Summary
Hier beschreiben wir eine Methodik, um eine reine Population von menschlichen Myoblasten aus erwachsenem Muskelgewebe zu erhalten. Diese Zellen werden verwendet, um die In-vitro- Skelettmuskeldifferenzierung zu untersuchen und insbesondere Proteine zu untersuchen, die an der Ca 2+ -Signalisierung beteiligt sind.
Abstract
Satellitenzellen (SC) sind Muskelstammzellen zwischen der Plasmamembran von Muskelfasern und der umgebenden Basallamina. Sie sind für die Muskelregeneration essentiell. Bei Verletzungen, die häufig in Skelettmuskeln auftreten, werden SCs aktiviert. Sie vermehren sich als Myoblasten und differenzieren, um Muskelläsionen zu reparieren. Unter vielen Ereignissen, die während der Muskeldifferenzierung stattfinden, sind zytosolische Ca 2+ -Signale von großer Bedeutung. Diese Ca 2+ -Signale ergeben sich aus der Ca 2+ - Freisetzung aus internen Ca 2+ - Speichern sowie aus dem Ca 2+ - Eintrag aus dem extrazellulären Raum, insbesondere dem speicherbetriebenen Ca 2+ - Eintrag (SOCE). Dieses Papier beschreibt eine Methodik, die verwendet wird, um eine reine Population von menschlichen Myoblasten aus Muskelproben zu erhalten, die nach orthopädischer Chirurgie gesammelt wurden. Das Gewebe wird mechanisch und enzymatisch verdaut, und die Zellen werden amplifiziert und dann nach Durchflusszytometrie nach der Anwesenheit von speci sortiertFische Membranmarker Einmal erhalten, werden menschliche Myoblasten erweitert und verpflichtet, durch die Entfernung von Wachstumsfaktoren aus dem Kulturmedium zu differenzieren. Die Expressionsniveaus spezifischer Transkriptionsfaktoren und in vitro Immunfluoreszenz werden verwendet, um den myogenen Differenzierungsprozess unter Kontrollbedingungen und nach dem Schweigen von Proteinen, die an der Ca 2+ -Signalisierung beteiligt sind, zu bewerten. Schließlich beschreiben wir die Verwendung von Fura-2 als ratiometrische Ca 2+ -Sonde, die zuverlässige und reproduzierbare Messungen von SOCE liefert.
Introduction
Die menschlichen Skelettmuskeln bestehen aus Gruppen von kontraktilen, mehrkernigen Muskelfasern, die aus der Fusion von myogenen Vorläuferzellen resultieren. Skelettmuskeln haben die Fähigkeit, nach Verletzung durch die Anwesenheit von SCs, die Skelettmuskel Stammzellen zwischen der Plasmamembran von Myofasern (Sarkolemma) und der Basallamina zu regenerieren. Im unverletzten Muskel sind die SCs meist in einem Ruhezustand. Als Reaktion auf mechanische Beanspruchung oder Verletzung werden die SCs aktiviert (Myoblasten), proliferieren und unterziehen sich entweder der Differenzierung, um neue Myofasern zu bilden oder sich selbst zu erneuern, um den SC-Pool 1 , 2 wieder aufzufüllen. Im Laufe der Jahre wurden mehrere Techniken entwickelt, um SCs und ihre Nachkommen, die Myoblasten, von Skelettmuskelbiopsien zu isolieren. Mit dem besseren Verständnis der auf diesen Zellen exprimierten Zelloberflächenmarker und der Methodik der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) 3, 4 , 5 ist es nun möglich, reine Populationen menschlicher Myoblasten aus Muskelproben zu isolieren.
Calcium-Signalisierung reguliert Skelettmuskelentwicklung, Homöostase und Regeneration. Insbesondere ist der Ca 2+ Eintrag, die folgenden intrazellulären Speicherentleerung aktiviert, SOCE genannt wird , ist von großer Bedeutung , 6 für diese Prozesse. Bei der Zellstimulation nimmt der Ca 2+ -Pegel im endo / sarkoplasmatischen Retikulum (ER / SR) ab, was wiederum Plasma-Membran-Ca 2+ -Kanäle aktiviert, die den Eintritt von Ca 2+ zum Nachfüllen des ER / SR 7 ermöglichen . Die beiden Hauptproteine, die an SOCE beteiligt sind, sind das ER / SR Ca 2+ -sensing stromal Interaktionsmolekül 1 (STIM1) Protein und die Plasmamembran Ca 2+ Kanal Orai1. Skelettmuskel drückt diese beiden Proteine, sowie andere Proteine der gleichen Familien (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 und mehrere Ca 2+ -permeable Kanäle der transienten Rezeptorpotential kanonischen (TRPC) Familie 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2+ Eintritt durch den SOCE-Weg ist von großer Bedeutung für die Muskelbildung / Regeneration 14 . Mutationen von STIM1- oder Orai1-Proteinen haben schädliche Wirkungen auf die Muskelfunktion, was vor allem auf Muskel-Hypotonie 15 führt . Tiermodelle mit SOCE-Beeinträchtigung zeigen auch reduzierte Muskelmasse und Kraft, zusammen mit erhöhter Ermüdbarkeit 6 , 16 , 17 . Wie bereits erwähnt, werden andere STIM- und Orai-Proteine sowie viele TRPC-Kanäle im Skelettmuskel ausgedrückt und ihre jeweiligen Rollen wurden bisher nicht bestimmt. Durch klopfen dBesitzen ihre Ausdrucksstufe, es ist also möglich, ihre Implikationen in SOCE und ihre Rollen während der menschlichen Skelettmuskeldifferenzierung zu untersuchen.
Die SOCE-Messung kann mit zwei verschiedenen Ansätzen durchgeführt werden: elektrophysiologische Stromaufnahmen und Ca 2+ -Messungen. Die Elektrophysiologie ist sicherlich eine direktere Methode, da sie den aktuellen Interesse und die damit verbundene elektrophysiologische Signatur misst. Allerdings ist diese Technik sehr schwierig, auf Muskelzellen anzuwenden, vor allem wegen der großen Größe der Muskelzellen und der geringen Größe des endogenen SOCE-Stroms. Die zytosolische Ca 2+ -Bildgebung ist technisch sehr zugänglich, aber die Maßnahme ist indirekt, da das im Cytosol gemessene Ca 2+ -Gehalt sowohl den Eintritt von Ca 2+ als auch das erneute Pumpen aus der Zelle oder in den internen Geschäften widerspiegelt.
Eine Methodik, die die Isolierung von Myoblasten von kleinen Stücken menschlichen Skels beinhaltetEtal Muskel nach enzymatischen Verdauung, Amplifikation und FACS ist in diesem Papier erklärt. Der Prozess der Muskeldifferenzierung und des Immunfluoreszenzprotokolls, um der Expression von Differenzierungsmarkern im Laufe der Zeit zu folgen, sind beschrieben 18 . Schließlich werden die Messung von SOCE und die Rolle der verschiedenen Ionenkanäle in Ca 2+ -Signalisierung und Skelettmuskeldifferenzierung erläutert.
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Protocol
Menschliche Muskelproben (Gewebe aus semitendinösen Muskeln) wurden während der orthopädischen Chirurgie bei gesunden Patienten als chirurgischen Abfall gesammelt. Alle Methoden der menschlichen Studie wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften der schweizerischen Regulatory Health Authorities durchgeführt und von der Kommission Cantonale d'Ethique de la Recherche von den Genfer Kantonalbehörden, Schweiz (Protokoll CER n ° 12-259) . Informiert und schriftliche Zustimmungen wurden von allen erwachsenen Fächern, die an der Studie beteiligt waren, erhalten.
1. Isolierung von Myoblasten aus dem menschlichen Skelettmuskel
- Während aller Verfahren, halten sterile Bedingungen durch die Arbeit unter einer Ebene II Gewebekultur Haube und mit sterilen Medium und sterilen Puffer.
Anmerkung: Dieses Verfahren kann auf viele menschliche Skelettmuskeln angewendet werden.
2. Dissoziations-Protokoll
- Übertragen Sie Muskelproben (2 - 3 g) in eine sterile 6 cmTeller.
- Waschen Sie die Muskelproben mit 5 - 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Wiederholen Sie die Wäsche.
- Entfernen Sie Binde- und Fettgewebe mit einer gebogenen Schere und einer Klemme.
- Wiegen Sie die Muskelprobe (siehe Schritt 2.13) und übertragen Sie sie auf eine neue sterile 6 cm Platte.
- Füge 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzu.
- Mit Scheren, schneiden und zerkleinern das Muskelgewebe in kleine Stücke (weniger als 2 mm).
- Mit einer 10 mL serologischen Pipette den gemahlenen Muskel auf eine 200 ml Dissoziationsflasche mit einem Magnetstab übertragen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis 90 ml von 0,05% Trypsin-EDTA mit allen gehackten Muskeln auf die Dissoziationsbox übertragen wurden. Schließen Sie die Dissoziationsflasche und inkubieren bei 37 ° C für 60 min unter leichter Bewegung.
- Entfernen Sie die Dissoziationsflasche aus dem Heizbad und stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 10 ml fötalem Kälberserum (FCS, 10% Endvolumen) zur Dissoziationsflasche. Die Mischung mit einer Pipette homogenisieren.
- VorbereitungSind zwei 50 mL Röhrchen mit jeweils 70 μm Zellsieb. Führen Sie die Hälfte der Zellsuspension durch das Zellsieb auf jedem Rohr durch Pipettieren auf und ab auf den Filter, bis die Suspension durchläuft.
- Die Röhrchen bei 200 xg und 20 ° C für 5 min zentrifugieren; Aspirieren und den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren der Zellen mit 10 ml Wachstumsmedium (GM, Tabelle 1 ) und Durchleiten der Zellen durch ein 40 μm-Zellsieb, das auf einem 50 ml-Röhrchen platziert ist. Das Röhrchen bei 200 xg und 20 ° C für 5 min zentrifugieren; Aspirieren und den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren der Zellen mit 10 ml GM und Zentrifugieren des Röhrchens bei 200 xg und 20 ° C für 5 min; Aspirieren und den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit 1 ml GM und zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer Kammer.
Hinweis: Normalerweise sollte eine Ausbeute von 3 x 10 5 Zellen pro g Muskel geerntet werden. Die Ausbeute wird berechnet, indem man die Anzahl der Zellen durch das Gewicht des Muskelbiops dividiertSy (Schritt 2.4). - Setzen Sie 2 x 10 5 Zellen in eine sterile 6-cm-Platte mit 4 ml GM und inkubieren bei 37 ° C und 7% CO 2 . Bereiten Sie so viele Platten wie nötig vor.
- Ändern Sie den GM nach 3 Tagen.
Hinweis: Frisch dissoziierte Zellen brauchen Zeit, um an der Kulturplatte zu haften. Darüber hinaus ist die erste myogene Zellverdopplungszeit etwa 50 - 60 h. Nach der ersten Teilung beträgt die Verdopplungszeit ca. 20 h. - Nach 5 - 7 Tagen, wenn Zellen 70 - 80% Konfluenz erreichen (ca. 1,5 x 10 6 Zellen / pro 6 cm Platte), beginnen Antikörperfärbung und Zellsortierung (Schritt 3).
3. Antikörperfärbung und Zellsortierung
- Nach einmaligem Spülen mit PBS inkubieren die adhärenten Zellen (in der 6-cm-Platte) mit 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA bei 37 ° C und 7% CO 2 für 3 min (oder inkubieren bei 5% CO 2 ). Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 2 ml GM und sammeln Sie die Zellen in 15 ml Röhrchen. Nach der Zentrifugation (200 xg für 5 min), resDie Zellen in 1 ml GM verteilen.
- Zähle die Zellen mit einer Neubauer Kammer.
- Führen Sie die folgenden Verfahren auf Eis durch.
Hinweis: Die Vorgehensweise zur Einstellung der korrekten Fluoreszenzkompensation am Zytometer ist unbedingt erforderlich und sollte bei jedem Zytometer ähnlich sein. Die Röhrchen 1 und 2 werden als Negativkontrollen verwendet. Die Röhrchen 3 - 7 dienen zur Einstellung der Kompensation am Zytometer während des ersten Experiments ( Tabelle 2 ). Die endgültige Konzentration, die für jeden Antikörper und seinen entsprechenden Isotyp verwendet wird, sollte derselbe sein (etwa 1 & mgr; g / 10 6 Zellen). - Versand 1 x 10 5 Zellen pro Röhrchen (5-ml-Röhrchen) für Röhrchen 1 - 7 ( Tabelle 2 ). Legen Sie die restliche Zellsuspension in das Rohr 8 für die Zellsortierung.
- Waschen Sie die Zellen mit 1 ml kaltem FACS-Puffer (PBS-5% FCS). Schließen und zentrifugieren die Röhrchen bei 200 xg und 4 ° C für 5 min; Aspirieren und den Überstand verwerfen.
- 200 μl FACS-Puffer pro Röhrchen zugeben. Füge Antikörper gegen th hinzuE Rohr nach Tabelle 2 . Inkubieren auf Eis für 30 min.
- Waschen Sie die Zellen: Fügen Sie 1 ml des FACS-Puffers zu jedem Röhrchen hinzu. Schließen und zentrifugieren die Röhrchen bei 200 xg und 4 ° C für 5 min. Absaugen und verwerfen den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
- Resuspendieren der Zellen in 500 μl FACS-Puffer. Schließen Sie die Röhren und halten Sie sie auf Eis, bis Zellsortierung. Bereiten Sie 4 Röhrchen von 1,5 ml vor, die jeweils 500 μl GM enthalten, was notwendig ist, um die Zellen während der Zellsortierung zu sammeln. Halten Sie sie auf Eis.
- Sortieren Sie menschliche Myoblasten durch Durchflusszytometrie ( Abbildung 1 ). Nach dem Ausschluss von CD45-positiven hämatopoetischen Zellen, getrennt CD45-negativen Zellen auf der Basis von CD56-Expression. Dann gib die CD56-positive Population für CD34, CD144 und CD146 (menschliche Myoblasten sind als CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-Zellen definiert). Reanalyse einen kleinen Bruchteil der sortierten Zellpopulation, um die Reinheit zu überprüfen.
- Pool die Röhren mit menschlichen MyoblaM in einem 15-ml-Röhrchen und waschen Sie sich einmal durch Zugabe von 5 ml GM. Das Röhrchen bei 200 xg und 20 ° C für 5 min zentrifugieren; Aspirieren und den Überstand verwerfen.
- Die Zellen in 1 ml GM resuspendieren und die Zellen auf einer unbeschichteten 6-cm-Platte mit 4 ml GM (2 x 10 5 Zellen pro Platte) auftragen. Inkubieren bei 37 ° C und 7% CO 2 .
4. Zellpflege
- Ändern Sie die Hälfte des Kulturmediums alle 2 Tage. Entfernen Sie 2 ml alten GM aus der Kulturschale und fügen Sie 2 ml GM hinzu.
Hinweis: Myoblasten erzeugen Wachstumsfaktoren, die für die Kulturbedingungen von Vorteil sind. - Trypsinize die Zellen, wenn sie 70 - 80% Konfluenz erreichen, um Vordifferenzierung zu vermeiden. Nach einmaligem Spülen mit PBS inkubieren die adhärenten Zellen (in der 6-cm-Platte) mit 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA bei 37 ° C und 7% CO 2 für 3 min. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 2 ml GM und sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen. Nach der Zentrifugation (200 xg für 5 min), resusHängen die Zellen in 1 ml GM.
- Zählen Sie die Zellen und bereiten 6 cm Platten mit 2 x 10 5 Zellen pro Platte in 4 ml GM.
- Halten Sie menschliche Myoblasten bis zu 6 Passagen oder frieren sie in GM mit 10% DMSO, 1 x 10 6 Zellen pro ml. Gefrieren Sie die Zellen in einer progressiven Gefrierbox (1 ° C / min); Für die Langzeitlagerung legen Sie die Zellen in flüssigen Stickstoff.
5. Transfektion von humanen Myoblasten mit siRNA
Anmerkung: Myoblasten werden mit handelsüblichem Transfektionsreagenz zwei Tage vor der Induktion der Differenzierung transfiziert. Die Wirkung von spezifischer siRNA gegen ein Gen wird immer mit der Wirkung einer Kontroll-siRNA verglichen. SiRNAs sind doppelsträngige RNAs, die auf Eis gehalten und mit Handschuhen manipuliert werden müssen.
- Erhalten Sie eine 70 - 80% konfluierende Monolage von menschlichen Myoblasten in einer 6-cm-Platte (ca. 1,5 x 10 6 Zellen).
Anmerkung: 5 x 10 5 Zellen pro Transfektion werden benötigt, um eine con zu erhaltenFließend Monolayer von transfizierten Myoblasten nach 2 Tagen in GM. - Vorbereiten von Glasdeckgläschen (beschrieben für die Kalziumabbildung in Schritt 7).
- Warmes GM, 0,05% Trypsin-EDTA und PBS auf 37 ° C.
- Führen Sie alle folgenden Schritte in einer Stufe II Gewebekulturhaube durch, um die Sterilität aufrechtzuerhalten.
- In einem 1,5-ml-Röhrchen werden 500 & mgr; l reduziertes Serummedium, 3 & mgr; l Transfektionsreagenz und 1 & mgr; l siRNA mit 20 & mgr; M versetzt. Mischen Sie vorsichtig und halten Sie bei Raumtemperatur (RT) für 15 - 20 min.
- Während dieser Inkubationszeit die Myoblasten zur Transfektion vorbereiten. Nach einmaligem Spülen mit PBS inkubieren die adhärenten Zellen (in der 6-cm-Platte) mit 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA bei 37 ° C und 7% CO 2 für 3 min. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 2 ml GM und sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen. Nach der Zentrifugation (200 xg für 5 min), resuspendieren die Zellen in 1 ml GM.
- Zähle die Zellen mit einer Neubauer Kammer.
- 5 x 10 5 Zellen resuspendierenIn 200 μl GM für jede Transfektion ( dh für 2 Transfektionen, Resuspend in 400 μL).
- Füge 200 μl der Zellsuspension zu je 500 μl siRNA-transfektiver Mischung hinzu. Pipettieren Sie zweimal auf und ab und inkubieren Sie für 5 min bei RT.
- Fügen Sie die 700 μL (Zellen + siRNA-Transfektanten) zu einer 3,5 cm Kulturschale hinzu, die ein Glasdeckel enthält. Füge GM hinzu, um ein Endvolumen von 2 ml zu erhalten.
- Nach 24 h bei 37 ° C und 7% CO 2 ersetzen Sie das Medium vollständig mit 2 mL frischem GM. Nach weiteren 24 h ist gewöhnlich eine konfluierende Monolage von transfizierten Zellen vorhanden; Wenn ja, induzieren Sie die Myoblastdifferenzierung, indem Sie den GM mit 2 ml Differenzierungsmedium (DM, Tabelle 1 ) ersetzen.
- Führen Sie Kalzium-Imaging-Experimente 24 - 48 h nach der Induktion der Differenzierung oder bei der Proliferation von Myoblasten.
Anmerkung: Immunfluoreszenz wird gewöhnlich 48 h nach der Induktion der Differenzierung durchgeführt.
6. ImmUnofluoreszenz färbung von differenzierungsmarkierungen
Hinweis: Die Immunfluoreszenzfärbung erfolgt nach 48 h in DM, kann aber auch zu anderen Differenzierungszeiten durchgeführt werden. Myogenin und MEF2 sind Nuklearproteine, die nur in differenzierten Zellen exprimiert werden (vor der Fusion in Myotubes), und ihre Färbung ermöglicht die Beurteilung des Differenzierungsprozesses. Myosin schwere Kette (MyHC) wird nur in Myotubes exprimiert und wird verwendet, um die Myotube Größe und Fusion Index (Anzahl der Kerne in Myotubes / Gesamtzahl der Kerne) zu schätzen.
- Nach 48 h in DM die konfluierende Monoschicht der differenzierten Zellen zweimal mit 1 mL PBS bei RT waschen. Machen Sie dies sorgfältig, um das Entfernen der Myotubes zu vermeiden.
- Fixieren Sie die Zellen mit 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) für 15 min bei RT. Waschen Sie die Zellen mit PBS zweimal, für jeweils 5 min.
- Permeabilisieren der Zellen mit 1 ml PBS, enthaltend 0,25% Triton X-100 für 45 min und waschen 3 mal mit 1 ml PBS.
- Blockieren Sie unsPecific Bindungsstellen durch Inkubieren der Zellen in PBS, ergänzt mit 0,2% Tween-10 und 2% Ziegenserum (Blocklösung) für 30 min bei RT.
- Bereiten Sie primäre Antikörper vor, die in Blocklösung verdünnt sind (600 & mgr; l pro 3,5-cm-Platte).
Anmerkung: Die folgenden primären Antikörper werden verwendet: Maus-Anti-Myogenin (1: 600), Kaninchen-Anti-MEF2 (1: 300) und Maus-Anti-MyHC-Antikörper (MF20, 1: 1.000). Es ist möglich, in der gleichen Blocking-Lösung, Maus Anti-Myosin schwere Kette oder Maus Anti-Myogenin, mit Kaninchen Anti-MEF2 mischen. - Entfernen Sie die Blocklösung und fügen Sie 600 μl primäre Antikörperlösungen pro 3,5-cm-Platte hinzu und inkubieren über Nacht bei 4 ° C in einer befeuchteten Kammer.
- Die Zellen 3 mal mit 1 ml PBS waschen. 1 Stunde bei RT in einer Dunkelkammer mit 600 μl der in der Blocklösung hergestellten sekundären Antikörper wie folgt inkubieren: Ziegen-anti-Maus Alexa 488 (1: 1000), Ziegen-Anti-Kaninchen Alexa 546 (1: 1000), Und DAPI (1:50, Stammlösung bei 15 μM).
CAUTION: DAPI ist eine toxische Verbindung, die mit Handschuhen umgehen sollte. - Aspirieren und waschen die Zellen 3 mal mit 1 ml PBS.
- Montieren Sie Glasdeckel mit Polyvinylalkohol-Montagemedium mit Antifading-Lösung. Halten Sie sie bei 4 ° C und vor Licht geschützt, bis die Zellen abgebildet sind.
7. Calcium Imaging
- Vorherige Kultur, bereiten Glas Deckgläser 25 mm im Durchmesser. Setzen Sie die Deckgläser in 70% Ethanol für 48 h, um jegliches Fett und Schmutz von der Oberfläche zu entfernen, was die Zellhaftung des Deckglases verringert.
- Nach dem Spülen der Deckgläser mehrere Male mit Wasser, legen Sie sie wieder in Wasser und sterilisieren sie (autoklaviert).
- Setzen Sie ein Deckglas pro 3,5-cm-Kulturplatte und lassen Sie sie trocknen. Bewahren Sie die Petrischalen für weitere Versuche auf oder verwenden Sie sie sofort.
- Fügen Sie die transfizierten Myoblasten (5 - 6 x 10 5 Zellen) dem Glasdeckel hinzu.
Anmerkung: Die Versuche werden 24 - 48 h nach der Induktion von differentiati durchgeführtAuf oder auf vermehrten Myoblasten. - Um die Ca 2+ -Bildgebung durchzuführen, waschen Sie die Zellen 2 mal mit PBS oder direkt mit dem für die Experimente verwendeten Medium (Calcium enthaltendes Medium, Tabelle 3 ). Legen Sie die Zellen mit 2 μM Fura-2 / AM plus 1 μM Pluronsäure für ca. 30 min im Dunkeln bei RT ein.
Anmerkung: Pluronsäure hilft, Fura-2 zu lösen. Fura-2 / AM und Pluronsäure werden in dem calciumhaltigen Medium gelöst. - Waschen Sie die Zellen zweimal im gleichen Medium, aber ohne Fura-2 / AM und Pluronsäure und lassen Sie sie im Dunkeln für weitere 10 - 15 min, um die Veresterung von Fura-2 / AM zu ermöglichen.
- Wenn die Belastungseffizienz von Fura-2 zu niedrig ist, fügen Sie mehr Fura-2 ( zB 4 μM) hinzu und / oder inkubieren Sie die Zellen für eine längere Zeit ( zB 40 min).
- Entfernen Sie das Deckglas von der Kulturplatte und installieren Sie es in der Versuchskammer. Füge ~ 1 ml kalziumhaltiges Medium hinzu (abhängig vom Volumen der ExperimenteGeistige Kammer). Installieren Sie es auf der Mikroskopstufe und starten Sie die Aufnahme.
Anmerkung: Die fluoreszierende Ca 2+ -sensitive Sonde Fura-2 wird abwechselnd bei 340 nm und 380 nm angeregt und das Emissionslicht wird bei 510 nm gesammelt. Da die Fluktuationen der Ca 2+ -Konzentration relativ langsam sind, erwerben sie 1 Verhältnis alle 2 s. - Um SOCE zu aktivieren, wird das folgende klassische Thapsigargin / Ca 2+ Re-Additionsprotokoll verwendet: Die Zellen für 2-3 min in kalziumhaltigem Medium verlassen. Ersetzen Sie das Medium mit einem kalziumfreien Medium für 1-2 min.
- Füge 1 μM Thapsigargin hinzu, um die internen Kalziumspeicher abzutragen.
Anmerkung: Thapsigargin ist ein irreversibler Blocker der sarco-endoplasmatischen Retikulum Ca 2+ ATPase (SERCA) Pumpenaktivität. Nach 8 - 10 min ersetzen Sie schnell das Medium mit dem calciumhaltigen Medium. Ca 2+ wird durch die SOCE-Kanäle in die Zellen gelangen. Warten Sie ca. 5 Minuten, bevor Sie die Experimente beenden.
ACHTUNG: Thapsigargin ist eine giftige Verbindung, die mit Handschuhen behandelt werden sollte.
- Füge 1 μM Thapsigargin hinzu, um die internen Kalziumspeicher abzutragen.
8. Ca 2+ -Messanalyse
Hinweis: Führen Sie die Analyse mit der Erfassungssoftware durch.
- Öffnen Sie das Experiment. Zeichnen Sie die Region 1 in einem Bereich, in dem es keine Zellen gibt (Hintergrundbereich), und ziehen Sie die anderen Regionen im Zytoplasma der zu analysierenden Zellen (die Regionen können auf jedem Bild gezeichnet werden: die 340 nm, die 380-nm, Oder das Verhältnisbild). Gehen Sie zu "Run experiments"> "Referenzbilder". Unter den 340- und 380-Kanälen wählen Sie "Region 1" und klicken dann auf "Subtrahieren von Hintergrund".
- Führen Sie das gesamte Experiment (F4: vorwärts) aus, um sicherzustellen, dass nichts mit dem Hintergrundbereich in Konflikt kommt, wie z. B. ein fluoreszierender Staubfleck, der durch die Hintergrundregion fährt und dass sich die Zellen während der Zeit der Experimente nicht bewegen.
Hinweis: Die interessierten Regionen sind ausgewähltSollte nicht dunkle Bereiche enthalten; Andernfalls wird der Verhältniswert verrauscht erscheinen, da ein Teil des Hintergrundes in die Messung einbezogen wird. - Klicken Sie auf "Logdaten" und spielen Sie das gesamte Experiment erneut.
Hinweis: Hiermit wird eine Tabellenkalkulation geöffnet, in der die Zeit und das Verhältnis protokolliert werden. Es ist auch möglich, die einzelnen Wellenlängen von 340 nm und 380 nm zu speichern. - Um Informationen über SOCE zu erhalten, extrahiere die beiden wichtigen Parameter aus dem Experiment: die Amplitude der Ca 2+ -Re-Addition und die Steigung der Ca 2+ -Eingangsphase ( Abbildung 3 ).
- Erhalten Sie die Amplitude durch Subtrahieren des Verhältniswerts kurz vor Ca 2+ -Re-Addition von der maximalen Amplitude der Ca 2+ -Hehe. Erhalten Sie die maximale Steigung, indem Sie eine lineare Regression der ersten Sekunden nach Ca 2+ Re-Addition anpassen.
Anmerkung: Der Bereich unter der Kurve der Thapsigargin-Antwort ist auch ein informativer Parameter für extracT, da es die Menge an freiem Kalzium in der SR gespeichert reflektiert.
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Representative Results
Nach der enzymatischen Dissoziation einer menschlichen Muskelprobe wurden die Zellen in GM amplifiziert. Menschliche Myoblasten, definiert als CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-Zellen, wurden nach FACS erhalten. Myoblasten repräsentierten mehr als 60% der analysierten Population ( Abbildung 1 ). Primäre menschliche Myoblasten wurden repliziert, zu Konfluenz gewachsen und in DM für 48 h kultiviert. Nach der Immunfärbung für die Expression des Transkriptionsfaktors MEF2 und der muskelspezifischen Protein-Myosin-Schwerkette (MyHC) beobachteten wir, dass eine Mehrheit der Zellen Myotubes in vitro (MyHC-positive Zellen) mit Fusionsindexwerten von 60,9 ± 1,3% (N = 5, Fig. 2 ). Wir haben auch beobachtet, dass etwa 40% der menschlichen Myoblasten, die Reservezellen genannt wurden, dieser terminalen Differenzierung entkamen und blieben undifferenzierte mononukleierte Zellen. Für funktionelle Studien analysierten wir die Ca 2+ - Antwort von Myoblasten oder Myotubes 48 h nach der Einleitung vonDifferenzierung. Fig. 3 zeigt ein repräsentatives Protokoll, das für induzierte SOCE verwendet wird, und die Schlüsselparameter, um aus einer solchen Aufzeichnung zu extrahieren. Um Informationen bezüglich der an SOCE beteiligten Moleküle zu erkennen, wurden die Zellen mit siRNA gegen das interessierende Molekül transfiziert. Abbildung 4 zeigt den Einfluss von schweigenden Ca 2+ -permeablen Kanälen der TRPC-Familie auf SOCE in Myoblasten.
Abbildung 1 : FACS von menschlichen Myoblasten. Dissoziierte menschliche Zellen wurden mit Antikörpern für die folgenden Zelloberflächenmarker immunostainiert: CD45, CD56, CD34, CD144 und CD146. Nach dem Ausschluss von CD45-positiven hämatopoetischen Zellen wurden CD45-negative Zellen auf der Basis der CD56-Expression getrennt. Die CD56-positive Population wurde dann für CD34, CD144 und CD146 gated. Menschliche Myoblasten wurden als CD56 definiert + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-Zellen, wie bereits beschrieben 19 , 4 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 : Menschliche Myoblast-Differenzierung. ( A ) Eine konfluierende Monoschicht von menschlichen Myoblasten wurde 48 Sekunden lang DM ausgesetzt; fest; Und mit Antikörpern gegen MEF2 (rot), MyHC (grün) und DAPI (blau) gefärbt, um Kerne zu identifizieren. Maßstab = 50 μm. ( B ) Der Fusionsindex repräsentiert die Anzahl der in Myotubes eingebauten Kerne, dividiert durch die Gesamtzahl der Kerne auf einem bestimmten Feld. Daten sind Mittelwert ± SEM von 5 unabhängigen Experimenten.Ank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3 : Repräsentative Kalziummessung von Thapsigargin-induziertem SOCE. Myotubes wurden mit Fura-2 beladen und die cytosolische Ca 2+ -Konzentration wurde gemessen. ( A ) Die Zellen sitzen einige Minuten in einem calciumhaltigen Medium, gefolgt von 2 min in einem calciumfreien Medium. 1 & mgr; M Thapsigargin wird dann für 8 min verwendet, gefolgt von der Calcium-Wiederzugabe. Die drei wichtigen Parameter, die aus einer solchen Aufzeichnung zu extrahieren sind, sind: die Fläche unter der Kurve der Thapsigargin-Antwort, die Steigung des SOCE und die Amplitude des SOCE. ( B ) Quantifizierung der 3 Parameter. Der Bereich unter der Kurve gibt Auskunft über die im ER / SR gespeicherte Menge an Ca 2+ und die beiden anderen Parameter erlauben die QuantitätDer SOCE. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4 : Beteiligung von TRPC1 und TRPC4 im SOCE. ( A ) Die cytosolische Ca 2+ -Konzentration wurde unter Verwendung von Fura-2 in proliferierenden Myoblasten, die mit siTRPC1 oder siTRPC1 und siTRPC4 transfiziert wurden, bestimmt. SOCE wurde durch interne Speicherverarmung mit 1 μM Thapsigargin in Abwesenheit von externem Ca 2+ (Ca 2+ frei) ausgelöst und während der erneuten Zugabe von 2 mM externem Ca 2+ gemessen. Jede Spur repräsentiert den Mittelwert eines repräsentativen Deckglases. ( B ) Quantifizierung der Effekte von siRNA auf SOCE-Amplitude. Diese Zahl wurde von Referenz 12 mit Genehmigung geändert. Bars ar E mittel ± SEM, * p <0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Wachstumsmedium (GM): | Konzentration | Differenzierungsmedium (DM): | Konzentration | |||||
| Ham's F10 | DMEM | |||||||
| FCS | 15% | Rinderserumalbumin | 0,5 mg / ml | |||||
| Rinderserumalbumin | 0,5 mg / ml | epidermaler Wachstumsfaktor | "> 10 ng / ml||||||
| Fetuin | 0,5 mg / ml | Insulin | 0,01 mg / ml | |||||
| epidermaler Wachstumsfaktor | 10 ng / ml | Kreatin | 1 mM | |||||
| Dexamethason | 0,39 μg / ml | Pyruvat | 100 & mgr; g / ml | |||||
| Insulin | 0,04 mg / ml | Uridin | 50 & mgr; g / ml | |||||
| Kreatin | 1 mM | Gentamycin | 10 & mgr; g / ml | |||||
| Pyruvat | 100 & mgr; g / ml | <Td colspan = "2"> | ||||||
| Uridin | 50 & mgr; g / ml | |||||||
| Gentamycin | 5 & mgr; g / ml | |||||||
Tabelle 1: Mittelkomposition für Myoblastkultur.
| Röhrchen | Antikörper | |||||
| 1 | Keiner | |||||
| 2 | Isotyp AlexaFluor 488-, Isotyp PE-CF594, Isotyp PE, Isotyp PECy7Isotyp APC | |||||
| 3 | Maus anti-menschliches CD56-AlexaFluor 488 | |||||
| 4 | Maus anti-human CD45 PE-CF594 | |||||
| 5 | Maus anti-human CD144-PE | |||||
| 6 | Maus anti-menschliches CD146-PECy7 | |||||
| 7 | Maus anti-menschliches CD34-APC | |||||
| 8 | Maus anti-menschliches CD56-AlexaFluor 488-, Maus anti-human CD45 PE-CF594, Maus anti-human CD144-PE, Maus anti-menschliches CD34-APC, Maus anti-menschliches CD146-PECy7 | |||||
Tabelle 2: Für die Zellsortierung verwendete Antikörper.
| Calciumhaltiges Medium | Konzentration | Calciumfreies Medium | Konzentration | |||||
| NaCl | NaCl | 135 mM | ||||||
| KCl | 5 mM | KCl | 5 mM | |||||
| MgCl & sub2; | 1 mM | MgCl & sub2; | 1 mM | |||||
| CaCl & sub2; | 2 mM | EGTA | 1 mM | |||||
| Hepes | 10 mM | Hepes | 10 mM | |||||
| Glucose | 10 mM | Glucose | 10 mM | |||||
| PH 7,45 eingestellt mit NaOH | PH 7,45 eingestellt mit NaOH | |||||||
Tabelle 3: Mittelzusammensetzung für Calcium-Imaging-Experimente
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Discussion
Die Isolierung und Kultur der menschlichen Myoblasten aus dem erwachsenen Skelettmuskel bietet ein in vitro Modell, um Muskelunterscheidung und Muskelregeneration zu untersuchen. In diesem Papier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das die Reinigung von hohen Erträgen von menschlichen Myoblasten auf einfache und kostenbegrenzte Weise ermöglicht. Darüber hinaus bietet diese Technik zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse in Bezug auf den Prozentsatz der isolierten Myoblasten und ihre myogene Differenzierungseffizienz. In der Tat erhielten wir etwa 60% der menschlichen Myoblasten nach der Zellsortierung. Diese Zellen können in Kultur für bis zu 6 Passagen (rund 30 Verdoppelungen) gehalten werden und ihre Kapazitäten zu differenzieren. Weiterhin erfolgt die myogene Differenzierung nach dem Wechsel des Mediums von GM nach DM, da nach 2 bis 3 Tagen in DM die Myoblastenfusion maximal ist. In diesem Modell verschmelzen etwa 60% der Myoblasten nach 2 Tagen in DM in Myotubes. Ein weiterer Vorteil ist, dass diese primäre menschliche celL-Kulturen werden mit siRNA leicht transfiziert. Die in unserem Labor verwendeten GM- und DM-Medien sind hausgemacht. Alternativ können kommerzielle Medien verwendet werden, aber wir haben niemals ihre Effizienz in menschlichen Primärkulturen ausprobiert.
Ein Nachteil der erwähnten Methode ist die Verwendung von Trypsin während der enzymatischen Gewebe des Gewebes. Dieses Verfahren entfernt einen großen Bruchteil der Zelloberflächenmarker und impliziert, dass wir die Zellen in Kultur für einige Tage verlassen, bevor wir FACS durchführen. Kollagenase könnte anstelle von Trypsin verwendet werden, um die Membranproteine besser zu erhalten und die Sortierung von menschlichen Myoblasten unmittelbar nach der Gewebedissoziation zu ermöglichen. Allerdings sind die Kosten der Kollagenase signifikant höher als Trypsin, und ein Amplifikationsschritt wäre nach der Zellsortierung noch erforderlich, um eine ausreichende Zellzahl für die nachfolgenden Experimente zu erhalten. Eine weitere Einschränkung der Technik ist die "Qualität" der Muskelproben aus OrthopenOP-Chirurgie Tatsächlich können die erhaltenen Gewebestücke aufgrund der Operation mehr oder weniger beschädigt werden, und die Zeit zwischen der Operation und der Zelldissoziation im Labor kann von Tag zu Tag variieren. Für die Myoblast-Isolierung, die Reinigung und die Differenzierung in Myotubes erhalten wir jedoch routinemäßig zufriedenstellende Ergebnisse. Schließlich kann das Alter des Patienten ein Problem sein, da die Menge und die regenerative Kapazität von Satellitenzellen mit 20 Jahren abnehmen. So beschränken wir unsere Experimente auf junge Patienten (weniger als 40 Jahre alt).
Wie erwähnt, unterscheiden sich Myoblasten schnell und effizient, was ein großer Vorteil ist, die ersten Ereignisse der Skelettmuskeldifferenzierung zu studieren. Da jedoch Myotubes schnell gebildet werden, haben sie auch eine Tendenz, sich spontan zu kontrahieren und sich von den Kulturplatten zu lösen. Dies schließt die Analyse der späteren Fusionsereignisse aus. Um diese späteren Ereignisse zu studieren, würde man brauchenUm die Kulturplatte mit extrazellulärer Matrix zu beschichten, um die Zelladhärenz zu verbessern und die Myotubablösung 21 zu verringern.
Calcium-Bildgebung mit der fluoreszierenden Sonde Fura-2 ist eine weit verbreitete, reproduzierbare Technik, die leicht durchzuführen ist. Die Beladung von Fura-2 ist effizient und die Verwendung einer ratiometrischen Sonde wie Fura-2 hat gegenüber einem einwellenlangen Farbstoff mehrere Vorteile. Es normalisiert Veränderungen des Fokus oder Unterschiede in der Belastung zwischen Zellen und innerhalb einer Zelle ( z. B. Kern gegen Cytosol). Das Protokoll, das wir beschrieben haben, um SOCE zu entlocken und zu messen, wird regelmäßig in vielen verschiedenen zellulären Systemen verwendet. Das Stummschalten verschiedener Kanäle oder Calciumregler erlaubt die Aufklärung der molekularen Zusammensetzung von SOCE und die relative Bedeutung der verschiedenen Akteure sowohl bei Myoblasten als auch bei Myotubes. Ein alternativer Ansatz mit Fura-2 und Ca 2+ Bildgebung ist die Anwendung derMn 2+ Quench-Technik. Mn 2+ tritt durch Ca 2+ -permeable Kanäle in die Zellen ein und löscht die Fura-2-Fluoreszenz. Das Maß der Quenchrate ergibt ein direkteres Maß für den SOCE 22 , 23 . Dies erfordert jedoch die Verwendung von leicht unterschiedlichen Geräten. Ca 2+ -Signalisierung könnte auch mit genetisch codierten Ca 2+ Indikatoren durchgeführt werden, die den großen Vorteil haben, in verschiedenen Zellfächern präzise lokalisiert zu werden. Die Nachteile sind die Voraussetzung für die Zelltransfektion und die Dynamik des Signals, die in der Regel geringer ist als bei chemischen Farbstoffen 24 . Um Ca 2+ in Organellen wie Mitochondrien oder SR zu messen, sind die genetischen Sonden der Goldstandard. Für cytosolische Ca 2+ -Messungen bleibt jedoch der Nutzen der Verwendung von Fura-2 über genetische Sonden bestehen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Schweizerischen Nationalfonds (Stipendiat 310030-166313), der "Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", der "Stiftung Marcel Levaillant" und der "Fondation pour la recherche ostéo-articulaire" unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 mL tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 mL tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 mL tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. |
References
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