Summary
Aqui, descrevemos uma metodologia para obter uma população pura de mioblastos humanos a partir do tecido muscular adulto. Essas células são usadas para estudar a diferenciação do músculo esquelético in vitro e, em particular, para estudar proteínas envolvidas na sinalização de Ca 2+ .
Abstract
As células satélites (SC) são células-tronco muscular localizadas entre a membrana plasmática das fibras musculares e a lâmina basal circundante. São essenciais para a regeneração muscular. Após lesão, que ocorre freqüentemente nos músculos esqueléticos, os SCs são ativados. Eles proliferam como mioblastos e se diferenciam para reparar lesões musculares. Entre muitos eventos que ocorrem durante a diferenciação muscular, os sinais citostáticos de Ca 2 + são de grande importância. Estes sinais de Ca2 + surgir de libertação de Ca2 + a partir de Ca 2+ lojas internos, bem como de Ca2 + entrada a partir do espaço extracelular, particularmente a entrada de Ca2 + operado por armazenamento (SOCE). Este artigo descreve uma metodologia utilizada para obter uma população pura de mioblastos humanos a partir de amostras musculares coletadas após a cirurgia ortopédica. O tecido é digerido mecanicamente e enzimaticamente, e as células são amplificadas e depois ordenadas por citometria de fluxo de acordo com a presença de especificaçãoMarcadores de membrana de fic. Uma vez obtidos, os mioblastos humanos são expandidos e comprometidos em se diferenciar removendo os fatores de crescimento do meio de cultura. Os níveis de expressão de fatores de transcrição específicos e imunofluorescência in vitro são utilizados para avaliar o processo de diferenciação miogênica em condições de controle e após o silenciamento de proteínas envolvidas na sinalização de Ca 2+ . Finalmente, detalhamos o uso de Fura-2 como uma sonda ratiométrica de Ca 2+ que fornece medidas confiáveis e reprodutíveis de SOCE.
Introduction
Os músculos esqueletais humanos são compostos de grupos de fibras musculares contrácteis e multinucleadas resultantes da fusão de células precursoras miogênicas. Os músculos esqueléticos têm a capacidade de regenerar após lesão graças à presença de SCs, as células estaminais do músculo esquelético localizadas entre a membrana plasmática das miofibras (sarcolemma) e a lâmina basal. Em músculos não feridos, os SCs estão principalmente presentes em um estado quiescente. Em resposta ao estresse ou lesão mecânica, os SCs se tornam ativados (mioblastos), proliferam e sofrem qualquer diferenciação para formar novas miofibras ou auto-renovação para reabastecer o SC pool 1 , 2 . Ao longo dos anos, várias técnicas foram desenvolvidas para isolar SCs e sua progênie, os mioblastos, a partir de biópsias de músculo esquelético. Com a maior compreensão dos marcadores de superfície celular expressados nessas células e a metodologia de triagem celular ativada por fluorescência (FACS) 3, 4 , 5 , agora é possível isolar populações puras de mioblastos humanos a partir de amostras musculares.
A sinalização de cálcio rege o desenvolvimento do músculo esquelético, a homeostase e a regeneração. Em particular, a entrada Ca 2+ que é ativada após a depleção da loja intracelular, chamada SOCE, é de grande importância 6 para esses processos. Após a estimulação celular, o nível de Ca 2 + no retículo endo / sarcoplasmático (ER / SR) diminui, o que, por sua vez, ativa os canais de Ca 2+ da membrana plasmática que permitem a entrada de Ca 2+ para reabastecer o ER / SR 7 . As duas principais proteínas envolvidas em SOCE são a proteína 1 (STIM1) da molécula de interação estromal sensível ao ER / SR Ca 2 + e o canal Ca 2+ da membrana plasmática Orai1. O músculo esquelético expressa abundantemente essas duas proteínas, bem como outras proteínas das mesmas famílias (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 e vários canais permeáveis a Ca 2+ da família canônica potencial de receptor transitório (TRPC) 10 , 11 , 12 , 13 . A entrada de Ca 2+ através da via SOCE é de grande importância para a formação / regeneração muscular 14 . As mutações das proteínas STIM1 ou Orai1 têm efeitos deletérios sobre a função muscular, levando principalmente a hipotonia muscular 15 . Modelos de animais com deficiência de SOCE também apresentam massa muscular reduzida e força, juntamente com uma fatigabilidade melhorada 6 , 16 , 17 . Como mencionado, outras proteínas STIM e Orai, bem como muitos canais TRPC, são expressas no músculo esquelético, e seus respectivos papéis não foram determinados até agora. Ao bater dPossuem seu nível de expressão, é possível investigar suas implicações na SOCE e seus papéis durante a diferenciação muscular do esqueleto humano.
A medição de SOCE pode ser realizada usando duas abordagens diferentes: gravações eletrofisiológicas atuais e medições de Ca 2+ . A eletrofisiologia é certamente um método mais direto, pois mede a atualidade de interesse e sua assinatura eletrofisiológica associada. No entanto, esta técnica é muito difícil de aplicar às células musculares, principalmente devido ao grande tamanho das células musculares e ao pequeno tamanho da corrente endógena da SOCE. A imagem citosólica do Ca 2 + é tecnicamente muito acessível, mas a medida é mais indireta, pois o nível de Ca 2+ medido no citosol reflete tanto a entrada de Ca 2 + quanto o re-bombeamento da célula ou nas lojas internas.
Uma metodologia que inclui a isolação de mioblastos de pequenos pedaços de skel humanoO músculo etal após digestão enzimática, amplificação e FACS é explicado neste artigo. O processo de diferenciação muscular e o protocolo de imunofluorescência para seguir a expressão de marcadores de diferenciação ao longo do tempo são descritos 18 . Finalmente, são explicadas as medidas de SOCE e o papel de diferentes canais de íons na sinalização de Ca 2 + e diferenciação muscular esquelética.
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Protocol
As amostras musculares humanas (tecidos obtidos a partir de músculos semitendinosos) foram coletadas durante a cirurgia ortopédica em pacientes saudáveis como resíduos cirúrgicos. Todos os métodos relacionados ao estudo humano foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos das Autoridades Regulatórias de Saúde da Suíça e aprovados pela Comissão Cantonale d'Ethique de Recherche dos Governos Cantonais de Genebra, Suíça (protocolo CER n ° 12-259) . Foram obtidos consentimentos informados e escritos de todos os sujeitos adultos envolvidos no estudo.
1. Isolamento de mioblastos do músculo esquelético humano
- Durante todos os procedimentos, mantenha condições estéreis trabalhando sob um capô de cultura de tecidos de nível II e usando tampões estéreis e esterilizados.
Nota: Este procedimento pode ser aplicado a muitos músculos esqueletais humanos.
2. Protocolo de dissociação
- Transfira amostras de músculo (2 - 3 g) para um esterilizado de 6 cmPrato.
- Lave as amostras musculares com 5 - 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Repita a lavagem.
- Remova os tecidos conectivos e adiposos usando tesoura curvada e uma braçadeira.
- Pesar a amostra muscular (ver passo 2.13) e transferi-la para uma nova placa esterilizada de 6 cm.
- Adicione 5 mL de tripsina-EDTA a 0,05%.
- Usando tesoura, corte e mole o tecido muscular em pequenos pedaços (menos de 2 mm).
- Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, transfira o músculo picado para um frasco de dissociação de 200 mL contendo uma barra magnética. Repita este passo até 90 mL de tripsina-EDTA a 0,05% ter sido transferido com todos os músculos picados para a caixa de dissociação. Feche o frasco de dissociação e incube a 37 ° C durante 60 minutos sob agitação suave.
- Retire o frasco de dissociação do banho de aquecimento e pare a reação enzimática adicionando 10 mL de soro fetal de vitela (FCS, 10% de volume final) ao frasco de dissociação. Homogenize a mistura com uma pipeta.
- PreparaçãoSão dois tubos de 50 mL com um filtro celular de 70 μm em cada um. Passe a metade da suspensão celular através do filtro celular em cada tubo, pipetando para cima e para baixo no filtro até a suspensão passar.
- Centrifugar os tubos a 200 xg e 20 ° C durante 5 min; Aspirar e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células com 10 mL de meio de crescimento (GM, Tabela 1 ) e passar as células através de um filtro de células de 40 um colocado em um tubo de 50 mL. Centrifugar o tubo a 200 xg e 20 ° C durante 5 min; Aspirar e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células com 10 mL de GM e centrifugar o tubo a 200 xg e 20 ° C durante 5 min; Aspirar e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células com 1 mL de GM e contar as células usando uma câmara de Neubauer.
Nota: Geralmente, um rendimento de 3 x 10 5 células por g de músculo deve ser colhido. O rendimento é calculado dividindo o número de células pelo peso da biopia muscularSy (passo 2.4). - Coloque 2 x 10 5 células em uma placa estéril de 6 cm contendo 4 mL de GM e incuba a 37 ° C e 7% de CO 2 . Prepare tantas placas quanto necessário.
- Mude o GM após 3 dias.
Nota: células recém-dissociadas precisam de tempo para aderir à placa de cultura. Além disso, o primeiro tempo de duplicação de células miogênicas é de cerca de 50 a 60 h. Após a primeira divisão, o tempo de duplicação é de cerca de 20 h. - Após 5 a 7 dias, quando as células atingem 70 a 80% de confluência (cerca de 1,5 x 10 6 células / por placa de 6 cm), comece a coloração de anticorpos e a triagem celular (passo 3).
3. Coloração de anticorpos e classificação de células
- Depois de enxaguar uma vez com PBS, incubar as células aderentes (na placa de 6 cm) com 1 mL de tripsina-EDTA a 0,05% a 37 ° C e 7% de CO 2 durante 3 min (ou incubar a 5% de CO 2 ). Pare a reação adicionando 2 mL de GM e colete as células em um tubo de 15 mL. Após centrifugação (200 xg durante 5 min), resUspend as células em 1 mL de GM.
- Contar as células usando uma câmara de Neubauer.
- Execute os seguintes procedimentos no gelo.
Nota: O procedimento para ajustar a compensação de fluorescência correta no citómetro é essencial e deve ser semelhante em qualquer citómetro. Os tubos 1 e 2 são usados como controles negativos. Os tubos 3 - 7 são usados para ajustar a compensação no citómetro durante o primeiro experimento ( Tabela 2 ). A concentração final utilizada para cada anticorpo e seu isotipo correspondente deve ser a mesma (cerca de 1 μg / 10 6 células). - Despachar 1 x 10 5 células por tubo (tubo de 5 mL) para tubos 1 - 7 ( Tabela 2 ). Coloque a suspensão celular restante no tubo 8 para triagem celular.
- Lavar as células com 1 mL de tampão FACS frio (PBS-5% FCS). Feche e centrifugue os tubos a 200 xg e 4 ° C durante 5 min; Aspirar e descartar o sobrenadante.
- Adicione 200 μL de tampão FACS por tubo. Adicionar anticorpos contraE tubo de acordo com a Tabela 2 . Incubar no gelo durante 30 min.
- Lave as células: adicione 1 mL do tampão FACS a cada tubo. Feche e centrifugue os tubos a 200 xg e 4 ° C por 5 min. Aspirar e descartar o sobrenadante. Repita este passo mais uma vez.
- Ressuspender as células em 500 μL de tampão FACS. Feche os tubos e mantenha-os no gelo até a classificação das células. Prepare 4 tubos de 1,5 mL, cada um contendo 500 μL de GM, o que é necessário para coletar as células durante a triagem celular. Mantenha-os no gelo.
- Classifique os mioblastos humanos por citometria de fluxo ( Figura 1 ). Depois de excluir as células hematopoiéticas CD45-positivas, separar células CD45-negativas com base na expressão de CD56. Em seguida, administre a população positiva de CD56 para CD34, CD144 e CD146 (os mioblastos humanos são definidos como células CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-). Realizalize uma pequena fração da população de células ordenadas para verificar a pureza.
- Coloque os tubos contendo myobla humanaEm um tubo de 15 ml e lave uma vez adicionando 5 mL de GM. Centrifugar o tubo a 200 xg e 20 ° C durante 5 min; Aspirar e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 1 mL de GM e plaquear as células em uma placa não revestida de 6 cm contendo 4 mL de GM (2 x 10 5 células por placa). Incubar a 37 ° C e 7% de CO 2 .
4. Manutenção celular
- Mude a metade do meio de cultura a cada 2 dias. Remova 2 mL de GM antigo do prato de cultura e adicione 2 mL de GM.
Nota: Myoblasts produzem fatores de crescimento que são benéficos para as condições de cultura. - Tossinize as células quando atingem 70 a 80% de confluência para evitar a pré-diferenciação. Depois de enxaguar uma vez com PBS, incubar as células aderentes (na placa de 6 cm) com 1 mL de tripsina-EDTA a 0,05% a 37 ° C e 7% de CO 2 durante 3 min. Pare a reação adicionando 2 mL de GM e colete as células em um tubo de 15 mL. Após centrifugação (200 xg durante 5 min), resusPular as células em 1 mL de GM.
- Contar as células e preparar placas de 6 cm com 2 x 10 5 células por placa em 4 mL de GM.
- Manter mioblastos humanos até 6 passagens ou congelá-los em GM contendo 10% de DMSO, 1 x 10 6 células por mL. Congelar as células em uma caixa de congelamento progressiva (1 ° C / min); Para armazenamento a longo prazo, coloque as células em nitrogênio líquido.
5. Transfecção de mioblastos humanos com siRNA
Nota: Os mioblastos são transfectados utilizando reagente de transfecção comercial dois dias antes da indução da diferenciação. O efeito de siRNA específico contra um gene é sempre comparado ao efeito de um siRNA de controle. SiRNAs são RNAs de cadeia dupla que devem ser mantidos no gelo e manipulados com luvas.
- Obtenha uma monocamada confluente de 70 a 80% de mioblastos humanos em uma placa de 6 cm (cerca de 1,5 x 10 6 células).
Nota: 5 x 10 5 células por transfecção são necessárias para obter um conMonocamada fluida de mioblastos transfectados após 2 dias em GM. - Prepare lamínulas de vidro (descritas para a imagem de cálcio no passo 7).
- Warm GM, 0,05% de tripsina-EDTA e PBS a 37 ° C.
- Execute todas as etapas a seguir em um capuz de cultura de tecidos de nível II para manter a esterilidade.
- Em um tubo de 1,5 mL, despachar 500 μL de meio soro reduzido, 3 μL de reagente de transfecção e 1 μL de siRNA a 20 μM. Misture suavemente e mantenha a temperatura ambiente (RT) durante 15-20 minutos.
- Durante este período de incubação, prepare os mioblastos para transfecção. Depois de enxaguar uma vez com PBS, incubar as células aderentes (na placa de 6 cm) com 1 mL de tripsina-EDTA a 0,05% a 37 ° C e 7% de CO 2 durante 3 min. Pare a reação adicionando 2 mL de GM e colete as células em um tubo de 15 mL. Após centrifugação (200 xg durante 5 min), ressuspender as células em 1 mL de GM.
- Contar as células usando uma câmara de Neubauer.
- Ressuspender 5 x 10 5 célulasEm 200 μL de GM para cada transfecção ( isto é, para 2 transfecções, ressuspender em 400 μL).
- Adicione 200 μL da suspensão celular a cada 500 μL de mistura de siRNA-transfectante. Pipetar para cima e para baixo duas vezes e incubar durante 5 min à TA.
- Adicione os 700 μL (células + siRNA-transfectante) a um prato de cultura de 3,5 cm contendo uma lamínula de vidro. Adicione GM para obter um volume final de 2 mL.
- Após 24 h a 37 ° C e 7% de CO 2 , substitua completamente o meio por 2 mL de GM fresco. Após mais 24 h, uma monocamada confluente de células transfectadas está geralmente presente; Se assim for, induzir a diferenciação de mioblastos substituindo o GM por 2 mL de meio de diferenciação (DM, Tabela 1 ).
- Execute experiências de imagem de cálcio 24 - 48 h após a indução de diferenciação ou em mioblastos de proliferação.
Nota: A imunofluorescência é geralmente realizada 48 h após a indução da diferenciação.
6. ImNão-fluorescência Coloração de Marcadores de Diferenciação
Nota: A coloração por imunofluorescência é realizada após 48 h em DM, mas também pode ser realizada em outros tempos de diferenciação. Myogenin e MEF2 são proteínas nucleares apenas expressas em células diferenciadas (antes da fusão em miotubos), e sua coloração permite a avaliação do processo de diferenciação. A cadeia pesada de Myosina (MyHC) é expressa apenas em miotubos e é utilizada para estimar o tamanho do miotubo e índice de fusão (número de núcleos em miotubos / número total de núcleos).
- Após 48 h em DM, lave a monocamada confluente de células diferenciadas duas vezes com 1 mL de PBS à TA. Faça isso com cuidado para evitar o desprendimento dos miotubos.
- Corrigir as células com 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) durante 15 minutos à TA. Lave as células com PBS duas vezes, durante 5 minutos cada.
- Permeabilize as células com 1 mL de PBS contendo Triton X-100 a 0,25% durante 45 minutos e lave 3 vezes com 1 mL de PBS.
- Bloqueie os insLocais de ligação pecificos incubando as células em PBS suplementado com 0,2% de Tween-10 e 2% de soro de cabra (solução de bloqueio) durante 30 min à TA.
- Prepare anticorpos primários diluídos em solução de bloco (600 μL por placa de 3,5 cm).
Nota: Os seguintes anticorpos primários são utilizados: anti-miogenina de rato (1: 600), anti-MEF2 de coelho (1: 300) e anticorpo anti-MyHC de rato (MF20, 1: 1000). É possível misturar na mesma solução de bloqueio, cadeia pesada anti-miosina de mouse ou anti-miogenina de mouse, com anti-MEF2 de coelho. - Remova a solução de bloco e adicione 600 μL de soluções de anticorpos primários por placa de 3,5 cm e incube durante a noite a 4 ° C numa câmara humidificada.
- Lavar as células 3 vezes com 1 mL de PBS. Incubar durante 1 h à RT em uma câmara escura com 600 μL dos anticorpos secundários preparados na solução de bloqueio, da seguinte forma: Alexa 488 de cabra (1: 1.000), cabra anti-coelho Alexa 546 (1: 1.000), E DAPI (1:50, solução-mãe a 15 μM).
CAUTION: DAPI é um composto tóxico que deve ser manipulado com luvas. - Aspirar e lavar as células 3 vezes com 1 mL de PBS.
- Monte revestimentos de vidro usando meio de montagem de álcool polivinílico com solução antitransmuvante. Mantenha-os a 4 ° C e protegidos da luz até imaginar as células.
7. Imaging de cálcio
- Cultura anterior, prepare cobertores de vidro com 25 mm de diâmetro. Coloque os lamínulas em etanol a 70% durante 48 h para remover qualquer graxa e sujeira da superfície, o que reduz a adesão celular à lamínula.
- Depois de enxaguar as lâminas com as águas, coloque-as novamente na água e esterilize-as (autoclavadas).
- Coloque um lamíngulo por placa de cultura de 3,5 cm e deixe secar. Armazene as placas de Petri para experiências adicionais ou use-as imediatamente.
- Adicione os mioblastos transfectados (5 - 6 x 10 5 células) ao lamínula de vidro.
Nota: as experiências são feitas 24 - 48 h após a indução de diferenciaçãoSobre, ou em proliferação de mioblastos. - Para realizar imagens de Ca 2+ , lave as células 2 vezes com PBS ou diretamente com o meio utilizado para as experiências (meio contendo cálcio, Tabela 3 ). Carregar as células com 2 μM de Fura-2 / AM mais 1 μM de ácido plurônico durante aproximadamente 30 min no escuro à temperatura ambiente.
Nota: O ácido plurônico ajuda a solubilizar Fura-2. Fura-2 / AM e ácido plurónico são dissolvidos no meio contendo cálcio. - Lave as células duas vezes no mesmo meio, mas sem Fura-2 / AM e ácido plurônico e deixe-as no escuro durante 10 a 15 minutos adicionais para permitir a desesterificação de Fura-2 / AM.
- Se a eficiência de carga de Fura-2 for muito baixa, adicione mais Fura-2 ( por exemplo, 4 μM) e / ou incuba as células por mais tempo ( por exemplo, 40 min).
- Remova o lamínula da placa de cultura e instale-a na câmara experimental. Adicione ~ 1 mL de meio contendo cálcio (dependendo do volume da experiênciaCâmara mental). Instale-o no palco do microscópio e comece a gravar.
Nota: A sonda sensível fluorescente Ca 2 + Fura-2 é excitada alternadamente a 340 nm e 380 nm, e a luz de emissão é coletada a 510 nm. Como as flutuações da concentração de Ca 2+ são relativamente lentas, adquira 1 razão a cada 2 s. - Para ativar o SOCE, é utilizado o seguinte protocolo clássico de reabsorção de thapsigargin / Ca 2+ : deixe as células por 2-3 minutos em meio contendo cálcio. Substitua o meio por meio sem cálcio por 1-2 minutos.
- Adicione 1 μM de thapsigargina para esgotar as lojas internas de cálcio.
Nota: O Thapsigargin é um bloqueador irreversível da atividade da bomba da ATPase de Ca 2+ ATPase sarco-endoplasmática (SERCA). Após 8 a 10 min, substitua rapidamente o meio com o meio contendo cálcio. Ca 2+ entrará nas células através dos canais SOCE. Aguarde cerca de 5 minutos antes de terminar as experiências.
CUIDADO: Thapsigargin é um composto tóxico que deve ser manuseado com luvas.
- Adicione 1 μM de thapsigargina para esgotar as lojas internas de cálcio.
8. Ca 2+ Análise de Medição
Nota: Execute a análise com o software de aquisição.
- Abra o experimento. Desenhe a região 1 em uma área onde não há células (região de fundo) e desenhe as outras regiões no citoplasma das células a serem analisadas (as regiões podem ser desenhadas em qualquer imagem: a 340 nm, a 380 nm, Ou a imagem de proporção). Vá para "Executar experiências"> "imagens de referência". Sob os 340 e 380 canais, selecione "região 1" e clique em "Subtrair fundo".
- Execute toda a experiência (F4: para frente) para garantir que nada interfira com a região do fundo, como um ponto de poeira fluorescente que percorra a região de fundo e que as células não se movem durante o tempo das experiências.
Nota: as regiões de interesse que são selecionadasNão deve incluir áreas escuras; Caso contrário, o valor da relação aparecerá ruidoso, pois parte do plano de fundo será incluído na medição. - Clique em "Log data" e reproduza todo o experimento novamente.
Nota: Isso abrirá uma planilha em que o tempo e a relação são registrados. Também é possível salvar os comprimentos de onda individuais de 340 nm e 380 nm. - Para obter informações sobre SOCE, extraia os dois parâmetros importantes do experimento: a amplitude da re-adição de Ca 2 + e a inclinação da fase de entrada de Ca 2+ ( Figura 3 ).
- Obter a amplitude subtraindo-se o valor de razão pouco antes de Ca2 + re-adio a partir da amplitude máxima da elevação de Ca2 +. Obtenha a inclinação máxima ajustando uma regressão linear dos primeiros segundos após a re-adição de Ca 2+ .
Nota: A área sob a curva da resposta ao thapsigargin é também um parâmetro informativo para extracT, pois reflete a quantidade de cálcio livre armazenada no SR.
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Representative Results
Após a dissociação enzimática de uma amostra de músculo humano, as células foram amplificadas em GM. Os mioblastos humanos, definidos como células CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, foram obtidos após FACS. Os mioblastos representaram mais de 60% da população analisada ( Figura 1 ). Os mioblastos humanos primários foram reaparecidos, cultivados em confluência e cultivados em DM por 48 h. Após a imunocoloração para a expressão do fator de transcrição MEF2 e da proteína muscular específica de miosina (MyHC), observamos que a maioria das células formou miotubos in vitro (células MyHC-positivas), com valores de índice de fusão de 60,9 ± 1,3% (N = 5; Figura 2 ). Observamos também que cerca de 40% dos mioblastos humanos, chamados células de reserva, escaparam dessa diferenciação terminal e permaneceram células mononucleadas indiferenciadas. Para estudos funcionais, analisamos a resposta de Ca 2 + de mioblastos ou miotubos 48 h após o início dediferenciação. A Figura 3 mostra um protocolo representativo usado para induzir SOCE e os parâmetros-chave para extrair de tal gravação. Para discernir informações relacionadas às moléculas envolvidas em SOCE, as células foram transfectadas com siRNA contra a molécula de interesse. A Figura 4 mostra o impacto do silenciamento de canais permeáveis a Ca 2 + da família TRPC em SOCE em mioblastos.
Figura 1 : FACS de Myoblasts Humanos. As células humanas dissociadas foram imunossintérias com anticorpos para os seguintes marcadores de superfície celular: CD45, CD56, CD34, CD144 e CD146. Depois de excluir células hematopoiéticas positivas para CD45, as células negativas para CD45 foram separadas com base na expressão de CD56. A população positiva de CD56 foi então fechada para CD34, CD144 e CD146. Os mioblastos humanos foram definidos como CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, como descrito anteriormente 19 , 4 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Diferenciação de Myoblastos Humanos. ( A ) Uma monocamada confluente de mioblastos humanos foi exposta à DM durante 48 h; fixo; E corados com anticorpos contra MEF2 (vermelho), MyHC (verde) e DAPI (azul) para identificar núcleos. Barra de escala = 50 μm. ( B ) O índice de fusão representa o número de núcleos incorporados nos miotubos divididos pelo número total de núcleos em um determinado campo. Os dados são médios ± SEM de 5 experimentos independentes.Ank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Medição de cálcio representativa da SOCE induzida por Thapsigargin. Os miotubos foram carregados com Fura-2 e a concentração de Ca 2+ citosólica foi medida. ( A ) As células permanecem durante alguns minutos num meio contendo cálcio, seguido de 2 min num meio isento de cálcio. A thapsigargina a 1 μM é então utilizada durante 8 min, seguida da re-adição de cálcio. Os 3 parâmetros importantes para extrair de tais registros são: a área sob a curva da resposta de thapsigargin, a inclinação do SOCE e a amplitude do SOCE. ( B ) Quantificação dos 3 parâmetros. A área sob a curva fornece informações sobre a quantidade de Ca 2+ armazenada no ER / SR, e os outros dois parâmetros permitem o quantificadorDa SOCE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Envolvimento de TRPC1 e TRPC4 em SOCE. ( A ) A concentração citosólica de Ca 2+ foi avaliada utilizando Fura-2 em mioblastos de proliferação transfectados com siTRPC1 ou siTRPC1 e siTRPC4. O SOCE foi desencadeado pela depleção da loja interna com thapsigargina 1 μM na ausência de Ca 2+ externo (Ca 2 + livre) e medido durante a re-adição de Ca 2+ externo 2 mM. Cada traço representa a média de um lamínula representativo. ( B ) Quantificação dos efeitos do siRNA na amplitude SOCE. Esta figura foi modificada a partir da referência 12 , com permissão. Barras ar E significam ± SEM, * p <0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Meio de crescimento (GM): | Concentração | Meio de diferenciação (DM): | Concentração | |||||
| Ham F10 | DMEM | |||||||
| FCS | 15% | Albumina de soro bovino | 0,5 mg / ml | |||||
| Albumina de soro bovino | 0,5 mg / ml | Factor de crescimento epidérmico | "> 10 ng / ml||||||
| Fetuin | 0,5 mg / ml | insulina | 0,01 mg / ml | |||||
| Factor de crescimento epidérmico | 10 ng / ml | Creatina | 1 mM | |||||
| Dexametasona | 0,39 μg / ml | Piruvato | 100 μg / ml | |||||
| insulina | 0,04 mg / ml | Uridina | 50 μg / ml | |||||
| Creatina | 1 mM | Gentamicina | 10 μg / ml | |||||
| Piruvato | 100 μg / ml | <Td colspan = "2"> | ||||||
| Uridina | 50 μg / ml | |||||||
| Gentamicina | 5 μg / ml | |||||||
Tabela 1: Composição média para cultura de mioblastos.
| Tubos | Anticorpos | |||||
| 1 | Nenhum | |||||
| 2 | Isotipo AlexaFluor 488-, Isotype PE-CF594, Isotype PE, Isotype PECy7Isotype APC | |||||
| 3 | Mouse anti-humano CD56-AlexaFluor 488 | |||||
| 4 | Mouse anti-humano CD45 PE-CF594 | |||||
| 5 | Mouse anti-humano CD144-PE | |||||
| 6 | Mouse anti-humano CD146-PECy7 | |||||
| 7 | Mouse anti-humano CD34-APC | |||||
| 8 | CD56-AlexaFluor 488-, anti-humano do rato, CD45 PE-CF594 anti-humano do rato, CD144-PE anti-humano do rato, CD34-APC anti-humano do rato, CD146-PECy7 anti-humano do rato | |||||
Tabela 2: Anticorpos usados para a classificação de células.
| Meio contendo cálcio | concentração | Meio sem cálcio | concentração | |||||
| NaCl | NaCl | 135 mM | ||||||
| KCl | 5 mM | KCl | 5 mM | |||||
| MgCl2 | 1 mM | MgCl2 | 1 mM | |||||
| CaCl2 | 2 mM | EGTA | 1 mM | |||||
| Hepes | 10 mM | Hepes | 10 mM | |||||
| Glicose | 10 mM | Glicose | 10 mM | |||||
| PH 7,45 ajustado com NaOH | PH 7,45 ajustado com NaOH | |||||||
Tabela 3: Composição média para experiências de imagem de cálcio.
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Discussion
O isolamento e a cultura dos mioblastos humanos do músculo esquelético adulto oferecem um modelo in vitro para estudar a diferenciação muscular e a regeneração muscular. Neste artigo, fornecemos um protocolo que permite a purificação de altos rendimentos de mioblastos humanos de maneira simples e limitada em termos de custo. Além disso, esta técnica fornece resultados confiáveis e reprodutíveis em termos de porcentagem de mioblastos isolados e sua eficiência de diferenciação miogênica. Na verdade, obtivemos cerca de 60% dos mioblastos humanos após a triagem celular. Essas células podem ser mantidas em cultura para até 6 passagens (cerca de 30 duplas) e manter suas capacidades para se diferenciar. Além disso, a diferenciação miogênica ocorre rapidamente depois de mudar o meio de GM para DM, pois após 2 a 3 dias em DM, a fusão de mioblastos é máxima. Neste modelo, cerca de 60% dos mioblastos se fundem em miotubos após 2 dias em DM. Outra vantagem é que estes cel celanos primáriosAs culturas são facilmente transfectadas com siRNA. A mídia GM e DM usada em nosso laboratório é caseira. Alternativamente, a mídia comercial pode ser usada, mas nunca tentamos sua eficiência em culturas primárias humanas.
Uma desvantagem do método mencionado é o uso de tripsina durante a digestão enzimática do tecido. Este procedimento remove uma grande fração dos marcadores de superfície celular e implica que deixamos as células em cultura por alguns dias antes de realizar FACS. A colagenase pode ser utilizada em vez da tripsina para preservar melhor as proteínas da membrana e permitir a triagem de mioblastos humanos imediatamente após a dissociação do tecido. No entanto, o custo da colagenase é significativamente maior do que a tripsina, e um passo de amplificação ainda seria necessário após a triagem celular para obter números de células suficientes para as experiências subsequentes. Outra limitação da técnica é a "qualidade" das amostras musculares obtidas de ortopediaCirurgia. De fato, os pedaços de tecido obtidos podem ser mais ou menos danificados devido à cirurgia, e o tempo entre a cirurgia e a dissociação celular no laboratório pode variar de um dia para o outro. No entanto, para o isolamento, purificação e diferenciação de mioblastos em miotubos, obtemos resultados obtidos de forma rotineira. Finalmente, a idade do paciente pode ser um problema, já que a quantidade e a capacidade regenerativa das células satélites diminuem com a idade de 20 anos. Assim, restringimos nossos experimentos a pacientes jovens (com menos de 40 anos).
Como mencionado, os mioblastos se diferenciam de forma rápida e eficiente, o que é uma grande vantagem de estudar os eventos iniciais da diferenciação muscular esquelética. No entanto, à medida que os miotubos se formam rapidamente, eles também tendem a se contrair e separar espontaneamente das placas de cultura. Isso impede a análise dos eventos de fusão posteriores. Para estudar esses eventos posteriores, seria necessárioPara revestir a placa de cultura com matriz extracelular para melhorar a aderência celular e diminuir o desprendimento de miotubos 21 .
Imagem de cálcio usando a sonda fluorescente Fura-2 é uma técnica amplamente utilizada e reprodutível que é fácil de executar. O carregamento de Fura-2 é eficiente e o uso de uma sonda ratiométrica, como a Fura-2, tem várias vantagens em relação a um corante de comprimento único de onda. Ele normaliza mudanças de foco ou diferenças no carregamento entre células e dentro de uma célula ( por exemplo, núcleo versus citosol). O protocolo que descrevemos para provocar e medir SOCE é usado regularmente em muitos sistemas celulares diferentes. O silenciamento de diferentes canais ou reguladores de cálcio permite a elucidação da composição molecular de SOCE e a importância relativa dos diferentes jogadores, tanto em mioblastos quanto em miotubos. Uma abordagem alternativa usando imagens Fura-2 e Ca 2+ é a aplicação doMn 2+ quench técnica. Mn 2+ entra nas células através de canais permeáveis a Ca 2 + e apaga a fluorescência de fura-2. A medida da taxa de resfriamento dá uma medida mais direta do SOCE 22 , 23 . Contudo, isso requer a utilização de equipamentos ligeiramente diferentes. A sinalização de Ca 2+ também pode ser realizada usando indicadores de Ca 2+ codificados geneticamente, que têm a grande vantagem de serem precisamente localizados em diferentes compartimentos celulares. As desvantagens são o requisito para a transfecção celular e a dinâmica do sinal, que geralmente é menor do que com corantes químicos 24 . Para medir Ca 2 + em organelas como mitocôndrias ou SR, as sondas genéticas são o padrão-ouro. No entanto, para as medidas citosolicas de Ca 2+ , o benefício de usar Fura-2 sobre sondas genéticas permanece.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência da Suíça (número de subvenção 310030-166313), a "Fundação Suisse para a pesquisa sobre les maladies musculaires", a "Fundação Marcel Levaillant" e a "Fundação para a pesquisa ostéo-articular".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 mL tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 mL tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 mL tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. |
References
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