Summary
כאן, אנו מתארים מתודולוגיה כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של myoblasts האדם מן רקמת שריר בוגר. תאים אלה משמשים ללמוד בידול שריר השלד במבחנה , בפרט, ללמוד חלבונים המעורבים Ca 2 + איתות.
Abstract
תאי הלוויין (SC) הם תאי גזע שרירים הממוקמים בין קרום הפלזמה של סיבי השריר לבין הלמינה הבסיסית. הם חיוניים עבור התחדשות שריר. עם פגיעה, אשר מתרחשת לעתים קרובות בשרירי השלד, SCs מופעלים. הם מתרבים כמו myoblasts ולהבדיל לתקן נגעים שרירים. בין אירועים רבים המתרחשים במהלך בידול השריר, cytosolic Ca 2 + אותות הם בעלי חשיבות רבה. אלה Ca 2 + אותות נובעים Ca 2 + שחרור מ הפנימי Ca 2 + חנויות, כמו גם מ Ca 2 + כניסה מהחלל תאיים, במיוחד את החנות המופעלות Ca 2 + כניסה (SOCE). מאמר זה מתאר מתודולוגיה המשמשת כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של myoblasts האדם מדגימות שריר שנאספו לאחר ניתוח אורתופדי. הרקמה היא מתעכל מכנית אנזימטית, ואת התאים הם מוגבר ולאחר מכן מיון על ידי cytometry הזרימה על פי נוכחות של speciסמני קרום. לאחר שהושג, myoblasts האדם מורחבים ומחויבים להבדיל על ידי הסרת גורמי גדילה מן המדיום התרבות. רמות הביטוי של גורמים שעתוק ספציפיים ב immunosluorescence חוץ גופית משמשים כדי להעריך את תהליך בידול myogenic בתנאי שליטה לאחר השתקת חלבונים המעורבים Ca 2 + איתות. לבסוף, אנו מפרטים את השימוש Fura-2 כמו ratiometric Ca 2 + בדיקה המספק מדידות אמין לשחזור של SOCE.
Introduction
שרירי השלד האנושיים מורכבים מקבוצות של סיבי שריר רב-תכליתיים, סינתטיים, הנובעים מאיחוי של תאים מבשר מיוגניים. שרירי השלד יש את היכולת להתחדש לאחר הפציעה תודה לנוכחות של SCS, תאי גזע שריר השלד הממוקם בין קרום הפלזמה של myofibers (sarcolemma) ואת הלמידה הבסיסית. בשרירים ללא פגע, SC הם בעיקר נוכחים במצב שקט. בתגובה ללחץ מכני או לפציעה, SC הופכים לפעילים (myoblasts), מתרבים, ועוברים תהליך הבחנה כדי ליצור מיופיבים חדשים או חידוש עצמי כדי לחדש את מאגר ה- SC 1 , 2 . במהלך השנים, מספר טכניקות פותחו כדי לבודד SCs הצאצאים שלהם, myoblasts, מן ביופסיות שריר השלד. עם הבנה גדולה יותר של פני השטח סמנים תאים הביע על תאים אלה ואת המתודולוגיה של מינון תא מופעלת הקרינה (FACS) 3, 4 , 5 , עכשיו ניתן לבודד אוכלוסיות טהור של myoblasts האדם מדגימות שרירים.
סידן איתות מסדיר את התפתחות שריר השלד, הומיאוסטזיס, התחדשות. בפרט, הכניסה Ca 2 + המופעל בעקבות דלדול החנות תאיים, הנקראים SOCE, הוא בעל חשיבות רבה 6 עבור תהליכים אלה. לאחר גירוי התא, רמת Ca 2 + ב reticulum endo / sarcoplasmic (ER / SR) פוחתת, אשר בתורו מפעילה ממברנה פלזמה Ca 2 + ערוצים המאפשרים Ca 2 + כניסה למלא את ER / SR 7 . שני חלבונים עיקריים המעורבים SOCE הם ER / SR Ca 2 + -חישה מולקולת אינטראקציה סטרומה 1 (STIM1) חלבון הממברנה פלזמה Ca 2 + ערוץ Orai1. שריר השלד מבטא בשפע את שני החלבונים הללו, כמו גם חלבונים אחרים של אותן משפחות (STIM2Ora Orai2-Orai3) 8 , 9 ו כמה קה 2 + ערוצי לערוץ של קולטן חולף פוטנציאלי (TRPC) משפחה 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2 + כניסה דרך מסלול SOCE הוא בעל חשיבות רבה עבור היווצרות שריר / התחדשות 14 . מוטציות של חלבונים STIM1 או Orai1 יש השפעות מזיקות על תפקוד השרירים, המוביל בעיקר לשריר היפוטוניה 15 . מודלים בעלי חיים עם ליקוי SOCE גם להציג מסת שרירים מופחת כוח, יחד עם עייפות משופרת 6 , 16 , 17 . כאמור, חלבונים אחרים של STIM ו- Orai, כמו גם ערוצי TRPC רבים, מתבטאים בשרירי השלד, ותפקידים אלה לא נקבעו עד כה. על ידי דפיקות דמשלו רמת הביטוי שלהם, ולכן ניתן לחקור את ההשלכות שלהם ב- SOCE ואת תפקידיהם במהלך בידול שריר השלד האנושי.
המדידה SOCE ניתן לבצע באמצעות שתי גישות שונות: הקלטות הנוכחי אלקטרו ו Ca 2 + מדידות. Electrophysiology הוא בהחלט שיטה ישירה יותר, כפי שהיא מודדת את הנוכחי של עניין וחתימה אלקטרופיזיולוגי הקשורים אליו. עם זאת, טכניקה זו קשה מאוד להחיל על תאי השריר, בעיקר בגלל גודל גדול של תאי שריר וגודל קטן של הנוכחי SOCE אנדוגני. Cytosolic Ca 2 + הדמיה היא טכנית מאוד נגיש, אבל המדד הוא יותר עקיף, כמו Ca 2 + רמת נמדדת cytosol משקף הן את כניסת Ca 2 + ואת שאיבה מחדש מתוך התא או בחנויות הפנימיות.
מתודולוגיה הכוללת בידוד myoblasts מ חתיכות קטנות של skel האדםשריר etal לאחר עיכול אנזימטי, הגברה, FACS מוסבר במאמר זה. תהליך של בידול שרירים ואת פרוטוקול immunofluorescence לעקוב אחר הביטוי של סמנים בידול לאורך זמן מתוארים 18 . לבסוף, המדידה של SOCE ואת התפקיד של ערוצי יון שונים Ca 2 + איתות והבחנה שריר השלד מוסברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגימות שרירים אנושיים (רקמות שהתקבלו משרירים למחצה) נאספו במהלך ניתוח אורתופדי על חולים בריאים כפסולת כירורגית. כל השיטות הנוגעות למחקר האנושי בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות של רשויות הבריאות הרגולטוריות השווייצריות ואושרו על ידי הוועדה קנטונאל ד'אתייק דה לה ריצ'רצ'ה מרשות קנטונאל, שוויץ (פרוטוקול CER 12-259) . הסכמות מושכלות וכתובות התקבלו מכל הנושאים הבוגרים המעורבים במחקר.
1. בידוד של Myoblasts של שריר השלד האנושי
- במהלך כל ההליכים, לשמור על תנאים סטריליים על ידי עבודה תחת ברדס רמה II תרבות רקמה באמצעות מאגרים בינוניים סטרילי סטרילי.
הערה: הליך זה יכול להיות מיושם על שרירי השלד האנושי רבים.
2. פרוטוקול דיסוציאציה
- העברת דגימות שריר (2 - 3 גרם) לתוך סטרילי 6 ס"מצַלַחַת.
- שטפו את דגימות השריר עם 5-10 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). חזור על הכביסה.
- הסר רקמות החיבור ואת השומן באמצעות מספריים מעוקל מהדק.
- לשקול את דגימת שריר (ראה שלב 2.13) ולהעביר אותו צלחת סטרילית 6 ס"מ חדש.
- הוסף 5 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA.
- שימוש במספריים, לחתוך ולמזער את רקמת השריר לחתיכות קטנות (פחות מ 2 מ"מ).
- באמצעות פיפטה 10 מ"ל סרולוגי, להעביר את השריר טחון בקבוק 200 מ"ל ניתוק המכיל בר מגנטי. חזור על שלב זה עד 90 מ"ל של 0.05% Trypsin-EDTA הועבר עם כל שריר טחון לתיבת ניתוק. סגור את בקבוק ניתוק דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות תחת תסיסה קלה.
- הסר את בקבוק ניתוק מן אמבטיה לחימום ולהפסיק את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 10 מ"ל של סרום עגל עגל (FCS, נפח 10% הסופי) על בקבוק ניתוק. Homogenize את התערובת עם פיפטה.
- Prepהם שני צינורות 50 מ"ל עם מסננת 70 מיקרומטר התא על כל אחד. לעבור חצי ההשעיה התא דרך מסננת התא על כל צינור על ידי pipetting מעלה ומטה על המסנן עד ההשעיה עובר.
- צנטריפוגה צינורות ב XG 200 ו 20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; לשאוב ולהשליך את supernatant.
- Resuspend התאים עם 10 מ"ל של המדיום הצמיחה (GM, טבלה 1 ) ולהעביר את התאים באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר ממוקם על צינור 50 מ"ל אחד. צנטריפוגה הצינור ב XG 200 ו 20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; לשאוב ולהשליך את supernatant.
- Resuspend התאים עם 10 מ"ל של GM ו צנטריפוגה הצינור ב XG 200 ו 20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; לשאוב ולהשליך את supernatant.
- Resuspend התאים עם 1 מ"ל של GM לספור את התאים באמצעות תא Neubauer.
הערה: בדרך כלל, תשואה של 3 x 10 5 תאים לכל גרם של שריר צריך לקצור. התשואה מחושבת על ידי חלוקת מספר התאים לפי משקל ביופ השריר(שלב 2.4). - שים 2 x 10 5 תאים בצלחת סטרילית 6 ס"מ המכיל 4 מ"ל של GM ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס ו 7% CO 2 . הכינו כמו לוחות רבים לפי הצורך.
- שנה את GM לאחר 3 ימים.
הערה: תאים ניתק טרי צריך זמן כדי לדבוק בצלחת תרבות. יתר על כן, הפעם הראשונה myogenic התא הכפלת הוא סביב 50 - 60 שעות. לאחר החלוקה הראשונה, זמן הכפלה הוא סביב 20 שעות. - לאחר 5-7 ימים, כאשר התאים מגיעים מפגש 70-80% (סביב 1.5 x 10 6 תאים / לכל צלחת 6 ס"מ), להתחיל מכתים נוגדנים מיון תאים (שלב 3).
3. נוגדנים מכתים ומיון תאים
- לאחר שטיפה אחת עם PBS, דגירה התאים חסיד (בצלחת 6 ס"מ) עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA ב 37 ° C ו 7% CO 2 במשך 3 דקות (או לדגור על 5% CO 2 ). עצור את התגובה על ידי הוספת 2 מ"ל של GM ולאסוף את התאים צינור 15 מ"ל. לאחר צנטריפוגה (200 xg במשך 5 דקות), מילUspend התאים 1 מ"ל של GM.
- ספירת התאים באמצעות תא Neubauer.
- בצע את ההליכים הבאים על הקרח.
הערה: הליך הגדרת פיצוי הקרינה הנכון על cytometer הוא חיוני צריך להיות דומה על כל cytometer. צינורות 1 ו -2 משמשים שולטת שלילית. צינורות 3 - 7 משמשים כדי להגדיר את הפיצוי על cytometer במהלך הניסוי הראשון ( טבלה 2 ). הריכוז הסופי המשמש עבור כל נוגדנים ועל איסוטיפ המקביל שלה צריך להיות זהה (בסביבות 1 מיקרוגרם / 10 6 תאים). - שדר 1 x 10 5 תאים לכל צינור (צינור 5 מ"ל) עבור צינורות 1 - 7 ( טבלה 2 ). מניחים את ההשעיה התא הנותר בצינור 8 למיון תאים.
- שטפו את התאים עם 1 מ"ל של חיץ FACS קר (PBS -5% FCS). סגור צנטריפוגה צינורות ב XG 200 ו 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; לשאוב ולהשליך את supernatant.
- הוסף 200 μL של חיץ FACS לכל צינור. הוסף נוגדנים לE tube לפי טבלה 2 . דגירה על קרח במשך 30 דקות.
- שטפו את התאים: מוסיפים 1 מ"ל למאגר FACS לכל צינור. סגור צנטריפוגה צינורות ב XG 200 ו 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. לשאוב ולזרוק supernatant. חזור על שלב זה עוד פעם אחת.
- Resuspend התאים μL 500 של חיץ FACS. סגור את צינורות ולשמור אותם על הקרח עד התא מיון. הכן 4 צינורות של 1.5 מ"ל, כל המכיל 500 μL של GM, אשר יש צורך לאסוף את התאים במהלך מיון התא. שמור אותם על הקרח.
- מיין myoblasts האדם על ידי cytometry זרימה ( איור 1 ). לאחר הכללת תאים hematopoietic CD45 חיובי, נפרד CD45 שלילי תאים המבוססים על ביטוי CD56. לאחר מכן, שער את האוכלוסייה CD56 חיובי CD34, CD144, ו CD146 (myoblasts האדם מוגדרים CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- תאים). Reanalyze חלק קטן של האוכלוסייה תאים ממוינים כדי לבדוק את הטוהר.
- הבריכה את הצינורות המכילים מיובלה אנושיתSts בצינור 15 מ"ל אחד לשטוף פעם אחת על ידי הוספת 5 מ"ל של GM. צנטריפוגה הצינור ב XG 200 ו 20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; לשאוב ולהשליך את supernatant.
- Resuspend התאים 1 מ"ל של GM וצלחת התאים על צלחת 6 ס"מ לא מצופה המכיל 4 מ"ל של GM (2 x 10 5 תאים לכל צלחת). לדגור על 37 מעלות צלזיוס ו -7% CO 2 .
4. תחזוקת תאים
- שינוי חצי המדיום תרבות כל 2 ימים. הסר 2 מ"ל של GM הישן מהצלחת תרבות להוסיף 2 מ"ל של GM.
הערה: Myoblasts לייצר גורמי גדילה כי הם מועילים לתנאי התרבות. - Trypsinize התאים כאשר הם מגיעים 70 - מפגש 80%, כדי למנוע pre-differentiation. לאחר שטיפה אחת עם PBS, דגירה התאים חסיד (בצלחת 6 ס"מ) עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA ב 37 ° C ו 7% CO 2 במשך 3 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 2 מ"ל של GM ולאסוף את התאים בצינור 15 מ"ל. לאחר צנטריפוגה (200 XG במשך 5 דקות), resusלטחון את התאים 1 מ"ל של GM.
- ספירת התאים ולהכין 6 לוחות צלחות עם 2 x 10 5 תאים לכל צלחת 4 מ"ל של GM.
- שמור myoblasts האדם עד 6 מעברים או להקפיא אותם GM המכיל 10% DMSO, 1 x 10 6 תאים לכל מ"ל. להקפיא את התאים קופסת הקפאה מתקדמת (1 ° C / דקות); עבור אחסון לטווח ארוך, במקום תאים בחנקן נוזלי.
5. transfection של Myoblasts האדם עם siRNA
הערה: Myoblasts הם transfected באמצעות מגיב transfection מסחרי יומיים לפני אינדוקציה של בידול. ההשפעה של siRNA ספציפי כנגד הגן הוא תמיד לעומת ההשפעה של siRNA שליטה. SiRNAs הם RNAs תקועים פעמיים כי חייב להישמר על קרח מניפולציה עם כפפות.
- השגת 70 - 80% monolayer confluent של myoblasts האדם בצלחת 6 ס"מ (סביב 1.5 x 10 6 תאים).
הערה: 5 x 10 5 תאים לכל transfection יש צורך להשיג conMonolayer שוטפת של myoblasts transfected לאחר 2 ימים ב- GM. - הכן coverslips זכוכית (המתואר עבור הדמיה סידן בשלב 7).
- ג 'נרל מוטורס חם, 0.05% טריפסין- EDTA, ו PBS ל 37 מעלות צלזיוס.
- בצע את כל השלבים הבאים ברדס רמה II תרבות רקמה כדי לשמור על סטריליות.
- בצינור 1.5 מ"ל, לשלוח 500 μL של המדיום בסרום מופחת, 3 μL של מגיב transfection, ו 1 μL של siRNA ב 20 מיקרומטר. מערבבים בעדינות לשמור בטמפרטורת החדר (RT) במשך 15 - 20 דקות.
- במהלך זמן הדגירה, להכין את myoblasts transfection. לאחר שטיפה אחת עם PBS, דגירה התאים חסיד (בצלחת 6 ס"מ) עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA ב 37 ° C ו 7% CO 2 במשך 3 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 2 מ"ל של GM ולאסוף את התאים בצינור 15 מ"ל. לאחר צנטריפוגה (200 xg במשך 5 דקות), resuspend התאים 1 מ"ל של GM.
- ספירת התאים באמצעות תא Neubauer.
- Resuspend 5 x 10 5 תאיםב 200 μL של GM עבור transfection כל ( כלומר, עבור transfections 2, resuspend ב 400 μL).
- הוסף 200 μL ההשעיה התא לכל 500 μL של תערובת siRNA- transfectant. פיפטה למעלה ולמטה פעמיים דגירה 5 דקות ב RT.
- הוסף את 700 μL (תאים + siRNA- transfectant) כדי צלחת 3.5 ס"מ תרבות המכילה coverslip זכוכית. הוסף GM כדי לקבל נפח סופי של 2 מ"ל.
- לאחר 24 שעות ב 37 ° C ו 7% CO 2 , לחלוטין להחליף את המדיום עם 2 מ"ל של GM טרי. לאחר עוד 24 שעות, monolayer confluent של תאים transfected נמצא בדרך כלל; אם כן, לגרום בידול myoblast ידי החלפת GM עם 2 מ"ל של המדידה בינוני (DM, טבלה 1 ).
- בצע ניסויים סידן הדמיה 24 - 48 שעות לאחר אינדוקציה של בידול או על myiferlasts מתרבים.
הערה: Immunofluorescence מתבצע בדרך כלל 48 שעות לאחר אינדוקציה של בידול.
6. Immצפיפות של סמנים בידול
הערה: מכתים Immunofluorescence מבוצע לאחר 48 שעות DM, אבל זה יכול גם להתבצע בזמנים אחרים. Myogenin ו- MEF2 הם חלבונים גרעיניים המתבטאים רק בתאים מובחנים (לפני היתוך לתוך המוטוביות), והכתים שלהם מאפשרים הערכה של תהליך ההבחנה. השרשרת הכבדה של מיוסין (MyHC) מתבטאת רק במיוטובוסים ומשמשת לאמידה של גודל המוטוביה ואינדקס ההיתוך (מספר גרעינים במיאוטובוסים / מספר כולל של גרעינים).
- לאחר 48 שעות DM, לשטוף את monolayer ומחוברות של תאים מובחנים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS ב RT. לעשות זאת בזהירות כדי למנוע ניתוק של המיאוב.
- תקן את התאים עם 1 מ"ל של paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 15 דקות ב RT. לשטוף את התאים עם PBS פעמיים, במשך 5 דקות כל אחד.
- Permeabilize התאים עם 1 מ"ל של PBS המכיל 0.25% טריטון X-100 במשך 45 דקות ולשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS.
- חסום אתPecific אתרי מחייב על ידי דוגרים את התאים PBS בתוספת 0.2% Tween-10 ו 2% בסרום עז (פתרון בלוק) במשך 30 דקות ב RT.
- הכן נוגדנים ראשוניים בדילול פתרון בלוק (600 μL לכל צלחת 3.5 ס"מ).
הערה: נוגדנים ראשוניים הבאים משמשים: עכבר anti-myogenin (1: 600), ארנב anti-MEF2 (1: 300), נוגדנים נגד העכבר MyHC (MF20, 1: 1,000). ניתן לערבב את אותו פתרון חסימה, עכבר anti-myosin שרשרת כבדה או העכבר נגד myogenin, עם ארנב anti-MEF2. - הסר את הפתרון לחסום ולהוסיף 600 μL של פתרונות נוגדן ראשוני לכל צלחת 3.5 ס"מ ו דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס בחדר humidified.
- לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS. דגירה במשך שעה 1 ב RT בחדר חשוך עם 600 μL של נוגדנים משני הכין פתרון בלוק, כדלקמן: עז נגד עכבר Alexa 488 (1: 1,000), נגד ארנבת Alexa 546 (1: 1,000), ו DAPI (1:50, פתרון המניה ב 15 מיקרומטר).
כאוטיוN: DAPI הוא תרכובת רעילה כי צריך להיות להתמודד עם כפפות. - לשאוב ולשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS.
- הר coverslips זכוכית באמצעות פוליויניל אלכוהול גובר בינוני עם פתרון antifading. שמור אותם על 4 מעלות צלזיוס מוגן מפני האור עד הדמיה התאים.
7. סידן הדמיה
- קודם התרבות, להכין coverslips זכוכית 25 מ"מ קוטר. שים את coverslips באתנול 70% במשך 48 שעות כדי להסיר כל שומן ועפר מפני השטח, מה שמקטין את התא דבקות coverslip.
- לאחר שטיפה פעמים coverslipsseveral עם מים, להחזיר אותם במים לעקר אותם (autoclaved).
- שים אחד coverslip לכל צלחת 3.5 ס"מ תרבות ולתת להם להתייבש. חנות כלים פטרי לניסויים נוספים או להשתמש בהם באופן מיידי.
- הוסף את myoblasts transfected (5 - 6 x 10 5 תאים) כדי coverslip זכוכית.
הערה: הניסויים נעשים 24 - 48 שעות לאחר אינדוקציה של differentiatiעל, או על התפשטות myoblasts. - כדי לבצע Ca 2 + הדמיה, לשטוף את התאים 2 פעמים עם PBS או ישירות עם המדיום המשמש לניסויים (בינוני המכיל סידן, טבלה 3 ). טען את התאים עם 2 מיקרומטר Fura-2 / AM פלוס 1 מיקרומטר חומצה פלורונית במשך כ 30 דקות בחושך ב RT.
הערה: חומצה פלורוני עוזר solubilize Fura-2. Fura-2 / AM וחומצה פלורונית מומסים במדיום המכיל סידן. - לשטוף את התאים פעמיים באותו בינוני אבל ללא Fura-2 / AM ו חומצה פלורונית ולהשאיר אותם בחושך במשך 10-15 דקות נוספות כדי לאפשר דה אסטריפיקציה של Fura-2 / AM.
- אם יעילות הטעינה של Fura-2 נמוכה מדי, להוסיף יותר Fura-2 ( למשל, 4 מיקרומטר) ו / או דגירה התאים במשך זמן רב יותר ( למשל, 40 דקות).
- הסר את coverslip מהצלחת תרבות ולהתקין אותו בחדר ניסיוני. הוסף ~ 1 מ"ל של המדיום המכיל סידן (בהתאם לנפח החוויהחדר נפשי). התקן אותו על הבמה מיקרוסקופ ולהתחיל את ההקלטה.
הערה: פלואורסצנטי Ca 2 + רגיש בדיקה Fura-2 הוא מתרגש לסירוגין ב 340 ננומטר 380 ננומטר, ואת האור פליטה נאסף ב 510 ננומטר. כמו התנודות של ריכוז Ca 2 + הם איטיים יחסית, לרכוש 1 יחס כל 2 שניות. - כדי להפעיל SOCE, הבא thapsigargin קלאסי / Ca 2 + מחדש תוספת פרוטוקול משמש: להשאיר את התאים במשך 2-3 דקות בינוני המכיל סידן. החלף את המדיום בינוני בינוני ללא סידן 1-2 דקות.
- הוסף thapsigargin 1 מיקרומטר כדי לרוקן את החנויות סידן פנימי.
הערה: Thapsigargin הוא חוסם בלתי הפיך של סרקו endoplasmic reticulum Ca 2 + ATPase (SERCA) פעילות המשאבה.לאחר 8 - 10 דקות, במהירות להחליף את המדיום עם המדיום המכיל סידן. Ca 2 + יכנסו לתאים דרך ערוצי SOCE. המתן 5 דקות לפני סיום הניסויים.
זהירות: Thapsigargin הוא תרכובת רעילה כי יש לטפל עם כפפות.
- הוסף thapsigargin 1 מיקרומטר כדי לרוקן את החנויות סידן פנימי.
8. Ca 2 + ניתוח מדידה
הערה: בצע את הניתוח עם תוכנת הרכישה.
- פתח את הניסוי. צייר אזור 1 באזור שבו אין תאים (אזור רקע), וצייר את האזורים האחרים בציטופלזמה של התאים כדי לנתח (האזורים ניתן לצייר על כל תמונה: 340 ננומטר, 380 ננומטר, או את התמונה יחס). עבור אל "הפעל ניסויים"> "תמונות התייחסות". תחת 340 ו 380 ערוצים, בחר "אזור 1" ולאחר מכן לחץ על "רקע רקע".
- הפעל את הניסוי כולו (F4: קדימה) כדי להבטיח ששום דבר לא יפריע לאזור הרקע, כגון נקודת אבק פלואורסצנטי שנוסעת באזור הרקע, ושהתאים אינם נעים בזמן הניסויים.
הערה: אזורי העניין שנבחרולא צריך לכלול אזורים כהים; אחרת, ערך היחס ייראה רועש, כחלק מהרקע יכללו במדידה. - לחץ על "התחבר נתונים" ולשחק את הניסוי כולו שוב.
הערה: פעולה זו תפתח גיליון אלקטרוני שבו הזמן והיחס יירשמו. ניתן גם לשמור את 340 ננומטר בודדים 380 ננומטר אורכי גל. - כדי לקבל מידע על SOCE, לחלץ את שני פרמטרים חשובים מן הניסוי: משרעת של Ca 2 + מחדש תוספת המדרון של שלב הכניסה 2 + Ca ( איור 3 ).
- השג את משרעת על ידי הפחתת ערך היחס לפני Ca 2 + תוספת מחדש מהמשרעת המקסימלית של העליה Ca 2 + . השג את המדרון המקסימלי על ידי התאמת רגרסיה ליניארית של השניות הראשונות לאחר Ca 2 + מחדש תוספת.
הערה: האזור מתחת לעיקול התגובה thapsigargin הוא גם פרמטר אינפורמטיבי ExtracT, כפי שהוא משקף את כמות הסידן חינם מאוחסן SR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר הדיסוציאציה האנזימטית של דגימת שריר אנושית, התאים גדלו ב- GM. מיובלסטים אנושיים, שהוגדרו כתאי CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, התקבלו לאחר FACS. Myoblasts ייצג יותר מ 60% של האוכלוסייה נותחו ( איור 1 ). ראשי myoblasts האדם הוחזרו, גדל המפגש, ותרבותי DM במשך 48 שעות. לאחר immunostaining עבור הביטוי של גורם שעתוק MEF2 ואת שריר ספציפי חלבון שרשרת כבדה (MyHC), ראינו כי רוב התאים יצרו myotubes במבחנה (תאים MyHC חיובי), עם ערכי אינדקס היתוך של 60.9 ± 1.3% (N = 5, איור 2 ). כמו כן, ראינו כי כ -40% מהמיובלאסטים האנושיים, הנקראים תאי מילואים, נמלטו מבידול הטרמינל הזה ונשארו תאים מונונוקלאטריים בלתי מובחנים. עבור מחקרים תפקודיים, ניתחנו את התגובה Ca 2 + של myoblasts או מיוטובים 48 שעות לאחר תחילתבידול. איור 3 מציג פרוטוקול נציג המשמש המושרה SOCE ואת הפרמטרים העיקריים כדי לחלץ מתוך הקלטה כזו. כדי להבחין במידע הקשור למולקולות המעורבות ב- SOCE, התאים עברו transfected ל- siRNA כנגד מולקולה של עניין. איור 4 מראה את ההשפעה של השתקת Ca 2 + ערוצי המופעלים של משפחת TRPC על SOCE ב myoblasts.
איור 1 : FACS של Myoblasts האדם. תאים אנושיים מנותקים היו immunostained עם נוגדנים עבור סמנים פני השטח הבאים תא: CD45, CD56, CD34, CD144, ו CD146. לאחר הכללת תאים hematopoietic CD45 חיובי, תאים CD45 שלילי הופרדו על סמך ביטוי CD56. האוכלוסייה CD56 חיובי היה מגודרת מכן עבור CD34, CD144, ו CD146. מיובלסטים אנושיים הוגדרו כ- CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- תאים, כפי שתואר לעיל 19 , 4 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 : מיאובלאסט הבידול האנושי. ( א ) monolayer confluent של myoblasts האדם נחשף DM במשך 48 שעות; תוקן; ומוכתמים נוגדנים נגד MEF2 (אדום), MyHC (ירוק), ו DAPI (כחול) כדי לזהות גרעינים. סולם בר = 50 מיקרומטר. ( ב ) מדד האיחוי מייצג את מספר הגרעינים המשולבים ב myotubes מחולק במספר הכולל של גרעינים על שדה מסוים. הנתונים הם ממוצע ± SEM של 5 ניסויים עצמאיים.אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 : מדידת סידן נציג של Thapsigargin המושרה SOCE. Myotubes היו טעון עם Fura-2 ו cytosolic Ca 2 + ריכוז נמדד. ( א ) התאים לשבת במשך כמה דקות במדיום המכיל סידן, ואחריו 2 דקות במדיום חופשי סידן. 1 מיקרומטר thapsigargin משמש לאחר מכן 8 דקות, ואחריו תוספת סידן מחדש. 3 פרמטרים חשובים כדי לחלץ מתוך הקלטה כזו הם: השטח תחת עקומת התגובה thapsigargin, המדרון של SOCE, ואת משרעת של SOCE. ( ב ) כימות של 3 הפרמטרים. האזור מתחת לעקומה מספק מידע על כמות Ca 2 + מאוחסנים ER / SR, ושני פרמטרים אחרים מאפשרים את quantificשל ה- SOCE. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 : מעורבות של TRPC1 ו TRPC4 ב SOCE. ( A ) cytosolic Ca 2 + ריכוז הוערך באמצעות Fura-2 ב myroplasts מתרבים transfected עם siTRPC1 או siTRPC1 ו siTRPC4. SOCE נגרם על ידי דלדול החנות הפנימי עם thapsigargin 1 מיקרומטר בהעדר Ca 2 + + (Ca 2 + חינם) ונמדד במהלך תוספת מחדש של 2 מ"מ חיצוני Ca 2 + . כל עקבות מייצג את הממוצע של coverslip נציג. ( ב ) כימות ההשפעות של siRNA על משרעת SOCE. נתון זה שונה מהתייחסות 12 , באישור. ברים ar E ± SEM, * p <0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| אמצעי הצמיחה (GM): | ריכוז | המדידה הבחנה (DM): | ריכוז | |||||
| חם F10 | DMEM | |||||||
| FCS | 15% | אלבומין בסרום שור | 0.5 מ"ג / מ"ל | |||||
| אלבומין בסרום שור | 0.5 מ"ג / מ"ל | גורם גדילה באפידרמיס | "> 10 ng / ml||||||
| פטוין | 0.5 מ"ג / מ"ל | אִינסוּלִין | 0.01 מ"ג / מ"ל | |||||
| גורם גדילה באפידרמיס | 10 ng / ml | קריאטין | 1 מ"מ | |||||
| Dexamethasone | 0.39 מיקרוגרם / מ"ל | Pyruvate | 100 מיקרוגרם / מ"ל | |||||
| אִינסוּלִין | 0.04 מ"ג / מ"ל | אורידין | 50 מיקרוגרם / מ"ל | |||||
| קריאטין | 1 מ"מ | גנטמיצין | 10 מיקרוגרם / מ"ל | |||||
| Pyruvate | 100 מיקרוגרם / מ"ל | <Td colspan = "2"> | ||||||
| אורידין | 50 מיקרוגרם / מ"ל | |||||||
| גנטמיצין | 5 מיקרוגרם / מ"ל | |||||||
טבלה 1: הרכב בינוני לתרבות מיובלסט.
| צינורות | נוגדנים | |||||
| 1 | אף אחד | |||||
| 2 | איזטייפ אלכאפלאור 488-, Isotype PE-CF594, Isotype PE, Isotype PECy7 סוג המוצר | |||||
| 3 | עכבר אנטי אנושי CD56-AlexaFluor 488 | |||||
| 4 | אנטי עכבר-אנושי CD45 PE-CF594 | |||||
| 5 | עכבר אנטי אנושי CD144-PE | |||||
| 6 | עכבר אנטי אנושי CD146-PECy7 | |||||
| 7 | עכבר אנטי אנושי CD34-APC | |||||
| 8 | עכבר אנטי-אנושי CD56-AlexaFluor 488-, עכבר אנטי-אנושי CD45 PE-CF594, עכבר אנטי-אנושי CD144-PE, עכבר אנטי-אנושי CD34-APC, עכבר אנטי-אנושי CD146-PECy7 | |||||
טבלה 2: נוגדנים המשמשים למיון תאים.
| המדיום המכיל סידן | ריכוז | המדיום ללא סידן | ריכוז | |||||
| NaCl | NaCl | 135 מ"מ | ||||||
| KCl | 5 מ"מ | KCl | 5 מ"מ | |||||
| MgCl2 | 1 מ"מ | MgCl2 | 1 מ"מ | |||||
| CaCl2 | 2 מ"מ | EGTA | 1 מ"מ | |||||
| Hepes | 10 מ"מ | Hepes | 10 מ"מ | |||||
| גלוקוז | 10 מ"מ | גלוקוז | 10 מ"מ | |||||
| PH 7.45 מותאם עם NaOH | PH 7.45 מותאם עם NaOH | |||||||
טבלה 3: הרכב בינוני לניסויי דימות סידן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הבידוד והתרבות של myoblasts האדם מן שריר השלד המבוגר מציע מודל במבחנה ללמוד בידול שרירים התחדשות שרירים. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול המאפשר טיהור של תשואות גבוהות של myoblasts האדם בצורה פשוטה וחסכונית. בנוסף, טכניקה זו מספקת תוצאות אמין לשחזור במונחים של אחוז myoblasts מבודדים יעילות ההבחנה myogenic שלהם. ואכן, השגנו סביב 60% של myoblasts האדם לאחר מיון התא. תאים אלה יכולים להישמר בתרבות עד 6 מעברים (סביב 30 כפילויות) ולשמור על היכולות שלהם כדי להבדיל. יתר על כן, בידול myogenic מתרחשת במהירות לאחר שינוי המדיום מ- GM ל- DM, כמו לאחר 2-3 ימים DM, היתוך myoblast הוא מקסימלי. במודל זה, סביב 60% של myoblasts נתיך לתוך myotubes לאחר 2 ימים DM. יתרון נוסף הוא כי אלה סל האדם העיקריאני תרבויות transfected בקלות עם siRNA. GM ו DM התקשורת המשמשים במעבדה שלנו הם תוצרת בית. לחלופין, ניתן להשתמש בתקשורת מסחרית, אך מעולם לא ניסינו את יעילותן בתרבויות ראשוניות של האדם.
חסרון אחד של השיטה המוזכרת היא השימוש טריפסין במהלך עיכול אנזימטי רקמות. הליך זה מסיר חלק גדול של סמנים פני השטח התא מרמז כי אנו עוזבים את התאים בתרבות במשך כמה ימים לפני ביצוע FACS. Collagenase יכול לשמש במקום טריפסין כדי לשמר טוב יותר את חלבונים הממברנה ולאפשר מיון של myoblasts האדם מיד לאחר ניתוק רקמות. עם זאת, העלות של collagenase גבוה באופן משמעותי מאשר טריפסין, צעד הגברה עדיין יידרש לאחר מיון התא כדי להשיג מספר תא מספיק עבור ניסויים הבאים. מגבלה נוספת של הטכניקה היא "איכות" של דגימות שריר המתקבל מ orthopedניתוח IC. ואכן, את החלקים של רקמות שהושגו יכול להיות פחות או יותר פגום עקב ניתוח, ואת הזמן בין הניתוח לבין דיסוציאציה התא במעבדה יכול להשתנות מיום ליום. עם זאת, עבור בידוד myoblast, טיהור, בידול לתוך myotubes, אנחנו באופן שגרתי להשיג תוצאות משביעות רצון. לבסוף, הגיל של המטופל יכול להיות בעיה, כמו כמות יכולת ההתחדשות של תאים לווין ירידה עם גיל 20 . לכן, אנו מגבילים את הניסויים שלנו לחולים צעירים (פחות מ -40 שנה).
כאמור, myoblasts להבדיל במהירות וביעילות, וזה יתרון גדול של חקר האירועים הראשונים של בידול שריר השלד. עם זאת, כמו myotubes נוצרים במהירות, יש להם גם נטייה ספונטנית חוזה ולהתנתק מן צלחות תרבות. זה מונע את ניתוח של האירועים היתוך מאוחר יותר. כדי ללמוד את המאורעות המאוחרים יותר, יהיה צורך בכךכדי המעיל את צלחת תרבות עם תאיים תאיים כדי לשפר את התא דבקות ולהקטין את הניתוק myotube 21 .
סידן הדמיה באמצעות בדיקה פלואורסצנטי Fura-2 הוא בשימוש נרחב, טכניקה לשחזור כי קל לבצע. הטעינה של Fura-2 היא יעילה, ושימוש בדיקה רטיומטרית כגון Fura-2 יש מספר יתרונות על פני אורך גל יחיד. זה מנרמל שינויים של מיקוד או הבדלים בהעמסה בין תאים בתוך תא ( למשל, גרעין מול cytosol). הפרוטוקול שתיארנו כדי לעורר ולמדוד SOCE משמש באופן קבוע במערכות סלולר שונות. השתקה של ערוצים שונים או הרגולטורים סידן מאפשר להבהיר את ההרכב המולקולרי של SOCE ואת החשיבות היחסית של השחקנים השונים, הן myoblasts ו ב myotubes. גישה חלופית באמצעות Fura-2 ו Ca 2 + הדמיה הוא יישום שלMn 2 + טכניקה מרווה. Mn 2 + מזין את התאים דרך Ca 2 + ערוצי לעשן מרווה את הקרינה Fura-2. המדד של שיעור מרווה נותן מדד ישיר יותר של SOCE 22 , 23 . זה, עם זאת, דורש ניצול של ציוד שונה במקצת. Ca 2 + איתות יכול להתבצע גם באמצעות מקודד גנטית Ca 2 + מחוונים, אשר יש את היתרון הגדול של להיות במדויק תאים תא שונים. החסרונות הם הדרישה לתאי transfection ואת הדינמיקה של האות, שהוא בדרך כלל פחות מאשר עם צבעים כימיים 24 . כדי למדוד Ca 2 + באברונים כמו המיטוכונדריה או SR, בדיקות גנטיות הם תקן הזהב. עם זאת, עבור cytosolic Ca 2 + מדידות, היתרון של שימוש Fura-2 מעל בדיקות גנטיות נשאר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית (מענק מס '310030-166313), "The Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", "Foundation Marcel Levaillant" ו- "Fondation pour la recherche ostéo-articulaire".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 mL tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 mL tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 mL tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. |
References
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
- Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
- Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
- Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
- Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
- Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
- Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
- Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
- Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
- Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
- Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
- Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
- Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
- Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
- Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
- Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).
