Summary
Qui descriviamo una metodologia per ottenere una popolazione pura di mioblasti umani dal tessuto muscolare adulto. Queste cellule sono utilizzate per studiare la differenziazione muscolare scheletrica in vitro e, in particolare, per studiare le proteine coinvolte nella segnalazione Ca 2+ .
Abstract
Le cellule satellitari (SC) sono cellule staminali muscolari situate tra la membrana plasmatica delle fibre muscolari e la lamina basale circostante. Sono essenziali per la rigenerazione muscolare. A seguito di lesioni, che si verificano spesso nei muscoli scheletrici, vengono attivati SC. Si proliferano come mioblasti e si differenziano per riparare le lesioni muscolari. Tra molti eventi che si verificano durante la differenziazione muscolare, i segnali citocholic Ca 2+ sono di grande importanza. Questi segnali Ca 2+ derivano da Ca 2+ rilascio dalla interne Ca 2 + negozi, nonché da Ca 2+ voce dallo spazio extracellulare, in particolare il negozio azionato Ca 2+ entrata (Soče). Questo documento descrive una metodologia utilizzata per ottenere una pura popolazione di mioblasti umani provenienti da campioni muscolari raccolti dopo la chirurgia ortopedica. Il tessuto viene digerito meccanicamente ed enzimatico e le cellule vengono amplificate e poi ordinate mediante citometria a flusso in funzione della presenza di speciMarcatori a membrana fic. Una volta ottenuto, i mioblasti umani si espandono e si impegnano a differenziarsi rimuovendo i fattori di crescita dal mezzo di coltura. I livelli di espressione di fattori specifici di trascrizione e di immunofluorescenza in vitro vengono utilizzati per valutare il processo di differenziazione miogenica nelle condizioni di controllo e dopo la silenziazione delle proteine coinvolte nella segnalazione Ca 2+ . Infine, abbiamo dettagliato l'uso di Fura-2 come una sonda ratiometrica Ca 2+ che fornisce misure affidabili e riproducibili di SOCE.
Introduction
I muscoli scheletrici umani sono composti da gruppi di fibre muscolari contrattili e multinucleate derivanti dalla fusione di cellule precursori miogeniche. I muscoli scheletrici hanno la capacità di rigenerarsi dopo lesioni grazie alla presenza di SC, le cellule staminali del muscolo scheletrico situate tra la membrana plasmatica delle miofibere (sarcolemma) e la lamina basale. Nel muscolo non sinistro, gli SC sono prevalentemente presenti in uno stato quiescente. In risposta a stress meccanici o lesioni, le SC si attivano (myoblasti), si proliferano e subiscono differenze per formare nuove miofibere o auto-rinnovamento per ricostituire il pool SC 1 , 2 . Nel corso degli anni sono state sviluppate diverse tecniche per isolare SC e la loro progenie, i mioblasti, dalle biopsie muscolari dello scheletro. Con la maggiore comprensione dei marker di superficie delle cellule espressi su queste cellule e la metodologia della classificazione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) 3, 4 , 5 , è ora possibile isolare popolazioni puro di mioblasti umane dai campioni muscolari.
La segnalazione del calcio regola lo sviluppo muscolare scheletrico, l'omeostasi e la rigenerazione. In particolare, la voce Ca 2+ attivata dopo l'esaurimento intracellulare del negozio, chiamata SOCE, è di grande importanza 6 per questi processi. Con la stimolazione cellulare, il livello Ca 2+ nel reticolo endo / sarcoplasmatico (ER / SR) diminuisce, che a sua volta attiva il canale Ca 2+ delle membrane plasmatiche che consentono l'ingresso di Ca 2+ per riempire l'ER / SR 7 . Le due principali proteine coinvolte nella SOCE sono la proteina di interazione stromale 1 (STIM1) ER / SR Ca 2+ e la membrana plasmatica Ca 2+ canale Orai1. Il muscolo scheletrico esprime abbondantemente queste due proteine, così come altre proteine delle stesse famiglie (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 e diversi canali permeabili Ca 2+ della famiglia canonica potenziale recettoriale transiente (TRPC) 10 , 11 , 12 , 13 . La penetrazione Ca 2+ attraverso il percorso SOCE è di grande importanza per la formazione / rigenerazione muscolare 14 . Le mutazioni delle proteine STIM1 o Orai1 hanno effetti deleteri sulla funzione muscolare, determinando principalmente l'ipotonia muscolare 15 . Modelli animali con insufficienza SOCE mostrano anche ridotta massa muscolare e della forza, insieme con una maggiore affaticabilità 6, 16, 17. Come già accennato, altre proteine di STIM e Orai, così come molti canali TRPC, sono espresse in muscoli scheletrici, ei loro rispettivi ruoli non sono stati ancora determinati. Colpendo dPossiede il loro livello di espressione, è quindi possibile esaminare le loro implicazioni nella SOCE e nei loro ruoli durante la differenziazione muscolare scheletrica umana.
La misurazione SOCE può essere effettuata utilizzando due approcci diversi: registrazioni elettrofisiologiche di corrente e misurazioni Ca 2+ . L'elettrofisiologia è sicuramente un metodo più diretto, in quanto misura la corrente dell'interesse e la relativa firma elettrofisiologica. Tuttavia, questa tecnica è molto difficile applicarsi alle cellule muscolari, soprattutto a causa della grande dimensione delle cellule muscolari e della piccola dimensione della corrente SOCE endogena. L'imaging Cytosolic Ca 2+ è tecnicamente molto accessibile, ma la misura è più indiretta, poiché il livello Ca 2+ misurato nel citosol riflette sia l'ingresso di Ca 2+ che il riapprocco della cellula o nei negozi interni.
Una metodologia che prevede l'isolamento di mioblasti da piccoli pezzi di scafo umanoIl muscolo etale dopo la digestione enzimatica, l'amplificazione e la FACS è spiegato in questo articolo. Il processo di differenziamento muscolare e il protocollo immunofluorescenza per seguire l'espressione dei marcatori di differenziazione nel tempo sono descritti 18. Infine, si spiega la misurazione del SOCE e il ruolo dei differenti canali ionici nella distinzione del segnale di Ca 2+ e della differenziazione muscolare scheletrica.
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Protocol
I campioni muscolari umani (tessuti ottenuti da muscoli semitendinosi) sono stati raccolti durante la chirurgia ortopedica su pazienti sani come rifiuti chirurgici. Tutti i metodi relativi allo studio umano sono stati eseguiti secondo le linee guida e le regolamentazioni delle autorità svizzere di regolamentazione sanitarie e approvate dalla Commissione Cantonale d'Etichetta de la Recherche delle autorità cantonali di Ginevra (protocollo CER n. 12-259) . Consensi informati e scritti sono stati ottenuti da tutti i soggetti adulti coinvolti nello studio.
1. Isolamento dei mioblasti dal muscolo scheletrico umano
- Durante tutte le procedure, mantenere le condizioni sterili lavorando sotto una cappa di coltura tissutale di livello II e utilizzando buffer sterili e sterili sterili.
Nota: questa procedura può essere applicata a molti muscoli scheletrici umani.
2. Protocollo di dissociazione
- Portare i campioni muscolari (2 - 3 g) in un sterile 6 cmpiatto.
- Lavare i campioni muscolari con 5 - 10 ml di soluzione salina fosfata tamponata (PBS). Ripetere il lavaggio.
- Rimuovere i tessuti connettivi e adiposi usando forbici curve e un morsetto.
- Pesare il campione muscolare (vedere passo 2.13) e trasferirlo in una nuova piastra sterile di 6 cm.
- Aggiungere 5 mL di 0,05% di Trypsin-EDTA.
- Usando le forbici tagliate e strappate il tessuto muscolare in piccoli pezzi (meno di 2 mm).
- Usando una pipetta serologica da 10 ml, trasferire il muscolo scremato in una bottiglia di dissociazione da 200 mL contenente una barra magnetica. Ripetere questa fase fino a quando 90 mL di 0,05% di Trypsin-EDTA sono stati trasferiti con tutti i muscoli tritati alla scatola di dissociazione. Chiudere la bottiglia di dissociazione e incubare a 37 ° C per 60 minuti con agitazione minima.
- Rimuovere la bottiglia di dissociazione dal bagno di riscaldamento e fermare la reazione enzimatica aggiungendo alla bottiglia di dissociazione 10 ml di siero di vitello fetale (FCS, 10% di volume finale). Homogenizzare la miscela con una pipetta.
- PrepSono due tubi da 50 mL con un filtro di cellule da 70 μm su ciascuno. Passare la metà della sospensione cellulare attraverso il filtro cellulare su ciascun tubo pipettando su e giù sul filtro finché la sospensione non passa.
- Centrifugare i tubi a 200 xg e 20 ° C per 5 min; Aspirare e scartare il surnatante.
- Resuspendere le cellule con 10 ml di mezzo di crescita (GM, Tabella 1 ) e passare le cellule attraverso un filtro di cellule da 40 μm posto su un tubo da 50 ml. Centrifugare il tubo a 200 xg e 20 ° C per 5 min; Aspirare e scartare il surnatante.
- Riposizionare le cellule con 10 ml di GM e centrifugare il tubo a 200 xg e 20 ° C per 5 min; Aspirare e scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule con 1 ml di GM e contare le cellule utilizzando una camera Neubauer.
Nota: di solito, una raccolta di 3 x 10 5 cellule per g di muscolo dovrebbe essere raccolta. La resa è calcolata dividendo il numero di cellule per il peso del biopicino muscolare(Punto 2.4). - Mettere 2 x 10 5 cellule in una piastra sterile da 6 cm contenente 4 mL di GM e incubare a 37 ° C e 7% CO 2 . Preparare il maggior numero di piatti come necessario.
- Cambiare il GM dopo 3 giorni.
Nota: le cellule appena dissociate necessitano di tempo per aderire alla piastra di coltura. Inoltre, il primo tempo di radiazione cellulare myogenica è di circa 50-60 h. Dopo la prima divisione, il tempo di raddoppiamento è di circa 20 h. - Dopo 5 - 7 giorni, quando le cellule raggiungono la confluenza del 70-80% (circa 1,5 x 10 6 cellule per ogni piastra di 6 cm), avviare la colorazione degli anticorpi e l'ordinamento delle cellule (fase 3).
3. Colorazione degli anticorpi e selezione delle cellule
- Dopo il risciacquo una volta con PBS, incubare le cellule aderenti (nella piastra da 6 cm) con 1 ml di Trypsin-EDTA 0,05% a 37 ° C e 7% di CO 2 per 3 minuti (o incubare a 5% CO 2 ). Interrompere la reazione aggiungendo 2 mL di GM e raccogliere le cellule in un tubo di 15 mL. Dopo centrifugazione (200 xg per 5 min), resMuovere le cellule in 1 ml di GM.
- Contare le celle usando una camera Neubauer.
- Eseguire le seguenti procedure su ghiaccio.
Nota: la procedura per l'impostazione della corretta compensazione della fluorescenza sul citometro è essenziale e dovrebbe essere simile a qualsiasi citometro. I tubi 1 e 2 sono usati come controlli negativi. I tubi da 3 a 7 vengono utilizzati per impostare la compensazione sul citometro durante il primo esperimento ( Tabella 2 ). La concentrazione finale utilizzata per ogni anticorpo e il relativo isotipo corrispondente deve essere la stessa (circa 1 μg / 10 6 cellule). - Spedire 1 x 10 5 cellule per tubo (tubo da 5 mL) per i tubi da 1 a 7 ( Tabella 2 ). Posizionare la sospensione cellulare residua nel tubo 8 per l'ordinamento delle cellule.
- Lavare le cellule con 1 mL di freddo FACS buffer (PBS-5% FCS). Chiudere e centrifugare i tubi a 200 xg e 4 ° C per 5 min; Aspirare e scartare il surnatante.
- Aggiungere 200 μL di buffer FACS per tubo. Aggiungere gli anticorpi a thTubo secondo la tabella 2 . Incubare su ghiaccio per 30 min.
- Lavare le cellule: aggiungere 1 mL del tampone FACS ad ogni tubo. Chiudere e centrifugare i tubi a 200 xg e 4 ° C per 5 min. Aspirare e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
- Resuspendere le cellule in 500 μL di buffer FACS. Chiudere i tubi e tenerli in ghiaccio fino alla selezione delle celle. Preparare 4 tubi da 1,5 mL ciascuno contenente 500 μL di GM, che è necessario per raccogliere le cellule durante la selezione delle cellule. Tenerli in ghiaccio.
- Ordinare i mioblasti umani mediante citometria a flusso ( Figura 1 ). Dopo aver escluso le cellule ematopoietiche CD45-positive, le cellule separate CD45-negative basate sull'espressione CD56. Quindi, portare la popolazione CD56-positiva per CD34, CD144 e CD146 (mioblasti umani sono definiti come cellule CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-). Riesaminare una piccola frazione della popolazione cellulare ordinata per controllare la purezza.
- Raccogliere i tubi contenenti myobla umanaIn un tubo da 15 ml e lavare una volta aggiungendo 5 ml di GM. Centrifugare il tubo a 200 xg e 20 ° C per 5 min; Aspirare e scartare il surnatante.
- Resuspendere le cellule in 1 mL di GM e piastrare le cellule su una piastra di 6 cm non rivestita contenente 4 mL di GM (2 x 10 5 cellule per piastra). Incubare a 37 ° C e 7% CO 2 .
4. Manutenzione delle cellule
- Cambi la metà del terreno di coltura ogni 2 giorni. Rimuovere 2 mL di vecchio GM dal piatto di coltura e aggiungere 2 mL di GM.
Nota: I mioblasti producono fattori di crescita che beneficiano di condizioni di coltura. - Trypsinize le cellule quando raggiungono la confluenza del 70-80% per evitare la pre-differenziazione. Dopo il risciacquo una volta con PBS, incubare le cellule aderenti (nella piastra da 6 cm) con 1 mL di trypsin-EDTA allo 0,05% a 37 ° C e 7% di CO 2 per 3 min. Interrompere la reazione aggiungendo 2 mL di GM e raccogliere le cellule in un tubo da 15 mL. Dopo centrifugazione (200 xg per 5 min), resusIncollare le cellule in 1 mL di GM.
- Contare le cellule e preparare piastre da 6 cm con 2 x 10 5 cellule per piastra in 4 mL di GM.
- Mantenere i mioblasti umani fino a 6 passaggi o congelarli in GM contenenti 10% DMSO, 1 x 10 6 cellule per ml. Bloccare le cellule in una scatola di congelamento progressiva (1 ° C / min); Per l'immagazzinamento a lungo termine, posizionare le cellule in azoto liquido.
5. Trasfezione di mioblasti umani con siRNA
Nota: I mioblasti vengono trasfettati utilizzando un reagente di transfection commerciale due giorni prima dell'induzione della differenziazione. L'effetto di siRNA specifico contro un gene è sempre paragonato all'effetto di un siRNA di controllo. I siRNA sono RNA a doppio filamento che devono essere mantenuti sul ghiaccio e manipolati con guanti.
- Ottenere un monolayer confluento del 70-80% di mioblasti umani in una piastra da 6 cm (circa 1,5 x 106 cellule).
Nota: 5 x 10 5 cellule per transfezione sono necessarie per ottenere un conFluido monolayer di mioblasti transfettati dopo 2 giorni in GM. - Preparare le copertine di vetro (descritte per l'imaging del calcio nel passaggio 7).
- GM caldo, 0,05% Trypsin-EDTA e PBS a 37 ° C.
- Eseguire tutte le fasi seguenti in un cappuccio per la cultura tissutale di livello II per mantenere la sterilità.
- In un tubo da 1,5 ml, spedire 500 μl di mezzo sierico ridotto, 3 μl di reagente di trasfezione e 1 μL di siRNA a 20 μM. Mescolare delicatamente e mantenere a temperatura ambiente (RT) per 15 - 20 min.
- Durante questo periodo di incubazione, preparare i mioblasti per la trasfezione. Dopo il risciacquo una volta con PBS, incubare le cellule aderenti (nella piastra da 6 cm) con 1 mL di trypsin-EDTA allo 0,05% a 37 ° C e 7% di CO 2 per 3 min. Interrompere la reazione aggiungendo 2 mL di GM e raccogliere le cellule in un tubo da 15 mL. Dopo centrifugazione (200 xg per 5 minuti), risospendere le cellule in 1 mL di GM.
- Contare le celle usando una camera Neubauer.
- Resuspendere 5 x 10 5 celluleIn 200 μL di GM per ogni transfezione ( vale a dire, per 2 transfezioni, risospendere in 400 μL).
- Aggiungere 200 μL di sospensione cellulare ad ogni 500 μL di miscela di siRNA-transfettante. Pipette su e giù due volte e incubare per 5 minuti a RT.
- Aggiungere il 700 μL (cellule + siRNA-transfettante) ad un piatto di coltura da 3,5 cm contenente una copertura in vetro. Aggiungere GM per ottenere un volume finale di 2 ml.
- Dopo 24 h a 37 ° C e 7% CO 2 , sostituire completamente il mezzo con 2 ml di GM fresco. Dopo altri 24 h, è solitamente presente un monolayer confluente di cellule trasfettate; In caso affermativo, indurre la differenziazione del mioblasto sostituendo il GM con 2 mL di mezzo di differenziazione (DM, Tabella 1 ).
- Eseguire esperimenti di formazione del calcio 24 - 48 h dopo l'induzione della differenziazione o sulla proliferazione di mioblasti.
Nota: L'immunofluorescenza viene di solito eseguita 48 h dopo l'induzione della differenziazione.
6. ImmUnofluorescenza Colorazione dei marker di differenziazione
Nota: La colorazione dell'immunofluorescenza viene eseguita dopo 48 ore in DM, ma può essere eseguita anche in altri tempi di differenziazione. Myogenin e MEF2 sono proteine nucleari espresse solo in cellule differenziate (prima della fusione in miotubi) e la loro colorazione consente di valutare il processo di differenziazione. La catena pesante Myosin (MyHC) è espressa solo in myotubes ed è usata per stimare la dimensione del myotube e l'indice di fusione (numero di nuclei in myotubes / numero totale di nuclei).
- Dopo 48 h in DM, lavare il monolavoro confluente di cellule differenziate due volte con 1 ml di PBS a RT. Fai questo con attenzione per evitare di staccare i myotubes.
- Fissare le cellule con 1 ml di 4% di paraformaldeide (PFA) per 15 minuti a RT. Lavare le cellule con PBS due volte, per 5 minuti ciascuno.
- Permeabilizzare le cellule con 1 ml di PBS contenente 0,25% Triton X-100 per 45 minuti e lavare 3 volte con 1 ml di PBS.
- Blocca unsPecifici incubando le cellule in PBS integrate con 0,2% Tween-10 e 2% di capra di capra (soluzione di blocco) per 30 minuti a RT.
- Preparare anticorpi primari diluiti in soluzione a blocchi (600 μL per piastra da 3,5 cm).
Nota: vengono utilizzati gli anticorpi primari seguenti: anti-miogenina del mouse (1: 600), coniglio anti-MEF2 (1: 300) e anticorpi anti-MyHC del mouse (MF20, 1: 1000). È possibile mescolare nella stessa soluzione di blocco, la catena pesante anti-myosina del mouse o anti-miogenina del mouse, con anti-MEF2 coniglio. - Rimuovere la soluzione di blocco e aggiungere 600 μL di soluzioni anticorpali primarie per una piastra da 3,5 cm e incubare per una notte a 4 ° C in una camera umidificata.
- Lavare le cellule 3 volte con 1 ml di PBS. Incubare per 1 h alla RT in una camera oscura con 600 μL degli anticorpi secondari preparati nella soluzione di blocco, come segue: Alexa 488 anti-mouse capra (1: 1,000), Alexa 546 anti-rabbino capra (1: 1000) E DAPI (1:50, soluzione di riserva a 15 μM).
CAUTION: DAPI è un composto tossico che deve essere manipolato con i guanti. - Aspirare e lavare le cellule 3 volte con 1 mL di PBS.
- Montare le copertine di vetro usando il mezzo di montaggio dell'alcool polivinilico con la soluzione antifading. Tenerli a 4 ° C e protetti dalla luce fino all'immagine delle cellule.
7. Calcio Imaging
- Cultura precedente, preparare le copertine in vetro di 25 mm di diametro. Mettere le copertine in etanolo al 70% per 48 ore per rimuovere grassi e sporcizia dalla superficie, che riduce l'adesione cellulare alla copertura.
- Dopo aver risciacquato le copertine più volte con acqua, metterle nuovamente in acqua e sterilizzarle (autoclavate).
- Mettere una copertura per la piastra di coltura da 3,5 cm e lasciarli asciugare. Conservare i piatti di Petri per ulteriori esperimenti o utilizzarli immediatamente.
- Aggiungere i myoblasti transfettati (5 - 6 x 10 5 cellule) alla copertura in vetro.
Nota: gli esperimenti vengono eseguiti 24 - 48 h dopo l'induzione di differentiatiOn, o sulla proliferazione di mioblasti. - Per eseguire l'imaging Ca 2+ , lavare le cellule 2 volte con PBS o direttamente con il mezzo utilizzato per gli esperimenti (terreno contenente calcio, Tabella 3 ). Caricare le cellule con 2 μM Fura-2 / AM e 1 μM di acido pluronico per circa 30 minuti al buio a RT.
Nota: L'acido pluronico aiuta a solubilizzare Fura-2. Fura-2 / AM e acido pluronic sono sciolti nel mezzo contenente calcio. - Lavare le cellule due volte nello stesso mezzo ma senza Fura-2 / AM e acido pluronico e lasciarle al buio per altri 10-15 minuti per consentire la de-esterificazione di Fura-2 / AM.
- Se l'efficienza di caricamento di Fura-2 è troppo bassa, aggiungere un altro Fura-2 ( ad esempio, 4 μM) e / o incubare le cellule per un tempo più lungo ( ad esempio, 40 minuti).
- Rimuovere il coperchio dalla piastra di coltura e installarlo nella camera sperimentale. Aggiungere 1 ml di mezzo contenente calcio (a seconda del volume dell'espertoCamera mentale). Installarlo sulla fase del microscopio e avviare la registrazione.
Nota: La sonda fluorescente Ca 2 + -sensitiva Fura-2 viene eccitata alternativamente a 340 nm e 380 nm e la luce di emissione viene raccolta a 510 nm. Poiché le oscillazioni della concentrazione Ca 2+ sono relativamente lente, acquisire 1 rapporto ogni 2 s. - Per attivare SOCE, viene utilizzato il seguente classico protocollo thapsigargin / Ca 2+ di re-aggiunta: lasciare le cellule per 2-3 min in mezzo contenente calcio. Sostituire il supporto con un mezzo privo di calcio per 1-2 minuti.
- Aggiungere 1 μM thapsigargin per esaurire i depositi di calcio interni.
Nota: Thapsigargin è un bloccante irreversibile di attività della pompa sarco-endoplasmatica Ca 2+ ATPase (SERCA). Dopo 8-10 minuti sostituire rapidamente il mezzo con il mezzo contenente calcio. Ca 2+ entrerà nelle celle attraverso i canali SOCE. Attendere circa 5 minuti prima di terminare gli esperimenti.
ATTENZIONE: Thapsigargin è un composto tossico che deve essere manipolato con guanti.
- Aggiungere 1 μM thapsigargin per esaurire i depositi di calcio interni.
8. Ca 2+ Analisi delle misure
Nota: eseguire l'analisi con il software di acquisizione.
- Apri l'esperimento. Disegna la regione 1 in una zona in cui non esistono celle (regione di sfondo) e tracciano le altre regioni nel citoplasma delle cellule da analizzare (le regioni possono essere disegnate su qualsiasi immagine: i 340 nm, i 380 nm, O l'immagine di rapporto). Vai a "Esegui esperimenti"> "immagini di riferimento". Sotto i 340 e 380 canali, seleziona "regione 1" e poi clicca su "Sottrarre lo sfondo".
- Esegui l'intero esperimento (F4: in avanti) per assicurarsi che nulla interferisca con la regione di sfondo, ad esempio un punto di polvere fluorescente che attraversa la regione di sfondo e che le cellule non si muovono durante il tempo degli esperimenti.
Nota: Le regioni di interesse selezionateNon dovrebbe includere aree scure; Altrimenti, il valore di rapporto apparirà rumoroso, come parte dello sfondo sarà incluso nella misurazione. - Fai clic su "Dati del registro" e riproduce di nuovo l'intero esperimento.
Nota: aprire un foglio di calcolo in cui viene registrato il tempo e il rapporto. È anche possibile salvare le singole lunghezze d'onda 340 nm e 380 nm. - Per ottenere informazioni su SOCE, estrarre i due parametri importanti dall'esperimento: l'ampiezza della re-aggiunta Ca 2+ e la pendenza della fase di ingresso Ca 2+ ( Figura 3 ).
- Ottieni l'ampiezza sottraendo il valore di rapporto appena prima della ricomposizione Ca 2+ dall'amplificazione massima dell'elevazione Ca 2+ . Ottieni la pendenza massima montando una regressione lineare dei primi secondi dopo la ricomposizione Ca 2+ .
Nota: L'area sotto la curva della risposta di thapsigargin è anche un parametro informativo per estrarreT, in quanto riflette la quantità di calcio libero immagazzinato nel SR.
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Representative Results
Dopo la dissociazione enzimatica di un campione muscolare umano, le cellule sono state amplificate in GM. I mioblasti umani, definiti come cellule CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, sono stati ottenuti dopo FACS. Myoblasti rappresentavano più del 60% della popolazione analizzata ( Figura 1 ). I mioblasti umani primari sono stati riversati, coltivati alla confluenza e coltivati in DM per 48 h. Dopo l'immunostaining per l'espressione del fattore di trascrizione MEF2 e la catena pesante miozinica (MyHC) proteina specifica muscolare, abbiamo osservato che la maggior parte delle cellule formavano myotubes in vitro (cellule MyHC positive), con valori di indice di fusione di 60,9 ± 1,3% (N = 5, figura 2 ). Abbiamo anche osservato che circa il 40% dei mioblasti umani, chiamati cellule di riserva, hanno sfuggito questa differenziazione del terminale e sono rimaste cellule mononucleate indifferenziate. Per studi funzionali abbiamo analizzato la risposta Ca 2+ di myoblasts o myotubes 48 h dopo l 'inizio didifferenziazione. La Figura 3 mostra un protocollo rappresentativo utilizzato per l'SOCE indotto e i parametri chiave da estrarre da tale registrazione. Per discernere le informazioni relative alle molecole coinvolte in SOCE, le cellule sono state trasfettate con siRNA contro la molecola di interesse. La Figura 4 mostra l'impatto del silenziamento dei canali periferici Ca 2+ della famiglia TRPC su SOCE nei mioblasti.
Figura 1 : FACS di mioblasti umani. Le cellule umane dissociate sono state immunocviluppate con anticorpi per i seguenti marcatori di superficie cellulare: CD45, CD56, CD34, CD144 e CD146. Dopo aver escluso le cellule ematopoietiche CD45-positive, le cellule negative CD45 furono separate a seconda dell'espressione CD56. La popolazione CD56-positiva è stata quindi gated per CD34, CD144 e CD146. Myoblasti umani sono stati definiti come CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, come descritto in precedenza 19 , 4 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Differenziazione del miooblasto umano. ( A ) Un monolayer confluente di mioblasti umani è stato esposto a DM per 48 ore; fisso; E macchiato con anticorpi contro MEF2 (rosso), MyHC (verde) e DAPI (blu) per identificare i nuclei. Barra di scala = 50 μm. ( B ) L'indice di fusione rappresenta il numero di nuclei incorporati in myotubes divisi per il numero totale di nuclei su un certo campo. I dati sono la media ± SEM di 5 esperimenti indipendenti.Ank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Misura rappresentativa del calcio di SOCE indotta da Thapsigargin. Myotubes sono stati caricati con Fura-2 e la concentrazione citosolica Ca 2+ è stata misurata. ( A ) Le cellule siedono per qualche minuto in un mezzo contenente calcio, seguite da 2 minuti in un mezzo senza calcio. Si impiega quindi 1 μM thapsigargin per 8 minuti, seguita dalla re-aggiunta del calcio. I tre parametri importanti da estrarre da tale registrazione sono: l'area sotto la curva della risposta di thapsigargin, la pendenza del SOCE e l'ampiezza dell'SOCE. ( B ) Quantificazione dei 3 parametri. L'area sotto la curva fornisce informazioni sulla quantità di Ca 2+ immagazzinata nell'ER / SR, ei due altri parametri consentono la quantificazioneDella SOCE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Coinvolgimento di TRPC1 e TRPC4 in SOCE. ( A ) La concentrazione di Ca 2+ citosolica è stata valutata usando Fura-2 in mioblasti proliferanti trasfettate con siTRPC1 o siTRPC1 e siTRPC4. SOCE è stato attivato dalla depletione del negozio interno con 1 μM thapsigargin in assenza di Ca 2+ esterno (Ca 2+ libero) e misurata durante la re-aggiunta di 2 mM Ca 2+ esterna. Ogni traccia rappresenta la media di una copertina rappresentativa. ( B ) Quantificazione degli effetti di siRNA sull'ampiezza del SOCE. Questa cifra è stata modificata dal riferimento 12 , con il permesso. Bar ar Significa ± SEM, * p <0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Mezzo di crescita (GM): | Concentrazione | Medio di differenziazione (DM): | Concentrazione | |||||
| Ham's F10 | DMEM | |||||||
| FCS | 15% | Albumina di siero bovina | 0,5 mg / ml | |||||
| Albumina di siero bovina | 0,5 mg / ml | Fattore di crescita epidermico | "> 10 ng / ml||||||
| fetuina | 0,5 mg / ml | insulina | 0,01 mg / ml | |||||
| Fattore di crescita epidermico | 10 ng / ml | creatina | 1 mM | |||||
| desametasone | 0,39 μg / ml | piruvato | 100 μg / ml | |||||
| insulina | 0,04 mg / ml | uridina | 50 μg / ml | |||||
| creatina | 1 mM | gentamicina | 10 μg / ml | |||||
| piruvato | 100 μg / ml | <Td colspan = "2"> | ||||||
| uridina | 50 μg / ml | |||||||
| gentamicina | 5 μg / ml | |||||||
Tabella 1: Composizione media per la cultura miooblastica.
| tubi | anticorpi | |||||
| 1 | Nessuna | |||||
| 2 | Isotipo AlexaFluor 488-, isotipo PE-CF594, isotipo PE, isotipo PECy7Isotipo APC | |||||
| 3 | Mouse anti-umano CD56-AlexaFluor 488 | |||||
| 4 | Anti mouseUmano CD45 PE-CF594 | |||||
| 5 | Mouse anti-umano CD144-PE | |||||
| 6 | Mouse anti-umano CD146-PECy7 | |||||
| 7 | Mouse anti-umano CD34-APC | |||||
| 8 | Anti-umano CD56-AlexaFluor 488, mouse anti-umano anti-umano CD45 PE-CF594, mouse anti-umano CD144-PE, mouse anti-umano CD34-APC, mouse anti-umano CD146-PECy7 | |||||
Tabella 2: Anticorpi utilizzati per la selezione delle cellule.
| Medio contenente calcio | concentrazione | Medio senza calcio | concentrazione | |||||
| NaCl | NaCl | 135 mM | ||||||
| KCl | 5 mM | KCl | 5 mM | |||||
| MgCl2 | 1 mM | MgCl2 | 1 mM | |||||
| CaCl2 | 2 mM | EGTA | 1 mM | |||||
| Hepes | 10 mM | Hepes | 10 mM | |||||
| Glucosio | 10 mM | Glucosio | 10 mM | |||||
| PH 7,45 regolato con NaOH | PH 7,45 regolato con NaOH | |||||||
Tabella 3: Composizione media per esperimenti di formazione del calcio.
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Discussion
L'isolamento e la cultura dei mioblasti umani dal muscolo scheletrico adulto offre un modello in vitro per studiare la differenziazione muscolare e la rigenerazione muscolare. In questo documento, forniamo un protocollo che consente la purificazione di elevate rese di mioblasti umane in modo semplice e costoso. Inoltre, questa tecnica fornisce risultati affidabili e riproducibili in termini di percentuale di mioblasti isolati e della loro efficacia di differenziazione myogenica. Infatti, abbiamo ottenuto circa il 60% dei mioblasti umani dopo la selezione delle cellule. Queste cellule possono essere mantenute in coltura per un massimo di 6 passaggi (circa 30 doppi) e mantenere la loro capacità di differenziarsi. Inoltre, la differenziazione miogenica avviene rapidamente dopo la modifica del mezzo da GM a DM, come dopo 2 a 3 giorni in DM, la fusione miooblasto è massima. In questo modello, circa il 60% dei mioblasti si fondono in myotubes dopo 2 giorni in DM. Un altro vantaggio è che questi celesti umani primariLe culture sono facilmente trasfettate con siRNA. I supporti GM e DM utilizzati nel nostro laboratorio sono fatti in casa. In alternativa, possono essere utilizzati supporti commerciali, ma non abbiamo mai provato la loro efficienza nelle colture primarie umane.
Un inconveniente del metodo menzionato è l'uso di tripsina durante la digestione enzimatica tissutale. Questa procedura elimina una grande frazione di marcatori della superficie cellulare e implica che lasciamo le cellule in coltura per alcuni giorni prima di eseguire FACS. La collagenasi potrebbe essere utilizzata anziché la tripsina per conservare meglio le proteine della membrana e consentire l'ordinamento di mioblasti umane immediatamente dopo la dissociazione tissutale. Tuttavia, il costo della collagenasi è significativamente superiore rispetto alla tripsina e un passo di amplificazione sarebbe ancora necessario dopo l'ordinamento delle cellule per ottenere un numero sufficiente di cellule per i successivi esperimenti. Un'altra limitazione della tecnica è la "qualità" dei campioni muscolari ottenuti da ortopediaChirurgia. Infatti, i pezzi di tessuto ottenuti potrebbero essere più o meno danneggiati a causa dell'intervento chirurgico, e il tempo tra l'intervento chirurgico e la dissociazione cellulare in laboratorio può variare di giorno in giorno. Tuttavia, per l'isolamento miooblasto, la purificazione e la differenziazione in myotubes, otteniamo regolarmente risultati soddisfacenti. Infine, l'età del paziente può essere un problema, in quanto l'importo e la capacità rigenerativa delle cellule satellitari diminuiscono con l'età di 20 anni. Così, limitiamo i nostri esperimenti a giovani pazienti (meno di 40 anni).
Come accennato, i mioblasti si differenziano rapidamente ed efficacemente, il che è un grande vantaggio dello studio degli eventi iniziali della differenziazione muscolare scheletrica. Tuttavia, poiché i myotubes si formano rapidamente, hanno anche la tendenza a spontaneamente contraggersi e staccarsi dalle piastre di coltura. Ciò preclude l'analisi degli eventi di fusione successivi. Per studiare questi eventi successivi, ci sarebbe bisognoPer rivestire la piastra di coltura con matrice extracellulare per migliorare l'adesione cellulare e per diminuire il distacco del mio tubo 21 .
Imaging di calcio utilizzando la sonda fluorescente Fura-2 è una tecnica ampiamente utilizzata e riproducibile che è facile da eseguire. Il carico di Fura-2 è efficiente e l'uso di una sonda ratiometrica come Fura-2 ha diversi vantaggi rispetto a una tonalità a lunghezza singola. Normalizza i cambiamenti di messa a fuoco o le differenze nel caricamento tra cellule e all'interno di una cellula ( ad esempio, nucleo rispetto al citosolo). Il protocollo descritto per sollevare e misurare SOCE viene utilizzato regolarmente in molti diversi sistemi cellulari. Il silenziamento di diversi canali o regolatori di calcio consente di chiarire la composizione molecolare di SOCE e l'importanza relativa dei diversi giocatori, sia nei mioblasti che nei myotubes. Un approccio alternativo che utilizza l'imaging Fura-2 e Ca 2+ è l'applicazione delMn 2+ tecnica di spegnimento. Mn 2+ entra nelle cellule attraverso canali perimetrali Ca 2+ e spegne la fluorescenza fura-2. La misura della velocità di allarme fornisce una misura più diretta dell'OSSO 22 , 23 . Ciò richiede tuttavia l'utilizzo di attrezzature leggermente diverse. La segnalazione Ca 2+ potrebbe anche essere eseguita utilizzando indicatori geneticamente codificati Ca 2+ , che hanno il grande vantaggio di essere localizzati in modo preciso in compartimenti diversi. Gli inconvenienti sono il requisito della trasfezione cellulare e della dinamica del segnale, che di solito è inferiore a quella dei coloranti chimici 24 . Per misurare Ca 2+ in organelli come mitocondri o SR, le sonde genetiche sono il gold standard. Tuttavia, per le misurazioni citocholic Ca 2+ , il vantaggio di utilizzare Fura-2 sulle sonde genetiche rimane.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione nazionale svizzera della scienza (numero di sovvenzione 310030-166313), dalla "Fondazione Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", dalla "Fondazione Marcel Levaillant" e dalla Fondazione per la recherche ostéo-articulaire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 mL tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 mL tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 mL tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. |
References
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