Summary
Hier beschrijven we een methodologie om een pure bevolking van menselijke myoblasten te verkrijgen uit volwassen spierweefsel. Deze cellen worden gebruikt om in vitro skeletspierdifferentiatie te bestuderen en in het bijzonder om eiwitten die betrokken zijn bij Ca 2+ -signalering te bestuderen.
Abstract
Satellietcellen (SC) zijn spierstamcellen die zich bevinden tussen het plasmamembraan van spiervezels en de omliggende basale lamina. Ze zijn essentieel voor spierregeneratie. Bij letsel, die vaak voorkomt in de skeletspieren, worden SC's geactiveerd. Ze vermenigvuldigen zich als myoblasten en differentiëren om spierlaesies te herstellen. Onder veel gebeurtenissen die plaatsvinden tijdens spierdifferentiatie, zijn cytosolische Ca 2+ signalen van groot belang. Deze Ca 2+ signalen vloeien voort uit Ca 2+ vrijlating van interne Ca 2+ winkels, evenals vanaf Ca 2+ toetreding van de extracellulaire ruimte, in het bijzonder de winkelbedreven Ca 2+ -toets (SOCE). Dit document beschrijft een methodologie die gebruikt wordt om een pure populatie van menselijke myoblasten te verkrijgen uit spiermonsters die zijn verzameld na orthopedische operatie. Het weefsel wordt mechanisch en enzymatisch verteerd en de cellen worden geamplificeerd en vervolgens gesorteerd door flowcytometrie volgens de aanwezigheid van speciFic membraan markers. Eenmaal verkregen worden menselijke myoblasten uitgebreid en toegewijd aan differentiatie door het verwijderen van groeifactoren uit het kweekmedium. De expressieniveaus van specifieke transcriptiefactoren en in vitro immunofluorescentie worden gebruikt om het myogene differentiatieproces in controleomstandigheden te beoordelen en na het afsluiten van eiwitten die betrokken zijn bij Ca 2+ -signalering. Ten slotte beschrijven we het gebruik van Fura-2 als een ratiometrische Ca 2+ sonde die betrouwbare en reproduceerbare metingen van SOCE levert.
Introduction
Menselijke skeletspieren zijn samengesteld uit groepen contractiele, multinucleated spiervezels die voortvloeien uit de fusie van myogene precursorcellen. Skeletspieren hebben de mogelijkheid om na verwonding te regenereren dankzij de aanwezigheid van SC's, de stamcellen van de skeletspier die zich bevinden tussen het plasmamembraan van myofibers (sarcolemma) en de basale lamina. Bij ongebonden spieren zijn SC's meestal aanwezig in een rustige staat. Naar aanleiding van mechanische stress of letsel worden SC's geactiveerd (myoblasten), prolifereren en ondergaan ofwel differentiatie om nieuwe myofibers of zelfvernieuwing te vormen om het SC-pool 1 , 2 aan te vullen. In de loop der jaren werden verschillende technieken ontwikkeld om SC's en hun nakomelingen, de myoblasten, van biopsies van skeletspieren te isoleren. Met het grotere begrip van de celoppervlakmarkers die op deze cellen worden uitgedrukt en de methodologie van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) 3, 4 , 5 , is het nu mogelijk om zuivere populaties van menselijke myoblasten van spiermonsters te isoleren.
Calciumsignaal regelt de ontwikkeling van de skeletspier, homeostase en regeneratie. In het bijzonder is de Ca 2+ -opname die geactiveerd wordt na intracellulaire opslaguitputting, genaamd SOCE, van groot belang 6 voor deze processen. Bij celstimulatie neemt het Ca 2+ -niveau in het endo / sarcoplasmatische reticulum (ER / SR) af, wat op zijn beurt plasma-membraan Ca 2+ kanalen activeert waardoor Ca 2+ toetreding mogelijk is om de ER / SR 7 te vullen. De twee belangrijkste eiwitten die betrokken zijn bij SOCE zijn het ER / SR Ca 2+ -senserende stromale interactie moleculen 1 (STIM1) eiwit en het plasma membraan Ca 2+ kanaal Orai1. Skeletspier spreekt overvloedig deze twee eiwitten uit, evenals andere eiwitten van dezelfde families (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 en een aantal Ca 2+ -doorlatende kanalen van de transiënte receptor potentiële kanonieke familie (TRPC) 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2+ toegang via de SOCE route is van groot belang voor spiervorming / regeneratie 14 . Mutaties van STIM1- of Orai1-eiwitten hebben schadelijke effecten op spierfunctie, die hoofdzakelijk leiden tot spierhypotonie 15 . Diermodellen met SOCE-afwijking tonen ook verminderde spiermassa en kracht, samen met verhoogde vermoeidheid 6 , 16 , 17 . Zoals eerder vermeld, worden andere STIM- en Orai-eiwitten, evenals veel TRPC-kanalen, uitgedrukt in de skeletspier, en hun respectieve rollen zijn tot op heden nog niet bepaald. Door te klopt dEigen zijn expressie niveau, het is dus mogelijk om hun implicaties in SOCE en hun rol te onderzoeken tijdens menselijke skeletspierdifferentiatie.
SOCE meting kan worden uitgevoerd met twee verschillende benaderingen: elektrofysiologische actuele opnames en Ca 2+ metingen. Elektrofysiologie is zeker een meer directe methode, aangezien het de huidige interesse en de bijbehorende elektrofysiologische handtekening meet. Deze techniek is echter erg moeilijk om op spiercellen toe te passen, vooral door de grote grootte van de spiercellen en de kleine omvang van de endogene SOCE stroom. Cytosolische Ca 2+ beeldvorming is technisch zeer toegankelijk, maar de maatregel is indirecter, aangezien het Ca 2+ -niveau gemeten in de cytosol zowel de ingang van Ca 2+ als de repomp uit de cel of in de interne winkels weerspiegelt.
Een methodologie die de myoblasten van kleine stukjes menselijke schil omvatEtal spier na enzymatische spijsvertering, amplificatie en FACS wordt uitgelegd in dit document. Het proces van spierdifferentiatie en het immunofluorescentieprotocol om de expressie van differentiatiemarkers over de tijd te volgen worden beschreven 18 . Tenslotte wordt de meting van SOCE en de rol van verschillende ionenkanalen in Ca 2+ signalering en skeletspierdifferentiatie verklaard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijke spiermonsters (weefsels verkregen uit semitendineuze spieren) werden verzameld tijdens orthopedische operatie bij gezonde patiënten als chirurgisch afval. Alle methoden met betrekking tot de menselijke studie zijn uitgevoerd volgens de richtlijnen en regelgeving van de Zwitserse regulerende gezondheidsautoriteiten en goedgekeurd door de Cantonale d'Ethique de la Recherche van de Cantonale autoriteiten van Genève, Zwitserland (protocol CER nr. 12-259) . Geinformeerde en schriftelijke toestemmingen werden verkregen van alle volwassen personen die betrokken zijn bij de studie.
1. Isolatie van Myoblasten uit Menselijk Skeletspier
- Gedurende alle procedures behoudt u steriele omstandigheden door te werken onder een weefselkweekhoofd van niveau II en met behulp van steriel medium en steriele buffers.
Opmerking: Deze procedure kan worden toegepast op veel menselijke skeletspieren.
2. Dissociation Protocol
- Breng spiermonsters over (2 - 3 g) in een steriele 6 cmbord.
- Was de spiermonsters met 5 - 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Herhaal de was.
- Verwijder bindweefsels en vetweefsels met behulp van gebogen schaar en een klem.
- Weeg het spiermonster (zie stap 2.13) en overbrengen naar een nieuwe steriele 6 cm plaat.
- Voeg 5 ml van 0,05% Trypsin-EDTA toe.
- Met behulp van een schaar, snijd en snijd het spierweefsel in kleine stukken (minder dan 2 mm).
- Gebruik een 10 ml serologische pipet, geef de gemalen spier over op een 200 ml dissociatiefles met een magnetische staaf. Herhaal deze stap tot 90 ml van 0,05% Trypsin-EDTA is overgebracht met alle gehakte spieren in de dissociatiebox. Sluit de dissociatiefles en incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten onder milde roering.
- Verwijder de dissociatiefles uit het verwarmingsbad en stop de enzymatische reactie door 10 ml foetaal kalfserum (FCS; 10% eindvolume) toe te voegen aan de dissociatiefles. Homogeniseer het mengsel met een pipet.
- PrepZijn twee 50 ml buizen met een 70 μm cel filter op elk. Passeer de helft van de cel suspensie door de celfilter op elke buis door op en neer op het filter te pipetteren totdat de suspensie doorgaat.
- Centrifugeer de buizen bij 200 xg en 20 ° C gedurende 5 minuten; Aspireren en weggooien van de supernatant.
- Resuspendeer de cellen met 10 ml groeimedium (GM; Tabel 1 ) en verplaats de cellen door een 40 μm celsilver die op een 50 ml buis wordt geplaatst. Centrifugeer de buis bij 200 xg en 20 ° C gedurende 5 minuten; Aspireren en weggooien van de supernatant.
- Resuspendeer de cellen met 10 ml GM en centrifugeer de buis bij 200 xg en 20 ° C gedurende 5 minuten; Aspireren en weggooien van de supernatant.
- Resusteer de cellen met 1 ml GM en tel de cellen met een Neubauer kamer.
Opmerking: Gewoonlijk moet een opbrengst van 3 x 10 5 cellen per g spier geoogst worden. De opbrengst wordt berekend door het aantal cellen te verdelen door het gewicht van de spierbiopSy (stap 2.4). - Zet 2 x 10 5 cellen in een steriele 6 cm-plaat die 4 ml GM bevat en incubeer bij 37 ° C en 7% CO 2 . Bereid zoveel mogelijk platen aan.
- Verander de GM na 3 dagen.
Opmerking: Vers gedistocieerde cellen hebben tijd nodig om aan de kweekplaat te houden. Bovendien is de eerste myogene celverdubbelingstijd ongeveer 50 - 60 uur. Na de eerste divisie is de verdubbelingstijd ongeveer 20 uur. - Na 5 tot 7 dagen, wanneer cellen 70 tot 80% samenvloeiing bereiken (ongeveer 1,5 x 10 6 cellen / per 6 cm plaat), beginnen met antilichamen kleuren en cellen sorteren (stap 3).
3. Antilichamenverf en Cell Sorteren
- Na eenmaal spoelen met PBS, incubeer de hechtende cellen (in 6 cm plaat) met 1 ml 0,05% trypsine-EDTA bij 37 ° C en 7% CO2 gedurende 3 minuten (of incuberen bij 5% CO2). Stop de reactie door 2 ml GM en voeg de cellen in 15 ml buis toe. Na centrifugeren (200 x g gedurende 5 minuten), resGebruik de cellen in 1 ml GM.
- Tel de cellen met een Neubauer kamer.
- Voer de volgende procedures uit op ijs.
Opmerking: de procedure voor het instellen van de juiste fluorescentievergoeding op de cytometer is essentieel en moet op elke cytometer vergelijkbaar zijn. Tubes 1 en 2 worden gebruikt als negatieve controles. Tubes 3 - 7 worden gebruikt om de vergoeding op de cytometer tijdens het eerste experiment in te stellen ( tabel 2 ). De uiteindelijke concentratie die voor elk antilichaam en het bijbehorende isotype wordt gebruikt, moet hetzelfde zijn (ongeveer 1 μg / 10 6 cellen). - Verzend 1 x 10 5 cellen per buis (5 ml buis) voor buizen 1 - 7 ( tabel 2 ). Plaats de resterende cel suspensie in buis 8 voor celsortering.
- Was de cellen met 1 ml koude FACS-buffer (PBS-5% FCS). Sluit de buizen bij 200 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten; Aspireren en weggooien van de supernatant.
- Voeg 200 μL FACS-buffer per buis toe. Voeg antilichamen tegen thBuis volgens tabel 2 . Incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
- Was de cellen: voeg 1 ml van de FACS-buffer toe aan elke buis. Sluit de buizen bij 200 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten. Aspireren en weggooien van de supernatant. Herhaal deze stap nog een keer.
- Resuspendeer de cellen in 500 μl FACS buffer. Sluit de buizen en houd ze op ijs tot het sorteren van cellen. Bereid 4 buizen van 1,5 ml, die elk 500 μL GM bevatten, die nodig zijn om de cellen te verzamelen tijdens de celsortering. Houd ze op ijs.
- Sorteer menselijke myoblasten door middel van flowcytometrie ( Figuur 1 ). Na het uitsluiten van CD45-positieve hematopoietische cellen scheiden CD45-negatieve cellen op basis van CD56 expressie. Vervolgens worden de CD56-positieve populatie voor CD34, CD144 en CD146 (humane myoblasten gedefinieerd als CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-cellen). Heranalyseer een kleine fractie van de gesorteerde celpopulatie om de zuiverheid te controleren.
- Pool de buizen die menselijke myobla bevattenSt in een 15 ml buis en was één keer door 5 ml GM toe te voegen. Centrifugeer de buis bij 200 xg en 20 ° C gedurende 5 minuten; Aspireren en weggooien van de supernatant.
- Resusteer de cellen in 1 ml GM en plaat de cellen op een niet-beklede 6 cm-plaat die 4 ml GM (2 x 10 5 cellen per plaat) bevat. Incubeer bij 37 ° C en 7% CO 2 .
4. Onderhoud van cellen
- Verander de helft van het kweekmedium om de 2 dagen. Verwijder 2 ml oude GM uit de kweekschotel en voeg 2 ml GM toe.
Opmerking: Myoblasten produceren groeifactoren die gunstig zijn voor de culturele omstandigheden. - Trypsineer de cellen wanneer ze 70 tot 80% samenvloeiing bereiken om pre-differentiatie te vermijden. Na eenmaal spoelen met PBS, incubeer de hechtende cellen (in 6 cm plaat) met 1 ml 0,05% trypsine-EDTA bij 37 ° C en 7% CO2 gedurende 3 minuten. Stop de reactie door 2 ml GM en voeg de cellen in een 15 ml buis toe. Na centrifugeren (200 xg gedurende 5 minuten), resusHang de cellen in 1 ml GM.
- Tel de cellen en berei 6 cm platen met 2 x 10 5 cellen per plaat in 4 ml GM.
- Bewaar menselijke myoblasten tot 6 passages of bevriezen ze in GM die 10% DMSO, 1 x 10 6 cellen per ml bevat. Bevroren de cellen in een progressieve bevriezingsbox (1 ° C / min); Voor langdurige opslag, plaats de cellen in vloeibare stikstof.
5. Transfectie van humane myoblasten met siRNA
Opmerking: Myoblasten worden getransfecteerd met behulp van commercieel transfectie reagens twee dagen voor de inductie van de differentiatie. Het effect van specifiek siRNA tegen een gen wordt altijd vergeleken met het effect van een controle siRNA. SiRNAs zijn dubbelstrengs RNA's die op ijs moeten worden bewaard en met handschoenen gemanipuleerd worden.
- Verkrijgen van een 70-80% confluente monolaag van menselijke myoblasten in een 6-cm plaat (ongeveer 1,5 x 10 6 cellen).
Opmerking: 5 x 10 5 cellen per transfectie zijn nodig om een con. Te verkrijgenVloeiende monolaag van getransfecteerde myoblasten na 2 dagen in GM. - Bereid glazen deklagen (beschreven voor de calciumafbeelding in stap 7).
- Warm GM, 0,05% trypsine-EDTA en PBS tot 37 ° C.
- Voer alle volgende stappen uit in een weefselkweekkap van level II om de steriliteit te behouden.
- Verzend in een 1,5 ml buis 500 μL gereduceerd serummedium, 3 μl transfectie-reagens en 1 μl siRNA bij 20 μM. Meng het voorzichtig en houd het gedurende 15 - 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Bereid de myoblasten voor transfectie gedurende deze incubatietijd. Na eenmaal spoelen met PBS, incubeer de hechtende cellen (in 6 cm plaat) met 1 ml 0,05% trypsine-EDTA bij 37 ° C en 7% CO2 gedurende 3 minuten. Stop de reactie door 2 ml GM en voeg de cellen in een 15 ml buis toe. Na centrifugeren (200 xg gedurende 5 minuten), resuspen de cellen opnieuw in 1 ml GM.
- Tel de cellen met een Neubauer kamer.
- Resuspendeer 5 x 10 5 cellenIn 200 μl GM voor elke transfectie ( dwz voor 2 transfecties, resuspenderen in 400 μl).
- Voeg 200 μl van de celsuspensie toe aan elk 500 μl siRNA-transfectiemengsel. Pipet omhoog en omlaag twee keer en incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
- Voeg de 700 μL (cellen + siRNA-transfectant) toe aan een kweekschotel van 3,5 cm met een glazen deklaag. Voeg GM toe om een eindvolume van 2 ml te krijgen.
- Na 24 uur bij 37 ° C en 7% CO2, volledig vervangen van het medium door 2 ml vers GM. Na nog eens 24 uur is een confluente monolaag van getransfecteerde cellen gewoonlijk aanwezig; Zo ja, induceer myoblastdifferentiatie door het GM te vervangen door 2 ml differentiatiemedium (DM; Tabel 1 ).
- Voer calciumbeeldvormingsexperimenten uit 24 tot 48 uur na de inductie van differentiatie of op proliferatie van myoblasten.
Opmerking: Immunofluorescentie wordt meestal uitgevoerd 48 uur na de inductie van differentiatie.
6. ImmUnofluorescentie Staining of Differentiation Markers
Opmerking: Immunofluorescentie kleuring wordt uitgevoerd na 48 uur in DM, maar kan ook uitgevoerd worden bij andere differentiatietijden. Myogenine en MEF2 zijn alleen nucleaire eiwitten uitgedrukt in gedifferentieerde cellen (vóór fusie in myotubes), en hun kleuring maakt het mogelijk om het differentiatieproces te beoordelen. Myosin zware keten (MyHC) wordt alleen uitgedrukt in myotubes en wordt gebruikt om de myotube grootte en fusie index te berekenen (aantal kernen in myotubes / totaal aantal kernen).
- Na 48 uur in DM wassen de confluente monolaag van gedifferentieerde cellen tweemaal met 1 ml PBS bij RT. Doe dit zorgvuldig om te voorkomen dat de myotubes worden ontdoken.
- Reinig de cellen met 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 15 minuten bij RT. Was de cellen twee keer met PBS, gedurende 5 minuten elk.
- Permeabiliseer de cellen met 1 ml PBS die 0,25% Triton X-100 bevat gedurende 45 minuten en 3 keer wassen met 1 ml PBS.
- Blokkeer nietSpecifieke bindingsplaatsen door incubatie van de cellen in PBS aangevuld met 0,2% Tween-10 en 2% geiten serum (blokoplossing) gedurende 30 min bij RT.
- Bereiding primaire antilichamen verdund in blokoplossing (600 μl per 3,5 cm plaat).
Opmerking: De volgende primaire antilichamen worden gebruikt: muis anti-myogenine (1: 600), konijn-anti-MEF2 (1: 300) en anti-MyHC-antistof tegen muizen (MF20, 1: 1000). Het is mogelijk om in dezelfde blokkerende oplossing, muis anti-myosine zware keten of muis anti-myogenine, met konijn anti-MEF2 te mengen. - Verwijder de blokoplossing en voeg 600 μL primaire antilichaamoplossingen per 3,5 cm-plaat toe en incubeer gedurende een nacht bij 4 ° C in een bevochtigde kamer.
- Was de cellen 3 keer met 1 ml PBS. Incubeer gedurende 1 uur bij RT in een donkere kamer met 600 μl van de secundaire antilichamen die in de blokoplossing bereid zijn, als volgt: geit anti-muis Alexa 488 (1: 1000), geit-anti-konijn Alexa 546 (1: 1000) En DAPI (1:50, voorraadoplossing bij 15 μM).
CAUTION: DAPI is een giftige verbinding die met handschoenen moet worden behandeld. - Aspireer en was de cellen 3 keer met 1 ml PBS.
- Monteer glazen deklagen met behulp van polyvinylalcohol montage medium met anti-vervuilende oplossing. Houd ze bij 4 ° C en beschermd tegen licht tot het afbeelden van de cellen.
7. Calcium Imaging
- Voorkweek, berei glazen deklagen 25 mm in diameter. Zet de dekglazen in 70% ethanol gedurende 48 uur om vet en vuil van het oppervlak te verwijderen, waardoor de kleef van de cel kleiner wordt.
- Na het spoelen van de omtrekwanden met water, zet ze terug in water en steriliseer ze (geautoclaveerd).
- Zet een deklip per 3,5 cm kentekenplaat en laat ze drogen. Bewaar de Petri-schotels voor verdere experimenten of gebruik ze direct.
- Voeg de getransfecteerde myoblasten (5 - 6 x 10 5 cellen) toe aan de glazen deklaag.
Opmerking: Experimenten worden 24 tot 48 uur uitgevoerd na de inductie van differentiatiOp of op proliferatie van myoblasten. - Om Ca 2+ beeldvorming uit te voeren, was de cellen 2 keer met PBS of direct met het medium dat gebruikt werd voor de experimenten (calciumhoudend medium, tabel 3 ). Laad de cellen met 2 μM Fura-2 / AM plus 1 μM pluronzuur gedurende ongeveer 30 minuten in het donker bij RT.
Opmerking: Pluronzuur helpt Fura-2 te solubiliseren. Fura-2 / AM en pluronzuur worden opgelost in het calciumbevattende medium. - Was de cellen tweemaal in hetzelfde medium maar zonder Fura-2 / AM en pluronzuur en laat ze gedurende 10 tot 15 minuten in het donker wassen om Fura-2 / AM te veresteren.
- Als de laad-efficiëntie van Fura-2 te laag is, voegt u meer Fura-2 ( bijv. 4 μM) toe en / of incubeer de cellen langere tijd ( bijv. 40 min).
- Verwijder de deksel van de kweekplaat en installeer deze in de experimentele kamer. Voeg ~ 1 ml calciumhoudend medium toe (afhankelijk van het volume van de experimentenMentale kamer). Installeer het op de microscoopfase en start de opname.
Opmerking: De fluorescerende Ca 2+ -gevoelige sonde Fura-2 wordt afwisselend op 340 nm en 380 nm opgewonden en het emissielicht wordt bij 510 nm verzameld. Aangezien de fluctuaties van de Ca 2+ concentratie relatief langzaam zijn, verwerven u 1 verhouding elke 2 s. - Om SOCE te activeren, wordt het volgende klassieke thapsigargin / Ca 2+ heradditieprotocol gebruikt: laat de cellen 2-3 min in calciumbevattend medium. Vervang het medium met calciumvrij medium gedurende 1-2 minuten.
- Voeg 1 μM thapsigargine toe om de interne calciumopslag te ontlopen.
Opmerking: Thapsigargine is een onomkeerbare blokkering van de Ca2 + ATPase (SERCA) pompactiviteit van de sarco-endoplasmatische reticulum. Na 8 - 10 minuten vervangt het medium snel met het calciumbevattende medium. Ca 2+ komt door de SOCE-kanalen in de cellen. Wacht ongeveer 5 minuten voor het beëindigen van de experimenten.
VOORZICHTIG: Thapsigargin is een giftige verbinding die met handschoenen moet worden behandeld.
- Voeg 1 μM thapsigargine toe om de interne calciumopslag te ontlopen.
8. Ca 2+ Meetanalyse
Opmerking: voer de analyse uit met de acquisitie software.
- Open het experiment. Teken regio 1 in een gebied waar er geen cellen zijn (achtergrondgebied) en teken de andere gebieden in het cytoplasma van de cellen die geanalyseerd moeten worden (de gebieden kunnen op elk beeld worden getekend: de 340 nm, de 380 nm, Of de verhouding afbeelding). Ga naar "Experimenten uitvoeren"> "referentieafbeeldingen." Selecteer onder de 340 en 380 kanalen 'regio 1' en klik vervolgens op 'Achtergrond trekken'.
- Voer het volledige experiment uit (F4: vooruit) om ervoor te zorgen dat er niets in de achtergrond regio valt, zoals een fluorescerende stofplek die door de achtergrondstreek reist en dat de cellen tijdens de experimenten niet bewegen.
Opmerking: de interessegebieden die geselecteerd zijnMag geen donkere gebieden bevatten; Anders zal de verhoudingswaarde luidruchtig zijn, als onderdeel van de achtergrond wordt in de meting opgenomen. - Klik op "Log data" en speel het hele experiment opnieuw.
Opmerking: hiermee wordt een spreadsheet geopend waarin de tijd en de ratio zijn aangemeld. Het is ook mogelijk om de individuele golflengtes van 340 nm en 380 nm te redden. - Om informatie over SOCE te krijgen, verwijder u de twee belangrijke parameters uit het experiment: de amplitude van de Ca 2+ -toevoeging en de helling van de Ca 2+ -fase ( Figuur 3 ).
- Verkrijg de amplitude door de verhoudingswaarde af te trekken net voor Ca 2+ re-addition van de maximale amplitude van de Ca 2+ -hoogte. Verkrijg de maximale helling door een lineaire regressie van de eerste seconden na de toevoeging van Ca 2+ aan te passen .
Opmerking: Het gebied onder de kromme van de thapsigargin-reactie is ook een informatieve parameter om te extracerenT, aangezien het de hoeveelheid vrije calcium opgeslagen in de SR weerspiegelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na de enzymatische dissociatie van een menselijk spiermonster werden cellen geamplificeerd in GM. Humane myoblasten, gedefinieerd als CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-cellen, werden verkregen na FACS. Myoblasten vertegenwoordigen meer dan 60% van de geanalyseerde populatie ( Figuur 1 ). Primaire humane myoblasten werden geherplanteerd, gegroeid tot samenvloeiing en gedurende 48 uur in DM gekweekt. Na immunostaining voor de expressie van de transcriptiefactor MEF2 en de spierspecifieke eiwitmyosin zware keten (MyHC), we waargenomen dat een meerderheid van cellen die myotubes in vitro vormden (MyHC-positieve cellen), met fusieindexwaarden van 60,9 ± 1,3% (N = 5; figuur 2 ). We hebben ook geconstateerd dat ongeveer 40% van de menselijke myoblasten, genaamd reservecellen, deze terminale differentiatie ontsnapt en ongedifferentieerde mononucleaire cellen bleven. Voor functionele studies analyseerden we de Ca 2+ respons van myoblasten of myotubes 48 uur na de aanvang vandifferentiatie. Figuur 3 toont een representatief protocol dat wordt gebruikt voor geïnduceerde SOCE en de sleutelparameters om uit dergelijke opname te extraheren. Om informatie te identificeren met betrekking tot de moleculen die betrokken zijn bij SOCE, werden cellen getransfecteerd met siRNA tegen het molecuul van belang. Figuur 4 toont de invloed van het stilzetten van Ca 2+ -doorlatende kanalen van de TRPC-familie op SOCE in myoblasten.
Figuur 1 : FACS van humane myoblasten. Dissocieerde menselijke cellen werden immunostained met antilichamen voor de volgende celoppervlakmarkers: CD45, CD56, CD34, CD144 en CD146. Na het uitsluiten van CD45-positieve hematopoietische cellen werden CD45-negatieve cellen gescheiden op basis van CD56 expressie. De CD56-positieve populatie werd vervolgens geluidd voor CD34, CD144 en CD146. Menselijke myoblasten werden gedefinieerd als CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-cellen, zoals eerder beschreven 19 , 4 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 : Human Myoblast Differentiatie. ( A ) Een confluente monolaag van humane myoblasten werd gedurende 48 uur aan DM blootgesteld; vastgesteld; En gekleurd met antilichamen tegen MEF2 (rood), MyHC (groen) en DAPI (blauw) om kernen te identificeren. Schaalbalk = 50 μm. ( B ) De fusieindex vertegenwoordigt het aantal kernen die in myotubes zijn opgenomen, gedeeld door het totale aantal kernen op een bepaald veld. Gegevens zijn gemiddeld ± SEM van 5 onafhankelijke experimenten.Ank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 3 : Representatieve Calciummeting van Thapsigargine-geïnduceerde SOCE. Myotubes werden geladen met Fura-2 en de cytosolische Ca2 + -concentratie werd gemeten. ( A ) De cellen zitten enkele minuten in een calciumbevattend medium, gevolgd door 2 minuten in een calciumvrij medium. 1 μM thapsigargine wordt dan gedurende 8 minuten gebruikt, gevolgd door de calciumherhaling. De 3 belangrijke parameters om uit deze opname te halen zijn: het gebied onder de kromme van de thapsigarginrespons, de helling van de SOCE en de amplitude van de SOCE. ( B ) Kwantificering van de 3 parameters. Het gebied onder de kromme geeft informatie over de hoeveelheid Ca 2+ die in de ER / SR is opgeslagen, en de twee andere parameters maken het mogelijk voor de kwantitatieveAksie van de SOCE. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4 : Betrokkenheid van TRPC1 en TRPC4 in SOCE. ( A ) Cytosolische Ca 2+ concentratie werd beoordeeld met behulp van Fura-2 in proliferatieve myoblasten getransfecteerd met siTRPC1 of siTRPC1 en siTRPC4. SOCE werd geactiveerd door de interne opslaguitputting met 1 μM thapsigargine bij afwezigheid van externe Ca 2+ (Ca 2+ vrij) en gemeten tijdens de hertoevoeging van 2 mM externe Ca 2+ . Elk spoor vertegenwoordigt het gemiddelde van een representatieve coverlip. ( B ) Kwantificering van de effecten van siRNA op SOCE amplitude. Dit cijfer is gewijzigd met referentie 12 , met toestemming. Bars ar E gemeen ± SEM, * p <0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Groeimedium (GM): | Concentratie | Differentiatiemedium (DM): | Concentratie | |||||
| Ham's F10 | DMEM | |||||||
| FCS | 15% | Runder serum albumine | 0,5 mg / ml | |||||
| Runder serum albumine | 0,5 mg / ml | Epidermale groeifactor | "> 10 ng / ml||||||
| fetuin | 0,5 mg / ml | insuline | 0,01 mg / ml | |||||
| Epidermale groeifactor | 10 ng / ml | creatine | 1 mM | |||||
| dexamethason | 0,39 μg / ml | pyruvaat | 100 μg / ml | |||||
| insuline | 0,04 mg / ml | uridine | 50 μg / ml | |||||
| creatine | 1 mM | gentamycine | 10 μg / ml | |||||
| pyruvaat | 100 μg / ml | <Td colspan = "2"> | ||||||
| uridine | 50 μg / ml | |||||||
| gentamycine | 5 μg / ml | |||||||
Tabel 1: Middelcompositie voor Myoblastcultuur.
| buizen | antilichamen | |||||
| 1 | Geen | |||||
| 2 | Isotype AlexaFluor 488-, Isotype PE-CF594, Isotype PE, Isotype PECy7Isotype APC | |||||
| 3 | Muis anti-menselijke CD56-AlexaFluor 488 | |||||
| 4 | Muis anti-Human CD45 PE-CF594 | |||||
| 5 | Muis anti-menselijk CD144-PE | |||||
| 6 | Muis anti-menselijk CD146-PECy7 | |||||
| 7 | Muis anti-menselijke CD34-APC | |||||
| 8 | Muis anti-menselijk CD56-AlexaFluor 488-, Muis anti-menselijk CD45 PE-CF594, Muis anti-menselijk CD144-PE, Muis anti-menselijk CD34-APC, Muis anti-menselijk CD146-PECy7 | |||||
Tabel 2: Antilichamen gebruikt voor de celsortering.
| Calcium bevattend medium | concentratie | Calciumvrij medium | concentratie | |||||
| NaCl | NaCl | 135 mM | ||||||
| KCl | 5 mM | KCl | 5 mM | |||||
| MgCl2 | 1 mM | MgCl2 | 1 mM | |||||
| CaCl2 | 2 mM | EGTA | 1 mM | |||||
| Hepes | 10 mM | Hepes | 10 mM | |||||
| Glucose | 10 mM | Glucose | 10 mM | |||||
| PH 7,45 aangepast met NaOH | PH 7,45 aangepast met NaOH | |||||||
Tabel 3: Middelcompositie voor Calcium Imaging Experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De isolatie en cultuur van menselijke myoblasten uit volwassen skeletspieren biedt een in vitro model om spierdifferentiatie en spierregeneratie te bestuderen. In dit document verschaffen wij een protocol dat de zuivering van hoge opbrengsten van menselijke myoblasten op een eenvoudige en kosteneffectieve manier mogelijk maakt. Bovendien biedt deze techniek betrouwbare en reproduceerbare resultaten in termen van het percentage geïsoleerde myoblasten en hun myogene differentiatie-efficiëntie. Inderdaad, we hebben ongeveer 60% van de menselijke myoblasten verkregen na celsortering. Deze cellen kunnen worden gehandhaafd in cultuur voor maximaal 6 passages (ongeveer 30 verdubbeling) en houden hun capaciteiten om te onderscheiden. Bovendien komt myogene differentiatie snel na het veranderen van het medium van GM naar DM, aangezien na 2 tot 3 dagen in DM de myoblastfusie maximaal is. In dit model versmelt ongeveer 60% van de myoblasten na 2 dagen in DM in myotubes. Een ander voordeel is dat deze primaire menselijke celL culturen worden gemakkelijk met siRNA getransfecteerd. De GM en DM media die in ons laboratorium worden gebruikt, zijn zelfgemaakt. Als alternatief kunnen commerciële media worden gebruikt, maar we hebben nooit hun efficiëntie in menselijke primaire culturen geprobeerd.
Een nadeel van de genoemde methode is het gebruik van trypsine tijdens weefsel-enzymatische vertering. Deze procedure verwijdert een grote fractie van de celoppervlakmarkers en impliceert dat we de cellen gedurende enkele dagen in de cultuur verlaten voordat u FACS uitvoert. Collagenase kan in plaats van trypsine gebruikt worden om de membraanproteïnen beter te behouden en de sortering van menselijke myoblasten direct na het weefseldissociatie mogelijk te maken. Echter, de kosten van collagenase zijn significant hoger dan trypsine, en een amplificatie stap zou nog steeds nodig zijn na celsortering om voldoende celnummer te verkrijgen voor de daaropvolgende experimenten. Een andere beperking van de techniek is de "kwaliteit" van de spiermonsters die van orthoped worden verkregenIc operatie. Inderdaad, de verkregen stukken weefsel zouden min of meer beschadigd kunnen zijn door een operatie, en de tijd tussen de operatie en de celdissociatie in het laboratorium kan van dag tot dag verschillen. Echter, voor myoblastisolatie, zuivering en differentiatie in myotubes, krijgen we regelmatig bevredigende resultaten. Tenslotte kan de leeftijd van de patiënt een probleem zijn, aangezien de hoeveelheid en regeneratieve capaciteit van satellietcellen afnemen met 20 jaar . Zo beperken we onze experimenten aan jonge patiënten (minder dan 40 jaar).
Zoals hierboven vermeld, onderscheiden myoblasten snel en efficiënt, wat een groot voordeel is om de initiële gebeurtenissen van skeletspierdifferentiatie te bestuderen. Echter, als myotubes snel gevormd worden, hebben ze ook de neiging om spontaan te contracteren en los te maken van de kweekplaten. Dit voorkomt de analyse van de latere fusie-gebeurtenissen. Om deze latere gebeurtenissen te bestuderen zou men nodig hebbenOm de cultuurplaat te bekleden met extracellulaire matrix om de celadhesie te verbeteren en de myotube-afscheiding 21 te verminderen.
Calciumbeeldvorming met behulp van de fluorescerende sonde Fura-2 is een veelgebruikte, reproduceerbare techniek die gemakkelijk uit te voeren is. Het laden van Fura-2 is efficiënt, en het gebruik van een ratiometrische sonde zoals Fura-2 heeft meerdere voordelen ten opzichte van een enkel-golflengte kleurstof. Het normaliseert veranderingen van focus of verschillen in het laden tussen cellen en binnen een cel ( bijv. Nucleus versus cytosol). Het protocol dat we beschreven hebben om SOCE uit te lokken en te meten, wordt regelmatig gebruikt in veel verschillende cellulaire systemen. Het stilzetten van verschillende kanalen of calciumregelaars maakt het mogelijk de moleculaire samenstelling van SOCE te verklaren en het relatieve belang van de verschillende spelers, zowel in myoblasten als in myotubes. Een alternatieve aanpak met behulp van Fura-2 en Ca 2+ beeldvorming is de toepassing van deMn 2+ quench techniek. Mn 2+ komt in de cellen door Ca 2+ -doorlaatbare kanalen en blokkeert de fura-2 fluorescentie. De maatregel van het bluspercentage geeft een meer directe maatregel van de SOCE 22 , 23 . Dit vereist echter het gebruik van iets andere apparatuur. Ca 2+ signalering kan ook worden uitgevoerd met behulp van genetisch gecodeerde Ca 2+ indicatoren, die het grote voordeel hebben om precies gelokaliseerd te zijn in verschillende celcompartimenten. De nadelen zijn de eis voor celtransfectie en de dynamiek van het signaal, dat meestal minder is dan met chemische kleurstoffen 24 . Om Ca 2+ te meten in organellen zoals mitochondria of de SR, zijn de genetische probes de gouden standaard. Voor cytosolische Ca 2+ -metingen blijft het voordeel om Fura-2 over genetische probes te gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (subsidienummer 310030-166313), de "Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", de "Stichting Marcel Levaillant" en de "Fondation pour la recherche ostéo-articulaire."
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 mL tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 mL tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 mL tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. |
References
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
- Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
- Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
- Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
- Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
- Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
- Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
- Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
- Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
- Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
- Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
- Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
- Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
- Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
- Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
- Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).
