, analyserte vi Ca 2+ responsen av myoblaster eller myotubes 48 timer etter initiering avdifferensiering. Figur 3 viser en representativ protokoll som brukes til å indusere SOCE og nøkkelparametrene for å trekke ut fra et slikt opptak. For å skille informasjon relatert til molekylene involvert i SOCE, ble transfektert med siRNA mot molekylet av interesse. Figur 4 viser virkningen av å silere Ca 2+ -permeable kanaler av TRPC-familien på SOCE i myoblaster.
Figur 1 : FACS av humane myoblaster. Dissocierte humane celler ble immunfargede med antistoffer for de følgende celleoverflate markører: CD45, CD56, CD34, CD144 og CD146. Etter å ha ekskludert CD45-positive hematopoietiske celler, ble CD45-negative celler separert basert på CD56-ekspresjon. Den CD56-positive populasjonen ble deretter gated for CD34, CD144 og CD146. Humane myoblaster ble definert som CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-celler, som tidligere beskrevet 19 , 4 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Human Myoblast Differensiering. ( A ) Et konfluent monolag av humane myoblaster ble utsatt for DM i 48 timer; fast; Og farget med antistoffer mot MEF2 (rød), MyHC (grønn) og DAPI (blå) for å identifisere kjerner. Skalbjelke = 50 μm. ( B ) Fusjonsindeksen representerer antall kjerner innlemmet i myotubes dividert med totalt antall kjerner på et bestemt felt. Data er gjennomsnittlig ± SEM av 5 uavhengige eksperimenter.Ank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 : Representativ kalsiummåling av Thapsigargin-indusert SOCE. Myotubes ble lastet med Fura-2 og den cytosolske Ca 2+ konsentrasjonen ble målt. ( A ) Cellene sitter i noen minutter i et kalsiumholdig medium, etterfulgt av 2 minutter i et kalsiumfritt medium. 1 μM thapsigargin blir deretter brukt i 8 minutter, etterfulgt av kalsium-re-tilsetningen. De tre viktige parametrene for å trekke ut fra slik innspilling er: området under kurven til tapsigargin-responsen, SOCE-hellingen og amplituden til SOCE. ( B ) Kvantifisering av de 3 parametrene. Arealet under kurven gir informasjon om mengden Ca 2+ lagret i ER / SR, og de to andre parametrene tillater kvantifiseringenSosjonens rolle. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 : Engasjement av TRPC1 og TRPC4 i SOCE. ( A ) Cytosolic Ca 2+ konsentrasjon ble vurdert ved bruk av Fura-2 i prolifererende myoblaster transfektert med siTRPC1 eller siTRPC1 og siTRPC4. SOCE ble utløst av internt depletion med 1 μM tapsigargin i fravær av ekstern Ca 2+ (Ca 2+ fri) og målt under re-tilsetningen av 2 mM ekstern Ca 2+ . Hvert spor representerer gjennomsnittet av en representativ coverlip. ( B ) Kvantifisering av virkningen av siRNA på SOCE amplitude. Denne figuren er endret fra referanse 12 , med tillatelse. Barer ar E betyr ± SEM, * p <0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Vekstmedium (GM): | Konsentrasjon | Differensieringsmedium (DM): | Konsentrasjon | |||||
| Ham er F10 | DMEM | |||||||
| FCS | 15% | Bovint serumalbumin | 0,5 mg / ml | |||||
| Bovint serumalbumin | 0,5 mg / ml | Epidermal vekstfaktor | "> 10 ng / ml||||||
| fetuin | 0,5 mg / ml | insulin | 0,01 mg / ml | |||||
| Epidermal vekstfaktor | 10 ng / ml | kreatin | 1 mM | |||||
| deksametason | 0,39 μg / ml | pyruvat | 100 μg / ml | |||||
| insulin | 0,04 mg / ml | uridin | 50 μg / ml | |||||
| kreatin | 1 mM | gentamicin | 10 μg / ml | |||||
| pyruvat | 100 μg / ml | <Td colspan = "2"> | ||||||
| uridin | 50 μg / ml | |||||||
| gentamicin | 5 μg / ml | |||||||
Tabell 1: Middelsammensetning for Myoblast-kultur.
| rør | antistoffer | |||||
| 1 | Ingen | |||||
| 2 | Isotype AlexaFluor 488-, Isotype PE-CF594, Isotype PE, Isotype PECy7Isotype APC | |||||
| 3 | Mus anti-human CD56-AlexaFluor 488 | |||||
| 4 | Mus anti-human CD45 PE-CF594 | |||||
| 5 | Mus anti-human CD144-PE | |||||
| 6 | Mus anti-human CD146-PECy7 | |||||
| 7 | Mus anti-human CD34-APC | |||||
| 8 | Mus anti-human CD56-AlexaFluor 488-, Mus anti-human CD45 PE-CF594, Mus anti-human CD144-PE, Mus anti-human CD34-APC, Mus anti-human CD146-PECy7 | |||||
Tabell 2: Antistoffer anvendt for cellesortering.
| Kalsiumholdig medium | konsentrasjon | Kalsiumfritt medium | konsentrasjon | |||||
| NaCl | NaCl | 135 mM | ||||||
| KCl | 5 mM | KCl | 5 mM | |||||
| MgCl2 | 1 mM | MgCl2 | 1 mM | |||||
| CaCl2 | 2 mM | EGTA | 1 mM | |||||
| Hepes | 10 mM | Hepes | 10 mM | |||||
| glukose | 10 mM | glukose | 10 mM | |||||
| PH 7,45 justert med NaOH | PH 7,45 justert med NaOH | |||||||
Tabell 3: Middelsammensetning for kalsiumbildingseksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isoleringen og kulturen av humane myoblaster fra voksen skjelettmuskel tilbyr en in vitro- modell for å studere muskeldifferensiering og muskelregenerering. I dette papiret gir vi en protokoll som muliggjør rensing av høye utbytter av humane myoblaster på en enkel og kostnadsbegrenset måte. I tillegg gir denne teknikken pålitelige og reproducerbare resultater i prosent av myoblaster isolert og deres myogene differensieringseffektivitet. Faktisk oppnådde vi rundt 60% av humane myoblaster etter cellesortering. Disse cellene kan opprettholdes i kultur for opptil 6 passasjer (rundt 30 doblinger) og beholder deres evne til å skille seg fra. Videre skjer myogen differensiering raskt etter endring av mediet fra GM til DM, etter at 2 til 3 dager i DM er myoblastfusjon maksimal. I denne modellen smelter rundt 60% av myoblastene i myotubes etter 2 dager i DM. En annen fordel er at disse primære menneskelige celleL kulturer er lett transfektert med siRNA. GM og DM media som brukes i vårt laboratorium er hjemmelaget. Alternativt kan kommersielle medier brukes, men vi har aldri prøvd deres effektivitet i menneskelige primære kulturer.
En ulempe ved fremgangsmåten nevnt er bruken av trypsin under vevs-enzymatisk fordøyelse. Denne prosedyren fjerner en stor del av celleoverflate markørene og innebærer at vi forlater cellene i kultur i noen dager før FACS utføres. Kollagenase kan brukes i stedet for trypsin for bedre å bevare membranproteinene og tillate sortering av humane myoblaster umiddelbart etter vevsdissociasjon. Kostnaden for kollagenase er imidlertid betydelig høyere enn trypsin, og et amplifiseringstrinn vil fremdeles være nødvendig etter celle sortering for å oppnå tilstrekkelig celle nummer for de etterfølgende eksperimenter. En annen begrensning av teknikken er "kvalitet" av muskelprøver oppnådd fra ortopediIc operasjon. Faktisk kan de oppnådde biter av vev bli mer eller mindre skadet på grunn av kirurgi, og tiden mellom operasjonen og celledissociasjonen i laboratoriet kan variere fra dag til dag. For myoblastisolasjon, rensing og differensiering i myotuber oppnår vi imidlertid rutinemessig tilfredsstillende resultater. Endelig kan pasientens alder være et problem, da mengden og regenerativ kapasitet av satellittceller avtar med 20 år . Dermed begrenser vi våre eksperimenter til unge pasienter (under 40 år).
Som nevnt, myoblasts skiller seg raskt og effektivt, noe som er en stor fordel ved å studere de første hendelsene i skjelettmuskeldifferensiering. Imidlertid, ettersom myotubene dannes raskt, har de også en tendens til spontant å trekke sammen og løsne seg fra kulturplattene. Dette utelukker analysen av de senere fusjonshendelsene. For å studere disse senere hendelsene, ville man trengeÅ belegge kulturplaten med ekstracellulær matriks for å forbedre celleadhærenheten og å redusere myotube-løsningen 21 .
Kalsiumbilding ved hjelp av fluorescerende sonde Fura-2 er en mye brukt, reproduserbar teknikk som er lett å utføre. Lastingen av Fura-2 er effektiv, og bruken av en ratiometrisk sonde som Fura-2 har flere fordeler over et enkeltbølgelengdefarve. Det normaliserer endringer i fokus eller forskjeller i lastingen mellom celler og i en celle ( f.eks. Kjerne versus cytosol). Protokollen vi beskrev for å fremkalle og måle SOCE, brukes jevnlig i mange forskjellige cellesystemer. Stymningen av forskjellige kanaler eller kalsiumregulatorer tillater forklaring av den molekylære sammensetningen av SOCE og den relative betydningen av de forskjellige aktørene, både i myoblastene og i myotubene. En alternativ tilnærming ved bruk av Fura-2 og Ca 2+ avbildning er anvendelsen avMn 2 + quench-teknikk. Mn 2+ går inn i cellene gjennom Ca 2+ -permeable kanaler og slukker fura-2 fluorescensen. Målet på slukkhastigheten gir et mer direkte mål på SOCE 22 , 23 . Dette krever imidlertid bruk av noe annet utstyr. Ca 2+ signalering kan også utføres ved hjelp av genetisk kodede Ca 2+ indikatorer, som har den store fordelen av å være nøyaktig lokalisert i forskjellige cellefelt. Ulempene er kravet til celletransfeksjon og dynamikken til signalet, som vanligvis er mindre enn med kjemiske fargestoffer 24 . For å måle Ca 2+ i organeller som mitokondrier eller SR, er de genetiske sonderene gullstandarden. For cytosoliske Ca 2+ -målinger forblir imidlertid fordelen ved bruk av Fura-2 over genetiske prober.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Swiss National Science Foundation (bevilgningsnummer 310030-166313), "Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", "Stiftelsen Marcel Levaillant" og "Fondation pour la recherche ostéo-articulaire."
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 mL tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 mL tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 mL tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. |
References
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
- Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
- Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
- Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
- Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
- Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
- Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
- Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
- Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
- Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
- Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
- Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
- Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
- Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
- Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
- Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).
