Summary
Her beskriver vi en metode til opnåelse af en ren population af humane myoblaster fra voksen muskelvæv. Disse celler anvendes til at studere in vitro skelettmuskeldifferentiering og især at studere proteiner involveret i Ca 2+ -signalering.
Abstract
Satellitceller (SC) er muskelstamceller placeret mellem plasmamembranen i muskelfibre og den omgivende basale lamina. De er afgørende for muskelregenerering. Ved skader, der forekommer hyppigt i skeletmuskler, aktiveres SC'er. De spredes som myoblaster og differentierer for at reparere muskel læsioner. Blandt mange begivenheder, der finder sted under muskel differentiering, er cytosoliske Ca 2+ signaler af stor betydning. Disse Ca 2+ signaler stammer fra Ca 2+ frigivelse fra interne Ca 2+ butikker såvel som fra Ca 2+ indgang fra det ekstracellulære rum, især den butikbetjente Ca 2+ post (SOCE). I dette papir beskrives en metode, der anvendes til at opnå en ren population af humane myoblaster fra muskelprøver opsamlet efter ortopædkirurgi. Vævet fordøjes mekanisk og enzymatisk, og cellerne amplificeres og sorteres derefter ved flowcytometri ifølge tilstedeværelsen af speciFic membran markører. Når de er opnået, ekspanderes humane myoblaster og engagerer sig i at differentiere ved at fjerne vækstfaktorer fra dyrkningsmediet. Ekspressionsniveauerne af specifikke transkriptionsfaktorer og in vitro immunofluorescens anvendes til at vurdere den myogene differentieringsproces under kontrolbetingelser og efter silencing af proteiner involveret i Ca 2+ -signalering. Endelig beskriver vi brugen af Fura-2 som en ratiometrisk Ca 2+ -probe, som giver pålidelige og reproducerbare målinger af SOCE.
Introduction
Humane skeletmuskler er sammensat af grupper af kontraktile, multinucleerede muskelfibre, der er resultatet af fusion af myogene precursorceller. Skeletmusklerne har kapacitet til at regenerere efter skade takket være forekomsten af SC'er, skeletmuskelstamcellerne ligger mellem myofibers plasmamembran (sarcolemma) og basallamina. I ubeskadiget muskel er SC'er for det meste til stede i en hvilende tilstand. Som reaktion på mekanisk stress eller skade bliver SC'er aktiveret (myoblaster), proliferere og undergår enten differentiering for at danne nye myofibere eller selvfornyelse for at genopfylde SC pool 1 , 2 . Gennem årene blev der udviklet flere teknikker til at isolere SC og deres afkom, myoblasterne, fra skeletmuskelbiopsier. Med den større forståelse af celleoverflademarkørerne udtrykt på disse celler og metoden for fluorescensaktiveret celle sortering (FACS) 3, 4 , 5 , er det nu muligt at isolere rene populationer af humane myoblaster fra muskelprøver.
Calcium signalering regulerer udvikling af skeletmuskel, homeostase og regenerering. Især er Ca 2+ -indgangen, der aktiveres efter intracellulær oplagring, kaldet SOCE, af stor betydning 6 for disse processer. Ved cellestimulering formindsker Ca2 + -niveauet i endo / sarcoplasmisk retikulum (ER / SR), hvilket igen aktiverer plasmamembran Ca 2+ -kanaler, der tillader Ca 2+ -indgang til påfyldning af ER / SR 7 . De to hovedproteiner, der er involveret i SOCE, er ER / SR Ca2 + -sensingstromal interaktionsmolekylet 1 (STIM1) -proteinet og plasmamembranen Ca2 + -kanalen Orai1. Skeletmuskulatur udtrykker i høj grad disse to proteiner samt andre proteiner fra de samme familier (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 og flere Ca 2+ -permeable kanaler i den transiente receptor potentielle canonical (TRPC) familie 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2+ indrejse gennem SOCE-banen er af stor betydning for dannelse / regenerering af muskler 14 . Mutationer af STIM1- eller Orai1-proteiner har skadelige virkninger på muskelfunktionen, hvilket primært fører til muskelhypotoni 15 . Dyremodeller med SOCE-svækkelse viser også reduceret muskelmasse og kraft sammen med forbedret træthed 6 , 16 , 17 . Som nævnt udtrykkes andre STIM- og Orai-proteiner samt mange TRPC-kanaler i skeletmuskel, og deres respektive roller er endnu ikke blevet bestemt. Ved at banke dEjer deres ekspressionsniveau, er det således muligt at undersøge deres implikationer i SOCE og deres roller under differentiering af humane skeletmuskler.
SOCE måling kan udføres ved hjælp af to forskellige metoder: elektrofysiologiske aktuelle optagelser og Ca 2+ målinger. Elektrofysiologi er bestemt en mere direkte metode, da den måler den aktuelle interesse og den tilhørende elektrofysiologiske signatur. Denne teknik er imidlertid meget vanskelig at anvende på muskelceller, primært på grund af muskelcellernes store størrelse og den lille størrelse af den endogene SOCE-strøm. Cytosolisk Ca 2+ billeddannelse er teknisk meget tilgængelig, men målet er mere indirekte, da Ca 2+ niveauet målt i cytosol afspejler både indtrængen af Ca 2+ og repumpningen ud af cellen eller i de interne butikker.
En metode, der omfatter isolering af myoblaster fra små stykker af menneskeskalEtal muskel efter enzymatisk fordøjelse, amplifikation og FACS er forklaret i dette papir. Processen med muskel differentiering og immunofluorescensprotokollen til at følge ekspressionen af differentieringsmarkører over tid er beskrevet 18 . Endelig forklares målingen af SOCE og de forskellige ionkanalers rolle i Ca 2+ signalering og skelettmuskeldifferentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humane muskelprøver (væv opnået fra semitendinøse muskler) blev samlet under ortopædkirurgi hos raske patienter som kirurgisk affald. Alle metoder i forbindelse med den menneskelige undersøgelse blev udført i overensstemmelse med de schweiziske regulerende sundhedsmyndigheders retningslinjer og forskrifter og godkendt af Kommissionen Cantonale d'Etique de la Recherche fra de kantonale myndigheder i Genève, Schweiz (protokol CER nr. 12-259) . Informerede og skriftlige samtykker blev opnået fra alle voksne forsøgspersoner involveret i undersøgelsen.
1. Isolering af Myoblaster fra Human Skeletal Muscle
- Under alle procedurer opretholdes sterile betingelser ved at arbejde under en vævskulturhætte på niveau II og ved anvendelse af sterilt medium og sterile buffere.
Bemærk: Denne procedure kan anvendes på mange humane skeletmuskler.
2. Dissociation Protocol
- Overfør muskelprøver (2 - 3 g) i en steril 6 cmplade.
- Vask muskelprøverne med 5-10 ml phosphatpufret saltvand (PBS). Gentag vasken.
- Fjern bindevæv og fedtvæv ved hjælp af buet saks og en klemme.
- Væg muskelprøven (se trin 2.13) og overfør den til en ny, steril 6 cm plade.
- Tilsæt 5 ml 0,05% trypsin-EDTA.
- Brug saks, skære og hakke muskelvævet i små stykker (mindre end 2 mm).
- Brug en 10 ml serologisk pipette, overfør den hakket muskel til en 200 ml dissociation flaske indeholdende en magnetisk bar. Gentag dette trin, indtil 90 ml 0,05% trypsin-EDTA er blevet overført med alle hakket muskler til dissociationskassen. Luk dissociation flasken og inkuber ved 37 ° C i 60 minutter under mild omrøring.
- Fjern dissociation flasken fra opvarmning bad og stop den enzymatiske reaktion ved at tilføje 10 ml føtalt kalveserum (FCS; 10% slutvolumen) til dissociation flasken. Homogeniser blandingen med en pipette.
- ForberedEr to 50 ml rør med en 70 μm celle sil på hver. Passer halvdelen af cellesuspensionen gennem cellesilen på hvert rør ved pipettering op og ned på filteret, indtil suspensionen passerer igennem.
- Centrifuger rørene ved 200 xg og 20 ° C i 5 minutter; Aspirere og kassere supernatanten.
- Resuspender cellerne med 10 ml vækstmedium (GM; Tabel 1 ) og passere cellerne gennem en 40 μm cellesilinder anbragt på et 50 ml rør. Centrifuger røret ved 200 xg og 20 ° C i 5 minutter; Aspirere og kassere supernatanten.
- Resuspender cellerne med 10 ml GM og centrifuger røret ved 200 xg og 20 ° C i 5 minutter; Aspirere og kassere supernatanten.
- Resuspender cellerne med 1 ml GM og tæl cellerne ved brug af et Neubauer-kammer.
Bemærk: Normalt skal en udbytte på 3 x 10 5 celler pr. G muskel høstes. Udbyttet beregnes ved at dividere antallet af celler af vægten af muskelbiopSy (trin 2.4). - Sætte 2 x 10 5 celler i en steril 6 cm plade indeholdende 4 ml GM og inkuber ved 37 ° C og 7% CO2. Forbered så mange plader som nødvendigt.
- Ændre GM efter 3 dage.
Bemærk: Frisk dissocierede celler har brug for tid til at klæbe til kulturpladen. Desuden er den første myogene celle fordoblingstid omkring 50-60 timer. Efter den første division er fordoblingstiden omkring 20 timer. - Efter 5 - 7 dage, når cellerne når 70-80% sammenflydelse (ca. 1,5 x 10 6 celler / pr. 6 cm plade), begynder antistoffarvning og cellesortering (trin 3).
3. Antistofplejning og cellesortering
- Efter skylning en gang med PBS, inkuberes de adhærerende celler (i 6-cm plade) med 1 ml 0,05% trypsin-EDTA ved 37 ° C og 7% CO2 i 3 minutter (eller inkuberes ved 5% CO2). Stop reaktionen ved at tilsætte 2 ml GM og samle cellerne i 15 ml rør. Efter centrifugering (200 xg i 5 minutter), resAnvend cellerne i 1 ml GM.
- Tæl cellerne ved hjælp af et Neubauer-kammer.
- Udfør følgende procedurer på is.
Bemærk: Fremgangsmåden til fastsættelse af korrekt fluorescenskompensation på cytometeret er afgørende og bør være ens på et hvilket som helst cytometer. Rør 1 og 2 anvendes som negative kontroller. Rør 3 - 7 bruges til at indstille kompensationen på cytometeret under det første forsøg ( tabel 2 ). Den endelige koncentration, der anvendes til hvert antistof og dets tilsvarende isotype, skal være den samme (ca. 1 μg / 106 celler). - Send 1 x 10 5 celler pr. Rør (5 ml rør) til rør 1-7 ( tabel 2 ). Anbring den resterende cellesuspension i rør 8 til cellesortering.
- Vask cellerne med 1 ml kold FACS-buffer (PBS-5% FCS). Luk og centrifuger rørene ved 200 xg og 4 ° C i 5 minutter; Aspirere og kassere supernatanten.
- Tilsæt 200 μl FACS-buffer pr. Rør. Tilsæt antistoffer mod thE-rør ifølge tabel 2 . Inkubér på is i 30 minutter.
- Vask cellerne: Tilsæt 1 ml FACS-bufferen til hvert rør. Luk og centrifuger rørene ved 200 xg og 4 ° C i 5 minutter. Aspirer og kassér supernatanten. Gentag dette trin en gang til.
- Resuspender cellerne i 500 μl FACS buffer. Luk rørene og hold dem på is indtil celle sortering. Forbered 4 rør på 1,5 ml, der hver indeholder 500 μl GM, som er nødvendigt for at samle cellerne under cellesortering. Opbevar dem på is.
- Sorter humane myoblaster ved hjælp af flowcytometri ( Figur 1 ). Efter at have udelukket CD45-positive hæmatopoietiske celler, separate CD45-negative celler baseret på CD56-ekspression. Derefter defineres den CD56-positive population for CD34, CD144 og CD146 (humane myoblaster som CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-celler). Reanalysere en lille del af den sorterede cellepopulation for at kontrollere renheden.
- Pulje rørene indeholdende human myoblaM i et 15 ml rør og vask en gang ved at tilsætte 5 ml GM. Centrifuger røret ved 200 xg og 20 ° C i 5 minutter; Aspirere og kassere supernatanten.
- Resuspender cellerne i 1 ml GM og plader cellerne på en ucoated 6 cm plade indeholdende 4 ml GM (2 x 10 5 celler pr. Plade). Der inkuberes ved 37 ° C og 7% CO2.
4. Vedligeholdelse af celler
- Skift halvdelen af dyrkningsmediet hver anden dag. Fjern 2 ml gammelt GM fra dyrkningsskålen og tilsæt 2 ml GM.
Bemærk: Myoblaster producerer vækstfaktorer, som er gavnlige for kulturbetingelserne. - Trypsiniser cellerne, når de når 70-80% sammenflydelse for at undgå præ-differentiering. Efter skylning en gang med PBS, inkuberes de adhærerende celler (i 6-cm plade) med 1 ml 0,05% trypsin-EDTA ved 37 ° C og 7% CO2 i 3 min. Stop reaktionen ved at tilsætte 2 ml GM og samle cellerne i et 15 ml rør. Efter centrifugering (200 xg i 5 minutter), resusPend cellerne i 1 ml GM.
- Tæl cellerne og lav 6 cm plader med 2 x 10 5 celler pr. Plade i 4 ml GM.
- Hold menneskelige myoblaster op til 6 passager eller frys dem i GM, der indeholder 10% DMSO, 1 x 10 6 celler pr. Ml. Frys cellerne i en progressiv fryseplade (1 ° C / min); Ved langtidsopbevaring placeres cellerne i flydende nitrogen.
5. Transfektion af humane myoblaster med siRNA
Bemærk: Myoblaster transfekteres under anvendelse af kommercielt transfektionsreagens to dage før induktion af differentieringen. Effekten af specifikt siRNA mod et gen sammenlignes altid med virkningen af et kontrol siRNA. SiRNA'er er dobbeltstrengede RNA'er, der skal opbevares på is og manipuleres med handsker.
- Opnå et 70 - 80% konfluent monolag af humane myoblaster i en 6 cm plade (ca. 1,5 x 106 celler).
Bemærk: 5 x 10 5 celler pr transfektion er nødvendige for at opnå en konFlydende monolag af transficerede myoblaster efter 2 dage i GM. - Klargør glasdæksler (beskrevet for calciumbilleddannelsen i trin 7).
- Varm GM, 0,05% trypsin-EDTA og PBS til 37 ° C.
- Udfør alle de følgende trin i en vævskulturhætte på niveau II for at opretholde sterilitet.
- I et 1,5 ml rør sendes 500 μl reduceret serummedium, 3 μl transfektionsreagens og 1 μl siRNA ved 20 μM. Bland forsigtigt og opbevar ved stuetemperatur (RT) i 15-20 minutter.
- I løbet af denne inkubationstid skal du forberede myoblasterne til transfektion. Efter skylning en gang med PBS, inkuberes de adhærerende celler (i 6-cm plade) med 1 ml 0,05% trypsin-EDTA ved 37 ° C og 7% CO2 i 3 min. Stop reaktionen ved at tilsætte 2 ml GM og samle cellerne i et 15 ml rør. Efter centrifugering (200 xg i 5 minutter) resuspenderes cellerne i 1 ml GM.
- Tæl cellerne ved hjælp af et Neubauer-kammer.
- Resuspender 5 x 10 5 cellerI 200 μl GM for hver transfektion ( dvs. for 2 transfektioner, resuspenderes i 400 μl).
- Tilsæt 200 μl af cellesuspensionen til hver 500 μl siRNA-transfektantblanding. Pipetter op og ned to gange og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 700 μL (celler + siRNA-transfektant) til en 3,5 cm kulturskål, der indeholder et glasdæksel. Tilføj GM for at få et slutvolumen på 2 ml.
- Efter 24 timer ved 37 ° C og 7% CO2, fuldstændigt at erstatte mediet med 2 ml frisk GM. Efter yderligere 24 timer er et konfluent monolag af transficerede celler sædvanligvis til stede; Hvis det er tilfældet, inducerer myoblastdifferentiering ved at erstatte GM med 2 ml differentieringsmedium (DM; Tabel 1 ).
- Udfør kalciumbilleddannelsesforsøg 24 - 48 timer efter induktion af differentiering eller på proliferative myoblaster.
Bemærk: Immunofluorescens udføres normalt 48 timer efter induktion af differentiering.
6. ImmUnofluorescence Farvning af differentieringsmarkører
Bemærk: Immunofluorescensfarvning udføres efter 48 timer i DM, men det kan også udføres ved andre differentieringstider. Myogenin og MEF2 er kun nukleare proteiner udtrykt i differentierede celler (før fusion i myotubes), og deres farvning muliggør vurdering af differentieringsprocessen. Myosin tung kæde (MyHC) udtrykkes kun i myotubes og bruges til at estimere myotube størrelse og fusionsindeks (antal kerner i myotubes / totalt antal kerner).
- Efter 48 timer i DM vaskedes det konfluente monolag af differentierede celler to gange med 1 ml PBS ved stuetemperatur. Gør dette omhyggeligt for at undgå at løsne myotubes.
- Fix cellerne med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter ved stuetemperatur. Vask cellerne med PBS to gange, i 5 minutter hver.
- Permeabiliser cellerne med 1 ml PBS indeholdende 0,25% Triton X-100 i 45 minutter og vask 3 gange med 1 ml PBS.
- Blok unsSpecifikke bindingssteder ved inkubering af cellerne i PBS suppleret med 0,2% Tween-10 og 2% gedsserum (blokopløsning) i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Forbered primære antistoffer fortyndet i blokopløsning (600 μl pr. 3,5 cm plade).
Bemærk: Følgende primære antistoffer anvendes: mus anti-myogenin (1: 600), kanin anti-MEF2 (1: 300) og anti-MyHC antistof (MF20, 1: 1000). Det er muligt at blande i samme blokeringsopløsning, mus anti-myosin tung kæde eller mus anti-myogenin, med kanin anti-MEF2. - Fjern blokopløsningen og tilsæt 600 μL primære antistofopløsninger pr. 3,5 cm plade og inkuber natten over ved 4 ° C i et befugtet kammer.
- Vask cellerne 3 gange med 1 ml PBS. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur i et mørkt kammer med 600 μl af de sekundære antistoffer, der er fremstillet i blokopløsningen, som følger: gede-anti-mus Alexa 488 (1: 1000), gede-anti-kanin Alexa 546 (1: 1000) Og DAPI (1:50, stamopløsning ved 15 μM).
cautioN: DAPI er en giftig forbindelse, der skal håndtere med handsker. - Aspirer og vask cellerne 3 gange med 1 ml PBS.
- Monter glasdækslip ved hjælp af polyvinylalkoholmonteringsmedium med antifadningsopløsning. Opbevar dem ved 4 ° C og beskyttes mod lys indtil billeddannelse af cellerne.
7. Calcium Imaging
- Forudgående kultur, tilbered glasdæksler 25 mm i diameter. Sæt dækslerne i 70% ethanol i 48 timer for at fjerne fedt og snavs fra overfladen, hvilket reducerer celleadhærens til dækslet.
- Efter skylning af coverslipsseveral gange med vand, sæt dem tilbage i vand og sterilisere dem (autoklaveret).
- Sæt en dækslip pr. 3,5 cm kulturplade og lad dem tørre. Opbevar Petriskålene til yderligere forsøg eller brug dem straks.
- Tilsæt de transficerede myoblaster (5 - 6 x 10 5 celler) til glasdækslet.
Bemærk: Eksperimenter udføres 24 - 48 timer efter induktion af differentiatiPå eller på proliferation af myoblaster. - For at udføre Ca 2+ billeddannelse vaskes cellerne 2 gange med PBS eller direkte med mediet anvendt til forsøgene (calciumholdigt medium, tabel 3 ). Indlæs cellerne med 2 μM Fura-2 / AM plus 1 μM pluronsyre i ca. 30 minutter i mørke ved stuetemperatur.
Bemærk: Pluronsyre hjælper med at opløse Fura-2. Fura-2 / AM og pluronsyre opløses i det calciumholdige medium. - Vask cellerne to gange i samme medium men uden Fura-2 / AM og pluronsyre og lad dem være i mørke i yderligere 10-15 minutter for at tillade deforestering af Fura-2 / AM.
- Hvis belastningseffektiviteten af Fura-2 er for lav, tilføj mere Fura-2 ( fx 4 μM) og / eller inkubere cellerne i længere tid ( f.eks. 40 min).
- Fjern dækslet fra dyrkningspladen og installer det i forsøgskammeret. Tilsæt ~ 1 ml calciumholdigt medium (afhængigt af volumenet af eksperimentetMentale kammer). Installer det på mikroskopfasen og start optagelsen.
Bemærk: Den fluorescerende Ca2 + -følsomme sonde Fura-2 ekspanderes skiftevis ved 340 nm og 380 nm, og emissionslyset opsamles ved 510 nm. Da fluktuationerne af Ca 2+ koncentrationen er relativt langsomme, erhverver 1 forhold hver 2. s. - For at aktivere SOCE anvendes følgende klassiske thapsigargin / Ca 2+ readditionsprotokol: lad cellerne i 2-3 minutter i calciumholdigt medium. Udskift mediet med calciumfrit medium i 1-2 minutter.
- Tilsæt 1 μM thapsigargin for at nedbryde de interne kalciumbutikker.
Bemærk: Thapsigargin er en irreversibel blokering af sarcoendoplasmatisk reticulum Ca 2+ ATPase (SERCA) pumpeaktivitet. Efter 8 - 10 min udskiftes mediet hurtigt med det calciumholdige medium. Ca 2+ kommer ind i cellerne via SOCE-kanalerne. Vent ca. 5 minutter før forsøgene afsluttes.
FORSIGTIG: Thapsigargin er en giftig forbindelse, der skal håndteres med handsker.
- Tilsæt 1 μM thapsigargin for at nedbryde de interne kalciumbutikker.
8. Ca 2+ måleanalyse
Bemærk: Udfør analysen med købsprogrammet.
- Åbn eksperimentet. Tegn region 1 i et område, hvor der ikke er celler (baggrundsregion), og tegner de andre regioner i cytoplasmaet af cellerne, der skal analyseres (regionerne kan tegnes på et hvilket som helst billede: 340 nm, 380 nm, Eller forholdet billede). Gå til "Kør eksperimenter"> "reference billeder." Under 340 og 380 kanalerne skal du vælge "region 1" og derefter klikke på "Subtract background."
- Kør hele eksperimentet (F4: fremad) for at sikre, at intet forstyrrer baggrundsregionen, f.eks. Et fluorescerende støvplet, der bevæger sig gennem baggrundsregionen, og at cellerne ikke bevæger sig i løbet af forsøgene.
Bemærk: De interesserede regioner, der er valgtBør ikke omfatte mørke områder Ellers vil forholdsværdien fremstå støjende, som en del af baggrunden vil blive inkluderet i målingen. - Klik på "Log data" og afspil hele eksperimentet igen.
Bemærk: Dette åbner et regneark, hvor tiden og forholdet logges. Det er også muligt at gemme de individuelle bølgelængder på 340 nm og 380 nm. - For at få oplysninger om SOCE, udtrækk de to vigtige parametre fra eksperimentet: amplituden af Ca 2+ -tilsætning og hældningen af Ca 2+ indgangsfasen ( Figur 3 ).
- Hent amplitude ved at subtrahere forholdsværdien lige før Ca 2+ re-addition fra den maksimale amplitude af Ca 2+ elevationen. Få den maksimale hældning ved at tilpasse en lineær regression af de første sekunder efter Ca 2+ -tilsætning.
Bemærk: Området under kurven for thapsigargin-responsen er også en informativ parameter til ekstraktionT, da det afspejler mængden af frit calcium, der er lagret i SR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter den enzymatiske dissociation af en human muskelprøve blev cellerne amplificeret i GM. Humane myoblaster, defineret som CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-celler, blev opnået efter FACS. Myoblaster repræsenterede mere end 60% af den analyserede population ( Figur 1 ). Primære humane myoblaster blev repliseret, dyrket til sammenflydelse og dyrket i DM i 48 timer. Efter immunostaining for ekspressionen af transkriptionsfaktoren MEF2 og den muskelspecifikke protein myosin tungkæde (MyHC) observerede vi, at et flertal af celler dannede myotuber in vitro (MyHC-positive celler) med fusionsindeksværdier på 60,9 ± 1,3% (N = 5; figur 2 ). Vi observerede også, at omkring 40% af humane myoblaster, der hedder reserveceller, undslap denne terminale differentiering og forblev udifferentierede mononucleerede celler. Til funktionelle undersøgelser analyserede vi Ca2 + responsen af myoblaster eller myotubes 48 timer efter indledningen afdifferentiering. Figur 3 viser en repræsentativ protokol anvendt til induceret SOCE og nøgleparametrene til ekstraktion fra en sådan optagelse. For at skelne information relateret til molekylerne involveret i SOCE blev celler transficeret med siRNA mod molekylet af interesse. Figur 4 viser virkningen af at silere Ca 2+ -permeable kanaler i TRPC-familien på SOCE i myoblaster.
Figur 1 : FACS af humane myoblaster. Dissocierede humane celler blev immunfarvet med antistoffer til de følgende celleoverflademarkører: CD45, CD56, CD34, CD144 og CD146. Efter at have udelukket CD45-positive hæmatopoietiske celler blev CD45-negative celler adskilt baseret på CD56-ekspression. Den CD56-positive population blev derefter gated for CD34, CD144 og CD146. Humane myoblaster blev defineret som CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-celler, som tidligere beskrevet 19 , 4 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Human Myoblast Differentiering. ( A ) Et konfluent monolag af humane myoblaster blev udsat for DM i 48 timer; fast; Og farvet med antistoffer mod MEF2 (rød), MyHC (grøn) og DAPI (blå) for at identificere kerner. Målestang = 50 μm. ( B ) Fusionsindekset repræsenterer antallet af kerner inkorporeret i myotuber divideret med det totale antal kerner på et bestemt område. Data er gennemsnitlige ± SEM af 5 uafhængige forsøg.Ank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3 : Repræsentativ Calciummåling af Thapsigargin-induceret SOCE. Myotubes blev fyldt med Fura-2, og den cytosolske Ca2 + -koncentration blev målt. ( A ) Cellerne sidder i et par minutter i et calciumholdigt medium efterfulgt af 2 minutter i et calciumfrit medium. 1 μM thapsigargin anvendes derefter i 8 minutter efterfulgt af calcium-tilsætning. De 3 vigtige parametre til ekstraktion fra en sådan optagelse er: området under kurven for thapsigargin-responsen, SOCE's hældning og SOCE's amplitude. ( B ) Kvantificering af de 3 parametre. Området under kurven giver information om mængden af Ca 2+, der er lagret i ER / SR, og de to andre parametre tillader kvantifikationenSOCE. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 : Inddragelse af TRPC1 og TRPC4 i SOCE. ( A ) Cytosolisk Ca2 + -koncentration blev vurderet under anvendelse af Fura-2 i prolifererende myoblaster transficeret med siTRPC1 eller siTRPC1 og siTRPC4. SOCE blev udløst ved internt lagerudtømning med 1 μM thapsigargin i fravær af ekstern Ca 2+ (Ca 2+ fri) og målt under genadditionen af 2 mM ekstern Ca 2+ . Hvert spor repræsenterer gennemsnittet af en repræsentativ coverlip. ( B ) Kvantificering af virkningerne af siRNA på SOCE amplitude. Denne figur er blevet ændret fra reference 12 , med tilladelse. Barer ar E betyder ± SEM, * p <0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Vækstmedium (GM): | Koncentration | Differentieringsmedium (DM): | Koncentration | |||||
| Skinke F10 | DMEM | |||||||
| FCS | 15% | Bovint serumalbumin | 0,5 mg / ml | |||||
| Bovint serumalbumin | 0,5 mg / ml | Epidermal vækstfaktor | "> 10 ng / ml||||||
| fetuin | 0,5 mg / ml | insulin | 0,01 mg / ml | |||||
| Epidermal vækstfaktor | 10 ng / ml | kreatin | 1 mM | |||||
| dexamethason | 0,39 μg / ml | pyruvat | 100 μg / ml | |||||
| insulin | 0,04 mg / ml | uridin | 50 μg / ml | |||||
| kreatin | 1 mM | gentamycin | 10 μg / ml | |||||
| pyruvat | 100 μg / ml | <Td colspan = "2"> | ||||||
| uridin | 50 μg / ml | |||||||
| gentamycin | 5 μg / ml | |||||||
Tabel 1: Middelkomposition for myoblast-kultur.
| Rør | Antistoffer | |||||
| 1 | Ingen | |||||
| 2 | Isotype AlexaFluor 488-, Isotype PE-CF594, Isotype PE, Isotype PECy7Isotype APC | |||||
| 3 | Mus anti-human CD56-AlexaFluor 488 | |||||
| 4 | Mus anti-human CD45 PE-CF594 | |||||
| 5 | Mus anti-human CD144-PE | |||||
| 6 | Mus anti-human CD146-PECy7 | |||||
| 7 | Mus anti-human CD34-APC | |||||
| 8 | Mus anti-human CD56-AlexaFluor 488-, mus anti-human CD45 PE-CF594, mus anti-human CD144-PE, mus anti-human CD34-APC, mus anti-human CD146-PECy7 | |||||
Tabel 2: Antistoffer anvendt til cellesorteringen.
| Calciumholdigt medium | koncentration | Kalkfrit medium | koncentration | |||||
| NaCl | NaCl | 135 mM | ||||||
| KCI | 5 mM | KCI | 5 mM | |||||
| MgCl2 | 1 mM | MgCl2 | 1 mM | |||||
| CaCl2 | 2 mM | EGTA | 1 mM | |||||
| Hepes | 10 mM | Hepes | 10 mM | |||||
| Glukose | 10 mM | Glukose | 10 mM | |||||
| PH 7,45 indstillet med NaOH | PH 7,45 indstillet med NaOH | |||||||
Tabel 3: Middelkomposition for kalciumbilleddannelsesforsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolationen og kulturen af humane myoblaster fra voksen skeletmuskel tilbyder en in vitro- model til at studere muskeldifferentiering og muskelregenerering. I dette papir giver vi en protokol, der giver mulighed for rensning af høje udbytter af humane myoblaster på en enkel og omkostningsbegrænset måde. Derudover giver denne teknik pålidelige og reproducerbare resultater i forhold til procentdelen af myoblaster isoleret og deres myogene differentieringseffektivitet. Faktisk opnåede vi omkring 60% af humane myoblaster efter cellesortering. Disse celler kan opretholdes i kultur for op til 6 passager (ca. 30 fordoblinger) og holde deres evne til at differentiere. Desuden sker myogen differentiering hurtigt efter ændring af mediet fra GM til DM, da efter 2 til 3 dage i DM er myoblastfusion maksimal. I denne model smelter omkring 60% af myoblasterne i myotubes efter 2 dage i DM. En anden fordel er, at disse primære menneskelige cellerL-kulturer transficeres let med siRNA. De GM og DM medier, der bruges i vores laboratorium, er hjemmelavede. Alternativt kan kommercielle medier anvendes, men vi forsøgte aldrig deres effektivitet i menneskelige primære kulturer.
En ulempe ved den nævnte metode er anvendelsen af trypsin under vævs-enzymatisk fordøjelse. Denne procedure fjerner en stor del af celleoverflademarkørerne og indebærer, at vi forlader cellerne i kultur i nogle dage, før de udfører FACS. Collagenase kunne anvendes i stedet for trypsin til bedre at bevare membranproteinerne og tillade sortering af humane myoblaster umiddelbart efter vævsdissociation. Imidlertid er omkostningerne ved collagenase signifikant højere end trypsin, og et amplifikationstrin ville stadig være påkrævet efter cellesortering for at opnå tilstrækkeligt celleantal til de efterfølgende forsøg. En anden begrænsning af teknikken er "kvalitet" af de muskelprøver opnået fra ortopediIc operation. Faktisk kan de opnåede stykker af væv mere eller mindre blive beskadiget på grund af kirurgi, og tiden mellem operationen og celledissociationen i laboratoriet kan variere fra dag til dag. For myoblastisolering, rensning og differentiering i myotuber opnår vi rutinemæssigt tilfredsstillende resultater. Endelig kan patientens alder være et problem, da mængden og regenerativ kapacitet af satellitceller falder med 20 år . Således begrænser vi vores forsøg til unge patienter (under 40 år).
Som nævnt differentierer myoblaster hurtigt og effektivt, hvilket er en stor fordel ved at studere de indledende begivenheder i skeletmuskeldifferentiering. Men da myotubes dannes hurtigt, har de også en tendens til at spontant kontrakt og løsne fra dyrkningsplade. Dette udelukker analysen af de senere fusionshændelser. For at studere disse senere begivenheder, ville man have brug forAt belægge kulturpladen med ekstracellulær matrix for at forbedre celleadhærenheden og for at reducere myotube-aflejring 21 .
Kalkbilleddannelse ved brug af fluorescerende sonde Fura-2 er en meget anvendt, reproducerbar teknik, der er let at udføre. Indlæsningen af Fura-2 er effektiv, og brugen af en ratiometrisk probe, såsom Fura-2, har flere fordele i forhold til et enkeltbølgelængdefarvestof. Det normaliserer ændringer i fokus eller forskelle i læsningen mellem celler og i en celle ( fx nucleus versus cytosol). Den protokol, vi beskrev for at fremkalde og måle SOCE, bruges jævnligt i mange forskellige cellulære systemer. Silencing af forskellige kanaler eller calciumregulatorer tillader at belyses af SOCEs molekylære sammensætning og de forskellige aktørers relative betydning både i myoblaster og i myotubes. En alternativ tilgang ved anvendelse af Fura-2 og Ca 2+ billeddannelse er anvendelsen afMn 2+ quench teknik. Mn 2+ går ind i cellerne gennem Ca 2+ -permeable kanaler og slukker fura-2 fluorescensen. Mængden af slukningshastigheden giver et mere direkte mål for SOCE 22 , 23 . Dette kræver imidlertid anvendelse af lidt andet udstyr. Ca 2+ signalering kunne også udføres ved hjælp af genetisk kodede Ca 2+ indikatorer, som har den store fordel at være nøjagtigt lokaliseret i forskellige cellelokaler. Ulemperne er kravet til celletransfektion og signalets dynamik, som normalt er mindre end med kemiske farvestoffer 24 . For at måle Ca 2+ i organeller som mitokondrier eller SR er de genetiske prober guldstandarden. For cytosoliske Ca 2+ målinger forbliver imidlertid fordelene ved at anvende Fura-2 over genetiske prober.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af det schweiziske nationalfagfonden (tilskud nr. 310030-166313), "Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", "Stiftelsen Marcel Levaillant" og "Fondation pour la recherche ostéo-articulaire."
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 mL tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 mL tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 mL tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. |
References
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
- Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
- Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
- Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
- Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
- Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
- Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
- Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
- Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
- Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
- Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
- Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
- Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
- Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
- Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
- Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).
