Summary
여기, 우리는 성인 근육 조직에서 인간 myoblasts의 순수 인구를 얻기위한 방법을 설명합니다. 이 세포들은 생체 외 골격근 분화를 연구하고, 특히 Ca 2+ 신호 전달에 관여하는 단백질을 연구하는데 사용됩니다.
Abstract
위성 세포 (SC)는 근섬유의 원형질 막과 주변 기저 층 사이에 위치한 근육 줄기 세포입니다. 그들은 근육 재생에 필수적입니다. 골격근에서 자주 발생하는 부상시 SC가 활성화됩니다. 그들은 근육 아세포로 증식하고 근육 병변을 치료하기 위해 분화합니다. 근육 분화 동안 일어나는 많은 사건 중에서, 세포질 Ca 2+ 신호는 매우 중요합니다. Ca 2+ 신호는 Ca 2+ 가 내부 Ca 2+ 저장소에서 방출 될뿐만 아니라 세포 외부 공간에서 칼슘 2+ 가 들어간 것, 특히 상점 운영 Ca 2+ 입구 (SOCE)에서 발생합니다. 이 논문은 정형 외과 수술 후 수집 된 근육 샘플로부터 인간 근섬유의 순수한 집단을 얻기 위해 사용 된 방법을 설명합니다. 조직은 기계적 및 효소 적으로 소화되며, 세포는 증폭되어 speci의 존재에 따라 유동 세포 계측법에 의해 분류된다fic 막 마커. 일단 얻은 인간의 myoblasts 확장 및 배양 매체에서 성장 인자를 제거하여 차별화에 전념. 특정 전사 인자 및 시험 관내 면역 형광의 발현 수준은 대조 조건 및 Ca 2+ 신호 전달에 관여하는 단백질을 정지시킨 후에 근원적 인 분화 과정을 평가하는데 사용된다. 마지막으로, Fura-2의 비율을 SOC의 신뢰성 있고 재현성있는 측정을 제공하는 비율 계 Ca 2+ 프로브로 사용합니다.
Introduction
인간 골격근은 근원 전구 세포의 융합으로 인한 수축성 다핵 근육 섬유 군으로 구성됩니다. 골격 근육은 근섬유 (원형질막)의 원형질 막과 기저 층 (basal lamina) 사이에 위치한 골격근 줄기 세포 인 SC의 존재로 인해 손상 후 재생성 할 수 있습니다. 손상되지 않은 근육에서 SC는 주로 정지 상태에 있습니다. 기계적 스트레스 나 부상에 반응하여 SC는 활성화되고 (myoblast), 증식하고, SC pool 1 , 2 를 보충하기 위해 새로운 myofibers를 형성하기 위해 분화되거나 자체 갱신됩니다. 수년에 걸쳐 골격근 생검에서 SC 및 그 자손 인 myoblast를 분리하기위한 몇 가지 기술이 개발되었습니다. 이 세포들에 표현 된 세포 표면 마커들과 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS) 3 의 방법론에 대한 더 깊은 이해로, 4 , 5 , 이제 근육 샘플로부터 인간 근섬유의 순수 집단을 분리하는 것이 가능합니다.
칼슘 시그널링은 골격근 발달, 항상성 및 재생을 조절합니다. 특히, SOCE라는 세포 내 저장 고갈 다음 활성화되는 칼슘 2 + 항목은 이러한 프로세스에 대한 중요성 6이다. 세포 자극시 endo / sarcoplasmic reticulum (ER / SR)의 Ca 2+ 수준이 감소하고 세포막 칼슘 이온 채널을 활성화시켜 Ca 2+ 유입을 허용하여 ER / SR 7 을 충전합니다. SOCE에 관여하는 두 가지 주요 단백질은 ER / SR Ca 2+ - 감지 간질 상호 작용 분자 1 (STIM1) 단백질과 원형질막 Ca 2+ 채널 Orai1입니다. 골격 근육은이 두 단백질과 같은 가족의 다른 단백질을 풍부하게 표현합니다 (STIM2 and Orai2-Orai3) 8 , 9 및 transient receptor potential canonical (TRPC) 계열 10 , 11 , 12 , 13의 Ca 2+ 투과성 채널. SOCE 경로를 통한 Ca 2+ 유입은 근육 형성 / 재생에 매우 중요합니다 14 . STIM1 Orai1 또는 단백질 돌연변이 근육 긴장 저하 (15)을 중심으로 이어지는 근육 기능에 해로운 영향을 미친다. SOCE 손상이있는 동물 모델은 또한 근육 질량과 힘을 감소시키고, 피로도를 6 , 16 , 17 로 향상시킵니다. 언급 한 바와 같이, 다른 TRP 채널뿐만 아니라 다른 STIM 및 Orai 단백질은 골격근에서 발현되며, 각각의 역할은 지금까지 결정되지 않았다. 노크 d함으로써그들의 발현 수준을 소유하고 있기 때문에 SOCE에서의 함의와 인간 골격근에서의 역할을 조사 할 수 있습니다.
SOCE 측정은 전기 생리 학적 전류 기록과 Ca 2+ 측정의 두 가지 접근법을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 전기 생리학은 확실히 현재의 관심과 그에 관련된 전기 생리 학적 신호를 측정하기 때문에보다 직접적인 방법입니다. 그러나,이 기술은 근육 세포에 적용하기가 매우 어렵습니다. 주로 근육 세포의 크기가 크고 내인성 SOCE 전류가 작기 때문입니다. 세포질 칼슘 촬상 기술적으로 매우 접근이지만, 세포질에서 측정 된 Ca2 + 수준의 칼슘의 유입 2+ 및 재 펌핑 셀로부터 또는 내부 저장에 모두 반영 같이 측정은 간접적이다.
인간의 뼈의 작은 조각으로부터 myoblasts를 분리하는 것을 포함하는 방법론효소 소화, 증폭 및 FACS 후 etal 근육이이 종이에 설명되어 있습니다. 시간이 지남에 따라 차별화 마커의 표현을 따르는 근육 차별화 및 면역 형광 프로토콜의 과정은 18 에 설명되어 있습니다. 마지막으로, SOCE의 측정과 칼슘 2 + 신호 및 골격근 분화에 다른 이온 채널의 역할이 설명되어 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
건강한 환자의 정형 외과 수술 중에 수술 용 폐기물로 인간 근육 샘플 (반결질 근육에서 얻은 조직)을 채취했습니다. 인체 연구와 관련된 모든 방법은 스위스 규정 보건 당국의 지침 및 규정에 따라 수행되었으며 스위스 제네바 당국 (Commission Cantonale d' Ethique de la Recherche)의 승인을 받았다 (프로토콜 CER 번호 12-259) . 이 연구에 참여한 모든 성인 피험자로부터 정보 및 서면 동의를 얻었습니다.
1. 인간 골격근으로부터 근섬유의 분리
- 모든 절차 동안, 수준 II 조직 배양 후드에서 작업하고 멸균 배지 및 멸균 완충액을 사용하여 멸균 상태를 유지하십시오.
참고 :이 절차는 많은 인간 골격 근육에 적용 할 수 있습니다.
2. 해리 프로토콜
- 근육 샘플 (2 - 3g)을 무균 6cm플레이트.
- 인산 완충 식염수 (PBS) 5 - 10 ML로 근육 샘플을 씻으십시오. 세척을 반복하십시오.
- 굽은 가위와 클램프를 사용하여 결합 조직과 지방 조직을 제거합니다.
- 근육 샘플을 계량하고 (2.13 단계 참조) 새로운 무균 6cm 플레이트로 옮깁니다.
- 5 mL의 0.05 % Trypsin-EDTA를 첨가한다.
- 가위를 사용하여 근육 조직을 잘라 내고 작은 조각 (2mm 미만)을 만듭니다.
- 10 ML 혈청 피펫을 사용하여 자기 막대를 포함하는 200 ML 해리 병에 다진 근육을 전송하십시오. 0.05 % 트립신 - EDTA 90 ML가 모든 다진 근육과 함께 해리 상자로 전송 될 때까지이 단계를 반복합니다. 해리 병을 닫고 온화한 교반하에 60 분 동안 37 ° C에서 품어 라.
- 가열 욕조에서 해리 병을 제거하고 해리 병에 태아 송아지 혈청 (FCS; 10 % 최종 부피) 10 ML을 추가하여 효소 반응을 중지합니다. 혼합물을 피펫으로 균질화하십시오.
- 예습각각에 70μm 셀 스트레이너가있는 두 개의 50mL 튜브입니다. 현탁액이 통과 할 때까지 필터 위에서 위아래로 pipetting하여 각 튜브에 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액의 절반을 전달하십시오.
- 튜브를 200 xg 및 20 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 흡인하고 상등액을 버린다.
- 성장 매체 (GM; 표 1 ) 10 ML로 세포를 Resuspend하고 한 50 ML 튜브에 배치 40 μm의 세포 스트레이너를 통해 세포를 전달하십시오. 튜브를 200 xg 및 20 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 흡인하고 상등액을 버린다.
- GM 10 ML와 세포를 Resuspend하고 5 분 200 XG와 20 ° C에서 튜브를 원심 분리기; 흡인하고 상등액을 버린다.
- GM 1 ML와 세포를 Resuspend하고 Neubauer 챔버를 사용하여 셀을 계산합니다.
참고 : 일반적으로 근육의 g 당 3 × 10 5 세포의 수율은 수확해야한다. 수확량은 세포 수를 근육 생체의 무게로 나누어 계산합니다sy (단계 2.4). - 37 ° C와 7 % CO 2 에서 4 ML의 GM 및 부화가 들어있는 멸균 6cm 플레이트에 2 X 10 5 세포를 넣으십시오. 필요한만큼의 번호판을 준비하십시오.
- 3 일 후에 GM을 변경하십시오.
참고 : 갓 해체 된 세포는 배양 판에 부착 할 시간이 필요합니다. 또한, 첫 번째 근육 세포 배증 시간은 약 50 - 60 시간입니다. 첫 번째 분열 후 두 배의 시간은 약 20 시간입니다. - 셀 (70)에 도달하면 7일 - - 5 후 (약 1.5 × 10 6 세포 / 6cm 플레이트 당) 80 % 컨 플루 언스, 항체 염색 및 세포 분류 (단계 3)를 시작한다.
3. 항체 얼룩과 세포 분류
- PBS로 한번 세척 한 후, 37 ℃에서 0.05 % 트립신 EDTA 1 ㎖와 (6 cm 플레이트)를 접착 세포 배양 7 % 3 분간 CO 2 (또는 5 % CO에서 배양 2). GM 2 mL를 첨가하여 반응을 멈추고 15 mL 튜브에 세포를 수집한다. 원심 분리 후 (200 xg, 5 분), resGM 1 mL에 세포를 첨가한다.
- Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 세십시오.
- 얼음 위에서 다음 절차를 수행하십시오.
참고 : cytometer에 올바른 형광 보상을 설정하는 절차는 필수적이며 모든 cytometer에서 유사해야합니다. 튜브 1과 2는 음성 대조군으로 사용됩니다. 튜브 3 - 7은 첫 번째 실험에서 cytometer의 보정량을 설정하는 데 사용됩니다 ( 표 2 ). 각 항체 및 해당 이소 형에 사용 된 최종 농도는 동일해야합니다 (약 1 μg / 10 6 세포). - 1 - 7 튜브 (5 ML 튜브) 당 1 X 10 5 세포를 파견 ( 표 2 ). 세포 정렬을 위해 튜브 8에 남아있는 세포 현탁액을 놓습니다.
- 차가운 FACS 버퍼 (PBS - 5 % FCS) 1 ML로 세포를 씻으십시오. 5 분 동안 200 xg 및 4 ° C에서 튜브를 닫고 원심 분리하십시오. 흡인하고 상등액을 버린다.
- 튜브 당 FACS 버퍼의 200 μL를 추가합니다. th에 항체를 추가하십시오표 2 에 따른 e 튜브. 얼음 위에서 30 분 동안 품어 낸다.
- 세포를 씻으십시오 : 각 튜브에 FACS 버퍼 1 ML을 추가합니다. 5 분 동안 200 xg 및 4 ° C에서 튜브를 닫고 원심 분리하십시오. 흡인하고 상등액을 버립니다. 이 단계를 한 번 더 반복하십시오.
- FACS 버퍼 500 μL에 세포를 Resuspend. 튜브를 닫고 셀 정렬까지 얼음에 보관하십시오. 세포 분별하는 동안 세포를 수집하는 데 필요한 GM의 500 μL를 각각 포함 1.5 ML의 4 튜브를 준비합니다. 얼음 위에 보관하십시오.
- 유동 세포 계측법 ( 그림 1 )에 의해 인간 myoblasts를 정렬합니다. CD45 양성 조혈 세포를 배제 한 후 CD56 발현을 기준으로 CD45 음성 세포를 분리합니다. 그런 다음 CD34, CD144 및 CD146 (인간 근섬유는 CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- 세포로 정의 됨)에 대한 CD56 양성 집단을 게이트하십시오. 순도를 확인하기 위해 정렬 된 세포 집단의 작은 부분을 재분석합니다.
- 인간 myobla가 들어있는 튜브를 풀다.1 개의 15 mL 튜브에 넣고 한 번 씻으십시오. 5 mL의 GM을 넣으십시오. 튜브를 200 xg 및 20 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 흡인하고 상등액을 버린다.
- GM 1 mL에 세포를 Resuspend하고 GM (접시 당 2 X 10 5 셀) 4 ML을 포함 uncoated 6cm 플레이트에 세포를 접시. 37 ° C 및 7 % CO 2 에서 배양하십시오.
4. 셀 유지 관리
- 2 일마다 배양액의 절반을 교체하십시오. 배양 접시에서 2 mL의 GM을 제거하고 2 mL의 GM을 첨가한다.
참고 : Myoblast는 배양 조건에 도움이되는 성장 인자를 생성합니다. - 그들은 pre - differentiation을 피하기 위해 70 - 80 % 합류에 도달하면 세포를 trypsinize. PBS로 한 번 헹구어 준 후 3 분 동안 37 ℃에서 7 % CO 2 에서 0.05 % Trypsin-EDTA 1 mL로 부착 세포 (6-cm 플레이트에서)를 배양합니다. GM 2 mL를 첨가하여 반응을 멈추고 15 mL 튜브에 세포를 수집한다. 원심 분리 후 (200 xg, 5 분), resusGM 1 mL에 세포를 고정 시키십시오.
- 세포 수를 세고 GM 4 mL에 2 x 10 5 세포 / 6 cm 플레이트를 준비하십시오.
- 6 개 통로 인간 근육 아세포를 유지하거나 GM은 10 % DMSO, 용액 당 1 × 106 세포를 함유하는 그들 동결. 점진적 동결 상자 (1 ° C / 분)에서 세포를 고정 시키십시오; 장기간 보관하려면 액체 질소를 넣으십시오.
5. siRNA와 인간 Myoblasts의 Transfection
참고 : Myoblast는 차별화 유도 2 일전에 상업용 형질 전환 시약을 사용하여 형질 감염됩니다. 특정 siRNA가 유전자에 미치는 영향은 항상 대조 siRNA의 효과와 비교됩니다. siRNA는 얼음 위에 보관하고 장갑으로 조작해야하는 이중 가닥 RNA입니다.
- 6 cm 플레이트 (약 1.5 × 106 세포) 인간 근육 아세포의 80 % 컨 플루 언트 단일 층 - 70를 구합니다.
참고 : 형질 당 5 × 10 개 5 세포는 죄수를 얻기 위해 필요하다GM에서 2 일 후에 transfected myoblasts의 유창한 monolayer. - 유리 coverslips을 준비 (7 단계에서 칼슘 이미징에 대해 설명).
- 웜 GM, 0.05 % 트립신 -EDTA 및 PBS 37 ° C.
- 불임을 유지하기 위해 레벨 II 조직 배양 후드에서 다음 단계를 모두 수행하십시오.
- 1.5 mL 튜브에서 500 μL의 환원 된 혈청 배지, 3 μL의 형질 전환 시약 및 1 μL의 siRNA를 20 μM로 보내십시오. 부드럽게 혼합하고 실온 (RT)에서 15 ~ 20 분간 유지합니다.
- 이 부화 시간 동안, transfection에 대한 myoblasts를 준비합니다. PBS로 한 번 헹구어 준 후 3 분 동안 37 ℃에서 7 % CO 2 에서 0.05 % Trypsin-EDTA 1 mL로 부착 세포 (6-cm 플레이트에서)를 배양합니다. GM 2 mL를 첨가하여 반응을 멈추고 15 mL 튜브에 세포를 수집한다. 원심 분리 후 (200 xg, 5 분), GM 1 mL에 세포를 재현 탁한다.
- Neubauer 챔버를 사용하여 세포를 세십시오.
- 5 x 10 5 세포 재현각 transfection ( 즉, 2 transfections, 400 μL에 resuspend)에 대한 GM의 200 μL에서.
- siRNA - transfectant 혼합물의 각 500 μL에 세포 현탁액 200 μL를 추가합니다. 위아래로 두 번 피펫과 RT에서 5 분 품어.
- 유리 coverslip을 포함 3.5cm 문화 요리에 700 μL (세포 + siRNA - transfectant)를 추가합니다. 2 mL의 최종 부피를 얻기 위해 GM을 첨가하십시오.
- 37 ° C 및 7 % CO 2 에서 24 시간이 지난 후 배지를 완전히 신선한 GM 2 mL로 교체하십시오. 또 다른 24 시간 후, 형질 전환 된 세포의 합류 단층이 일반적으로 존재한다; 그렇다면 GM을 2 mL의 분화 배지 (DM; 표 1 )로 대체하여 myoblast 분화를 유도하십시오.
- 분화 유도 후 또는 근섬유를 증식시킨 후 24 - 48 시간 후에 칼슘 이미징 실험을 수행하십시오.
참고 : Immunofluorescence는 일반적으로 분화 유도 후 48 시간에 수행됩니다.
6. Imm분화 마커의 무 형광 형광 염색
참고 : Immunofluorescence 얼룩은 DM에서 48 시간 후에 수행되지만 다른 분화 시간에 수행 할 수도 있습니다. Myogenin과 MEF2는 분화 된 세포에서만 발현되는 핵 단백질로 (myotubes에 융합되기 전), 이들의 염색은 분화 과정을 평가할 수있게합니다. Myosin 중쇄 (MyHC)는 myotubes에서만 발현되며 myotube 크기와 융합 지수 (myotubes에서 핵의 수 / 총 핵의 수)를 추정하는 데 사용됩니다.
- 48 시간 후, RT에서 PBS 1 mL로 분화 된 세포의 합류 단층을 두 번 씻는다. myotubes를 분리하지 않도록주의 깊게하십시오.
- RT에서 15 분 동안 4 % paraformaldehyde (PFA) 1 ML로 세포를 고정. 5 분 각각 두 번 PBS로 세포를 씻으십시오.
- 45 분 동안 0.25 % 트리톤 X-100을 함유하는 PBS 1 mL로 세포를 투과시키고 PBS 1 mL로 3 회 세척한다.
- uns 블록RT에서 30 분 동안 0.2 % Tween-10 및 2 % 염소 혈청 (블록 용액)으로 보충 된 PBS에서 세포를 인큐베이션시킴으로써 비특이적 결합 부위를 제거 하였다.
- 블록 솔루션 (3.5cm 플레이트 당 600μL)으로 희석 한 기본 항체를 준비합니다.
참고 : 다음과 같은 기본 항체가 사용됩니다 : 마우스 anti-myogenin (1 : 600), 토끼 anti-MEF2 (1 : 300) 및 마우스 anti-MyHC 항체 (MF20, 1 : 1,000). 마우스 anti-myosin 중쇄 또는 마우스 anti-myogenin과 같은 차단 용액을 토끼 항 -MEF2와 혼합하는 것이 가능합니다. - 블록 솔루션을 제거하고 3.5cm 판 당 1 차 항체 용액 600 μL를 첨가하고 밤새도록 4 ℃에서 가온 처리하십시오.
- PBS 1 ML와 세포를 세 번 씻으십시오. 염소 안티 - 마우스 알렉사 488 (1 : 1,000), 염소 안티 - 토끼 알렉사 546 (1 : 1,000), 다음과 같이 블록 솔루션에서 준비 보조 항체 600 μL와 어두운 챔버에서 실온에서 1 시간 품어. 및 DAPI (1:50, 15 μM에서 스톡 용액).
CAUTION : DAPI는 장갑으로 처리해야하는 독성 화합물입니다. - 흡인하고 PBS 1 ML와 세포를 세 번 씻으십시오.
- 안티 유리 솔루션과 폴리 비닐 알코올 마운트 매체를 사용하여 유리 coverslips를 탑재. 4 ° C에 보관하고 세포를 영상화 할 때까지 빛으로부터 보호하십시오.
7. 칼슘 이미징
- 이전 문화, 직경 25mm 유리 coverslips를 준비합니다. 48 시간 동안 70 % 에탄올에 coverslips을 넣어 커버 슬립에 세포 준수를 줄이는 표면에서 기름과 먼지를 제거합니다.
- 물로 coverslips 여러 번 rinsing 후, 물에 다시 넣고 (autoclaved) 그들을 소독.
- 3.5cm 배양 플레이트 당 하나의 coverslip을 넣고 말리십시오. 더 많은 실험을 위해 페트리 접시를 보관하거나 즉시 사용하십시오.
- 유리 coverslip에 transfected myoblasts (5 - 6 X 10 5 세포)를 추가합니다.
참고 : 실험은 24 시간 - 48 시간 후에 수행됩니다.에, 또는 증식하는 myoblast에. - 칼슘 2 + 이미징을 수행하려면 실험에 사용되는 매체 (칼슘 함유 매체, 표 3 )와 PBS 또는 직접 매체로 세포를 두 번 씻으십시오. RT에서 어둠 속에서 약 30 분 동안 2 μM Fura-2 / AM plus 1 μM pluronic acid로 세포를 적재하십시오.
참고 : Pluronic acid는 Fura-2를 용해하는 데 도움이됩니다. Fura-2 / AM과 pluronic acid는 calcium-containing medium에 용해되어있다. - Fura-2 / AM 및 pluronic acid가없는 동일한 배지에서 두 번 세포를 씻고 Fura-2 / AM의 탈 에스테르 화를 고려하여 추가로 10 - 15 분간 어두운 곳에 두십시오.
- Fura-2의 적재 효율이 너무 낮 으면 Fura-2 ( 예 : 4 μM)를 추가하거나 세포를 더 오랫동안 ( 예 : 40 분) 배양하십시오.
- 배양 플레이트에서 coverslip을 제거하고 실험 챔버에 설치합니다. 칼슘 함유 배지 1 mL를 추가하십시오 (실험 물의 부피에 따라 다름)정신 챔버). 현미경 스테이지에 설치하고 녹음을 시작하십시오.
참고 : 형광 칼슘 2 + 감수성 프로브 Fura - 2는 340 nm와 380 nm에서 교대로 여기되며 방출 빛은 510 nm에서 수집됩니다. Ca 2+ 농도의 변동이 비교적 느리기 때문에 2 초마다 1 비율을 획득하십시오. - SOCE를 활성화하기 위해 다음과 같은 고전적인 thapsigargin / Ca 2+ 재 첨가 프로토콜을 사용합니다. 칼슘이 함유 된 배지에 2-3 분 동안 세포를 남겨 둡니다. 1-2 분 동안 칼슘이없는 배지로 배지를 교체하십시오.
- 1 μM thapsigargin을 첨가하여 내부 칼슘 저장고를 고갈시킵니다.
참고 : Thapsigargin은 세포질 소포체 Ca 2+ ATPase (SERCA) 펌프 활성의 돌이킬 수없는 차단제입니다 .8 - 10 분 후에는 신속하게 배지를 칼슘 함유 배지로 교체하십시오. Ca 2+ 는 SOCE 채널을 통해 세포에 들어갑니다. 실험을 종료하기 전에 약 5 분간 기다리십시오.
주의 : Thapsigargin은 장갑으로 처리해야하는 독성 화합물입니다.
- 1 μM thapsigargin을 첨가하여 내부 칼슘 저장고를 고갈시킵니다.
8. 칼슘 2+ 측정 분석
참고 : 수집 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행하십시오.
- 실험을 엽니 다. 세포 (배경 영역)가없는 영역에 영역 1을 그리고 분석 할 세포의 세포질에 다른 영역을 그립니다 (영역은 모든 이미지에서 그릴 수 있습니다 : 340 nm, 380 nm, 또는 비율 이미지). '실험 실행'> '참조 이미지'로 이동하십시오. 340 및 380 채널에서 "지역 1"을 선택한 다음 "배경 빼기"를 클릭하십시오.
- 백그라운드 영역을 통과하는 형광 분진과 같이 백그라운드 영역을 방해하지 않도록 실험 전체를 실행 (F4 : 앞으로)하고 실험 중에는 세포가 움직이지 않도록하십시오.
참고 : 선택한 관심 영역어두운 영역을 포함해서는 안됩니다. 그렇지 않으면 배경의 일부가 측정에 포함되므로 비율 값이 시끄 럽습니다. - '로그 데이터'를 클릭하고 전체 실험을 다시 재생하십시오.
참고 : 그러면 시간과 비율이 기록되는 스프레드 시트가 열립니다. 340nm 및 380nm 파장을 개별적으로 저장할 수도 있습니다. - SOCE에 관한 정보를 얻으려면 실험에서 두 가지 중요한 매개 변수 인 Ca 2+ 재 첨가의 진폭과 Ca 2+ 진입 단계의 기울기 ( 그림 3 )를 추출하십시오.
- 칼슘 2 + 상승의 최대 진폭에서 칼슘 2 + 다시 추가 직전의 비율 값을 빼서 진폭을 구하십시오. Ca 2+ 재 첨가 후 첫 번째 초의 선형 회귀 분석을 적용하여 최대 기울기를 얻습니다.
참고 : thapsigargin 반응의 곡선 아래 영역은 또한 extrac에 대한 유익한 매개 변수입니다그것은 SR에 저장된 자유 칼슘의 양을 반영하기 때문이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
인간 근육 샘플의 효소 해리 후, 세포는 GM에서 증폭되었다. CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- 세포로 정의 된 사람의 myoblasts는 FACS 후에 얻어졌다. Myoblast는 분석 된 인구의 60 % 이상을 차지했습니다 ( 그림 1 ). 일차 인간의 myoblasts는 재결합, 합류로 성장하고, DM에서 48 시간 동안 배양했다. 전사 인자 MEF2와 근육 특이 적 단백질 myosin heavy chain (MyHC)의 발현에 대한 면역 염색 후 융합 지수가 60.9 ± 1.3 % 인 세포가 대다수의 세포 에서 Myotubes in MyHC 양성 세포 (MyHC 양성 세포) (n = 5, 그림 2 ). 우리는 예비 세포라고 불리는 인간 근섬유의 약 40 %가이 말단 분화를 피하고 미분 화 단핵구 세포로 남아 있음을 관찰했다. 기능적 연구를 위해, 우리는 48 시간 후에 myoblast 또는 myotubes의 Ca 2+ 반응을 분석했다.분화. 그림 3 은 SOCE를 유도하는 데 사용 된 대표적인 프로토콜과 그러한 기록에서 추출 할 주요 매개 변수를 보여줍니다. SOCE에 관여하는 분자와 관련된 정보를 분별하기 위해 관심있는 분자에 대한 siRNA를 세포에 도입했다. 그림 4 는 근육 아세포에서 SOCE에 대한 TRPC 계열의 Ca 2+ 투과성 채널을 억제하는 효과를 보여줍니다.
그림 1 : 인간의 Myoblast의 FACS. 해리 된 인간 세포를 CD45, CD56, CD34, CD144 및 CD146에 대한 항체로 면역 염색 하였다. CD45 양성 조혈 세포를 배제 한 후, CD56 음성에 따라 CD45 음성 세포를 분리 하였다. 그런 다음 CD56 양성 집단을 CD34, CD144 및 CD146에 대해 문을 열었다. 인간의 myoblast는 CD56 + / CD146 + / CD45 - / CD34 - / CD144- 세포에, 이전 19 , 4에서 설명한대로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 인간의 Myoblast Differentiation. ( A ) 인간 myoblasts의 합류 monolayer는 48 시간 DM에 노출되었다; 결정된; 핵을 확인하기 위해 MEF2 (적색), MyHC (녹색) 및 DAPI (청색)에 대한 항체로 염색 하였다. 스케일 바 = 50 μm. ( B ) 융합 지수는 근관 내에 포함 된 핵의 수를 특정 분야의 총 핵으로 나눈 값을 나타낸다. 데이터는 5 번의 독립적 인 실험의 평균 ± SEM이다.ank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : Thapsigargin에 의한 SOCE의 대표적인 칼슘 측정. Myotubes는 Fura-2를 가지고 세포질 Ca 2+ 농도를 측정 하였다. ( A ) 칼슘이 함유 된 배지에 몇 분 동안 세포를 넣고 칼슘이없는 배지에 2 분 동안 넣는다. 1 μM thapsigargin을 8 분 동안 사용하고 칼슘 재 첨가를한다. 이러한 녹음에서 추출 할 수있는 3 가지 중요한 매개 변수는 aps시 가르 진 반응의 곡선 아래 영역, SOCE의 기울기 및 SOCE의 진폭입니다. ( B ) 3 매개 변수의 부량. 커브 아래의 영역은 ER / SR에 저장된 Ca 2+ 의 양에 대한 정보를 제공하며 두 개의 다른 매개 변수는 정량SOCE의 동의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : TRPC1과 TRPC4의 SOCE 참여. ( A ) siTRPC1 또는 siTRPC1 및 siTRPC4로 형질 감염된 증식 성 근육 아세포에서 Fura-2를 사용하여 세포질 Ca 2+ 농도를 평가 하였다. SOCE는 외부 Ca 2+ (Ca 2+가 없는)가 없을 때 1μM 텝시 가르 긴으로 내부 저장 고갈에 의해 유발되었고 2mM 외부 Ca 2+ 의 재 첨가 중에 측정되었다. 각 추적은 대표적인 coverslip의 평균을 나타냅니다. ( B ) SOCE 진폭에 siRNA의 영향의 부량. 이 수치는 허가를 얻어 참조 번호 12 에서 수정되었습니다. 바 ar e mean ± SEM, * p <0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 성장 매체 (GM) : | 집중 | 분화 배지 (DM) : | 집중 | |||||
| 햄의 F10 | DMEM | |||||||
| FCS | 15 % | 소 혈청 알부민 | 0.5 mg / ml | |||||
| 소 혈청 알부민 | 0.5 mg / ml | 표피 성장 인자 | 10 ng / ml 초과||||||
| 페튜 인 | 0.5 mg / ml | 인슐린 | 0.01 mg / ml | |||||
| 표피 성장 인자 | 10 ng / ml | 크레아틴 | 1 mM | |||||
| 덱사메타손 | 0.39 μg / ml | 피루 베이트 | 100 μg / ml | |||||
| 인슐린 | 0.04 mg / ml | 우리 딘 | 50 ㎍ / ml | |||||
| 크레아틴 | 1 mM | 겐타 마이신 | 10 ㎍ / ml | |||||
| 피루 베이트 | 100 μg / ml | <td colspan = "2"> | ||||||
| 우리 딘 | 50 ㎍ / ml | |||||||
| 겐타 마이신 | 5 ㎍ / ml | |||||||
도표 1 : Myoblast 문화를위한 매체 구성.
| 튜브 | 항체 | |||||
| 1 | 없음 | |||||
| 2 | Isotype AlexaFluor 488-, Isotype PE-CF594, Isotype PE, Isotype PECy7Isotype APC | |||||
| 삼 | 마우스 항 - 인간 CD56-AlexaFluor 488 | |||||
| 4 | 마우스 방지- 인간 CD45 PE-CF594 | |||||
| 5 | 마우스 항 - 인간 CD144-PE | |||||
| 6 | 마우스 항 - 인간 CD146-PECy7 | |||||
| 7 | 마우스 항 - 인간 CD34-APC | |||||
| 8 | 마우스 항 - 인간 CD56-AlexaFluor 488-, 마우스 항 - 인간 CD45 PE-CF594, 마우스 항 - 인간 CD144-PE, 마우스 항 - 인간 CD34-APC, 마우스 항 - 인간 CD146-PECy7 | |||||
도표 2 : 세포 분류를 위해 사용되는 항체.
| 칼슘 - 함유 매질 | 집중 | 칼슘이 함유되지 않은 배지 | 집중 | |||||
| NaCl | NaCl | 135 mM | ||||||
| KCl | 5 mM | KCl | 5 mM | |||||
| MgCl2 | 1 mM | MgCl2 | 1 mM | |||||
| CaCl2 | 2 mM | EGTA | 1 mM | |||||
| Hepes | 10 mM | Hepes | 10 mM | |||||
| 포도당 | 10 mM | 포도당 | 10 mM | |||||
| NaOH로 pH 7.45로 조정 | NaOH로 pH 7.45로 조정 | |||||||
표 3 : 칼슘 이미징 실험을위한 중간 조성.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
성체 골격근으로부터의 인간 myoblasts의 분리 및 배양은 근육 분화 및 근육 재생을 연구하는 in vitro 모델을 제공합니다. 이 논문에서, 우리는 간단하고 비용 - 제한된 방식으로 인간 myoblasts의 높은 수율의 정화를 허용 프로토콜을 제공합니다. 또한,이 기술은 고립 된 myoblasts의 비율과 myogenic 차별화의 효율성 측면에서 신뢰성과 재현성 결과를 제공합니다. 사실, 우리는 세포 정렬 후 인간 myoblasts의 약 60 %를 얻었다. 이 세포는 최대 6 계통 (약 30 배)의 배양 조건에서 유지되고 차별화 된 능력을 유지할 수 있습니다. 또한 DM에서 2 ~ 3 일 후에 myoblast 융합이 최대가되어 GM에서 DM으로 배지를 바꾸면 근원적 인 분화가 빠르게 일어난다. 이 모델에서 DM의 2 일 후에 myoblasts의 약 60 %가 myotubes 안으로 융합됩니다. 또 다른 이점은 이들 1 차 사람 세포l 배양은 siRNA로 쉽게 형질 감염됩니다. 우리 실험실에서 사용 된 GM 및 DM 매체는 수 제입니다. 또는 상업적 매체를 사용할 수도 있지만, 인간의 일차 배양에서 결코 효율성을 시험하지 않았습니다.
언급 된 방법의 한 가지 단점은 조직 효소 소화 동안 트립신의 사용이다. 이 절차는 세포 표면 마커의 큰 부분을 제거하고 우리가 FACS를 수행하기 전에 문화에 세포를 몇 일 동안두고 의미합니다. Collagenase는 막 단백질을 더 잘 보존하고 조직 해리 직후 인간 myoblast를 분류 할 수 있도록 트립신 대신 사용할 수 있습니다. 그러나, 콜라게나 제의 비용은 트립신보다 현저히 높으며, 후속 실험을위한 충분한 세포 수를 얻기 위해 세포 분류 후에 여전히 증폭 단계가 필요할 것이다. 이 기법의 또 다른 한계는 orthoped에서 얻은 근육 샘플의 "품질"입니다IC 수술. 실제로 얻은 조직 조각은 수술로 인해 다소 손상 될 수 있으며 실험실에서 수술과 세포 해리 사이의 시간은 날마다 달라질 수 있습니다. 그러나 myoblast 분리, 정제 및 myotubes 로의 분화를 위해 우리는 일상적으로 만족스러운 결과를 얻습니다. 마지막으로, 위성 세포의 양과 재생 능력이 20 세에 감소함에 따라 환자의 나이가 문제가 될 수 있습니다. 따라서 우리는 40 세 미만의 젊은 환자에게 실험을 제한합니다.
언급 한 바와 같이, myoblasts는 신속하고 효율적으로 차별화됩니다. 이는 골격근 분화의 초기 사건을 연구하는 큰 이점입니다. 그러나, myotubes가 급속하게 형성됨에 따라, 그들은 또한 자발적으로 수축하고 문화 플레이트에서 분리되는 경향이 있습니다. 이것은 이후의 융합 사건의 분석을 배제한다. 이 사건들을 연구하기 위해,세포 부착을 개선하고 근관 분리를 줄이기 위해 세포 외 기질로 배양 플레이트를 코팅하는 것 21 .
형광 프로브 Fura-2를 사용하는 칼슘 이미징은 널리 사용되는 재현 가능한 기술로 수행하기 쉽습니다. Fura-2의 탑재는 효율적이며, Fura-2와 같은 비율 측정 프로브의 사용은 단일 파장 염료에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 초점 변화 또는 세포 내 및 세포 내 부하 ( 예 : 핵 대 세포질)의 차이를 표준화합니다. SOCE를 도출하고 측정하기 위해 설명한 프로토콜은 여러 다른 셀룰러 시스템에서 정기적으로 사용됩니다. 서로 다른 채널이나 칼슘 조절제의 침묵은 SOCE의 분자 구성과 근육 세포와 근육 세포 모두에서 서로 다른 플레이어의 상대적 중요성을 해명 할 수있게합니다. Fura-2와 Ca 2+ 영상을 이용한 다른 접근법은Mn 2+ 급냉 기술. Mn 2+ 는 Ca 2+ 투과성 채널을 통해 세포로 들어가고 fura-2 형광을 차단합니다. 담금질 비율의 측정은 SOCE 22 , 23 의보다 직접적인 척도를 제공합니다. 그러나 이것은 약간 다른 장비를 사용해야합니다. Ca 2+ 시그널링은 유 전적으로 암호화 된 Ca 2+ 지시약을 사용하여 수행 할 수도 있는데, 이는 서로 다른 세포 구획에 정확하게 국한된다는 큰 이점이 있습니다. 단점은 일반적으로 화학 염료 24 보다 적은 세포 형질 감염 및 신호의 역학에 대한 요구 사항입니다. 미토콘드리아 또는 SR과 같은 세포 소기관에서 Ca 2+ 를 측정하기 위해 유전자 프로브가 금본위 제입니다. 그러나, cytosolic 칼슘 2 + 측정, 유전 프로브를 통해 Fura - 2를 사용하는 이점이 남아 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (부여 번호 310030-166313), "Fondation Suisse la recherche sur les les maladies musculaires", "Foundation Marcel Levaillant"및 "Fondation pour la recherche ostéo articulaire"에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 mL tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 mL tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 mL tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. |
References
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
- Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
- Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
- Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
- Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
- Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
- Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
- Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
- Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
- Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
- Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
- Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
- Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
- Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
- Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
- Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).
