Summary
Aquí, describimos una metodología para obtener una población pura de mioblastos humanos a partir de tejido muscular adulto. Estas células se utilizan para estudiar la diferenciación in vitro del músculo esquelético y, en particular, para estudiar las proteínas implicadas en la señalización del Ca 2+ .
Abstract
Las células satélites (SC) son células madre musculares localizadas entre la membrana plasmática de las fibras musculares y la lámina basal circundante. Son esenciales para la regeneración muscular. Tras la lesión, que se produce con frecuencia en los músculos esqueléticos, SCs se activan. Proliferan como mioblastos y se diferencian para reparar lesiones musculares. Entre los muchos eventos que tienen lugar durante la diferenciación muscular, citosólico Ca 2 + señales son de gran importancia. Estas señales de Ca 2+ surgen de la liberación de Ca2 + desde internas Ca 2 + tiendas, así como de entrada de Ca2 + desde el espacio extracelular, particularmente la entrada de Ca2 + store-operado (SOCE). Este artículo describe una metodología utilizada para obtener una población pura de mioblastos humanos a partir de muestras musculares recogidas después de la cirugía ortopédica. El tejido se digiere mecánica y enzimáticamente y las células se amplifican y luego se clasifican por citometría de flujo de acuerdo con la presencia deFic marcadores de membrana. Una vez obtenidos, los mioblastos humanos se expanden y se comprometen a diferenciarse eliminando factores de crecimiento del medio de cultivo. Los niveles de expresión de los factores de transcripción específicos y la inmunofluorescencia in vitro se utilizan para evaluar el proceso de diferenciación miogénica en condiciones de control y después de silenciar las proteínas implicadas en la señalización de Ca 2 + . Finalmente, detallamos el uso de Fura-2 como una sonda ratiométrica de Ca 2+ que proporciona mediciones confiables y reproducibles de SOCE.
Introduction
Los músculos esqueléticos humanos están compuestos de grupos de fibras musculares contráctiles, multinucleadas, resultantes de la fusión de células precursoras miogénicas. Los músculos esqueléticos tienen la capacidad de regenerarse después de la lesión gracias a la presencia de SC, las células madre del músculo esquelético situadas entre la membrana plasmática de las miofibras (sarcolemma) y la lámina basal. En el músculo no lesionado, los SC están presentes en su mayoría en estado de reposo. En respuesta al estrés mecánico oa la lesión, los SC se activan (mioblastos), proliferan y experimentan diferenciación para formar nuevas miofibras o auto-renovación para reponer el grupo SC 1 , 2 . A lo largo de los años, se desarrollaron varias técnicas para aislar los CS y su progenie, los mioblastos, de las biopsias del músculo esquelético. Con la mayor comprensión de los marcadores de superficie celular expresados en estas células y la metodología de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) 3, 4 , 5 , ahora es posible aislar poblaciones puras de mioblastos humanos a partir de muestras musculares.
La señalización del calcio regula el desarrollo del músculo esquelético, la homeostasis y la regeneración. En particular, la entrada de Ca2 + que se activa después del agotamiento de la tienda intracelular, llamada SOCE, es de gran importancia 6 para estos procesos. Tras la estimulación celular, disminuye el nivel de Ca 2 + en el retículo endo / sarcoplasmático (ER / SR), lo que a su vez activa los canales de Ca 2+ de la membrana plasmática que permiten la entrada de Ca 2+ para rellenar el ER / SR 7 . Las dos principales proteínas implicadas en SOCE son el ER / SR Ca 2 + -sensing stromal interacción molécula 1 (STIM1) de proteínas y la membrana plasmática Ca 2 + canal Orai1. El músculo esquelético expresa abundantemente estas dos proteínas, así como otras proteínas de las mismas familias (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 y varios canales permeables al Ca2 + de la familia canónica de potencial transitorio del receptor (TRPC) 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2 + entrada a través de la vía SOCE es de gran importancia para la formación muscular / regeneración [ 14] . Mutaciones de STIM1 o Orai1 proteínas tienen efectos nocivos sobre la función muscular, lo que conduce principalmente a la hipotonía muscular [ 15] . Los modelos animales con deterioro de SOCE también muestran menor masa muscular y fuerza, junto con una mayor fatigabilidad 6 , 16 , 17 . Como se mencionó, otras proteínas STIM y Orai, así como muchos canales TRPC, se expresan en el músculo esquelético, y sus funciones respectivas no se han determinado hasta el momento. GolpeandoSu nivel de expresión, es posible investigar sus implicaciones en SOCE y sus funciones durante la diferenciación del músculo esquelético humano.
La medición de SOCE puede realizarse utilizando dos enfoques diferentes: registros de corriente electrofisiológica y mediciones de Ca 2+ . La electrofisiología es ciertamente un método más directo, ya que mide la corriente de interés y su firma electrofisiológica asociada. Sin embargo, esta técnica es muy difícil de aplicar a las células musculares, principalmente debido al gran tamaño de las células musculares y el pequeño tamaño de la corriente SOCE endógena. La obtención de imágenes de Ca 2+ citosólica es técnicamente muy accesible, pero la medida es más indirecta, ya que el nivel de Ca 2+ medido en el citosol refleja tanto la entrada de Ca 2+ como el re-bombeo fuera de la célula o en los almacenes internos.
Una metodología que incluye el aislamiento de mioblastos a partir de pequeñas piezas de skel humanoEtal después de digestión enzimática, amplificación y FACS se explica en este trabajo. Se describe el proceso de diferenciación muscular y el protocolo de inmunofluorescencia para seguir la expresión de marcadores de diferenciación con el tiempo 18 . Finalmente, se explican las medidas de SOCE y el papel de diferentes canales iónicos en la señalización de Ca 2+ y en la diferenciación del músculo esquelético.
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Protocol
Las muestras de músculo humano (tejidos obtenidos de músculos semitendinosos) se recogieron durante la cirugía ortopédica en pacientes sanos como residuos quirúrgicos. Todos los métodos relacionados con el estudio en seres humanos se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos de las Autoridades Sanitarias Reguladoras suizas y aprobados por la Comisión Cantonal de Ética de la Investigación de las Autoridades Cantonales de Ginebra, Suiza (protocolo CER n ° 12-259) . Se obtuvieron consentimientos informados y escritos de todos los sujetos adultos involucrados en el estudio.
1. Aislamiento de los mioblastos del músculo esquelético humano
- Durante todos los procedimientos, mantenga condiciones estériles trabajando bajo una capa de cultivo de tejidos de nivel II y usando medio estéril y tampones estériles.
Nota: Este procedimiento se puede aplicar a muchos músculos esqueléticos humanos.
2. Protocolo de disociación
- Transferir muestras de músculo (2 - 3 g) en un estéril de 6 cmplato.
- Lavar las muestras musculares con 5 - 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Repetir el lavado.
- Retire los tejidos conectivos y adiposos usando tijeras curvas y una abrazadera.
- Pesar la muestra muscular (ver paso 2.13) y transferirla a una nueva placa estéril de 6 cm.
- Añadir 5 ml de tripsina-EDTA al 0,05%.
- Usando tijeras, cortar y picar el tejido muscular en pedazos pequeños (menos de 2 mm).
- Usando una pipeta serológica de 10 ml, transfiera el músculo picado a una botella de disociación de 200 ml que contiene una barra magnética. Repita este paso hasta que 90 mL de tripsina-EDTA al 0,05% se hayan transferido con todos los músculos picados a la caja de disociación. Cerrar la botella de disociación e incubar a 37 ° C durante 60 minutos bajo agitación suave.
- Retire la botella de disociación del baño de calentamiento y detenga la reacción enzimática añadiendo 10 ml de suero fetal de ternera (FCS, 10% de volumen final) a la botella de disociación. Homogeneizar la mezcla con una pipeta.
- DeberesSon dos tubos de 50 ml con un filtro de células de 70 μm en cada uno. Pase la mitad de la suspensión de células a través del filtro de células en cada tubo pipeteando hacia arriba y hacia abajo sobre el filtro hasta que pase la suspensión.
- Centrifugar los tubos a 200 xg y 20 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Resuspender las células con 10 ml de medio de crecimiento (GM, Tabla 1 ) y pasar las células a través de un tamiz de células de 40 μm colocado en un tubo de 50 ml. Centrifugar el tubo a 200 xg y 20 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Resuspender las células con 10 ml de GM y centrifugar el tubo a 200 xg y 20 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Resuspender las células con 1 mL de GM y contar las células utilizando una cámara de Neubauer.
Nota: Por lo general, se debe cosechar un rendimiento de 3 x 10 5 células por g de músculo. El rendimiento se calcula dividiendo el número de células por el peso del músculo biopSy (paso 2.4). - Ponga 2 x 10 5 células en una placa de 6 cm estéril que contiene 4 ml de GM y se incuba a 37 ° C y 7% de CO2. Prepare tantas placas como sea necesario.
- Cambie el GM después de 3 días.
Nota: Las células recién disociadas necesitan tiempo para adherirse a la placa de cultivo. Además, el primer tiempo de duplicación de células miogénicas es de alrededor de 50 - 60 h. Después de la primera división, el tiempo de duplicación es alrededor de 20 h. - Después de 5 - 7 días, cuando las células alcanzan una confluencia del 70-80% (alrededor de 1,5 x 10 6 células / por placa de 6 cm), comienzan la tinción de anticuerpos y la clasificación celular (paso 3).
3. Tinción de anticuerpos y clasificación de células
- Después de enjuagar una vez con PBS, incubar las células adherentes (en la placa de 6 cm) con 1 ml de tripsina-EDTA al 0,05% a 37 ° C y 7% de CO 2 durante 3 min (o incubar a 5% de CO 2 ). Detener la reacción mediante la adición de 2 ml de GM y recoger las células en 15 ml de tubo. Después de la centrifugación (200 xg durante 5 min), resUspend las células en 1 ml de GM.
- Cuente las células usando una cámara Neubauer.
- Realice los siguientes procedimientos en hielo.
Nota: El procedimiento para establecer la compensación de fluorescencia correcta en el citómetro es esencial y debe ser similar en cualquier citómetro. Los tubos 1 y 2 se usan como controles negativos. Los tubos 3 - 7 se usan para establecer la compensación en el citómetro durante el primer experimento ( Tabla 2 ). La concentración final utilizada para cada anticuerpo y su isotipo correspondiente debe ser la misma (alrededor de 1 μg / 10 6 células). - Despacho 1 x 10 5 células por tubo (tubo de 5 ml) para los tubos 1 - 7 ( Tabla 2 ). Coloque la suspensión celular restante en el tubo 8 para la clasificación celular.
- Lavar las células con 1 ml de tampón FACS frío (PBS-5% FCS). Cerrar y centrifugar los tubos a 200 xg y 4 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Añadir 200 μl de tampón FACS por tubo. Añadir anticuerpos alDe acuerdo con la Tabla 2 . Incubar en hielo durante 30 min.
- Lavar las células: añadir 1 mL del tampón FACS a cada tubo. Cerrar y centrifugar los tubos a 200 xg y 4 ° C durante 5 min. Aspirar y desechar el sobrenadante. Repita este paso una vez más.
- Resuspender las células en 500 μ l de FACS buffer. Cerrar los tubos y mantenerlos en hielo hasta la clasificación celular. Prepare 4 tubos de 1,5 ml, cada uno de los cuales contiene 500 μl de GM, que es necesario para recoger las células durante la clasificación celular. Mantenerlos en hielo.
- Clasificar los mioblastos humanos por citometría de flujo ( Figura 1 ). Después de excluir células hematopoyéticas positivas para CD45, separar células CD45-negativas basadas en la expresión de CD56. A continuación, se muestra la población CD56-positiva para CD34, CD144 y CD146 (los mioblastos humanos se definen como células CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-). Realizar una pequeña fracción de la población de células clasificadas para verificar la pureza.
- Piscina de los tubos que contienen myobla humanosPts en un tubo de 15 mL y lavar una vez añadiendo 5 mL de GM. Centrifugar el tubo a 200 xg y 20 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 1 ml de GM y placa de las células en una placa no revestida de 6 cm que contiene 4 ml de GM (2 x 10 5 células por placa). Incubar a 37 ° C y 7% de CO 2 .
4. Mantenimiento celular
- Cambiar la mitad del medio de cultivo cada 2 días. Quitar 2 ml de GM de edad de la placa de cultivo y agregar 2 ml de GM.
Nota: Los mioblastos producen factores de crecimiento que son beneficiosos para las condiciones de cultivo. - Trypsinize las células cuando alcanzan 70 - 80% confluencia para evitar la pre-diferenciación. Después de enjuagar una vez con PBS, incubar las células adherentes (en la placa de 6 cm) con 1 mL de tripsina-EDTA al 0,05% a 37 ° C y 7% de CO 2 durante 3 min. Detener la reacción mediante la adición de 2 ml de GM y recoger las células en un tubo de 15 ml. Después de la centrifugación (200 xg durante 5 min), resusLas células en 1 ml de GM.
- Contar las células y preparar placas de 6 cm con 2 x 10 5 células por placa en 4 ml de GM.
- Mantener los mioblastos humanos hasta 6 pases o congelarlos en GM que contenga DMSO al 10%, 1 x 106 células por ml. Congele las células en una caja de congelación progresiva (1 ° C / min); Para almacenamiento a largo plazo, coloque las células en nitrógeno líquido.
5. Transfección de Myoblastos Humanos con siRNA
Nota: Los mioblastos se transfectan usando reactivo de transfección comercial dos días antes de la inducción de la diferenciación. El efecto de ARNsi específico contra un gen siempre se compara con el efecto de un ARNsi de control. Los ARNsi son ARN bicatenarios que deben mantenerse en hielo y manipulados con guantes.
- Obtener una monocapa confluente de 70 - 80% de mioblastos humanos en una placa de 6 cm (alrededor de 1,5 x 106 células).
Nota: 5 x 10 5 células por transfección se necesitan para obtener una estafaMonocapa fluida de mioblastos transfectados después de 2 días en GM. - Prepare los cubreobjetos de vidrio (descritos para la imagen de calcio en el paso 7).
- GM caliente, tripsina-EDTA al 0,05% y PBS a 37ºC.
- Realice todos los pasos siguientes en una campana de cultivo de tejidos de nivel II para mantener la esterilidad.
- En un tubo de 1,5 ml, envíe 500 μl de medio de suero reducido, 3 μl de reactivo de transfección y 1 μl de ARNsi a 20 μM. Mezclar suavemente y mantener a temperatura ambiente (RT) durante 15 - 20 min.
- Durante este tiempo de incubación, preparar los mioblastos para la transfección. Después de enjuagar una vez con PBS, incubar las células adherentes (en la placa de 6 cm) con 1 mL de tripsina-EDTA al 0,05% a 37 ° C y 7% de CO 2 durante 3 min. Detener la reacción mediante la adición de 2 ml de GM y recoger las células en un tubo de 15 ml. Después de la centrifugación (200 xg durante 5 min), resuspender las células en 1 ml de GM.
- Cuente las células usando una cámara Neubauer.
- Resuspender 5 x 10 5 célulasEn 200 μl de GM para cada transfección ( es decir, para 2 transfecciones, resuspender en 400 μl).
- Añadir 200 μl de la suspensión celular a cada 500 μl de la mezcla de siRNA-transfectante. Pipetar dos veces y dos veces e incubar durante 5 min a RT.
- Añadir el 700 μ l (células + siRNA-transfectante) a un plato de 3,5 cm de cultivo que contiene un cubreobjetos de vidrio. Añadir GM para obtener un volumen final de 2 ml.
- Después de 24 h a 37 ° C y 7% de CO 2 , sustituir completamente el medio con 2 ml de GM fresco. Después de otras 24 h, está habitualmente presente una monocapa confluente de células transfectadas; Si es así, inducir la diferenciación de los mioblastos sustituyendo el GM por 2 mL de medio de diferenciación (DM, Tabla 1 ).
- Realizar experimentos de imágenes de calcio 24 - 48 h después de la inducción de la diferenciación o sobre la proliferación de mioblastos.
Nota: La inmunofluorescencia suele realizarse 48 h después de la inducción de la diferenciación.
6. ImmUnofluorescence Tinción de marcadores de diferenciación
Nota: La tinción con inmunofluorescencia se realiza después de 48 h en DM, pero también puede realizarse en otros tiempos de diferenciación. Myogenin y MEF2 son proteínas nucleares que sólo se expresan en células diferenciadas (antes de la fusión en miotubos), y su tinción permite la evaluación del proceso de diferenciación. La cadena pesada de miosina (MyHC) sólo se expresa en miotubos y se utiliza para estimar el tamaño del miotubo y el índice de fusión (número de núcleos en miotubos / número total de núcleos).
- Después de 48 h en DM, lavar la monocapa confluente de células diferenciadas dos veces con 1 ml de PBS a RT. Haga esto cuidadosamente para evitar desprendimiento de los myotubes.
- Fijar las células con 1 mL de paraformaldehído al 4% (PFA) durante 15 minutos a RT. Lavar las células con PBS dos veces, durante 5 min cada una.
- Permeabilizar las células con 1 mL de PBS que contiene 0,25% de Triton X-100 durante 45 min y lavar 3 veces con 1 mL de PBS.
- BloquearPecific por incubación de las células en PBS suplementado con 0,2% de Tween-10 y 2% de suero de cabra (solución de bloque) durante 30 min a RT.
- Preparar anticuerpos primarios diluidos en solución de bloque (600 μL por placa de 3,5 cm).
Nota: Se utilizan los siguientes anticuerpos primarios: anti-myogenin de ratón (1: 600), anti-MEF2 de conejo (1: 300) y anticuerpo anti-MyHC de ratón (MF20, 1: 1.000). Es posible mezclar en la misma solución de bloqueo, la cadena pesada de anti-miosina de ratón o la anti-miogenina de ratón, con anti-MEF2 de conejo. - Eliminar la solución de bloque y añadir 600 μL de soluciones de anticuerpos primarios por placa de 3,5 cm e incubar durante la noche a 4 ° C en una cámara humidificada.
- Lavar las células 3 veces con 1 mL de PBS. Incubar durante 1 hora a RT en una cámara oscura con 600 μl de los anticuerpos secundarios preparados en la solución de bloque, como sigue: Alexa 488 de cabra anti-ratón (1: 1.000), Alexa 546 de cabra anti-conejo (1: 1.000) Y DAPI (1:50, solución madre a 15 μM).
CAUTION: DAPI es un compuesto tóxico que debe manejarse con guantes. - Aspirar y lavar las células 3 veces con 1 mL de PBS.
- Coloque cubreobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje de alcohol polivinílico con una solución antifading. Manténgalas a 4 ° C y protegidas de la luz hasta visualizar las células.
7. Imágenes de calcio
- Cultivo previo, preparar cubreobjetos de vidrio de 25 mm de diámetro. Coloque los cubreobjetos en etanol al 70% durante 48 h para eliminar la grasa y la suciedad de la superficie, lo que reduce la adherencia celular a la cubreobjetos.
- Después de enjuagar los cubrealimentos varias veces con agua, volver a ponerlos en agua y esterilizarlos (esterilizados en autoclave).
- Coloque un cubreobjetos por placa de cultivo de 3,5 cm y déjelos secar. Guarde las placas de Petri para experimentos adicionales o utilícelas inmediatamente.
- Añadir los mioblastos transfectados (5 - 6 x 10 5 células) al cubreobjetos de vidrio.
Nota: Los experimentos se realizan 24 - 48 h después de la inducción de differentiatiOn, o en mioblastos proliferantes. - Para realizar la formación de imágenes de Ca 2+ , lavar las células 2 veces con PBS o directamente con el medio utilizado para los experimentos (medio que contiene calcio, Tabla 3 ). Cargar las células con 2 μ M Fura-2 / AM más 1 μ M de ácido plurónico durante unos 30 minutos en la oscuridad a RT.
Nota: El ácido plurónico ayuda a solubilizar Fura-2. Fura-2 / AM y ácido plurónico se disuelven en el medio que contiene calcio. - Lavar las células dos veces en el mismo medio pero sin Fura-2 / AM y ácido plurónico y dejarlas en la oscuridad durante 10-15 minutos adicionales para permitir la desesterificación de Fura-2 / AM.
- Si la eficiencia de carga de Fura-2 es demasiado baja, agregue más Fura-2 ( por ejemplo, 4 μM) y / o incube las células durante más tiempo ( por ejemplo, 40 minutos).
- Retire el cubreobjetos de la placa de cultivo e instálelo en la cámara experimental. Añadir ~ 1 ml de medio que contiene calcio (dependiendo del volumen del experiCámara mental). Instálelo en la etapa del microscopio e inicie la grabación.
Nota: La sonda fluorescente sensible al Ca2 + Fura-2 se excita alternativamente a 340 nm y 380 nm, y la luz de emisión se recoge a 510 nm. Como las fluctuaciones de la concentración de Ca2 + son relativamente lentas, adquieran una relación cada 2 s. - Para activar SOCE, se utiliza el siguiente protocolo clásico de reabsorción de tapsigargina / Ca 2+ : dejar las células durante 2-3 min en medio que contiene calcio. Reemplace el medio con medio libre de calcio durante 1-2 min.
- Añadir 1 μ M thapsigargin para agotar los almacenes internos de calcio.
Nota: La tapsigargina es un bloqueador irreversible de la actividad de la bomba de Ca2 + ATPasa del retículo sarco-endoplásmico (SERCA). Después de 8-10 minutos, reemplace rápidamente el medio con el medio que contiene calcio. Ca 2 + entrará en las células a través de los canales SOCE. Espere alrededor de 5 minutos antes de terminar los experimentos.
PRECAUCIÓN: Thapsigargin es un compuesto tóxico que debe ser manipulado con guantes.
- Añadir 1 μ M thapsigargin para agotar los almacenes internos de calcio.
8. Ca 2+ Análisis de Medición
Nota: Realice el análisis con el software de adquisición.
- Abra el experimento. Dibuje la región 1 en un área donde no hay células (región de fondo) y dibuje las otras regiones en el citoplasma de las células a analizar (las regiones se pueden dibujar en cualquier imagen: el 340-nm, el 380-nm, O la relación imagen). Vaya a "Ejecutar experimentos"> "Imágenes de referencia". Bajo los canales 340 y 380, seleccione "región 1" y luego haga clic en "Restar fondo".
- Ejecute todo el experimento (F4: adelante) para asegurarse de que nada interfiera con la región de fondo, como una mancha de polvo fluorescente que viaja a través de la región de fondo y que las celdas no se mueven durante el tiempo de los experimentos.
Nota: Las regiones de interés seleccionadasNo debe incluir áreas oscuras; De lo contrario, el valor de la relación será ruidoso, ya que parte del fondo se incluirá en la medición. - Haga clic en "Registrar datos" y vuelva a reproducir todo el experimento.
Nota: Esto abrirá una hoja de cálculo en la que se registrará el tiempo y la relación. También es posible guardar las longitudes de onda individuales de 340 nm y 380 nm. - Para obtener información sobre el SOCE, extraiga los dos parámetros importantes del experimento: la amplitud de la re-adición de Ca 2+ y la pendiente de la fase de entrada del Ca 2+ ( Figura 3 ).
- Obtener la amplitud restando el valor de la relación justo antes de la re-adición de Ca 2+ de la amplitud máxima de la elevación de Ca 2+ . Obtener la pendiente máxima ajustando una regresión lineal de los primeros segundos después de la re-adición de Ca 2+ .
Nota: El área bajo la curva de la respuesta thapsigargin es también un parámetro informativo para extracT, ya que refleja la cantidad de calcio libre almacenado en el SR.
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Representative Results
Después de la disociación enzimática de una muestra de músculo humano, las células se amplificaron en GM. Los mioblastos humanos, definidos como células CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, se obtuvieron después de FACS. Los mioblastos representaron más del 60% de la población analizada ( Figura 1 ). Los mioblastos humanos primarios fueron repoblados, crecidos hasta confluencia, y cultivados en DM durante 48 h. Después de la inmunotinción para la expresión del factor de transcripción MEF2 y la cadena pesada de miosina de proteína específica de músculo (MyHC), observamos que la mayoría de las células formaron myotubes in vitro (células MyHC-positivas) con valores de fusión de 60,9 ± 1,3% (N = 5, figura 2 ). También observamos que alrededor del 40% de los mioblastos humanos, llamados células de reserva, escaparon de esta diferenciación terminal y permanecieron células mononucleadas indiferenciadas. Para los estudios funcionales, se analizó la respuesta de Ca 2+ de mioblastos o miotubos 48 h después de la iniciación dediferenciación. La Figura 3 muestra un protocolo representativo utilizado para inducir SOCE y los parámetros clave para extraer de dicha grabación. Para discernir información relacionada con las moléculas implicadas en SOCE, las células se transfectaron con siRNA contra la molécula de interés. La Figura 4 muestra el impacto de silenciar los canales permeables al Ca2 + de la familia TRPC en SOCE en los mioblastos.
Figura 1 : FACS de Myoblasts humanos. Las células humanas disociadas se inmunotinaron con anticuerpos para los siguientes marcadores de superficie celular: CD45, CD56, CD34, CD144 y CD146. Después de excluir células hematopoyéticas positivas para CD45, se separaron células CD45-negativas basadas en la expresión de CD56. La población CD56-positiva fue entonces cerrada para CD34, CD144 y CD146. Los mioblastos humanos se definieron como CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, como se ha descrito anteriormente 19 , 4 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Diferenciación de Myoblastos Humanos. ( A ) Una monocapa confluente de mioblastos humanos fue expuesta a DM durante 48 h; fijo; Y se tiñeron con anticuerpos contra MEF2 (rojo), MyHC (verde) y DAPI (azul) para identificar núcleos. Barra de escala = 50 μm. ( B ) El índice de fusión representa el número de núcleos incorporados en los miotubos divididos por el número total de núcleos en un determinado campo. Los datos son media ± SEM de 5 experimentos independientes.Ank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Medición representativa del calcio del SOCE inducido por Thapsigargin. Los miotubos se cargaron con Fura-2 y se midió la concentración de Ca 2+ citosólica. ( A ) Las células reposan durante unos minutos en un medio que contiene calcio, seguido de 2 minutos en un medio libre de calcio. 1 μ M thapsigargin entonces se utiliza durante 8 min, seguido de la re-adición de calcio. Los 3 parámetros importantes a extraer de tal registro son: el área bajo la curva de la respuesta del thapsigargin, la pendiente del SOCE, y la amplitud del SOCE. ( B ) Cuantificación de los 3 parámetros. El área bajo la curva proporciona información sobre la cantidad de Ca 2+ almacenada en el ER / SR, y los otros dos parámetros permiten la cuantificaciónCión del SOCE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Participación de TRPC1 y TRPC4 en SOCE. ( A ) La concentración de Ca 2+ citosólica se evaluó usando Fura-2 en mioblastos proliferantes transfectados con siTRPC1 o siTRPC1 y siTRPC4. SOCE fue desencadenada por el agotamiento almacén interno con 1 μ M thapsigargin en ausencia externa de Ca 2 + (Ca 2 + libre) y medido durante la re-adición de 2 mM externa Ca 2 + . Cada trazo representa la media de un cubreobjetos representativo. ( B ) Cuantificación de los efectos del ARNsi en la amplitud del SOCE. Esta cifra ha sido modificada a partir de la referencia 12 , con permiso. Barras ar E media ± SEM, * p <0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medio de crecimiento (GM): | Concentración | Medio de diferenciación (DM): | Concentración | |||||
| F10 del jamón | DMEM | |||||||
| FCS | 15% | albúmina de suero bovino | 0,5 mg / ml | |||||
| albúmina de suero bovino | 0,5 mg / ml | factor de crecimiento epidérmico | "> 10 ng / ml||||||
| Fetuin | 0,5 mg / ml | insulina | 0,01 mg / ml | |||||
| factor de crecimiento epidérmico | 10 ng / ml | Creatina | 1 mM | |||||
| Dexametasona | 0,39 mu g / ml | Piruvato | 100 mu g / ml | |||||
| insulina | 0,04 mg / ml | Uridina | 50 mu g / ml | |||||
| Creatina | 1 mM | Gentamicina | 10 mu g / ml | |||||
| Piruvato | 100 mu g / ml | <Td colspan = "2"> | ||||||
| Uridina | 50 mu g / ml | |||||||
| Gentamicina | 5 mu g / ml | |||||||
Tabla 1: Composición media para cultivo de mioblastos.
| Tubos | Anticuerpos | |||||
| 1 | Ninguna | |||||
| 2 | Isotype AlexaFluor 488-, isotipo PE-CF594, isotipo PE, isotipo PECy7tipo APC | |||||
| 3 | Ratón anti-humano CD56-AlexaFluor 488 | |||||
| 4 | Ratón anti-humano CD45 PE-CF594 | |||||
| 5 | Ratón anti-humano CD144-PE | |||||
| 6 | Ratón anti-humano CD146-PECy7 | |||||
| 7 | Ratón anti-humano CD34-APC | |||||
| 8 | Ratón anti-humana CD156-AlexaFluor 488-, Ratón anti-humano CD45 PE-CF594, Ratón anti-humano CD144-PE, Ratón anti-humano CD34-APC, Ratón anti-humano CD146-PECy7 | |||||
Tabla 2: Anticuerpos usados para la Clasificación de Células.
| Medio que contiene calcio | concentración | Medio sin calcio | concentración | |||||
| NaCl | NaCl | 135 mM | ||||||
| KCl | 5 mM | KCl | 5 mM | |||||
| MgCl _ {2} | 1 mM | MgCl _ {2} | 1 mM | |||||
| CaCl _ {2} | 2 mM | EGTA | 1 mM | |||||
| Hepes | 10 mM | Hepes | 10 mM | |||||
| Glucosa | 10 mM | Glucosa | 10 mM | |||||
| PH 7,45 ajustado con NaOH | PH 7,45 ajustado con NaOH | |||||||
Tabla 3: Composición media para experimentos de formación de imágenes de calcio.
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Discussion
El aislamiento y cultivo de mioblastos humanos a partir del músculo esquelético adulto ofrece un modelo in vitro para estudiar la diferenciación muscular y la regeneración muscular. En este artículo, proporcionamos un protocolo que permite la purificación de altos rendimientos de mioblastos humanos de una manera simple y costo-limitada. Además, esta técnica proporciona resultados fiables y reproducibles en términos de porcentaje de mioblastos aislados y su eficacia de diferenciación miogénica. De hecho, hemos obtenido alrededor del 60% de los mioblastos humanos después de la clasificación celular. Estas células pueden mantenerse en cultivo hasta 6 pasajes (alrededor de 30 duplicaciones) y mantener su capacidad de diferenciación. Además, la diferenciación miogénica se produce rápidamente después de cambiar el medio de GM a DM, como después de 2 a 3 días en DM, la fusión de mioblastos es máxima. En este modelo, alrededor del 60% de los mioblastos se fusionan en miotubos después de 2 días en DM. Otra ventaja es que estas celulas humanas primariasL se transfectan fácilmente con siRNA. Los medios GM y DM utilizados en nuestro laboratorio son hechos en casa. Alternativamente, se pueden usar medios comerciales, pero nunca probamos su eficacia en cultivos primarios humanos.
Un inconveniente del método mencionado es el uso de tripsina durante la digestión enzimática de los tejidos. Este procedimiento elimina una gran fracción de los marcadores de la superficie celular e implica que dejamos las células en cultivo durante algunos días antes de realizar FACS. La colagenasa podría usarse en lugar de tripsina para preservar mejor las proteínas de la membrana y permitir la clasificación de los mioblastos humanos inmediatamente después de la disociación tisular. Sin embargo, el coste de la colagenasa es significativamente mayor que la tripsina, y seguiría siendo necesario un paso de amplificación después de la clasificación celular para obtener un número de células suficiente para los experimentos subsiguientes. Otra limitación de la técnica es la "calidad" de las muestras musculares obtenidas de ortopediaCirugía. De hecho, las piezas de tejido obtenidas podrían estar más o menos dañadas debido a la cirugía, y el tiempo entre la cirugía y la disociación celular en el laboratorio puede variar de un día a otro. Sin embargo, para el aislamiento, purificación y diferenciación de mioblastos en miotubos, obtenemos rutinariamente resultados satisfactorios. Finalmente, la edad del paciente puede ser un problema, ya que la cantidad y la capacidad de regeneración de las células satélites disminuyen con la edad de 20 años. Por lo tanto, restringimos nuestros experimentos a pacientes jóvenes (menores de 40 años).
Como se ha mencionado, los mioblastos se diferencian rápida y eficientemente, lo cual es una gran ventaja de estudiar los eventos iniciales de la diferenciación del músculo esquelético. Sin embargo, a medida que los miotubos se forman rápidamente, también tienen una tendencia a contraerse y separarse espontáneamente de las placas de cultivo. Esto excluye el análisis de los eventos posteriores de fusión. Para estudiar estos sucesos posteriores, se necesitaríaPara revestir la placa de cultivo con matriz extracelular para mejorar la adherencia celular y para disminuir el desprendimiento de miotubos 21 .
Imagen de calcio utilizando la sonda fluorescente Fura-2 es una técnica ampliamente utilizada, reproducible que es fácil de realizar. La carga de Fura-2 es eficiente, y el uso de una sonda ratiométrica tal como Fura-2 tiene varias ventajas sobre un colorante de una sola longitud de onda. Normaliza cambios de enfoque o diferencias en la carga entre células y dentro de una célula ( por ejemplo, núcleo versus citosol). El protocolo que describimos para obtener y medir SOCE se utiliza regularmente en muchos sistemas celulares diferentes. El silenciamiento de diferentes canales o reguladores de calcio permite elucidar la composición molecular de SOCE y la importancia relativa de los diferentes actores, tanto en mioblastos como en miotubos. Un enfoque alternativo que utiliza Fura-2 y Ca 2 + imágenes es la aplicación de laMn 2+ técnica de enfriamiento. Mn2 + entra en las células a través de canales permeables al Ca2 + y apaga la fluorescencia de fura-2. La medida de la velocidad de enfriamiento proporciona una medida más directa del SOCE 22 , 23 . Esto, sin embargo, requiere la utilización de equipos ligeramente diferentes. Ca 2 + señalización también podría realizarse utilizando genéticamente codificados Ca 2 + indicadores, que tienen la gran ventaja de ser precisamente localizados en diferentes compartimentos celulares. Los inconvenientes son el requisito para la transfección de células y la dinámica de la señal, que suele ser menor que con los colorantes químicos 24 . Para medir Ca 2 + en orgánulos como las mitocondrias o el SR, las sondas genéticas son el estándar de oro. Sin embargo, para las mediciones citosólicas de Ca 2+ , el beneficio de usar Fura-2 sobre sondas genéticas permanece.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (subsidio número 310030-166313), la Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires, la Fondation Marcel Levaillant y la Fondation pour la recherche ostéo-articulaire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 mL tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 mL tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 mL tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. |
References
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