Summary
Här beskriver vi en metod för att erhålla en ren population av humana myoblaster från vuxen muskelvävnad. Dessa celler används för att studera in vitro- skelettmuskeldifferentiering och i synnerhet att studera proteiner som är involverade i Ca 2 + -signaleringen.
Abstract
Satellitceller (SC) är muskelstamceller placerade mellan plasmamembranet i muskelfibrer och den omgivande basala lamina. De är viktiga för muskelregenerering. Vid skada, som uppträder ofta i skelettmuskler, aktiveras SC. De spridas som myoblaster och differentierar för att reparera muskelskador. Bland många händelser som sker under muskeldifferentiering är cytosoliska Ca 2+ signaler av stor betydelse. Dessa Ca2 + -signaler härrör från Ca2 + -frisättning från interna Ca2 + -butiker, såväl som från Ca2 + -inträde från det extracellulära utrymmet, i synnerhet den affärsdrivna Ca 2 + -inmatningen (SOCE). I detta dokument beskrivs en metod som används för att erhålla en ren population av humana myoblaster från muskelprover som samlats in efter ortopedisk kirurgi. Vävnaden smälts mekaniskt och enzymatiskt, och cellerna amplifieras och sorteras därefter genom flödescytometri beroende på närvaron av speciFic membranmarkörer. När de erhållits, expanderas humana myoblaster och engagerar sig för att differentiera genom att avlägsna tillväxtfaktorer från odlingsmediet. Expressionsnivåerna för specifika transkriptionsfaktorer och in vitro immunofluorescens används för att bedöma den myogena differentieringsprocessen i kontrollbetingelser och efter silkning av proteiner involverade i Ca 2 + -signalering. Slutligen beskriver vi användningen av Fura-2 som en ratiometrisk Ca 2+ -prov som ger pålitliga och reproducerbara mätningar av SOCE.
Introduction
Mänskliga skelettmuskler består av grupper av kontraktil multinukleerade muskelfibrer som härrör från fusionen av myogena prekursorceller. Skelettmusklerna har kapacitet att regenerera efter skada tack vare förekomst av SC, skelettmuskelstamcellerna som ligger mellan plasmamembranet av myofibrer (sarcolemma) och basallamina. I oskadad muskel är SCs mestadels närvarande i ett vilande tillstånd. Som svar på mekanisk stress eller skada aktiveras SCs (myoblaster), prolifereras och genomgår antingen differentiering för att bilda nya myofibrer eller självförnyelse för att fylla i SC-poolen 1 , 2 . Under åren har flera tekniker utvecklats för att isolera SC och deras avkomma, myoblasterna, från skelettmuskelbiopsier. Med den större förståelsen av cellytmarkörerna uttryckta på dessa celler och metoden för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) 3, 4 , 5 , är det nu möjligt att isolera rena populationer av humana myoblaster från muskelprover.
Kalciumsignaleringen reglerar utveckling av skelettmuskler, homeostas och regenerering. I synnerhet är Ca 2 + -posten som aktiveras efter intracellulär lagring, kallad SOCE, av stor betydelse 6 för dessa processer. Vid cellstimulering minskar Ca2 + -nivån i endo / sarkoplasmisk retikulum (ER / SR), som i sin tur aktiverar plasmametall Ca 2+ -kanaler som medger Ca 2+ -tillträde för att fylla på ER / SR 7 . De två huvudproteinerna som är involverade i SOCE är ER / SR Ca2 + -sensingstromal-interaktionsmolekylen 1 (STIM1) -proteinet och plasmamembranet Ca2 + -kanalen Orai1. Skelettmuskel uttrycker i hög grad dessa två proteiner, liksom andra proteiner av samma familjer (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 och flera Ca 2+ -permeabla kanaler i den transienta receptorpotentialkanoniska (TRPC) -familjen 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2+ inträde genom SOCE-vägen är av stor betydelse för muskelbildning / regenerering 14 . Mutationer av STIM1- eller Orai1-proteiner har skadliga effekter på muskelfunktionen, vilket främst leder till muskelhypotoni 15 . Djurmodeller med SOCE-försämring visar också minskad muskelmassa och kraft tillsammans med ökad utmattning 6 , 16 , 17 . Som nämnts uttrycks andra STIM- och Orai-proteiner, liksom många TRPC-kanaler, i skelettmuskler, och deras respektive roller har inte hittills bestämts. Genom att knacka dÄger sin uttrycksnivå, är det således möjligt att undersöka deras konsekvenser i SOCE och deras roller under human skelettmuskeldifferentiering.
SOCE-mätning kan utföras med två olika metoder: elektrofysiologiska ströminspelningar och Ca 2+ mätningar. Elektrofysiologi är verkligen en mer direkt metod, eftersom den mäter aktuell ström och dess associerade elektrofysiologiska signatur. Emellertid är denna teknik mycket svår att applicera på muskelceller, främst på grund av muskelcellernas stora storlek och den lilla storleken hos den endogena SOCE-strömmen. Cytosolisk Ca 2+ bildbehandling är tekniskt mycket tillgänglig, men åtgärden är mer indirekt, eftersom Ca 2+ -nivån uppmätt i cytosolen återspeglar både inmatningen av Ca 2+ och repumpningen ur cellen eller i de interna butikerna.
En metod som inkluderar isolering av myoblaster från små bitar av mänsklig skelEtalmuskel efter enzymatisk uppslutning, förstärkning och FACS förklaras i detta dokument. Processen med muskeldifferentiering och immunofluorescensprotokollet för att följa uttrycket av differentieringsmarkörer över tiden beskrivs 18 . Slutligen förklaras mätningen av SOCE och rollen av olika jonkanaler i Ca 2 + -signalerings- och skelettmuskeldifferentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humana muskelprover (vävnader erhållna från semitendinösa muskler) samlades under ortopedisk operation på friska patienter som kirurgiskt avfall. Alla metoder relaterade till den mänskliga studien utfördes i enlighet med de schweiziska regulatoriska hälsomyndigheternas riktlinjer och föreskrifter och godkändes av Cantonale d'Etique de la Recherche från Genèves kantonautoriteter, Schweiz (protokoll CER nr 12-259) . Informerade och skriftliga samtycke erhölls från alla vuxna personer som var involverade i studien.
1. Isolering av myoblaster från human skelettmuskel
- Under alla förfaranden bibehålla sterila betingelser genom att arbeta under en nivå II vävnadsodlingshuvud och använda sterilt medium och sterila buffertar.
Obs! Denna procedur kan tillämpas på många humana skelettmuskler.
2. Dissociation Protocol
- Överför muskelprover (2 - 3 g) till en steril 6 cmtallrik.
- Tvätta muskelproverna med 5-10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Upprepa tvätten.
- Ta bort bindväv och fettvävnader med böjd sax och en klämma.
- Väg muskelprovet (se steg 2.13) och överför det till en ny steril 6 cm platta.
- Tillsätt 5 ml 0,05% trypsin-EDTA.
- Använd sax, skär och hugga musklerna i små bitar (mindre än 2 mm).
- Använd en 10 ml serologisk pipett, överför den malda muskeln till en 200 ml dissociationsflaska innehållande en magnetisk bar. Upprepa detta steg tills 90 ml 0,05% trypsin-EDTA har överförts med all malet muskel till dissociationsboxen. Stäng dissociationsflaskan och inkubera vid 37 ° C under 60 minuter under mild omröring.
- Ta bort dissociationsflaskan från uppvärmningsbadet och stoppa den enzymatiska reaktionen genom att tillsätta 10 ml kalvfosterserum (FCS, 10% slutvolym) till dissociationsflaskan. Homogenisera blandningen med en pipett.
- PrepÄr två 50 ml rör med en 70 μm cellfilm på vardera. Passera hälften av cellsuspensionen genom cellsilen på varje rör genom pipettering upp och ner på filtret tills suspensionen passerar genom.
- Centrifugera rören vid 200 xg och 20 ° C i 5 min; Aspirera och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellerna med 10 ml tillväxtmedium (GM, tabell 1 ) och passera cellerna genom en 40 μm cellfilm placerad på ett 50 ml rör. Centrifugera röret vid 200 xg och 20 ° C under 5 minuter; Aspirera och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellerna med 10 ml GM och centrifugera röret vid 200 xg och 20 ° C i 5 min; Aspirera och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellerna med 1 ml GM och räkna cellerna med en Neubauer-kammare.
Obs! Vanligen bör ett utbyte av 3 x 10 5 celler per g muskel skördas. Utbytet beräknas genom att dividera antalet celler med hjälp av muskelbiopens viktSy (steg 2.4). - Sätta 2 x 10 5 celler i en steril 6-cm platta innehållande 4 ml av GM och inkubera vid 37 ° C och 7% CO2. Förbered så många tallrikar som behövs.
- Byt GM efter 3 dagar.
Anm .: Färskt dissocierade celler behöver tid att fästa vid odlingsplattan. Dessutom är den första myogencellens fördubblingstid cirka 50-60 timmar. Efter den första divisionen är fördubblingstiden cirka 20 h. - Efter 5 - 7 dagar, när celler når 70-80% sammanflöde (omkring 1,5 x 10 6 celler / per 6 cm platta), startar antikroppsfärgning och cellsortering (steg 3).
3. Antikroppsfärgning och cellsortering
- Efter sköljning en gång med PBS, inkubera de vidhäftande cellerna (i 6-cm platta) med en ml 0,05% Trypsin-EDTA vid 37 ° C och 7% CO2 under 3 min (eller inkubera vid 5% CO2). Stoppa reaktionen genom att tillsätta 2 ml GM och samla cellerna i 15 ml rör. Efter centrifugering (200 xg i 5 min), resAnvänd cellerna i 1 ml GM.
- Räkna cellerna med en Neubauer-kammare.
- Utför följande procedurer på is.
Obs! Proceduren för att ställa in korrekt fluorescenskompensation på cytometern är väsentlig och bör likna varje cytometer. Rör 1 och 2 används som negativa kontroller. Rör 3-7 används för att ställa in kompensationen på cytometern under det första experimentet ( tabell 2 ). Den slutliga koncentrationen som används för varje antikropp och dess motsvarande isotyp bör vara densamma (omkring 1 μg / 106 celler). - Dispatch 1 x 10 5 celler per rör (5 ml rör) för rör 1-7 ( Tabell 2 ). Placera den återstående cellsuspensionen i röret 8 för cellsortering.
- Tvätta cellerna med 1 ml kall FACS-buffert (PBS-5% FCS). Stäng och centrifugera rören vid 200 xg och 4 ° C i 5 minuter; Aspirera och kassera supernatanten.
- Tillsätt 200 μl FACS-buffert per rör. Lägg till antikroppar mot thE-röret enligt tabell 2 . Inkubera på is i 30 minuter.
- Tvätta cellerna: tillsätt 1 ml av FACS-bufferten till varje rör. Stäng och centrifugera rören vid 200 xg och 4 ° C i 5 min. Aspirera och kassera supernatanten. Upprepa detta steg en gång till.
- Resuspendera cellerna i 500 | il FACS-buffert. Stäng rören och behåll dem på is tills cell sortering. Förbered 4 rör av 1,5 ml, vardera innehållande 500 μl GM, vilket är nödvändigt för att samla cellerna under cellsortering. Håll dem på is.
- Sortera humana myoblaster genom flödescytometri ( Figur 1 ). Efter att ha exkluderat CD45-positiva hematopoietiska celler, separera CD45-negativa celler baserade på CD56-uttryck. Därefter definieras den CD56-positiva populationen för CD34, CD144 och CD146 (humana myoblaster som CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-celler). Reanalysera en liten del av den sorterade cellpopulationen för att kontrollera renheten.
- Smörj rören som innehåller mänsklig myoblaM i ett 15 ml rör och tvätta en gång genom att tillsätta 5 ml GM. Centrifugera röret vid 200 xg och 20 ° C under 5 minuter; Aspirera och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 1 ml GM och plåta cellerna på en obelagd 6 cm platta innehållande 4 ml GM (2 x 10 5 celler per platta). Inkubera vid 37 ° C och 7% CO2.
4. Cellunderhåll
- Byt hälften av odlingsmediet varannan dag. Ta bort 2 ml gammal GM från odlingsskålen och tillsätt 2 ml GM.
Obs! Myoblaster producerar tillväxtfaktorer som är fördelaktiga för odlingsförhållandena. - Trypsiniserar cellerna när de når 70-80% sammanflöde för att undvika fördifferentiering. Efter sköljning en gång med PBS, inkubera de vidhäftande cellerna (i 6-cm platta) med en ml 0,05% Trypsin-EDTA vid 37 ° C och 7% CO2 under 3 min. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 2 ml GM och samla cellerna i ett 15 ml rör. Efter centrifugering (200 xg i 5 min), resusPenda cellerna i 1 ml GM.
- Räkna cellerna och bereda 6 cm plattor med 2 x 10 5 celler per platta i 4 ml GM.
- Håll mänskliga myoblaster upp till 6 passager eller frys dem i GM som innehåller 10% DMSO, 1 x 10 6 celler per ml. Frys cellerna i en progressiv frysbox (1 ° C / min); För långtidsförvaring, placera cellerna i flytande kväve.
5. Transfektion av humana myoblaster med siRNA
Anm .: Myoblaster transfekteras med användning av kommersiellt transfektionsreagens två dagar före induktion av differentieringen. Effekten av specifikt siRNA mot en gen jämförs alltid med effekten av ett kontroll-siRNA. SiRNAs är dubbelsträngade RNA som måste hållas på is och manipuleras med handskar.
- Hämta ett 70 - 80% konfluent monolag av humana myoblaster i en 6 cm platta (ca 1,5 x 106 celler).
Notera: 5 x 10 ^ celler per transfektion behövs för att erhålla en konFlytande monolag av transfekterade myoblaster efter 2 dagar i GM. - Förbereda glasöverdragslister (beskrivna för kalciumbildningen i steg 7).
- Varm GM, 0,05% trypsin-EDTA och PBS till 37 ° C.
- Utför alla följande steg i en vävnadskulturhuva på nivå II för att bibehålla steriliteten.
- I ett 1,5 ml rör sänds 500 μl reducerat serummedium, 3 μl transfektionsreagens och 1 μl siRNA vid 20 μM. Blanda försiktigt och håll vid rumstemperatur (RT) i 15 - 20 min.
- Under denna inkubationstid, förbered myoblasterna för transfektion. Efter sköljning en gång med PBS, inkubera de vidhäftande cellerna (i 6-cm platta) med en ml 0,05% Trypsin-EDTA vid 37 ° C och 7% CO2 under 3 min. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 2 ml GM och samla cellerna i ett 15 ml rör. Efter centrifugering (200 xg i 5 min) resuspenderar cellerna i 1 ml GM.
- Räkna cellerna med en Neubauer-kammare.
- Resuspendera 5 x 10 5 cellerI 200 μl GM för varje transfektion ( dvs för 2 transfektioner, resuspenderas i 400 μl).
- Tillsätt 200 pl av cellsuspensionen till varje 500 | il av siRNA-transfektantblandning. Pipettera upp och ner två gånger och inkubera i 5 min vid RT.
- Tillsätt 700 μL (celler + siRNA-transfektant) till en 3,5 cm odlingsskål som innehåller ett glasöverdrag. Lägg till GM för att få en slutlig volym på 2 ml.
- Efter 24 h vid 37 ° C och 7% CO2, helt ersätta mediet med 2 ml färskt GM. Efter ytterligare 24 timmar är ett konfluent monolag av transfekterade celler vanligtvis närvarande; Om så är fallet inducerar myoblastdifferentiering genom att ersätta GM med 2 ml differentieringsmedium (DM; Tabell 1 ).
- Utför kalciumbildningsförsök 24 - 48 timmar efter induktion av differentiering eller på prolifererande myoblaster.
Anm .: Immunofluorescens utförs vanligtvis 48 h efter induktion av differentiering.
6. ImmUnofluorescence Staining of Differentiation Markers
Obs! Immunofluorescensfärgning utförs efter 48 timmar i DM, men det kan också utföras vid andra differentieringstider. Myogenin och MEF2 är endast kärnproteiner uttryckta i differentierade celler (före fusion i myotubes), och deras färgning möjliggör bedömning av differentieringsprocessen. Myosin tung kedja (MyHC) uttrycks endast i myotubes och används för att uppskatta myotube storlek och fusionsindex (antal kärnor i myotubes / totalt antal kärnor).
- Efter 48 timmar i DM tvättar det konfluenta monoskiktet av differentierade celler två gånger med 1 ml PBS vid RT. Gör detta försiktigt för att undvika att myotubes avlägsnas.
- Fixera cellerna med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i 15 minuter vid RT. Tvätta cellerna med PBS två gånger, i 5 min vardera.
- Permeabilisera cellerna med 1 ml PBS innehållande 0,25% Triton X-100 i 45 minuter och tvätta 3 gånger med 1 ml PBS.
- Blockera unsSpecifika bindningsställen genom att inkubera cellerna i PBS kompletterat med 0,2% Tween-10 och 2% get serum (blocklösning) under 30 minuter vid RT.
- Förbered primära antikroppar utspädd i blocklösning (600 | il per 3,5 cm platta).
Anmärkning: Följande primära antikroppar används: mus anti-myogenin (1: 600), kanin-anti-MEF2 (1: 300) och anti-MyHC-antikropp mot mus (MF20, 1: 1000). Det är möjligt att blanda i samma blockerande lösning, mus anti-myosin tung kedja eller mus anti-myogenin, med kanin anti-MEF2. - Ta bort blocklösningen och sätt 600 μL primära antikroppslösningar per 3,5 cm platta och inkubera över natten vid 4 ° C i en fuktad kammare.
- Tvätta cellerna 3 gånger med 1 ml PBS. Inkubera i 1 h vid RT i en mörk kammare med 600 | il av de sekundära antikropparna framställda i blocklösningen enligt följande: get-anti-mus Alexa 488 (1: 1000), get-anti-kanin Alexa 546 (1: 1000) Och DAPI (1:50, stamlösning vid 15 | im).
cautioN: DAPI är en giftig förening som bör hanteras med handskar. - Aspirera och tvätta cellerna 3 gånger med 1 ml PBS.
- Montera glasskyddsglas med hjälp av polyvinylalkoholmonteringsmedium med antifationslösning. Håll dem vid 4 ° C och skyddad från ljus tills bildning av cellerna.
7. Calcium Imaging
- Förkultur, förbered glasskyddsglas 25 mm i diameter. Sätt täckglasen i 70% etanol i 48 timmar för att avlägsna fett och smuts från ytan, vilket minskar cellens vidhäftning till täckglaset.
- Efter sköljning av täckglaset gånger med vatten, sätt tillbaka dem i vatten och sterilisera dem (autoklaverad).
- Lägg en täckglas per 3,5 cm odlingsplatta och låt dem torka. Förvara Petriskålarna för ytterligare experiment eller använd dem omedelbart.
- Lägg de transfekterade myoblasterna (5 - 6 x 10 5 celler) till glasskyddet.
Obs! Experimenten görs 24 - 48 timmar efter induktion av differentiatiPå eller på proliferera myoblaster. - För att utföra Ca 2+ bildbehandling tvätta cellerna 2 gånger med PBS eller direkt med mediet som används för experimenten (kalciumhaltigt medium, tabell 3 ). Ladda cellerna med 2 μM Fura-2 / AM plus 1 μM pluronsyra i ca 30 min i mörkret vid RT.
Obs! Pluronsyra hjälper till att solubilisera Fura-2. Fura-2 / AM och pluronsyra löses i det kalciuminnehållande mediet. - Tvätta cellerna två gånger i samma medium men utan Fura-2 / AM och pluronsyra och lämna dem i mörkret i ytterligare 10-15 minuter för att tillåta förestring av Fura-2 / AM.
- Om laddningseffektiviteten hos Fura-2 är för låg, lägg till mer Fura-2 ( t.ex. 4 μM) och / eller inkubera cellerna under en längre tid ( t.ex. 40 min).
- Ta bort täckglaset från odlingsplattan och montera det i experimentkammaren. Tillsätt ~ 1 ml kalciumhaltigt medium (beroende på volymen av experimentetMental kammare). Installera det på mikroskopsteget och starta inspelningen.
Obs! Den fluorescerande Ca2 + -sensitiva sonden Fura-2 exciteras alternerande vid 340 nm och 380 nm, och emissionsljuset uppsamlas vid 510 nm. Eftersom fluktuationerna i Ca2 + -koncentrationen är relativt långsama, förvärva 1 förhållande var 2: e s. - För att aktivera SOCE används följande klassiska thapsigargin / Ca 2+ återtilläggsprotokoll: lämna cellerna i 2-3 min i kalciumhaltigt medium. Byt mediet med kalciumfritt medium i 1-2 minuter.
- Tillsätt 1 μM thapsigargin för att tömma de interna kalciumbutikerna.
Obs! Thapsigargin är en irreversibel blockerare av sarco-endoplasmatisk retikulum Ca 2+ ATPase (SERCA) pumpaktivitet. Efter 8-10 min ersätter mediet snabbt med det kalciumhaltiga mediet. Ca 2+ kommer in i cellerna via SOCE-kanalerna. Vänta ca 5 min innan experimenten avslutas.
VARNING: Thapsigargin är en giftig förening som bör hanteras med handskar.
- Tillsätt 1 μM thapsigargin för att tömma de interna kalciumbutikerna.
8. Ca 2+ mätanalys
Obs! Utför analysen med förvärvsprogrammet.
- Öppna experimentet. Rita region 1 i ett område där det inte finns några celler (bakgrundsregion) och dra de andra regionerna i cytoplasman hos cellerna som ska analyseras (regionerna kan dras på vilken bild som helst: 340 nm, 380 nm, Eller förhållandebilden). Gå till "Kör experiment"> "referensbilder." Under 340 och 380 kanaler, välj "region 1" och klicka sedan på "Subtrahera bakgrund."
- Kör hela experimentet (F4: framåt) för att säkerställa att ingenting stör bakgrundsområdet, till exempel en fluorescerande dammpunkt som reser genom bakgrundsregionen och att cellerna inte rör sig under experimentens gång.
Obs: De intressanta regionerna som är markeradeBör inte inkludera mörka områden; Annars kommer förhållandevärdet att visas bullrigt, eftersom en del av bakgrunden kommer att ingå i mätningen. - Klicka på "Logga data" och spela hela experimentet igen.
Obs! Detta öppnar ett kalkylblad där tiden och förhållandet loggas. Det är också möjligt att spara enskilda 340 nm och 380 nm våglängder. - För att få information om SOCE, extrahera de två viktiga parametrarna från experimentet: amplituden för Ca 2 + -tillägget och höjden av Ca 2+ -fasen ( Figur 3 ).
- Hämta amplituden genom att subtrahera förhållandevärdet strax före Ca 2+ återtillägg från den maximala amplituden av Ca 2+ höjden . Hämta maximal lutning genom att passa en linjär regression av de första sekunderna efter Ca 2+ återtillägg.
Obs! Området under kurvan för thapsigargin-svaret är också en informativ parameter för extraktionT, eftersom det speglar mängden fri kalcium som lagras i SR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter den enzymatiska dissociationen av ett humant muskelprov förstärktes cellerna i GM. Humana myoblaster, definierade som CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-celler, erhölls efter FACS. Myoblaster representerade mer än 60% av den analyserade populationen ( Figur 1 ). Primära humana myoblaster replierades, odlades till sammanflöde och odlades i DM under 48 timmar. Efter immunostaining för expressionen av transkriptionsfaktorn MEF2 och den muskelspecifika proteinet myosin tunga kedjan (MyHC) observerades att en majoritet av celler bildade myotubes in vitro (MyHC-positiva celler) med fusionsindexvärden på 60,9 ± 1,3% (N = 5; fig 2 ). Vi observerade också att omkring 40% av humana myoblaster, kallade reservceller, flydde denna terminal differentiering och förblev odefinierade mononukleerade celler. För funktionella studier analyserade vi Ca2 + -svaret av myoblaster eller myotubes 48 h efter initieringen avdifferentiering. Figur 3 visar ett representativt protokoll som används för att inducerade SOCE och nyckelparametrarna för att extrahera från en sådan inspelning. För att urskilja information relaterad till molekylerna som är involverade i SOCE transfekterades celler med siRNA mot molekylen av intresse. Figur 4 visar effekten av att simmar Ca2 + -permeabla kanaler hos TRPC-familjen på SOCE i myoblaster.
Figur 1 : FACS av humana myoblaster. Dissocierade humana celler immunostained med antikroppar för följande cellytmarkörer: CD45, CD56, CD34, CD144 och CD146. Efter att ha exkluderat CD45-positiva hematopoietiska celler separerades CD45-negativa celler baserat på CD56-uttryck. Den CD56-positiva populationen var sedan gated för CD34, CD144 och CD146. Humana myoblaster definierades som CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-celler, såsom tidigare beskrivits 19 , 4 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Mänsklig myoblastdifferentiering. ( A ) Ett konfluent monolag av humana myoblaster exponerades för DM i 48 timmar; fast; Och färgas med antikroppar mot MEF2 (röd), MyHC (grön) och DAPI (blå) för identifiering av kärnor. Skala bar = 50 μm. ( B ) Fusionsindexet representerar antalet kärnor inkorporerade i myotubes dividerat med det totala antalet kärnor på ett visst fält. Data är medelvärde ± SEM av 5 oberoende experiment.Ank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 : Representativ kalciummätning av Thapsigargin-inducerad SOCE. Myotubes laddades med Fura-2 och den cytosoliska Ca2 + -koncentrationen uppmättes. ( A ) Cellerna sitter i några minuter i ett kalciumhaltigt medium följt av 2 min i ett kalciumfritt medium. 1 μM tapsigargin användes därefter under 8 min, följt av återföringen av kalcium. De tre viktiga parametrarna för att extrahera från sådan inspelning är: området under kurvan för tapsigargin-svaret, SOCE-lutningen och amplituden för SOCE. ( B ) Kvantificering av de 3 parametrarna. Området under kurvan ger information om mängden Ca 2+ lagrad i ER / SR, och de två andra parametrarna möjliggör kvantifieringenSOCE. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 : Inblandning av TRPC1 och TRPC4 i SOCE. ( A ) Cytosolisk Ca2 + -koncentration bedömdes med användning av Fura-2 i prolifererande myoblaster transfekterade med siTRPC1 eller siTRPC1 och siTRPC4. SOCE utlöstes av internt lagerdepletion med 1 uM tapsigargin i frånvaro av extern Ca 2+ (Ca 2+ fri) och uppmätt under återtillägget av 2 mM extern Ca 2+ . Varje spår representerar medelvärdet av en representativ täckglas. ( B ) Kvantificering av effekterna av siRNA på SOCE amplitude. Denna siffra har ändrats från referens 12 , med tillstånd. Barer ar E betyder ± SEM, * p <0,05. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Tillväxtmedium (GM): | Koncentration | Differentieringsmedium (DM): | Koncentration | |||||
| Skinka F10 | DMEM | |||||||
| FCS | 15% | Bovint serumalbumin | 0,5 mg / ml | |||||
| Bovint serumalbumin | 0,5 mg / ml | Epidermal tillväxtfaktor | "> 10 ng / ml||||||
| fetuin | 0,5 mg / ml | insulin | 0,01 mg / ml | |||||
| Epidermal tillväxtfaktor | 10 ng / ml | kreatin | 1 mM | |||||
| dexametason | 0,39 μg / ml | pyruvat | 100 | ig / ml | |||||
| insulin | 0,04 mg / ml | uridin | 50 | ig / ml | |||||
| kreatin | 1 mM | gentamycin | 10 | ig / ml | |||||
| pyruvat | 100 | ig / ml | <Td colspan = "2"> | ||||||
| uridin | 50 | ig / ml | |||||||
| gentamycin | 5 | ig / ml | |||||||
Tabell 1: Medelkomposition för Myoblast-kultur.
| rör | antikroppar | |||||
| 1 | Ingen | |||||
| 2 | Isotyp AlexaFluor 488-, Isotyp PE-CF594, Isotyp PE, Isotyp PECy7Isotyp APC | |||||
| 3 | Mus anti-human CD56-AlexaFluor 488 | |||||
| 4 | Mus anti-human CD45 PE-CF594 | |||||
| 5 | Mus anti-human CD144-PE | |||||
| 6 | Mus anti-human CD146-PECy7 | |||||
| 7 | Mus anti-human CD34-APC | |||||
| 8 | Mus anti-human CD56-AlexaFluor 488-, mus anti-human CD45 PE-CF594, mus anti-human CD144-PE, mus anti-human CD34-APC, mus anti-human CD146-PECy7 | |||||
Tabell 2: Antikroppar som används för cellsortering.
| Kalciuminnehållande medium | koncentration | Kalsiumfritt medium | koncentration | |||||
| NaCl | NaCl | 135 mM | ||||||
| KCI | 5 mM | KCI | 5 mM | |||||
| MgCl2 | 1 mM | MgCl2 | 1 mM | |||||
| CaCl2 | 2 mM | EGTA | 1 mM | |||||
| hepes | 10 mM | hepes | 10 mM | |||||
| Glukos | 10 mM | Glukos | 10 mM | |||||
| PH 7,45 justerat med NaOH | PH 7,45 justerat med NaOH | |||||||
Tabell 3: Medelkomposition för kalciumbildningsförsök.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isoleringen och kulturen av humana myoblaster från vuxen skelettmuskel erbjuder en in vitro- modell för att studera muskeldifferentiering och muskelregenerering. I det här dokumentet tillhandahåller vi ett protokoll som möjliggör rening av höga utbyten av humana myoblaster på ett enkelt och kostnadsbegränsat sätt. Dessutom ger denna teknik pålitliga och reproducerbara resultat i termer av procentuell andel av myoblaster isolerade och deras myogena differentieringseffektivitet. I själva verket erhöll vi omkring 60% av humana myoblaster efter cellsortering. Dessa celler kan bibehållas i kultur för upp till 6 passager (cirka 30 dubbelrum) och behålla sin förmåga att differentiera. Vidare sker myogen differentiering snabbt efter förändring av mediet från GM till DM, eftersom efter 2 till 3 dagar i DM är myoblastfusion maximal. I denna modell smälter omkring 60% av myoblasterna i myotubes efter 2 dagar i DM. En annan fördel är att dessa primära mänskliga cellerL-kulturer transfekteras lätt med siRNA. De GM- och DM-medier som används i vårt laboratorium är hemlagade. Alternativt kan kommersiella medier användas, men vi har aldrig försökt sin effektivitet i mänskliga primära kulturer.
En nackdel med den angivna metoden är användningen av trypsin under vävnadsenzymatisk digestion. Detta förfarande tar bort en stor del av cellytmarkörerna och innebär att vi lämnar cellerna i odling i några dagar innan FACS utförs. Kollagenas kan användas istället för trypsin för att bättre bevara membranproteinerna och tillåta sortering av humana myoblaster omedelbart efter vävnadsdissociation. Kostnaden för kollagenas är emellertid signifikant högre än trypsin, och ett amplifieringssteg skulle fortfarande krävas efter cellsortering för att erhålla ett tillräckligt cellantal för de följande experimenten. En annan begränsning av tekniken är "kvalitet" av de muskelprover som erhållits från ortopedIc operation. Faktum är att de erhållna bitarna av vävnad kan bli mer eller mindre skadade på grund av operation, och tiden mellan operationen och celldissociationen i laboratoriet kan variera från dag till dag. För myoblastisolering, rening och differentiering i myotubes erhåller vi emellertid rutinmässigt tillfredsställande resultat. Slutligen kan patientens ålder vara ett problem, eftersom mängden och regenererande kapacitet hos satellitceller minskar med 20 års ålder. Således begränsar vi våra experiment till unga patienter (mindre än 40 år gamla).
Som nämnts skiljer myoblaster snabbt och effektivt, vilket är en stor fördel med att studera de initiala händelserna av skelettmuskeldifferentiering. Men när myotubes bildas snabbt har de också en tendens att spontant sammandraga och avlägsna från odlingsplattorna. Detta utesluter analysen av de senare fusionshändelserna. För att studera dessa senare händelser skulle man behövaAtt belägga odlingsplattan med extracellulär matris för att förbättra celladhäftningen och förminska myotube-avlägsnandet 21 .
Kalciumavbildning med hjälp av den fluorescerande proben Fura-2 är en allmänt använd, reproducerbar teknik som är lätt att utföra. Lastningen av Fura-2 är effektiv, och användningen av en ratiometrisk sond, såsom Fura-2, har flera fördelar jämfört med ett färgvåg med en våglängd. Det normaliserar förändringar av fokus eller skillnader i laddningen mellan celler och i en cell ( t.ex. kärnan mot cytosol). Protokollet vi beskriver för att framkalla och mäta SOCE används regelbundet i många olika cellulära system. Avstängningen av olika kanaler eller kalciumregulatorer möjliggör att belysa den molekylära sammansättningen av SOCE och den relativa betydelsen av de olika aktörerna, både i myoblaster och i myotubes. Ett alternativt tillvägagångssätt med användning av Fura-2 och Ca 2+ avbildning är tillämpningen avMn 2+ släckteknik. Mn 2+ går in i cellerna genom Ca 2+ -permeabla kanaler och släcker fluorescensen fura-2. Mätningen av släckningsgraden ger en mer direkt åtgärd av SOCE 22 , 23 . Detta kräver emellertid användningen av något annorlunda utrustning. Ca 2 + -signaleringen kan också utföras med användning av genetiskt kodade Ca 2+ -indikatorer, vilka har den stora fördelen att de är exakt lokaliserade i olika cellfack. Nackdelarna är kravet på celltransfektion och signalens dynamik, vilket vanligtvis är mindre än med kemiska färgämnen 24 . För att mäta Ca 2+ i organeller som mitokondrier eller SR, är de genetiska sonderna guldstandarden. För cytosoliska Ca 2 + -mätningar kvarstår dock fördelen att använda Fura-2 över genetiska prober.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av den schweiziska National Science Foundation (bidrag nr 310030-166313), "Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", "Stiftelsen Marcel Levaillant" och "Fondation pour la recherche ostéo-articulaire."
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 mL tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 mL tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 mL tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. |
References
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
- Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
- Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
- Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
- Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
- Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
- Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
- Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
- Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
- Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
- Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
- Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
- Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
- Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
- Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
- Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).
