Summary
Здесь мы опишем методологию получения чистой популяции человеческих миобластов из мышечной ткани взрослого человека. Эти клетки используются для изучения дифференцировки скелетных мышц in vitro и, в частности, для изучения белков, участвующих в передаче сигналов Ca 2+ .
Abstract
Спутниковые клетки (SC) представляют собой мышечные стволовые клетки, расположенные между плазматической мембраной мышечных волокон и окружающей базальной пластинкой. Они необходимы для регенерации мышц. При травме, которая часто встречается в скелетных мышцах, активируются СК. Они размножаются как миобласты и дифференцируются для восстановления мышечных повреждений. Среди многих событий, которые происходят во время мышечной дифференциации, цитозольные сигналы Ca 2+ имеют большое значение. Эти сигналы Ca 2+ возникают из-за выделения Ca 2+ из внутренних хранилищ Ca 2+ , а также из Ca 2 + -входа из внеклеточного пространства, в частности, в хранилище Ca 2+, хранящегося в магазине (SOCE). В этой статье описывается методология, используемая для получения чистой популяции миобластов человека из образцов мышц, собранных после ортопедической хирургии. Ткань механически и ферментативно расщепляется, и клетки амплифицируются, а затем сортируются по проточной цитометрии в зависимости от наличия специфическихFic мембранные маркеры. После получения человеческие миобласты расширяются и привержены дифференциации путем удаления факторов роста из культуральной среды. Уровни экспрессии специфических факторов транскрипции и иммунофлуоресценции in vitro используются для оценки процесса миогенной дифференцировки в условиях контроля и после нейтрализации белков, участвующих в передаче сигналов Ca 2+ . Наконец, мы подробно описываем использование Fura-2 в качестве рациометрического зонда Ca 2+, который обеспечивает надежные и воспроизводимые измерения SOCE.
Introduction
Человеческие скелетные мышцы состоят из групп сократительных, многоядерных мышечных волокон, полученных в результате слияния миогенных клеток-предшественников. Скелетные мышцы способны регенерировать после травмы благодаря наличию SC, стволовых клеток скелетных мышц, расположенных между плазматической мембраной myofibers (сарколеммой) и базальной пластинкой. В неповрежденной мышце SCs в основном присутствуют в спокойном состоянии. В ответ на механические стрессы или травмы SC активируются (миобласты), размножаются и подвергаются либо дифференцировке, либо формируют новые миофибры или самообновление для пополнения пула SC 1 , 2 . На протяжении многих лет были разработаны несколько методов для выделения SC и их потомства, миобластов, из биопсий скелетных мышц. С большим пониманием маркеров клеточной поверхности, экспрессируемых на этих клетках, и методологии сортировки клеток, активированной флуоресценцией (FACS) 3, 4 , 5 , теперь можно выделить чистые популяции миобластов человека из образцов мышц.
Кальциевая сигнализация регулирует развитие скелетных мышц, гомеостаз и регенерацию. В частности, вход Са 2+ , который активируется следующим внутриклеточным истощением магазина, называется SOCE, имеет большое значения 6 для этих процессов. При стимуляции клеток, уровень Са 2+ в эндо / саркоплазматического ретикулума (ER / SR) уменьшается, что , в свою очередь , активирует плазматической мембраны Ca 2+ каналы , которые позволяют вход Ca 2+ для пополнения ER / SR 7. Двумя основными белками, участвующими в СОСЭ, являются белок ERR / SR Ca 2+ -центрирующего стромального взаимодействия 1 (STIM1) и канал Ca 2+ плазматической мембраны Orai1. Скелетные мышцы обильно выражают эти два белка, а также другие белки одних и тех же семейств (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 и несколько Ca 2+ -проницаемых каналов карионического (TRPC) транзиторного рецепторного семейства 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2+ через канал SOCE имеет большое значение для мышечного образования / регенерации 14 . Мутации протеинов STIM1 или Orai1 оказывают вредное воздействие на функцию мышц, что в основном ведет к мышечной гипотонии 15 . Модели животных с ухудшением состояния окружающей среды также демонстрируют снижение мышечной массы и силы вместе с повышенной утомляемостью 6 , 16 , 17 . Как уже упоминалось, другие белки STIM и Orai, а также многие каналы TRPC выражены в скелетных мышцах, и их соответствующие роли пока не определены. Сбив dВладеют своим уровнем экспрессии, поэтому можно исследовать их последствия в SOCE и их роли во время дифференциации скелетных мышц человека.
Измерение SOCE может быть выполнено с использованием двух разных подходов: электрофизиологических записей тока и измерений Ca 2+ . Электрофизиология, безусловно, является более прямым методом, поскольку она измеряет текущий интерес и связанную с ним электрофизиологическую подпись. Однако эту технику очень трудно применять к мышечным клеткам, главным образом из-за большого размера мышечных клеток и небольшого размера эндогенного тока СОЭ. Цитозолическое изображение Ca 2+ технически очень доступно, но эта мера более косвенная, так как уровень Ca 2+, измеренный в цитозоле, отражает как вход Ca 2+, так и повторное прокачивание клетки или во внутренних хранилищах.
Методология, которая включает выделение миобластов из мелких кусочков человеческого скеляЭтальной мышцы после ферментативного расщепления, амплификации и FACS объясняется в этой статье. Процесс дифференцировки мышц и протокол иммунофлюоресценции , чтобы следить за экспрессией маркеров дифференцировки с течением времени описаны 18. Наконец, объясняются измерения SOCE и роли различных ионных каналов в передаче сигналов Ca 2+ и дифференцировке скелетных мышц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы человеческих мышц (ткани, полученные из полутяжелых мышц) были собраны во время ортопедической хирургии у здоровых пациентов в качестве хирургических отходов. Все методы, относящиеся к человеческому исследованию, были выполнены в соответствии с руководящими принципами и положениями швейцарских регулирующих органов здравоохранения и одобрены Комиссией по связям с общественностью Женевских кантональных властей Швейцарии (протокол CER № 12-259) , Информированные и письменные согласия были получены от всех взрослых субъектов, участвующих в исследовании.
1. Выделение миобластов из скелетных мышц человека
- Во время всех процедур поддерживайте стерильные условия, работая под капюшоном для культуры тканей уровня II и используя стерильные среды и стерильные буферы.
Примечание. Эта процедура может применяться ко многим человеческим скелетным мышцам.
2. Протокол диссоциации
- Перенесите образцы мышц (2 - 3 г) в стерильный 6 смпластина.
- Промойте образцы мышц 5-10 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS). Повторите промывку.
- Удалите соединительные и жировые ткани с помощью изогнутых ножниц и зажима.
- Взвесьте образец мышцы (см. Шаг 2.13) и перенесите его на новую стерильную пластину диаметром 6 см.
- Добавить 5 мл 0,05% трипсин-ЭДТА.
- Используя ножницы, вырежьте и протрите мышечную ткань на мелкие кусочки (менее 2 мм).
- Используя 10 мл серологической пипетки, перенесите измельченную мышцу в 200 мл диссоциационную бутылку, содержащую магнитный бар. Повторите этот шаг до тех пор, пока 90 мл 0,05% трипсина-ЭДТА не будут перенесены со всеми измельченными мышцами в коробку для диссоциации. Закройте бутылку для диссоциации и инкубируйте при 37 ° C в течение 60 минут при мягком перемешивании.
- Удалите бутылку для диссоциации из нагревающей ванны и прекратите ферментативную реакцию, добавив 10 мл сыворотки плода теленка (FCS, конечный объем 10%) в бутылку для диссоциации. Гомогенизируйте смесь пипеткой.
- приготовительныйПредставляют собой две трубки объемом 50 мл с сетчатым фильтром на 70 мкм. Пропустите половину клеточной суспензии через сетчатый фильтр на каждой трубе, пипетируя вверх и вниз по фильтру до тех пор, пока суспензия не пройдет.
- Центрифугируйте трубки при 200 xg и 20 ° C в течение 5 мин; Аспирируют и отбрасывают супернатант.
- Ресуспендируют клетки с 10 мл среды для роста (GM, таблица 1 ) и пропускают клетки через 40-мкм клеточный фильтр, помещенный на одну трубку объемом 50 мл. Центрифугируйте трубку при 200 xg и 20 ° C в течение 5 мин; Аспирируют и отбрасывают супернатант.
- Ресуспендируют клетки с 10 мл GM и центрифугируют пробирку при 200 xg и 20 ° C в течение 5 мин; Аспирируют и отбрасывают супернатант.
- Ресуспендируют клетки с 1 мл GM и подсчитывают клетки, используя камеру Нойбауэра.
Примечание: Обычно урожай 3 × 10 5 клеток на 1 г мышц следует собирать. Выход рассчитывается путем деления числа клеток на вес мышечной биопыSy (шаг 2.4). - Поместите 2 × 10 5 клеток в стерильную 6-см пластинку, содержащую 4 мл GM, и инкубируйте при 37 ° C и 7% CO 2 . Приготовьте столько пластин, сколько необходимо.
- Измените GM через 3 дня.
Примечание. Свежеотсеченные клетки нуждаются во времени, чтобы придерживаться культуральной пластины. Более того, первое время удвоения миогенных клеток составляет около 50-60 ч. После первого деления время удвоения составляет около 20 часов. - Через 5-7 дней, когда клетки достигают 70 - 80% слияния (около 1,5 × 10 6 клеток / на 6 см пластину), начинают окрашивание антител и сортировку клеток (шаг 3).
3. Окрашивание антитела и сортировка клеток
- После однократного ополаскивания PBS инкубируйте адгезивные клетки (в пластине размером 6 см) с 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА при 37 ° С и 7% СО 2 в течение 3 мин (или инкубируйте при 5% СО 2 ). Остановите реакцию, добавив 2 мл GM и соберите клетки в пробирке 15 мл. После центрифугирования (200 мкг в течение 5 мин), resUspend клетки в 1 мл GM.
- Подсчитайте ячейки с помощью камеры Нойбауэра.
- Выполните следующие процедуры на льду.
Примечание. Процедура установки правильной коррекции флуоресценции на цитометре имеет важное значение и должна быть одинаковой на любом цитометре. Трубы 1 и 2 используются в качестве отрицательных контролей. Трубки 3-7 используются для установки компенсации на цитометре во время первого эксперимента ( таблица 2 ). Конечная концентрация, используемая для каждого антитела и соответствующего изотипа, должна быть одинаковой (около 1 мкг / 10 6 клеток). - Отгрузка 1 × 10 5 клеток на пробирку (5-мл пробирка) для труб 1-7 ( таблица 2 ). Поместите оставшуюся суспензию клеток в пробирку 8 для сортировки клеток.
- Промойте клетки 1 мл холодного FACS-буфера (PBS-5% FCS). Закрыть и центрифугировать трубки при 200 xg и 4 ° C в течение 5 мин; Аспирируют и отбрасывают супернатант.
- Добавьте 200 мкл буфера FACS на пробирку. Добавить антитела к thE в соответствии с таблицей 2 . Инкубируйте на льду в течение 30 мин.
- Вымойте клетки: добавьте 1 мл буфера FACS в каждую пробирку. Закрыть и центрифугировать трубки при 200 xg и 4 ° C в течение 5 минут. Аспирируйте и отбросьте супернатант. Повторите этот шаг еще раз.
- Ресуспендируют клетки в 500 мкл буфера FACS. Закройте трубки и держите их на льду до сортировки клеток. Подготовьте 4 трубки по 1,5 мл, каждая из которых содержит 500 мкл GM, что необходимо для сбора клеток во время сортировки клеток. Держите их на льду.
- Сортируйте человеческие миобласты методом проточной цитометрии ( рис. 1 ). После исключения CD45-положительных гемопоэтических клеток выделяют CD45-негативные клетки на основе экспрессии CD56. Затем устанавливают CD56-положительную популяцию для CD34, CD144 и CD146 (человеческие миобласты определяются как CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-клетки). Повторно проанализируйте небольшую часть отсортированной популяции клеток, чтобы проверить чистоту.
- Пул труб, содержащих человеческую миоблаВ одну 15-мл пробирку и промыть один раз, добавив 5 мл GM. Центрифугируйте трубку при 200 xg и 20 ° C в течение 5 мин; Аспирируют и отбрасывают супернатант.
- Ресуспендируют клетки в 1 мл GM и наклеивают клетки на непокрытую 6-см пластинку, содержащую 4 мл GM (2 × 10 5 клеток на планшет). Инкубируйте при 37 ° C и 7% CO 2 .
4. Обслуживание ячеек
- Изменяйте половину культуральной среды каждые 2 дня. Удалите 2 мл старого ГМ из чашки с культурой и добавьте 2 мл GM.
Примечание: Myoblasts производят факторы роста, которые полезны для условий культуры. - Трипсинизируйте клетки, когда они достигают 70 - 80% слияния, чтобы избежать преддифференциации. После однократного ополаскивания PBS инкубируйте адгезивные клетки (в 6-см пластинке) с 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА при 37 ° С и 7% СО 2 в течение 3 мин. Остановите реакцию, добавив 2 мл GM и соберите клетки в пробирке объемом 15 мл. После центрифугирования (200 мкг в течение 5 мин), resusОтложите клетки в 1 мл GM.
- Подсчитайте клетки и подготовьте 6 см планшеты с 2 × 10 5 клетками на планшет в 4 мл GM.
- Хранить человеческие миобласты до 6 проходов или замораживать их в ГМ, содержащем 10% ДМСО, 1 х 10 6 клеток на мл. Заморозить клетки в прогрессивном морозильном шкафу (1 ° C / мин); Для длительного хранения помещайте клетки в жидкий азот.
5. Трансфекция миобластов человека с помощью siRNA
Примечание: Myoblasts трансфицируют с использованием коммерческого трансфекционного реагента за два дня до индукции дифференцировки. Эффект специфической siRNA против гена всегда сравнивается с эффектом контрольной миРНК. SiRNAs представляют собой двухцепочечные РНК, которые необходимо держать на льду и манипулировать перчатками.
- Получите 70 - 80% сливного монослоя человеческих миобластов в пластине размером 6 см (около 1,5 × 10 6 клеток).
Примечание: 5 x 10 5 клеток на трансфекцию необходимы для получения conПлавный монослой трансфицированных миобластов через 2 дня в ГМ. - Подготовьте стеклянные покровные стекла (описанные для изображения кальция на этапе 7).
- Теплый ГМ, 0,05% трипсина-ЭДТА и ЗФР до 37 ° С.
- Выполните все следующие шаги в капюшона культуры ткани уровня II для поддержания стерильности.
- В 1,5-миллилитровой пробирке высылают 500 мкл восстановленной сывороточной среды, 3 мкл трансфекционного реагента и 1 мкл сиРНК при 20 мкМ. Аккуратно перемешайте и держите при комнатной температуре (RT) в течение 15-20 мин.
- Во время этого инкубационного периода подготовьте миобласты для трансфекции. После однократного ополаскивания PBS инкубируйте адгезивные клетки (в 6-см пластинке) с 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА при 37 ° С и 7% СО 2 в течение 3 мин. Остановите реакцию, добавив 2 мл GM и соберите клетки в пробирке объемом 15 мл. После центрифугирования (200 мкг в течение 5 мин) ресуспендируют клетки в 1 мл ГМ.
- Подсчитайте ячейки с помощью камеры Нойбауэра.
- Resuspend 5 x 10 5 клетокВ 200 мкл GM для каждой трансфекции ( т.е. для 2 трансфекций ресуспендируют в 400 мкл).
- Добавьте 200 мкл клеточной суспензии к каждой 500 мкл смеси siRNA-transfectant. Пипетируйте вверх и вниз дважды и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Добавьте 700 мкл (клетки + siRNA-трансфектант) в чашку для приготовления 3,5 см, содержащую покровное стекло. Добавьте GM, чтобы получить окончательный объем 2 мл.
- Через 24 часа при 37 ° C и 7% CO 2 полностью замените среду 2 мл свежего GM. Через 24 ч обычно присутствует слитый монослой трансфицированных клеток; Если это так, индуцируют миобластную дифференцировку путем замены GM на 2 мл среды дифференцировки (DM, таблица 1 ).
- Выполните эксперименты по визуализации кальция через 24 - 48 ч после индукции дифференцировки или пролиферирующих миобластов.
Примечание: Иммунофлуоресценцию обычно проводят через 48 ч после индукции дифференцировки.
6. Им.Окрашивание маркеров дифференцировки
Примечание: окрашивание иммунофлюоресценции выполняется через 48 часов в DM, но оно также может быть выполнено в другое время дифференцировки. Миогенин и MEF2 представляют собой ядерные белки, экспрессируемые только в дифференцированных клетках (до слияния в миотубы), а их окрашивание позволяет оценить процесс дифференциации. Тяжелая цепь миозина (MyHC) выражается только в миотауках и используется для оценки размера и индекса слияния миопутов (количество ядер в миотубах / общее число ядер).
- Через 48 ч в DM промывают слитый монослой дифференцированных клеток дважды 1 мл PBS при комнатной температуре. Делайте это осторожно, чтобы не отсоединить миотубы.
- Закрепите клетки 1 мл 4% параформальдегида (PFA) в течение 15 мин при комнатной температуре. Промойте клетки PBS дважды, в течение 5 минут каждый.
- Пермеабилизируйте клетки с 1 мл PBS, содержащим 0,25% Triton X-100, в течение 45 минут и промойте 3 раза 1 мл PBS.
- БлокироватьСпецифические сайты связывания путем инкубации клеток в PBS с добавлением 0,2% Tween-10 и 2% сыворотки козы (блок-раствор) в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Подготовьте первичные антитела, разведенные в блочном растворе (600 мкл на пластину 3,5 см).
Примечание: Используются следующие первичные антитела: мышь против миогенина (1: 600), кролик анти-MEF2 (1: 300) и мышиное антитело против MyHC (MF20, 1: 1000). В одном и том же блокирующем растворе можно смешивать тяжелую цепь против миозина мыши или антимиогенин мыши с кроличьим анти-MEF2. - Удалите блок-раствор и добавьте 600 мкл первичных растворов антител на 3,5-см пластинку и инкубируйте в течение ночи при 4 ° С в увлажненной камере.
- Промывают клетки 3 раза 1 мл PBS. Инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре в темной камере с 600 мкл вторичных антител, полученных в блочном растворе, следующим образом: козьи антимышица Alexa 488 (1: 1000), козьего кролика Alexa 546 (1: 1000), И DAPI (1:50, исходный раствор при 15 мкМ).
обеспечения уплатыN: DAPI - это токсичное соединение, которое должно обрабатываться перчатками. - Аспирируйте и промывайте клетки 3 раза 1 мл PBS.
- Горизонтальные покровные стекла с использованием среды для поливинилового спирта с антифрикционным раствором. Держите их при температуре 4 ° C и защищен от света до изображения клеток.
7. Кальциевая визуализация
- Перед культурой подготовьте стеклянные покровные стекла диаметром 25 мм. Поместите покровные стекла в 70% этанол в течение 48 часов, чтобы удалить с поверхности смазку и грязь, что уменьшает прилипание клеток к покровному стеклу.
- После промывки покровных интервалов водой, положите их обратно в воду и стерилизуйте их (автоклавированные).
- Поместите покровное стекло на 3,5-сантиметровую культуральную пластину и дайте им высохнуть. Храните чашки Петри для дальнейших экспериментов или используйте их немедленно.
- Добавьте трансфецированные миобласты (5 - 6 × 10 5 клеток) в покровное стекло.
Примечание: эксперименты проводятся через 24 - 48 ч после индукции дифференциацииНа или на пролиферирующих миобластах. - Чтобы выполнить изображение Ca 2+ , промойте клетки 2 раза PBS или непосредственно средой, используемой для экспериментов (кальцийсодержащая среда, таблица 3 ). Загрузите клетки с помощью 2 мкМ Fura-2 / AM плюс 1 мкМ плуроновой кислоты в течение примерно 30 мин в темноте при комнатной температуре.
Примечание. Плуроновая кислота помогает солюбилизировать Fura-2. Fura-2 / AM и плуроновая кислота растворяются в среде, содержащей кальций. - Промойте клетки дважды в одной и той же среде, но без Fura-2 / AM и плуроновой кислоты, и оставьте их в темноте в течение дополнительных 10-15 минут, чтобы обеспечить деэтерификацию Fura-2 / AM.
- Если эффективность загрузки Fura-2 слишком низкая, добавьте еще Fura-2 ( например, 4 мкМ) и / или инкубируйте клетки в течение более длительного времени ( например, 40 минут).
- Удалите покровное стекло с культуральной пластины и установите его в экспериментальную камеру. Добавьте ~ 1 мл кальцийсодержащей среды (в зависимости от объема опытаМентальная камера). Установите его на ступень микроскопа и начните запись.
Примечание: флуоресцентный Ca 2+ -чувствительный зонд Fura-2 возбуждается попеременно при 340 нм и 380 нм, а свет излучения собирается при 510 нм. Поскольку флуктуации концентрации Ca 2+ относительно медленны, приобретайте 1 отношение каждые 2 с. - Чтобы активировать SOCE, используется следующий классический протокол повторного добавления тапсигаргина / Ca 2+ : оставьте клетки в течение 2-3 минут в среде, содержащей кальций. Замените среду средой, не содержащей кальция, в течение 1-2 минут.
- Добавьте 1 мкМ тапсигаргина для истощения внутренних хранилищ кальция.
Примечание. Тапсигаргин является необратимым блокатором активности саркоэндоплазматического ретикулума Ca 2+ АТФазы (SERCA). Через 8-10 минут быстро замените среду кальцийсодержащей средой. Ca 2+ войдет в клетки через каналы SOCE. Подождите около 5 мин до завершения экспериментов.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ. Тапсигаргин является токсичным соединением, которое должно обрабатываться перчатками.
- Добавьте 1 мкМ тапсигаргина для истощения внутренних хранилищ кальция.
8. Анализ Ca 2+
Примечание. Выполните анализ с помощью программного обеспечения для приобретения.
- Откройте эксперимент. Нарисуйте область 1 в области, где нет клеток (область фона), и рисуйте другие области в цитоплазме клеток, подлежащих анализу (области можно нарисовать на любом изображении: 340 нм, 380 нм, Или отношение изображения). Перейдите в раздел «Запуск экспериментов»> «Обратные изображения». Под каналами 340 и 380 выберите «регион 1», а затем нажмите «Вычесть фон».
- Проведите весь эксперимент (F4: вперед), чтобы гарантировать, что ничто не мешает области фона, например, флуоресцентное пятно пыли, которое проходит через область фона, и что клетки не движутся во время экспериментов.
Примечание. Интересующие регионыНе должны включать темные области; В противном случае значение отношения будет казаться шумным, так как часть фона будет включена в измерение. - Нажмите «Данные журнала» и повторите весь эксперимент.
Примечание. Это откроет таблицу, в которой регистрируются время и отношение. Также возможно сохранить отдельные длины волн длиной 340 нм и 380 нм. - Чтобы получить информацию о SOCE, извлеките из эксперимента два важных параметра: амплитуду повторного добавления Ca 2+ и наклон фазы входа Ca 2+ ( рисунок 3 ).
- Получите амплитуду, вычитая значение отношения непосредственно перед повторным добавлением Са 2+ из максимальной амплитуды повышения Ca 2+ . Получите максимальный уклон, установив линейную регрессию в первые секунды после повторного добавления Ca 2+ .
Примечание. Площадь под кривой ответа тапсигаргина также является информативным параметром для экстракцииТ, так как он отражает количество свободного кальция, хранящегося в СР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После ферментативной диссоциации образца человеческой мышцы клетки амплифицировали в GM. Человеческие миобласты, определенные как CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- клетки, были получены после FACS. Миобласты представляли более 60% анализируемого населения ( рис. 1 ). Первичные человеческие миобласты реплицировали, выращивали до слияния и культивировали в DM в течение 48 часов. После иммуноокрашивания для экспрессии транскрипционного фактора MEF2 и мускульной специфической белковой миозиновой тяжелой цепи (MyHC) мы наблюдали, что большинство клеток образовывали миопузы in vitro (MyHC-положительные клетки) со значениями индекса слияния 60,9 ± 1,3% (N = 5; Рисунок 2 ). Мы также заметили, что около 40% человеческих миобластов, называемых резервными клетками, избегали этой терминальной дифференцировки и оставались недифференцированными мононуклеированными клетками. Для функциональных исследований мы проанализировали реакцию Ca 2+ миобластов или миотубов через 48 ч после началадифференциация. На рисунке 3 показан типичный протокол, используемый для индуцированного SOCE и ключевых параметров для извлечения из такой записи. Чтобы различать информацию, связанную с молекулами, участвующими в СОЗ, клетки трансфицировали siRNA против представляющей интерес молекулы. На рисунке 4 показано влияние глушения Ca 2+ -проницаемых каналов семейства TRPC на SOCE в миобластах.
Рисунок 1 : FACS человеческих миобластов. Диссоциированные клетки человека иммуноокрашивали антителами для следующих маркеров клеточной поверхности: CD45, CD56, CD34, CD144 и CD146. После исключения CD45-положительных гемопоэтических клеток CD45-негативные клетки разделяли на основе экспрессии CD56. Затем CD56-положительную популяцию собирали для CD34, CD144 и CD146. Человеческие миобласты были определены как CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, как описано ранее 19 , 4 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Дифференциация человеческого миобласта. ( A ) слитый монослой человеческих миобластов подвергали воздействию DM в течение 48 часов; исправлено; И окрашивали антителами против MEF2 (красный), MyHC (зеленый) и DAPI (синий) для идентификации ядер. Шкала шкалы = 50 мкм. ( B ) Индекс слияния представляет собой число ядер, включенных в миотубы, деленные на общее число ядер в определенном поле. Данные представляют собой среднее ± SEM из 5 независимых экспериментов.Ank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3 : Репрезентативное измерение кальция индуцированного тапсигаргином СОЖ. Миотубы загружали с помощью Fura-2 и измеряли цитозольную концентрацию Ca 2+ . ( A ) Клетки помещают в течение нескольких минут в кальцийсодержащую среду, затем 2 мин в среде, не содержащей кальция. Затем 1 мкМ тапсигаргина используют в течение 8 мин с последующим добавлением кальция. 3 важными параметрами для извлечения из такой записи являются: площадь под кривой ответа тапсигаргина, наклон SOCE и амплитуда SOCE. ( B ) Количественная оценка трех параметров. Область под кривой предоставляет информацию о количестве Ca 2+, хранящемся в ER / SR, и два других параметра позволяют использовать количественныеА также в связи с этим. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4 : Привлечение TRPC1 и TRPC4 в SOCE. ( A ) Концентрацию цитозольного Ca 2+ оценивали с использованием Fura-2 в пролиферирующих миобластах, трансфецированных siTRPC1 или siTRPC1 и siTRPC4. SOCE была вызвана внутренним истощением магазина с 1 мкМ тапсигаргином в отсутствие внешнего Ca 2+ (Ca 2+ free) и измерена во время повторного добавления 2 мМ внешнего Ca 2+ . Каждая трасса представляет собой среднее значение представительского покровного. ( B ) Количественная оценка влияния siRNA на амплитуду SOCE. Эта цифра была изменена из ссылки 12 с разрешения. Бары ar E mean ± SEM, * p <0,05. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Среда роста (GM): | концентрация | Дифференцирующая среда (DM): | концентрация | |||||
| Ham's F10 | DMEM | |||||||
| FCS | 15% | Бычий сывороточный альбумин | 0,5 мг / мл | |||||
| Бычий сывороточный альбумин | 0,5 мг / мл | Эпидермальный фактор роста | "> 10 нг / мл||||||
| фетуин | 0,5 мг / мл | инсулин | 0,01 мг / мл | |||||
| Эпидермальный фактор роста | 10 нг / мл | креатин | 1 мМ | |||||
| дексаметазон | 0,39 мкг / мл | пируват | 100 мкг / мл | |||||
| инсулин | 0,04 мг / мл | уридин | 50 мкг / мл | |||||
| креатин | 1 мМ | гентамицин | 10 мкг / мл | |||||
| пируват | 100 мкг / мл | <Td colspan = "2"> | ||||||
| уридин | 50 мкг / мл | |||||||
| гентамицин | 5 мкг / мл | |||||||
Таблица 1: Средняя композиция для культуры Myoblast.
| трубы | Антитела | |||||
| 1 | Никто | |||||
| 2 | Изотип AlexaFluor 488-, изотип PE-CF594, изотип PE, изотип PECy7Isotype APC | |||||
| 3 | Мышь против человека CD56-AlexaFluor 488 | |||||
| 4 | Мышь анти-человек CD45 PE-CF594 | |||||
| 5 | Мышь с анти-человеческим CD144-PE | |||||
| 6 | Мышь анти-человеческая CD146-PECy7 | |||||
| 7 | Мышь с анти-человеческим CD34-APC | |||||
| 8 | Мышь анти-человеческая CD56-AlexaFluor 488-, Мышь анти-человеческая CD45 PE-CF594, Мышь анти-человеческая CD144-PE, Мышь анти-человеческая CD34-APC, Мышь античеловеческая CD146-PECy7 | |||||
Таблица 2: Антитела, используемые для сортировки клеток.
| Кальцийсодержащая среда | концентрация | Без кальция среда | концентрация | |||||
| NaCl | NaCl | 135 мМ | ||||||
| KCl | 5 мМ | KCl | 5 мМ | |||||
| MgCl2 | 1 мМ | MgCl2 | 1 мМ | |||||
| CaCl2 | 2 мМ | EGTA | 1 мМ | |||||
| Hepes | 10 мМ | Hepes | 10 мМ | |||||
| глюкоза | 10 мМ | глюкоза | 10 мМ | |||||
| PH 7,45, с помощью NaOH | PH 7,45, с помощью NaOH | |||||||
Таблица 3: Средний состав для экспериментов по визуализации кальция.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изоляция и культура человеческих миобластов из взрослых скелетных мышц предлагают модель in vitro для изучения дифференциации мышц и регенерации мышц. В этой статье мы предлагаем протокол, позволяющий очищать высокие урожаи человеческих миобластов простым и ограниченным образом. Кроме того, этот метод обеспечивает надежные и воспроизводимые результаты в отношении процента выделенных миобластов и эффективности их миогенной дифференциации. Действительно, мы получили около 60% человеческих миобластов после сортировки клеток. Эти клетки могут поддерживаться в культуре до 6 проходов (около 30 удвоений) и сохранять их способности дифференцироваться. Кроме того, миогенная дифференциация происходит быстро после изменения среды от GM до DM, так как через 2-3 дня в DM миообластное слияние является максимальным. В этой модели около 60% миобластов сливаются в миотубы через 2 дня в DM. Другим преимуществом является то, что эти первичные человеческиеL культуры легко трансфицируются siRNA. Средства GM и DM, используемые в нашей лаборатории, являются домашними. В качестве альтернативы можно использовать коммерческие среды, но мы никогда не пробовали их эффективность в первичных культурах человека.
Одним из недостатков упомянутого метода является использование трипсина во время тканевого ферментативного расщепления. Эта процедура удаляет большую часть маркеров клеточной поверхности и подразумевает, что мы оставляем клетки в культуре в течение нескольких дней перед выполнением FACS. Вместо трипсина вместо трипсина можно использовать коллагеназу, чтобы лучше сохранить мембранные белки и позволить сортировать человеческие миобласты сразу же после диссоциации ткани. Однако стоимость коллагеназы значительно выше, чем трипсин, и после сортировки клеток все еще потребуется этап амплификации, чтобы получить достаточное количество клеток для последующих экспериментов. Другим ограничением техники является «качество» образцов мышц, полученных из ортопедическихХирургии. Действительно, полученные кусочки ткани могут быть более или менее повреждены из-за операции, а время между операцией и диссоциацией клеток в лаборатории может меняться изо дня в день. Однако для изоляции миобластов, очистки и дифференцировки в миотубы мы обычно получаем удовлетворительные результаты. Наконец, возраст пациента может быть проблемой, поскольку количество и регенеративная способность сателлитных клеток снижаются с 20 лет. Таким образом, мы ограничиваем наши эксперименты молодыми пациентами (менее 40 лет).
Как уже упоминалось, миобласты дифференцируются быстро и эффективно, что является большим преимуществом изучения начальных событий дифференциации скелетных мышц. Однако, поскольку миотубы образуются быстро, они также склонны к спонтанному сокращению и отделению от культуральных пластин. Это исключает анализ более поздних событий слияния. Чтобы изучить эти более поздние события, нужно было быЧтобы покрыть культуральную пластину внеклеточным матриксом для улучшения клеточной адгезии и уменьшения отслоения миотоба 21 .
Кальциевая визуализация с использованием флуоресцентного зонда Fura-2 является широко используемой, воспроизводимой техникой, которую легко выполнить. Загрузка Fura-2 эффективна, и использование ратиометрического зонда, такого как Fura-2, имеет несколько преимуществ по сравнению с одноволновым красителем. Он нормализует изменения фокуса или различия в нагрузке между клетками и внутри клетки ( например, ядро против цитозоля). Протокол, который мы описали для выявления и измерения SOCE, регулярно используется во многих различных сотовых системах. Глушимость различных каналов или регуляторов кальция позволяет выяснить молекулярный состав SOCE и относительную важность разных игроков, как в миобластах, так и в миотубах. Альтернативный подход с использованием изображений Fura-2 и Ca 2+ - это применениеMn 2+ . Mn 2+ входит в клетки через Ca 2+ -проницаемые каналы и гасит флуоресценцию фура-2. Мера скорости гашения дает более прямую меру для SOCE 22 , 23 . Это, однако, требует использования немного другого оборудования. Передача сигналов Ca 2+ также может выполняться с использованием генетически кодированных индикаторов Ca 2+ , которые имеют большое преимущество в том, что они точно локализованы в разных ячейках. Недостатки являются требованием для трансфекции клеток и динамики сигнала, который обычно меньше, чем с химическими красителями 24 . Для измерения Ca 2+ в органеллах, таких как митохондрии или SR, генетические зонды являются золотым стандартом. Однако для цитозольных измерений Ca 2+ преимущество использования Fura-2 над генетическими зондами остается.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Швейцарским национальным научным фондом (грант № 310030-166313), «Фондом Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires», «Фондом Марселем Левайаном» и «Фондом за рекреацию ostéo-articulaire».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 mL tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 mL tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 mL tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. |
References
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
- Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
- Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
- Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
- Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
- Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
- Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
- Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
- Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
- Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
- Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
- Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
- Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
- Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
- Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
- Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).
