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Developmental Biology

मानव माइॉब्लास्ट्स अलगाव, मायाजक विभेदन का आकलन और स्टोर-संचालित कैल्शियम एंट्री मापन

Published: July 26, 2017 doi: 10.3791/55918
Automatic Translation
*1, *2, 2,3, 3
1Department of Orthopedic Surgery, Geneva University Hospitals & Faculty of Medicine, 2Department of Basic Neurosciences, Geneva Medical Center, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Geneva Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम वयस्क मांसपेशियों के ऊतकों से मानव म्यॉब्लास्ट की शुद्ध जनसंख्या प्राप्त करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करते हैं। इन कोशिकाओं का उपयोग इन विट्रो कंकाल की मांसपेशी विभेद में अध्ययन करने के लिए किया जाता है, और विशेषकर, सीए 2+ सिग्नलिंग में शामिल प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए।

Abstract

उपग्रह कोशिकाएं (एससी) मांसपेशी तंतुओं के प्लाज्मा झिल्ली के बीच स्थित मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं और आसपास के बेसल लैमिना हैं। वे मांसपेशियों के उत्थान के लिए आवश्यक हैं चोट पर, जो कंकाल की मांसपेशियों में अक्सर होता है, अनुसूचित जाति सक्रिय होते हैं। वे म्यॉब्लास्ट के रूप में फैल जाते हैं और मांसपेशियों के घावों की मरम्मत के लिए अंतर करते हैं। मांसपेशियों के भेदभाव के दौरान होने वाली कई घटनाओं में, साइटोसोलिक सीए 2 + सिग्नल बहुत महत्वपूर्ण हैं। इन सीए 2 + सिग्नल सीए 2+ से आंतरिक सीए -2+ स्टोर्स से रिलीज हो सकते हैं, साथ ही बाह्य अंतरिक्ष से सीए 2+ एंट्री से, विशेष रूप से दुकान संचालित सीए 2 + एंट्री (एसओसीई) से उठता है। यह पेपर अस्थि-चिकित्सा सर्जरी के बाद एकत्र हुए मांसपेशियों के नमूनों से मानव मैबोलास्ट की शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली एक पद्धति का वर्णन करता है। ऊतक यंत्रवत् और एंजाइमिक रूप से पच जाता है, और कोशिकाओं को विस्तारित किया जाता है और फिर विशिष्टता की उपस्थिति के अनुसार प्रवाह cytometry द्वारा क्रमबद्ध किया जाता हैफिक झिल्ली मार्कर एक बार प्राप्त होने पर, संस्कृति के माध्यम से विकास के कारकों को हटाकर मानव म्यॉब्लास्ट का विस्तार किया जाता है और विभेद करने के लिए प्रतिबद्ध है। विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों और इन विट्रो इम्युनोफ्लोरेसेंस के अभिव्यक्ति के स्तर का उपयोग नियंत्रण परिस्थितियों में मायोजेनिक भेदभाव प्रक्रिया का आकलन करने के लिए किया जाता है और सीए 2+ सिग्नलिंग में शामिल होने वाले प्रोलीन प्रोटीन के बाद किया जाता है। अंत में, हम फ्यूरा -2 के उपयोग को रातिओमेट्रिक सीए 2+ जांच के रूप में विस्तारित करते हैं जो SOCE के विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप प्रदान करता है।

Introduction

मानव कंक्रीट की मांसपेशियों में संक्रमित समूहों के समूह होते हैं, बहु-केन्द्रित मांसपेशियों के फाइबर्स जिसके परिणामस्वरूप मायोजेनिक पूर्ववर्ती कोशिकाओं के संलयन होते हैं। कंकाल की मांसपेशियों में अनुसूचित जाति की मौजूदगी के लिए चोट के बाद पुनर्जन्म होने की क्षमता है, कंफ़्टरल पेशी स्टेम कोशिकाएं जो मायोफिबर (सरकोलेमा) और बेसल लैमिना के प्लाज्मा झिल्ली के बीच स्थित होती हैं। निर्जीव मांसपेशी में, अनुसूचित जातियों ज्यादातर मौन राज्य में मौजूद हैं। यांत्रिक तनाव या चोट के जवाब में, अनुसूचित जातियों को सक्रिय (मायोब्लास्ट) बन जाते हैं, पैदा होते हैं, और एसआईसी पूल 1 , 2 को फिर से भरने के लिए नए मायोफिबर या आत्म-नवीकरण करने के लिए भेदभाव से गुजरती हैं। इन वर्षों में, अनुसूचित जातियों और उनकी संतान, म्यॉब्लास्ट को कंकाल की मांसपेशी बायोप्सी से अलग करने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया था। कोशिका की सतह के मार्करों की अधिक समझ के साथ इन कोशिकाओं और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) 3 की पद्धति पर व्यक्त की गई, 4 , 5 , अब मांसपेशियों के नमूनों से मानव म्यॉब्लास्ट की शुद्ध आबादी को अलग करना संभव है।

कैल्शियम सिग्नलिंग कंकाल की मांसपेशियों के विकास, होमोस्टैसिस और पुनर्जनन को नियंत्रित करती है। विशेष रूप से, सीए 2 + एंट्री जो इंट्रासेल्युलर स्टोर कम करने के बाद सक्रिय होती है, जिसे एसओसीई कहा जाता है, इन प्रक्रियाओं के लिए बहुत महत्व 6 है। सेल उत्तेजना पर, एंडो / सर्पोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर / एसआर) में सीए 2 + स्तर कम हो जाता है, जो बदले में प्लाज्मा झिल्ली सीए 2 + चैनल सक्रिय करता है जो ईआर / एसआर 7 को फिर से भरने के लिए Ca 2+ एंट्री की अनुमति देता है। एसओसीई में शामिल दो मुख्य प्रोटीन ईआर / एसआर सीए 2+ हैं - स्ट्रॉमल इंटरैक्शन अणु 1 (एसटीआईएम 1) प्रोटीन और प्लाज्मा झिल्ली सीए 2 + चैनल ओराई 1। कंकाल की मांसपेशियों में इन दोनों प्रोटीन, साथ ही एक ही परिवार के अन्य प्रोटीन (एसटीआईएम 2 एएनडी ओराई 2-ओराई 3) 8 , 9 और कई सीए 2+ -अभिव्यक रिसेप्टर संभावित कैनोनिकल (टीआरपीसी) परिवार 10 , 11 , 12 , 13 के पारगम्य चैनल। एसओईई मार्ग के माध्यम से सीए 2+ एंट्री मांसपेशियों के गठन / उत्थान 14 के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। एसटीआईएम 1 या ओराई 1 प्रोटीन का म्यूटेशन मांसपेशी समारोह पर हानिकारक प्रभाव है, मुख्य रूप से पेशी हाइपोटोनिया 15 के लिए अग्रणी है। एसओसीई हानि के साथ पशु मॉडल भी मांसपेशियों और बल को कम करते हैं, साथ में बढ़ी हुई थकावट 6 , 16 , 17 के साथ । जैसा कि उल्लेख किया गया है, अन्य एसटीआईएम और ओराई प्रोटीन, साथ ही साथ कई टीआरपीसी चैनल, कंकाल की मांसपेशी में व्यक्त हैं, और उनकी भूमिकाएं अब तक निर्धारित नहीं की गई हैं। घ दस्तक करकेअपनी अभिव्यक्ति के स्तर का मालिक है, इसलिए एसओसीई में उनके निहितार्थ की जांच करना संभव है और मानवीय कंकाल की मांसपेशियों के भेदभाव के दौरान उनकी भूमिकाएं हैं।

एसईसीई माप दो अलग-अलग दृष्टिकोणों का उपयोग कर किया जा सकता है: इलेक्ट्रोफिज़ियोलॉजिकल वर्तमान रिकॉर्डिंग और सीए 2+ मापन। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी निश्चित रूप से एक अधिक प्रत्यक्ष पद्धति है, क्योंकि यह ब्याज की वर्तमान और उसके संबंधित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल हस्ताक्षर को मापता है। हालांकि, मांसपेशियों की कोशिकाओं पर इस तकनीक को लागू करना बहुत मुश्किल है, मुख्य रूप से मांसपेशी कोशिकाओं के बड़े आकार और अंतर्जात SOCE वर्तमान के छोटे आकार के कारण। साइटोसोलिक सीए 2 + इमेजिंग तकनीकी रूप से बहुत पहुँचा जा सकता है, लेकिन उपाय, अधिक अप्रत्यक्ष है के रूप में सीए 2 + स्तर साइटोसोल में मापा दोनों सीए के प्रवेश 2 + और फिर से पम्पिंग सेल से बाहर या आंतरिक दुकानों में दर्शाता है।

एक कार्यप्रणाली जिसमें मायब्ल्लास्ट्स को मानव स्केले के छोटे टुकड़ों से अलग करना शामिल हैइस पत्र में एंजाइमिक पाचन, प्रवर्धन, और एफएसीएस के बाद एटियल मांसपेशियों को समझाया गया है। समय के साथ भेदभाव के मार्करों की अभिव्यक्ति का पालन करने के लिए मांसपेशियों के भेदभाव की प्रक्रिया और इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल 18 को वर्णित किया गया है। अंत में, एसओईसी की माप और सीए 2+ सिग्नलिंग और कंकाल की मांसपेशी विभेद में अलग-अलग आयन चैनलों की भूमिका को समझाया गया है।

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Protocol

मानव मांसपेशियों के नमूनों (अर्धसैनिक मांसपेशियों से प्राप्त ऊतक) स्वस्थ रोगियों के दौरान आर्थोपेडिक सर्जरी के दौरान सर्जिकल कचरे के रूप में एकत्र किए गए थे। मानव अध्ययन से जुड़े सभी तरीकों स्विस विनियामक स्वास्थ्य प्राधिकरणों के दिशानिर्देशों और नियमों के अनुरूप प्रदर्शन किए गए थे और स्विट्जरलैंड (प्रोटोकॉल सीईआर नं। 12-259) से जिनेवा कैन्टोनल प्राधिकारियों से आयोग के कैंटोनले डी एथिक डी ला रिकशे ने अनुमोदित किया था। । अध्ययन में शामिल सभी वयस्क विषयों से ज्ञात और लिखित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. मानव स्केलेटल स्नायु से मायोबलास्ट्स का अलगाव

  1. सभी प्रक्रियाओं के दौरान, स्तर द्वितीय टिशू कल्चर हुड के तहत काम करके और बाँझ मध्यम और बाँझ बफरों का उपयोग करके बाँझ शर्तों को बनाए रखें।
    नोट: यह प्रक्रिया कई मानव कंकाल की मांसपेशियों पर लागू की जा सकती है

2. पृथक्करण प्रोटोकॉल

  1. एक बाँझ 6 सेमी में मांसपेशियों के नमूनों (2-3 ग्राम) को स्थानांतरित करेंप्लेट।
  2. मांसपेशियों के नमूनों को 5 - 10 एमएल फॉस्फेट बुफ़र खारा (पीबीएस) के साथ धो लें। धोने को दोहराएं
  3. घुमावदार कैंची और क्लैंप का उपयोग कर संयोजी और वसा ऊतकों को निकालें
  4. मांसपेशियों के नमूने का वजन (चरण 2.13 देखें) और इसे एक नए बाँझ 6 सेमी प्लेट में स्थानांतरित करें
  5. 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 5 एमएल जोड़ें।
  6. कैंची का उपयोग करना, मांसपेशियों के ऊतकों को छोटे टुकड़ों (कम से कम 2 मिमी) में काटकर कम करें।
  7. 10 मिलीलीटर सीरॉलॉजिकल पिपेट का उपयोग करना, एक चुंबकीय बार वाली 200 मिलीलीटर विस्थापन की बोतल में कीमा बनाया हुआ मांसपेशियों को स्थानांतरित करें। 0.05% की 90 एमएल तक ट्रिप्सिन-ईडीटीए को सभी नायाब मांसपेशियों को पृथक्करण बॉक्स में स्थानांतरित कर दिया गया है जब तक इस चरण को दोहराएं। विघटन की बोतल बंद करें और हल्के आंदोलन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट तक का सेवन करें।
  8. पृथक्करण की बोतल हीटिंग स्नान से निकालें और भ्रूण की बोतल के 10 मिलीलीटर भ्रूण के बछड़े सीरम (एफसीएस; 10% अंतिम मात्रा) जोड़कर एंजाइमी प्रतिक्रिया को रोकें। एक विंदुक के साथ मिश्रण homogenize।
  9. प्रस्तुत करने काप्रत्येक पर 70 माइक्रोन सेल झरनी के साथ दो 50 एमएल ट्यूब हैं निलंबन के माध्यम से गुजरता है जब तक फिल्टर पर ऊपर और नीचे pipetting द्वारा प्रत्येक ट्यूब पर सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन का आधा पास।
  10. ट्यूबों को 200 x ग्राम और 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट तक अपकेंद्रित्र करें; Aspirate और सतह पर तैरनेवाला त्यागें
  11. 10 मिलीलीटर वृद्धि माध्यम (जीएम, तालिका 1 ) के साथ कोशिकाओं को फिर से खोलें और एक 50 एमएल ट्यूब पर रखे गए 40-माइक्रोन सेल स्ट्रेनर के माध्यम से कोशिकाओं को पास करें। ट्यूब 200 मीटर और 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र; Aspirate और सतह पर तैरनेवाला त्यागें
  12. 10 एमएल जीएम के साथ कोशिकाओं को फिर से खोलें और ट्यूब को 200 X जी और 5 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब दें; Aspirate और सतह पर तैरनेवाला त्यागें
  13. 1 एमएल जीएम के साथ कोशिकाओं को फिर से खोलें और एक Neubauer चैंबर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट: आम तौर पर, 3 x 10 5 कोशिका प्रति ग्राम मांसपेशी की उपज कटाई करनी चाहिए। मांस की मांसपेशियों के वजन से कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करके उपज की गणना की जाती हैSy (चरण 2.4)।
  14. 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं को बाँझ 6 सेमी की प्लेट में रखें जिसमें 4 एमएल जीएम शामिल है और 37 डिग्री सेल्सियस और 7% सीओ 2 पर सेते हैं। आवश्यक के रूप में कई प्लेटें तैयार करें
  15. 3 दिनों के बाद जीएम बदलें।
    नोट: हौसले से पृथक कोशिकाओं को संस्कृति प्लेट का पालन करने के लिए समय की जरूरत है। इसके अलावा, पहला मैयोजेनिक सेल दोहरीकरण का समय लगभग 50 - 60 घंटे है। प्रथम विभाजन के बाद, दोहरीकरण का समय लगभग 20 घंटे है।
  16. 5-7 दिनों के बाद, जब कोशिकाओं 70- 80% संगम (करीब 1.5 x 10 6 कोशिकाओं / प्रति 6 सेमी प्लेट) तक पहुंचें, एंटीबॉडी धुंधला हो और सेल सॉर्टिंग (चरण 3) शुरू करें।

3. एंटीबॉडी स्टीनिंग और सेल सॉर्टिंग

  1. पीबीएस के साथ एक बार धोने के बाद, 3 मिनट के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.05% ट्रिप्सिन- EDTA के 1 एमएल के साथ पक्षपाती कोशिकाओं (6 सेमी थाली में) सेते हैं और 7% (या 5% सीओ पर सेते हैं 2)। जीएम के 2 एमएल जोड़कर प्रतिक्रिया रोकें और 15 एमएल ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करें। सेंटीफ्यूगेशन के बाद (200 मिनट के लिए 5 मिनट), रेसजीएम के 1 एमएल में कोशिकाओं का उपयोग करें
  2. एक Neubauer कक्ष का उपयोग कर कक्षों की गणना करें
  3. बर्फ पर निम्नलिखित प्रक्रियाएं करें
    नोट: साइटोमीटर पर सही प्रतिदीप्ति मुआवजा स्थापित करने की प्रक्रिया जरूरी है और किसी भी साइटोमीटर के समान होनी चाहिए। ट्यूब 1 और 2 को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है ट्यूब्स 3 - 7 का इस्तेमाल पहले प्रयोग ( तालिका 2 ) के दौरान cytometer पर मुआवजे लगाने के लिए किया जाता है। प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए इस्तेमाल की जाने वाली अंतिम एकाग्रता और इसके संबंधित आकृति का आकार समान होना चाहिए (लगभग 1 माइक्रोग्राम / 10 6 कोशिकाओं)।
  4. ट्यूब 1 के लिए 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं प्रति ट्यूब (5-एमएल ट्यूब) डिस्पैच 1-7 ( टेबल 2 )। सेल सॉर्टिंग के लिए ट्यूब 8 में शेष सेल निलंबन रखें।
  5. 1 एमएल शीत एफएसीएस बफर (पीबीएस -5% एफसीएस) वाले कोशिकाओं को धो लें। करीब 200 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों को बंद और अपकेंद्रित करें; Aspirate और सतह पर तैरनेवाला त्यागें
  6. एफएसीएस बफर प्रति ट्यूब 200 μL जोड़ें। प्रति एंटीबॉडी जोड़ेंतालिका 2 के अनुसार ई ट्यूब 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं
  7. कोशिकाओं को धो लें: प्रत्येक ट्यूब में एफएसीएस बफर के 1 एमएल जोड़ें। करीब 200 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों को बंद करें और अपकेंद्रित करें आकांक्षा और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। इस चरण को दोबारा दोहराएं।
  8. 500 μL एफएसीएस बफर में कोशिकाओं को फिर से खोलें। ट्यूबों को बंद करें और उन्हें सेल सॉर्टिंग तक बर्फ पर रखें। 1.5 एमएल के 4 ट्यूबों को तैयार करें, जिसमें प्रत्येक 500 ग्राम जीएम होता है, जो सेल सॉर्टिंग के दौरान कोशिकाओं को एकत्र करने के लिए आवश्यक है। उन्हें बर्फ पर रखें
  9. फ्लो साइमेट्रेट्री द्वारा मानव माइॉब्लास्ट को क्रमबद्ध करें ( चित्रा 1 )। CD45-पॉजिटिव हेमटोपोएटिक कोशिकाओं को छोड़ने के बाद, CD56 अभिव्यक्ति पर आधारित अलग CD45- नकारात्मक कोशिकाएं। उसके बाद, सीडी 434, सीडी 144 और सीडी 146 (मानव माइबोलास्ट को सीडी 56 + / सीडी 146 + / सीडी 45- / सीडी 34- / सीडी 144-कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया है) के लिए सीडी 56-पॉजिटिव आबादी गेट। पवित्रता की जांच करने के लिए सॉर्ट किए गए सेल आबादी का एक छोटा सा अंश रीनलाइज़ करें
  10. मानव मेओबाला युक्त ट्यूबों को पूल करेंएक 15 एमएल ट्यूब में एसटीएस और 5 एमएल जीएम जोड़कर एक बार धोएं। ट्यूब 200 मीटर और 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र; Aspirate और सतह पर तैरनेवाला त्यागें
  11. जीएम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खोलें और 4 एमएल जीएम (प्लेट प्रति 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं) युक्त एक uncoated 6 सेमी की थाली पर कोशिकाओं को थाली। 37 डिग्री सेल्सियस और 7% सीओ 2 में सेते हैं

4. सेल रखरखाव

  1. हर 2 दिन संस्कृति माध्यम के आधे में बदलाव करें। संस्कृति डिश के 2 एमएल पुराने जीएम को निकालें और 2 एमएल जीएम जोड़ें।
    नोट: मैओब्ल्लास्ट्स उन विकास कारकों का उत्पादन करती हैं जो संस्कृति की स्थितियों के लिए फायदेमंद होते हैं।
  2. पूर्व भेदभाव से बचने के लिए 70 से 80% संगम तक पहुंचने पर कोशिकाओं की कोशिशें करें। पीबीएस के साथ एक बार धोने के बाद, अनुयायी कोशिकाओं (6 सेमी की प्लेट में) 0.05% की 1 एमएल के साथ ट्रिप्सिन-ईडीटीए 37 डिग्री सेल्सियस और 3 मिनट के लिए 7% सीओ 2 से लें। जीएम के 2 एमएल जोड़कर प्रतिक्रिया रोकें और 15 एमएल ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करें। सेंटीफ्यूगेशन के बाद (200 मिनट के लिए 5 मिनट), रेससजीएम के 1 एमएल में कोशिकाओं को पेंड करें
  3. कोशिकाओं की गणना करें और 4 एमएल जीएम में प्लेट में प्रति 2 x 10 5 कोशिकाओं के साथ 6 सेमी प्लेटें तैयार करें।
  4. मानव मैबोलास्ट को 6 मार्गों तक रखें या उन्हें जीएम में 10% डीएमएसओ, 1 एक्स 10 6 एमएल प्रति कोशिकाओं में फ्रीज करें। एक प्रगतिशील ठंड बॉक्स (1 डिग्री सेल्सियस / मिनट) में कोशिकाओं को रुकें; दीर्घकालिक भंडारण के लिए, तरल नाइट्रोजन में कोशिकाओं को रखें।

5. siRNA के साथ मानव माइॉब्लास्ट के अभिकर्मक

नोट: भेदभाव को शामिल करने से दो दिनों पहले वाणिज्यिक अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग करके माइबोलास्ट ट्रांसफ़ेक्ट किया गया है। जीन के खिलाफ विशिष्ट एसएआरएनए का असर हमेशा एक नियंत्रण सीआरएनए के प्रभाव की तुलना में होता है। सीआईआरएनए डबल फंसे हुए आरएनए हैं जिन्हें बर्फ पर रखा जाना चाहिए और दस्ताने के साथ हेरफेर करना चाहिए।

  1. एक 6-सेमी प्लेट (लगभग 1.5 x 10 6 कोशिकाओं) में मानव माइॉब्लास्ट के एक 70-80% मिला हुआ मोनोलाइर प्राप्त करें।
    नोट: 5 एक्स 10 5 अभिकर्मक प्रति कोशिकाओं को एक चोर मिलाने के लिए आवश्यक हैंजीएम में 2 दिनों के बाद ट्रांसफ़ेक्टेड मायोबलास्ट्स के धाराप्रवाह मोनोलायर
  2. कांच के कवरलेट तैयार करें (चरण 7 में कैल्शियम इमेजिंग के लिए वर्णित है)।
  3. गर्म जीएम, 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए, और पीबीएस से 37 डिग्री सेल्सियस
  4. बाँझपन बनाए रखने के लिए एक स्तर II टिशू कल्चर हुड में सभी निम्न चरणों का पालन करें।
  5. 1.5-एमएल ट्यूब में, 500 μL कम सीरम मध्यम, अभिकर्मक अभिकर्मक के 3 μL, और 20 माइक्रोन में सीआरएनए के 1 μL प्रेषित करें। धीरे से मिलाएं और कमरे के तापमान (आरटी) में 15-20 मिनट के लिए रखें।
  6. इस ऊष्मायन समय के दौरान, अभिकर्मक के लिए म्यॉब्लास्ट तैयार करें। पीबीएस के साथ एक बार धोने के बाद, अनुयायी कोशिकाओं (6 सेमी की प्लेट में) 0.05% की 1 एमएल के साथ ट्रिप्सिन-ईडीटीए 37 डिग्री सेल्सियस और 3 मिनट के लिए 7% सीओ 2 से लें। जीएम के 2 एमएल जोड़कर प्रतिक्रिया रोकें और 15 एमएल ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करें। सेंटीफ्यूगेशन (5 मिनट के लिए 200 xg) के बाद, जीएम के 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: resuspend
  7. एक Neubauer कक्ष का उपयोग कर कक्षों की गणना करें
  8. Resuspend 5 एक्स 10 5 कोशिकाओंप्रत्येक अभिकर्मक के लिए जीएम के 200 μL में ( यानी, 2 संक्रमण के लिए, 400 μL में resuspend)
  9. प्रत्येक 500 μL siRNA- ट्रांसफ़ेक्टेंट मिश्रण के लिए सेल निलंबन के 200 μL जोड़ें। दो बार पिपेट करें और आरटी पर 5 मिनट के लिए लें।
  10. 700 μL (कोशिकाओं + सीआरएनए-ट्रांसपेक्टेन्ट) को एक 3.5 सेमी कल्चर डिश में जोड़ें, जिसमें एक गिलास कसलीप है। 2 एमएल की अंतिम मात्रा पाने के लिए जीएम जोड़ें
  11. 37 डिग्री सेल्सियस और 7% सीओ 2 में 24 घंटे के बाद, पूरी तरह से 2 जीएल की ताजा जीएम के साथ मध्यम की जगह। एक और 24 घंटे के बाद, ट्रांसफ़ेक्टेड कोशिकाओं का मिला हुआ मोनोलाइयर आम तौर पर मौजूद होता है; यदि हां, तो जीएम को भेदभाव माध्यम (डीएम, 1 टेबल ) के 2 एमएल के स्थान पर स्थानांतरित करके माइनोब्लास्ट भेदभाव को प्रेरित करें।
  12. कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों को 24 - 48 घंटे के भेदभाव को शामिल करने के बाद या माईबोलास्ट को फैलाने पर
    नोट: भेदभाव को शामिल करने के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस आमतौर पर 48 घंटे किया जाता है

6. Immविभेदक मार्करों की अनोफ्लोरेसन्स स्टेंसिंग

नोट: डीएम में 48 घंटे के बाद immunofluorescence धुंधला किया जाता है, लेकिन यह अन्य भेदभाव के समय भी किया जा सकता है। मायोजेन और एमईएफ 2 ही विभेदित कोशिकाओं (माइोट्यूब में संलयन से पहले) में व्यक्त होने वाले परमाणु प्रोटीन होते हैं, और उनके धुंधलापन भेदभाव प्रक्रिया के आकलन के लिए अनुमति देता है मायोसिन भारी श्रृंखला (मायएचसी) केवल मैयोट्यूब में व्यक्त की जाती है और इसका उपयोग मायोट्यूब आकार और फ्यूजन इंडेक्स (माइोट्यूब / न्युक्लीय की कुल संख्या में न्यूक्ली की संख्या) के अनुमान के लिए किया जाता है।

  1. डीएम में 48 घंटे के बाद, विभेदित कोशिकाओं के मिला हुआ मोनोलायर को आरटी पर 1 एमएल पीबीएस पर दो बार धोएं। मैट्यूब्यूब को अलग करने से बचने के लिए इसे ध्यान से रखें
  2. आरटी पर 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्माल्डहाइड (पीएफए) के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें 5 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  3. 45 एमबी के लिए 0.25% ट्राइटन एक्स-100 वाले पीबीएस युक्त 1 एमएल युक्त कोशिकाओं को स्थिर करें और 1 एमएल पीबीएस के साथ 3 बार धो लें।
  4. अनस ब्लॉक करेंपीबीएस में कोशिकाओं को 0.2% ट्यूइन -10 और 2% बकरी सीरम (ब्लॉक समाधान) के आरटी पर 30 मिनट के लिए पूरक के साथ अभेद्य बाध्यकारी साइटें।
  5. ब्लॉक समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें (600 μL प्रति 3.5-सेमी प्लेट)।
    नोट: निम्न प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है: माउस एंटी-मायोजेन (1: 600), खरगोश एंटी-एमईएफ 2 (1: 300), और माउस एंटी-माइएचसी एंटीबॉडी (एमएफ 20, 1: 1,000)। खरगोश विरोधी MEF2 के साथ, एक ही अवरुद्ध समाधान, माउस एंटी-मायोसिन भारी श्रृंखला या माउस एंटी-मायोजेन में मिश्रण करना संभव है।
  6. ब्लॉक समाधान निकालें और प्रति 3.5 सेंटीमीटर प्लेट के प्रति 600 μL प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्मीडेड कक्ष में सेते रहें।
  7. पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को 3 बार धोएं खंड समाधान में तैयार माध्यमिक एंटीबॉडी के 600 μL के साथ एक अंधेरे कक्ष में आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं: बकरी विरोधी माउस एलेक्सा 488 (1: 1,000), बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा 546 (1: 1,000), और डीएपीआई (1:50, 15 माइक्रोन में स्टॉक समाधान)।
    CAUTIOएन: डीएपीआई एक जहरीले परिसर है जिसे दस्ताने के साथ संभाल करना चाहिए।
  8. पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को 3 बार धुँधला और धो लें
  9. माउंट कांच कवर एलिप्स पॉलीविनाल शराब बढ़ते माध्यम से बढ़ते समाधान के साथ। उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें और कोशिकाओं को इमेजिंग तक रोशनी से सुरक्षित रखें।

7. कैल्शियम इमेजिंग

  1. पहले की संस्कृति, कांच के कवर्स को 25 मिमी व्यास में तैयार करें। 48 घंटे के लिए सतह से किसी भी तेल और गंदगी को हटाने के लिए 70% इथेनॉल में कवचौली डाल दीजिए, जो कि कसरत से सेल के पालन को कम करता है।
  2. कवरलिप्स धोने के बाद पानी के साथ कई बार, उन्हें पानी में वापस डाल दिया और उन्हें (आटोक्लेव) बाँझ डालें
  3. 3.5 सेमी सेमी की प्रत्येक प्लेट में एक कंडोली डाल दीजिये और उन्हें सूखा दें। अधिक प्रयोगों के लिए पेट्री डिश स्टोर करें या उन्हें तुरंत उपयोग करें
  4. कांच के कंसोल में ट्रांसफ़ेक्ट मायोबलास्ट (5-6 x 10 5 कोशिकाओं) जोड़ें
    नोट: अलग-अलग को शामिल करने के बाद 24 से 48 घंटे का प्रयोग किया जाता हैपर या myoblasts proliferating पर
  5. सीए 2 + इमेजिंग करने के लिए, पीबीएस के साथ 2 बार कोशिकाओं को धो लें या सीधे प्रयोगों (कैल्शियम से युक्त माध्यम; तालिका 3 ) के लिए उपयोग किए गए माध्यम के साथ। आरटी के अंधेरे में लगभग 30 मिनट के लिए 2 सुक्ष्ममापी फुरा-2 / एएम प्लस 1 सुक्ष्ममापी प्लुरोनिक एसिड युक्त कोशिकाओं को लोड करें।
    नोट: प्लुरोनिक एसिड फुरा -2 को सुलझाने में मदद करता है फुरा -2 / एएम और प्लूरोनिक एसिड कैल्शियम युक्त माध्यम में भंग कर रहे हैं।
  6. कोशिकाओं को दो बार एक ही माध्यम में धो लें लेकिन बिना फ्यूरा -2 / एएम और प्लूरोनिक एसिड को छोड़ दें और उन्हें अतिरिक्त 10 से 15 मिनट के लिए अंधेरे में छोड़ दें ताकि फुरा-2 / एएम के डी-एस्टरीफिकेशन की अनुमति मिल सके।
  7. यदि फुरा -2 की लोडिंग क्षमता बहुत कम है, तो अधिक फुरा -2 ( जैसे, 4 माइक्रोग्राम) जोड़ें और / या लंबे समय तक कोशिकाओं को सेते ( जैसे, 40 मिनट)।
  8. संस्कृति प्लेट से coverslip निकालें और इसे प्रायोगिक कक्ष में स्थापित करें। कैल्शियम से युक्त माध्यम के ~ 1 एमएल जोड़ें (अनुभव की मात्रा के आधार परमानसिक चैम्बर) माइक्रोस्कोप मंच पर इसे स्थापित करें और रिकॉर्डिंग शुरू करें।
    नोट: फ्लोरोसेंट सीए 2 + -संवेदनशील जांच फुरा -2 340 एनएम और 380 एनएम पर एकांतर से उत्साहित है, और उत्सर्जन प्रकाश 510 एनएम पर एकत्र किया जाता है। जैसा कि सीए 2+ एकाग्रता की उतार-चढ़ाव अपेक्षाकृत धीमी है, 1 अनुपात को हर 2 एस प्राप्त होता है
  9. एसओसीई को सक्रिय करने के लिए, निम्नलिखित शास्त्रीय थापीगैरगिन / सीए 2+ री-एक्सल प्रोटोकॉल का प्रयोग किया जाता है: कैल्शियम से युक्त माध्यम में 2-3 मिनट के लिए कोशिकाओं को छोड़ दें। 1-2 मिनट के लिए कैल्शियम से मुक्त माध्यम के साथ मध्यम बदलें
    1. आंतरिक कैल्शियम स्टोरों को समाप्त करने के लिए 1 माइक्रोन थैपसीगर्जिन जोड़ें।
      नोट: थापसिगैर्ग सरको एंडोप्लास्मिक रेटिकुलम सीए 2+ एटपेज (एसईआरसीए) पंप गतिविधि का एक अपरिवर्तनीय ब्लॉकर है। 8-10 मिनट के बाद, कैल्शियम से युक्त माध्यम के साथ मध्यम को तेजी से बदलें सीए 2 + एसओईई चैनलों के माध्यम से कोशिकाओं में प्रवेश करेंगे। प्रयोग समाप्त करने से पहले लगभग 5 मिनट प्रतीक्षा करें।
      सावधानी: थैसिसिगर्जिन एक जहरीले परिसर है जो दस्ताने के साथ संभाला जाना चाहिए।

8. सीए 2+ मापन विश्लेषण

नोट: अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण करना।

  1. प्रयोग खोलें उस क्षेत्र में 1 क्षेत्र को निकालना जहां कोई कोशिका (पृष्ठभूमि क्षेत्र) नहीं है, और अन्य क्षेत्रों को कोशिकाओं के कोशिकीय कोशिकाओं में विश्लेषण करने के लिए आकर्षित करें (क्षेत्रों को किसी भी चित्र पर खींचा जा सकता है: 340-एनएम, 380-एनएम, या अनुपात छवि)। "प्रयोगों को चलाएं"> "संदर्भ छवियां" पर जाएं। 340 और 380 चैनलों के तहत, "क्षेत्र 1" चुनें और फिर "घटाना पृष्ठभूमि" पर क्लिक करें।
  2. यह सुनिश्चित करने के लिए पूरे प्रयोग (एफ 4: फ़ॉरवर्ड) चलाएं कि पृष्ठभूमि क्षेत्र के साथ कुछ भी हस्तक्षेप न हो, जैसे कि फ्लोरोसेंट धूल स्थान जो पृष्ठभूमि क्षेत्र के माध्यम से यात्रा करता है, और यह कि कोशिकाओं प्रयोगों के दौरान चलती नहीं हैं।
    नोट: ब्याज के क्षेत्रों का चयन किया जाता हैअंधेरे क्षेत्रों में शामिल नहीं होना चाहिए; अन्यथा, अनुपात मान शोर दिखाई देगा, पृष्ठभूमि के हिस्से के रूप में माप में शामिल किया जाएगा।
  3. "लॉग डेटा" पर क्लिक करें और फिर से पूरे प्रयोग को चलाएं।
    नोट: यह एक स्प्रैडशीट खोल देगा जिसमें समय और अनुपात लॉग होगा। व्यक्तिगत 340 एनएम और 380 एनएम तरंग दैर्ध्य को भी बचाया जा सकता है।
  4. एसओसीई के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए, प्रयोग से दो महत्वपूर्ण पैरामीटर निकालें: Ca 2+ पुनः जोड़ के आयाम और Ca 2+ प्रवेश चरण ( चित्रा 3 ) के ढलान।
  5. सीए 2 + ऊंचाई के अधिकतम आयाम से सीए 2 + पुनः जोड़ के ठीक पहले अनुपात मान घटाकर आयाम प्राप्त करें Ca 2+ re-addition के बाद पहले सेकंड के एक रैखिक प्रतिगमन को फिटिंग द्वारा अधिकतम ढलान प्राप्त करें।
    नोट: थापसिगैरिन प्रतिक्रिया की वक्र के नीचे का क्षेत्र भी अतिरिक्त जानकारी के लिए पैरामीटर हैटी, क्योंकि यह एसआर में संग्रहित मुक्त कैल्शियम की मात्रा को दर्शाता है

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Representative Results

मानव मांसपेशियों के नमूने के एंजाइमिक पृथक्करण के बाद, कोशिकाओं को जीएम में बढ़ा दिया गया। मानव myoblasts, CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- कोशिकाओं के रूप में परिभाषित, एफएसीएस के बाद प्राप्त किए गए थे। Myoblasts विश्लेषण जनसंख्या ( चित्रा 1 ) के 60% से अधिक प्रतिनिधित्व किया। प्राथमिक मानव म्यॉबलास्टों को दोहराया गया, संगम के लिए उगाया गया, और 48 घंटे में डीएम में सुसंस्कृत किया गया। ट्रांसक्रिप्शन कारक एमईएफ 2 और मांसपेशी-विशिष्ट प्रोटीन मायोसिन भारी श्रृंखला (एमएचसी) की अभिव्यक्ति के लिए immunostaining के बाद, हमने देखा कि अधिकांश कोशिकाओं ने इन विट्रो (मायएचसी पॉजिटिव सेल्स) में मैयोट्यूब बनाया, जिसमें संलयन सूचकांक मूल्य 60.9 ± 1.3% (एन = 5; चित्रा 2 )। हमने यह भी देखा कि मानव रिज़र्व कोशिकाओं को बुलाए गए मानव म्यॉब्लास्टों के करीब 40% इस टर्मिनल भेदभाव से बच गए हैं और बिना आवर्तित मोनोनक्लेक्लेक्टेड सेल कार्यात्मक अध्ययनों के लिए, हमने सीओ 2 ++ का विश्लेषण किया था, जो कि मैयॉब्लास्ट्स या म्युट्यूब्स के 48 घभेदभाव। चित्रा 3 प्रेरित एसओसीई के लिए इस्तेमाल किया एक प्रतिनिधि प्रोटोकॉल और इस तरह के एक रिकॉर्डिंग से निकालने के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों से पता चलता है। एसओसीई में शामिल अणुओं से संबंधित जानकारी के बारे में जानने के लिए, कोशिकाओं को ब्याज के अणु के खिलाफ siRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। चित्रा 4 चित्रा 4 में सीओ 2 + - टीओआरसी परिवार के एसईसीई पर पारिवारिक चैनलों के मौन के प्रभाव को दर्शाता है।

आकृति 1
चित्रा 1 : मानव माइॉब्लास्ट के एफएसीएस। पृथक्कृत मानव कोशिकाओं को निम्नलिखित सेल सतह मार्करों के लिए एंटीबॉडी के साथ immunostained किया गया: CD45, CD56, CD34, CD144, और CD146। CD45-positive hematopoietic कोशिकाओं को छोड़ने के बाद, CD45- नकारात्मक कोशिकाओं को CD56 अभिव्यक्ति के आधार पर अलग किया गया था। सीडी 56-पॉजिटिव जनसंख्या को सीडी 34, सीडी 144 और सीडी 146 के लिए गेट किया गया था। मानव myoblasts CD56 के रूप में परिभाषित किया गया था + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- कोशिकाओं, जैसा कि पहले 1 9 , 4 वर्णित है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 : मानव Myoblast भेदभाव ( ए ) मानव म्यॉब्लास्ट्स के मिला हुआ मोनोलाइयर 48 घंटे में डीएम के संपर्क में था; तय; और नाभिक की पहचान करने के लिए MEF2 (लाल), माईएचसी (हरे), और डीएपीआई (नीला) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग। स्केल बार = 50 माइक्रोन ( बी ) संलयन सूचकांक एक निश्चित क्षेत्र पर कुल नाभिक की कुल संख्या से विभाजित मैयोट्यूब में शामिल नाभिक की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा का अर्थ है 5 स्वतंत्र प्रयोगों का SEM।Ank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3 : Thapsigargin- प्रेरित SOCE प्रतिनिधि कैल्शियम मापन म्युट्यूब्स को फुरा -2 के साथ लोड किया गया था और साइटोसोलिक Ca 2+ एकाग्रता को मापा गया था। ( ए ) कोशिकाओं कैल्शियम युक्त माध्यम में कुछ मिनट के लिए बैठते हैं, कैल्शियम से मुक्त माध्यम में 2 मिनट बाद। 1 माइक्रोन थैपासगैरगिन का उपयोग 8 मिनट के लिए किया जाता है, फिर कैल्शियम फिर से जोड़ता है। ऐसे रिकॉर्डिंग से निकालने के लिए 3 महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं: थापसिगैरिन प्रतिक्रिया की कवच, एसओसीई की ढलान और एसओसीई के आयाम के तहत क्षेत्र। ( बी ) 3 मापदंडों की मात्रा वक्र के तहत क्षेत्र ईआर / एसआर में संग्रहीत सीए 2 + की मात्रा के बारे में जानकारी प्रदान करता है, और दो अन्य पैरामीटर मात्रा के लिए अनुमति देते हैंएसओसीई के आचरण इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4 : एसओसीई में टीआरपीसी 1 और टीआरपीसी 4 का समावेश ( ए ) सीआईटीआरपीसी 1 या सीआईटीआरपीसी 1 और सीआईटीआरपीसी 4 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट मैओब्ल्लास्ट्स को फैलाने में फुटा -2 का उपयोग कर साइटोसॉलिक सीए 2+ एकाग्रता का मूल्यांकन किया गया था। एसओसीई बाह्य सीए 2 + (सीए 2 + फ्री) की अनुपस्थिति में 1 माइक्रोन थापसिगर्जिन के साथ आंतरिक स्टोर की कमी से शुरू हो गई थी और 2 एमएम बाहरी सीए 2 + के पुनः अतिरिक्त होने के दौरान मापा गया था। प्रत्येक ट्रेस एक प्रतिनिधि coverslip का मतलब दर्शाता है। ( बी ) SOER आयाम पर siRNA के प्रभाव की मात्रा अनुमति के साथ, यह आंकड़ा संदर्भ 12 से संशोधित किया गया है। बार्स एर ई मतलब ± एसईएम, * पी <0.05 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

"> 10 एनजी / एमएल <टीडी कॉलस्पैन = "2">
विकास माध्यम (जीएम): एकाग्रता विभेदक माध्यम (डीएम): एकाग्रता
हैम एफ एफ 10 DMEM
FCS 15% पशुओं से जुड़े टीके का अन्नसार 0.5 मिलीग्राम / एमएल
पशुओं से जुड़े टीके का अन्नसार 0.5 मिलीग्राम / एमएल एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर
fetuin 0.5 मिलीग्राम / एमएल इंसुलिन 0.01 मिलीग्राम / एमएल
एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर 10 एनजी / एमएल creatine 1 मिमी
डेक्सामेथासोन 0.39 माइक्रोग्राम / एमएल पाइरूवेट 100 ग्राम / एमएल
इंसुलिन 0.04 मिलीग्राम / एमएल uridine 50 ग्राम / एमएल
creatine 1 मिमी gentamycin 10 माइक्रोग्राम / एमएल
पाइरूवेट 100 ग्राम / एमएल
uridine 50 ग्राम / एमएल
gentamycin 5 μg / एमएल

तालिका 1: मायाब्लास्ट कल्चर के लिए मध्यम रचना

ट्यूब एंटीबॉडी
1 कोई नहीं
2 Isotype AlexaFluor 488-, Isotype PE-CF594, Isotype PE, Isotype PECy7Isotype एपीसी
3 मानव विरोधी मानव CD56-AlexaFluor 488
4 माउस विरोधी-हमान CD45 पीई- CF594
5 मानव विरोधी मानव CD144-PE
6 मानव विरोधी मानव CD146-PECy7
7 मानव विरोधी मानव CD34-APC
8 मानव विरोधी मानव CD56-AlexaFluor 488-, माउस विरोधी मानव CD45 पीई- CF594, माउस विरोधी मानव CD144-PE, माउस विरोधी मानव CD34-APC, माउस विरोधी मानव CD146-PECy7

तालिका 2: सेल सॉर्टिंग के लिए इस्तेमाल एंटीबॉडी।

कैल्शियम युक्त माध्यम एकाग्रता कैल्शियम मुक्त माध्यम एकाग्रता
सोडियम क्लोराइड सोडियम क्लोराइड 135 मिमी
KCl 5 मिमी KCl 5 मिमी
MgCl2 1 मिमी MgCl2 1 मिमी
CaCl2 2 मिमी EGTA 1 मिमी
Hepes 10 मिमी Hepes 10 मिमी
शर्करा 10 मिमी शर्करा 10 मिमी
पीएच 7.45 को NaOH के साथ समायोजित किया गया पीएच 7.45 को NaOH के साथ समायोजित किया गया

तालिका 3: कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों के लिए मध्यम रचना।

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Discussion

वयस्क कंकाल की मांसपेशियों से मानव मैबोलास्ट्स का अलगाव और संस्कृति पेशी विभेद और मांसपेशियों के उत्थान के अध्ययन के लिए एक इन विट्रो मॉडल पेश करता है। इस पत्र में, हम एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो कि सरल और लागत-सीमित तरीके से मानव मैबोलास्ट की उच्च पैदावार के शुद्धिकरण की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, इस तकनीक को विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करता है जो कि मायोब्लास्ट के प्रतिशत के अलग-थलग होते हैं और उनके मायोजेनिक भेदभाव की दक्षता। दरअसल, सेल सॉर्टिंग के बाद हमने लगभग 60% मानव मैबोलास्ट प्राप्त किए। ये कोशिकाओं को 6 मार्गों (लगभग 30 मुकाबले) तक संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है और अलग-अलग करने के लिए उनकी क्षमताओं को बनाए रख सकते हैं। इसके अलावा, जीएम से डीएम तक के माध्यम को बदलने के बाद, मैयोजेनिक भेदभाव तेजी से होता है, जैसा कि डीएम में 2 से 3 दिनों के बाद, म्यॉब्लास्ट फ्यूजन अधिकतम है। इस मॉडल में, डीएम के 2 दिनों के बाद से लगभग 60% माइॉब्लास्ट म्यूटोट्यूब में फ्यूज होता है। एक और लाभ यह है कि ये प्राथमिक मानव सेलएल संस्कृतियों आसानी से siRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं हमारी प्रयोगशाला में जीएम और डीएम मीडिया का उपयोग होममेड है। वैकल्पिक रूप से, वाणिज्यिक मीडिया का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन हमने कभी भी मानवीय प्राथमिक संस्कृतियों में उनकी दक्षता नहीं की।

उल्लिखित विधि का एक दोष टिशू एंजाइमेटिक पाचन के दौरान ट्रिप्सिन का उपयोग होता है। यह प्रक्रिया सेल की सतह के मार्करों का एक बड़ा अंश निकाल देती है और यह दर्शाती है कि हम एफएसीएस प्रदर्शन करने से पहले कुछ दिनों तक संस्कृति में कोशिकाओं को छोड़ देते हैं। झिल्ली प्रोटीन को बेहतर बनाए रखने के लिए ट्रिप्सिन के बजाय कोलेजनज़ का उपयोग किया जा सकता है और ऊतक विघटन के तुरंत बाद मानवीय म्यॉब्लास्ट की छंटाई के लिए अनुमति देता है। हालांकि, कोलेजनज़ की लागत ट्रिप्सिन की तुलना में काफी अधिक है, और बाद के प्रयोगों के लिए पर्याप्त सेल नंबर प्राप्त करने के लिए सेल वर्गीकरण के बाद भी एक प्रवर्धन कदम की आवश्यकता होगी। तकनीक का एक और सीमा हड्डी से प्राप्त मांसपेशियों के नमूनों की "गुणवत्ता" हैआईसी सर्जरी दरअसल, सर्जरी की वजह से प्राप्त ऊतकों के टुकड़े अधिक या कम क्षतिग्रस्त हो सकते हैं, और प्रयोगशाला में सर्जरी और सेल के बीच का समय दिन-प्रतिदिन बदल सकता है। हालांकि, मायोब्लास्ट अलगाव, शुद्धि और म्यूट्यूब्स में भेदभाव के लिए, हम नियमित रूप से संतोषजनक परिणाम प्राप्त करते हैं। अंत में, रोगी की आयु एक मुद्दा हो सकती है, क्योंकि 20 साल की उम्र के साथ उपग्रह कोशिकाओं की मात्रा और पुनर्योजी क्षमता कम होती है। इस प्रकार, हम अपने प्रयोगों को युवा रोगियों (40 वर्ष से कम उम्र के) तक सीमित कर देते हैं।

जैसा कि उल्लेख किया गया है, म्यॉब्लास्ट तेजी से और कुशलता से अंतर करते हैं, जो कंकाल की मांसपेशियों के भेदभाव की प्रारंभिक घटनाओं का अध्ययन करने का एक बड़ा लाभ है। हालांकि, जैसा कि मैयोट्यूब तेजी से बनते हैं, वे भी सहजता से संविदा और संस्कृति प्लेटों से अलग करने की प्रवृत्ति रखते हैं। यह बाद में संलयन घटनाओं के विश्लेषण को रोकता है। इन बाद की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए, एक की आवश्यकता होगीकोशिका पालन को सुधारने और मायोट्यूब अलगाव 21 को कम करने के लिए बाह्य मैट्रिक्स के साथ संस्कृति प्लेट को कोट करने के लिए

फ्लूरेसेंट जांच फुरा -2 का उपयोग कर कैल्शियम इमेजिंग एक व्यापक रूप से प्रयुक्त, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक है जो प्रदर्शन करना आसान है। फुरा -2 लोड हो रहा है, और फ्यूरा-2 जैसे रैटीओमेट्रिक जांच का उपयोग एकल-तरंग दैर्ध्य डाई के कई फायदे हैं। यह कोशिकाओं के बीच और सेल के बीच लोडिंग में फोकस या मतभेदों के परिवर्तनों को सामान्य बनाता है ( जैसे, नाभिक बनाम साइटोसोल) प्रोटोकॉल जिसे हमने सीएसीईईज और मापने के लिए वर्णित किया है, नियमित रूप से कई अलग-अलग सेलुलर सिस्टमों में उपयोग किया जाता है। विभिन्न चैनलों या कैल्शियम नियामकों की चुप्पी एसओसीई की आणविक संरचना और विभिन्न खिलाड़ियों के रिश्तेदार महत्व को स्पष्ट करने के लिए अनुमति देते हैं, दोनों में मैबोलास्ट्स और मायोट्यूब में। फुरा -2 और सीए 2 + इमेजिंग का उपयोग करते हुए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण हैएमएन 2 + शराब तकनीक एमएन 2+ सीए 2 + के माध्यम से कोशिकाओं में प्रवेश करती है- पारगम्य चैनल और फ्यूरा-2 प्रतिदीप्ति बुझती है। शमन दर के उपाय SOCE 22 , 23 के एक अधिक प्रत्यक्ष उपाय देता है। हालांकि, कुछ अलग उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता है। सीए 2+ सिग्नलिंग आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए 2+ संकेतकों का उपयोग करके भी किया जा सकता है, जो विभिन्न सेल डिब्बों में ठीक से स्थानीयकृत होने का महान लाभ है। कमियां सेल अभिकर्मक और सिग्नल की गतिशीलता की आवश्यकता होती है, जो आम तौर पर रासायनिक रंग 24 से कम होती है। माइटोकोंड्रिया या एसआर जैसे ऑर्गेनल्स में सीए 2+ को मापने के लिए, आनुवांशिक जांच सोने के मानक हैं। हालांकि, साइटोसोलिक सीए 2+ मापन के लिए, आनुवांशिक जांच पर फ़ura -2 का उपयोग करने का लाभ बनी हुई है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतियोगी वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

यह काम स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 310030-166313), "फोंडेशन सुइस डेल ला रिफेर्क ला लेस मेलैडीज मस्क्यूलायर्स", "फाउंडेशन मार्सेल लेविल्लंत" और "फोंडेशन डेल ला रिकरके ओस्टियो-आर्टिकुलायर" द्वारा किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ham’s F10 ThermoFisher Scientific 31550-023
FCS ThermoFisher Scientific 10270-106 Lot 41G5532K
BSA Sigma O5482
fetuin Sigma F3385
EGF Corning 354001
Dexamethansone Sigma D1756
Insulin Sigma I9278
Creatine Sigma 27900
Pyruvate Sigma P4562
Uridine Sigma U3003
Gentamycin ThermoFisher Scientific 15710-049
Trypsin-EDTA 0.05% ThermoFisher Scientific 25300-062
70 μm cell strainer Falcon 352350
40 μm cell strainer Falcon 352340
Falcon 50 mL tube Falcon 352070
Falcon 15 mL tube Falcon 352096
Falcon 5 mL tube (FACS) Falcon 352058
Culture medium: OPTI-MEM ThermoFisher Scientific 31985-047
Transfectant reagnt: RNAiMax ThermoFisher Scientific 1756064
PBS ThermoFisher Scientific 14190-094
Mounting medium Fluka 10981
Mouse anti-MyHC * DSHB MF20  concentrate
Mouse anti-myogenin BD Pharmigen 556358
Rabbit anti-MEF2 Santa Cruz Biotech C-21
Goat anti-mouse Alexa488 ThermoFisher Scientific A11029
Goat anti-rabbit Alexa 546 ThermoFisher Scientific A11035
Mouse anti human CD56-Alexa488 BD Pharmingen 557699
Mouse anti human CD146-PECy7 BD Pharmingen 562135
Mouse anti human CD45-PE-CF594 BD Pharmingen 562279
Mouse anti human CD34-APC BD Pharmingen 345804
Mouse anti human CD144-PE BD Pharmingen 560410
Alexa Fluor 488 mouse IgG1k BD Pharmingen 557702
PECy7 mouse IgG1k BD Pharmingen 557872
PE-CF594 mouse IgG1k BD Pharmingen 562292
APC mouse IgG1k BD Pharmingen 550854
PE mouse IgG1k BD Pharmingen 556650
DAPI Sigma D9542 CAUTION:  toxic compound
Paraformaldehyde Fluka 762400
Fura-2 AM ThermoFisher Scientific F1201
Pluronic F-127 ThermoFisher Scientific P3000MP
Thapsigargin Sigma T9033 CAUTION : toxic compound 
Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 Molecular Device
* : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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विकास जीवविज्ञान अंक 125 मायोजेनिक कोशिकाएं मायोबलास्ट भेदभाव सीए स्टोर-ऑपरेटेड सीए भेदभाव के मार्कर प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग
मानव माइॉब्लास्ट्स अलगाव, मायाजक विभेदन का आकलन और स्टोर-संचालित कैल्शियम एंट्री मापन
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Laumonier, T., Koenig, S.,… More

Laumonier, T., Koenig, S., Saüc, S., Frieden, M. Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement. J. Vis. Exp. (125), e55918, doi:10.3791/55918 (2017).

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