Summary
Ici, nous décrivons une méthodologie pour obtenir une population pure de myoblastes humains à partir d'un tissu musculaire adulte. Ces cellules sont utilisées pour étudier la différenciation in vitro des muscles squelettiques et, en particulier, pour étudier les protéines impliquées dans la signalisation du Ca 2+ .
Abstract
Les cellules satellites (SC) sont des cellules souches musculaires situées entre la membrane plasmique des fibres musculaires et la lame basale environnante. Ils sont essentiels pour la régénération musculaire. En cas de blessure, qui se produit fréquemment dans les muscles squelettiques, les SC sont activés. Ils prolifèrent comme myoblastes et se différencient pour réparer les lésions musculaires. Parmi les nombreux événements qui se déroulent lors de la différenciation musculaire, les signaux cytosoliques de Ca 2+ sont d'une grande importance. Ces signaux Ca 2+ proviennent de la libération de Ca de Ca 2+ magasins internes, ainsi que de Ca 2+ entrée de l'espace extracellulaire, en particulier l'entrée Ca 2+ magasin fonctionnant (SOCE). Cet article décrit une méthodologie utilisée pour obtenir une population pure de myoblastes humains à partir d'échantillons musculaires recueillis après la chirurgie orthopédique. Le tissu est digéré mécaniquement et enzymatiquement, et les cellules sont amplifiées puis triées par cytométrie en flux selon la présence de spécimensMarqueurs de membrane de fic. Une fois obtenu, les myoblastes humains sont élargis et s'engagent à se différencier en éliminant les facteurs de croissance du milieu de culture. Les niveaux d'expression des facteurs de transcription spécifiques et de l' immunofluorescence in vitro sont utilisés pour évaluer le processus de différenciation myogénique dans les conditions de contrôle et après le silence des protéines impliquées dans la signalisation du Ca 2+ . Enfin, nous détaillons l'utilisation de Fura-2 comme une sonde ratiométrique Ca 2+ qui fournit des mesures fiables et reproductibles de SOCE.
Introduction
Les muscles squelettiques humains sont composés de groupes de fibres musculaires contractiles et multinucléées résultant de la fusion des cellules précurseurs myogéniques. Les muscles squelettiques ont la capacité de se régénérer après une blessure grâce à la présence de SC, les cellules souches du muscle squelettique situées entre la membrane plasmatique des myofibres (sarcolemma) et la lame basale. Dans les muscles non blessés, les SC sont principalement présents dans un état de repos. En réponse au stress mécanique ou aux blessures, les SC sont activés (myoblastes), prolifèrent et subissent soit une différenciation pour former de nouvelles myofibres, soit un auto-renouvellement pour reconstituer le pool SC 1 , 2 . Au cours des années, plusieurs techniques ont été développées pour isoler les SC et leur descendance, les myoblastes, à partir des biopsies des muscles squelettiques. Avec une meilleure compréhension des marqueurs de surface cellulaire exprimés sur ces cellules et de la méthodologie du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) 3, 4 , 5 , il est maintenant possible d'isoler des populations pures de myoblastes humains à partir d'échantillons musculaires.
La signalisation de calcium régule le développement du muscle squelettique, l'homéostasie et la régénération. En particulier, l'entrée Ca 2+ qui est activé suite à l' épuisement du magasin intracellulaire, appelé SOCE, est d' une grande importance pour 6 ces processus. Lors de la stimulation cellulaire, le niveau de Ca 2+ dans le réticulum endo / sarcoplasmique (ER / SR) diminue, ce qui active les canaux Ca 2+ de la membrane plasmatique qui permettent l'entrée de Ca 2+ pour remplir le ER / SR 7 . Les deux principales protéines impliquées dans SOCE sont la protéine de l'interaction ERR / SR Ca 2+ -sensing stromal interaction molécule 1 (STIM1) et la chaîne plasma Ca 2+ canal Orai1. Le muscle squelettique exprime abondamment ces deux protéines, ainsi que d'autres protéines des mêmes familles (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 et plusieurs canaux perméables au Ca 2+ de la famille canonique canonique (TRPC) du récepteur transitoire 10 , 11 , 12 , 13 . L'entrée de Ca 2+ à travers la voie SOCE revêt une grande importance pour la formation / régénération musculaire 14 . Les mutations des protéines STIM1 ou Orai1 ont des effets délétères sur la fonction musculaire, conduisant principalement à l'hypotonie musculaire 15 . Les modèles animaux avec déficience de SOCE présentent également une masse musculaire et une force réduites, ainsi qu'une fatigabilité accrue 6 , 16 , 17 . Comme mentionné, d'autres protéines STIM et Orai, ainsi que de nombreux canaux TRPC, sont exprimés dans le muscle squelettique, et leurs rôles respectifs n'ont pas encore été déterminés jusqu'à présent. En battant dPossèdent leur niveau d'expression, il est ainsi possible d'étudier leurs implications dans SOCE et leurs rôles lors de la différenciation des muscles squelettiques humains.
La mesure SOCE peut être effectuée en utilisant deux approches différentes: enregistrements électrophysiologiques actuels et mesures Ca 2+ . L'électrophysiologie est certainement une méthode plus directe, car elle mesure le courant d'intérêt et sa signature électrophysiologique associée. Cependant, cette technique est très difficile à appliquer aux cellules musculaires, principalement en raison de la grande taille des cellules musculaires et de la petite taille du courant endogène de la SOCE. L'imagerie cytosolique Ca 2+ est techniquement très accessible, mais la mesure est plus indirecte, car le niveau de Ca 2+ mesuré dans le cytosol reflète à la fois l'entrée de Ca 2+ et le refoulement de la cellule ou dans les magasins internes.
Une méthodologie qui comprend l'isolement des myoblastes à partir de petits morceaux de skel humainEtal après digestion enzymatique, amplification et FACS est expliqué dans cet article. Le processus de différenciation musculaire et le protocole d'immunofluorescence pour suivre l'expression de marqueurs de différenciation dans le temps sont décrits 18 . Enfin, la mesure de SOCE et le rôle de différents canaux ioniques dans la signalisation Ca 2 + et la différenciation musculaire squelettique sont expliqués.
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Protocol
Des échantillons musculaires humains (tissus obtenus à partir de muscles semi-finissants) ont été recueillis lors de la chirurgie orthopédique chez des patients en bonne santé en tant que déchets chirurgicaux. Toutes les méthodes relatives à l'étude humaine ont été réalisées conformément aux directives et règlements des Autorités suisses de réglementation de la santé et approuvées par la Commission Cantonale d'Ethique de Recherche des Autorités cantonales de Genève en Suisse (protocole CER n ° 12-259) . Des consentements éclairés et écrits ont été obtenus auprès de tous les sujets adultes impliqués dans l'étude.
1. Isolation des myoblastes du muscle squelettique humain
- Pendant toutes les procédures, maintenir des conditions stériles en travaillant sous un capot de culture tissulaire de niveau II et en utilisant des tampons stériles et stériles.
Note: Cette procédure peut être appliquée à de nombreux muscles squelettiques humains.
2. Protocole de dissociation
- Transférer les échantillons musculaires (2 à 3 g) dans un stérile de 6 cmassiette.
- Lavez les échantillons musculaires avec 5 à 10 ml de solution salée tamponnée au phosphate (PBS). Répétez le lavage.
- Enlever les tissus conjonctifs et adipeux à l'aide de ciseaux incurvés et d'une pince.
- Peser l'échantillon musculaire (voir étape 2.13) et le transférer dans une nouvelle plaque stérile de 6 cm.
- Ajouter 5 ml de trypsine-EDTA à 0,05%.
- À l'aide de ciseaux, coupez et piquez le tissu musculaire en petits morceaux (moins de 2 mm).
- À l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml, transférez le muscle haché à une bouteille de dissociation de 200 ml contenant une barre magnétique. Répétez cette étape jusqu'à ce que 90 ml de 0,05% de trypsine-EDTA aient été transférés avec tous les muscles hachés à la boîte de dissociation. Fermer la bouteille de dissociation et incuber à 37 ° C pendant 60 minutes sous agitation douce.
- Enlever la bouteille de dissociation du bain de chauffage et arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 10 ml de sérum de veau foetal (FCS, 10% de volume final) à la bouteille de dissociation. Homogénéiser le mélange avec une pipette.
- PréparationSont deux tubes de 50 ml avec une crépine cellulaire de 70 μm sur chacun. Passer la moitié de la suspension de cellules à travers la crépine cellulaire sur chaque tube en pipetant vers le haut et vers le bas sur le filtre jusqu'à la fin de la suspension.
- Centrifuger les tubes à 200 xg et 20 ° C pendant 5 min; Aspirer et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules avec 10 ml de milieu de croissance (GM, tableau 1 ) et passer les cellules à travers une filtre de 40 μm placé sur un tube de 50 ml. Centrifuger le tube à 200 xg et 20 ° C pendant 5 min; Aspirer et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules avec 10 ml de GM et centrifuger le tube à 200 xg et 20 ° C pendant 5 minutes; Aspirer et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules avec 1 ml de GM et compter les cellules en utilisant une chambre Neubauer.
Note: Habituellement, un rendement de 3 x 10 5 cellules par g de muscle devrait être récolté. Le rendement est calculé en divisant le nombre de cellules par le poids de la biopie musculaireSy (étape 2.4). - Mettre 2 x 10 5 cellules dans une plaque stérile de 6 cm contenant 4 ml de GM et incuber à 37 ° C et 7% de CO 2 . Préparez autant de plaques que nécessaire.
- Changez le GM après 3 jours.
Remarque: Les cellules fraîchement dissociées ont besoin de temps pour adhérer à la plaque de culture. En outre, le premier temps de doublement de cellules myogéniques est d'environ 50 à 60 h. Après la première division, le temps de doublement est d'environ 20 h. - Après 5 à 7 jours, lorsque les cellules atteignent 70 à 80% de confluence (environ 1,5 x 10 6 cellules / par plaque de 6 cm), commencer la coloration des anticorps et le tri des cellules (étape 3).
3. Coloration des anticorps et tri des cellules
- Après rinçage une fois avec du PBS, incuber les cellules adhérentes (dans la plaque de 6 cm) avec 1 ml de trypsine-EDTA 0,05% à 37 ° C et 7% de CO 2 pendant 3 min (ou incuber à 5% de CO 2 ). Arrêtez la réaction en ajoutant 2 ml de GM et en recueillant les cellules dans un tube de 15 ml. Après centrifugation (200 xg pendant 5 min), resUtiliser les cellules dans 1 ml de GM.
- Comptez les cellules en utilisant une chambre Neubauer.
- Effectuez les procédures suivantes sur la glace.
Remarque: La procédure de réglage de la compensation de fluorescence correcte sur le cytomètre est essentielle et devrait être similaire sur tout cytomètre. Les tubes 1 et 2 sont utilisés comme témoins négatifs. Les tubes 3 à 7 sont utilisés pour régler la compensation sur le cytomètre pendant la première expérience ( tableau 2 ). La concentration finale utilisée pour chaque anticorps et son isotype correspondant devrait être la même (environ 1 μg / 10 6 cellules). - Déposer 1 x 10 5 cellules par tube (tube de 5 ml) pour les tubes 1 à 7 ( tableau 2 ). Placez la suspension cellulaire restante dans le tube 8 pour le tri des cellules.
- Lavez les cellules avec 1 ml de tampon FACS froid (PBS-5% FCS). Fermer et centrifuger les tubes à 200 xg et 4 ° C pendant 5 min; Aspirer et jeter le surnageant.
- Ajouter 200 μL de tampon FACS par tube. Ajouter des anticorps contre thE tube selon le tableau 2 . Incuber sur de la glace pendant 30 min.
- Laver les cellules: ajouter 1 ml de tampon FACS à chaque tube. Fermer et centrifuger les tubes à 200 xg et 4 ° C pendant 5 min. Aspirer et jeter le surnageant. Répétez cette étape une fois de plus.
- Remettre en suspension les cellules dans 500 μL de tampon FACS. Fermez les tubes et gardez-les sur glace jusqu'à ce que le tri des cellules. Préparez 4 tubes de 1,5 ml, contenant chacun 500 μL de GM, ce qui est nécessaire pour collecter les cellules lors du tri des cellules. Gardez-les sur la glace.
- Trier les myoblastes humains par cytométrie en flux ( Figure 1 ). Après avoir exclu les cellules hématopoïétiques positives pour CD45, séparer les cellules CD45 négatives en fonction de l'expression de CD56. Ensuite, porte la population positive CD56 pour CD34, CD144 et CD146 (les myoblastes humains sont définis comme des cellules CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-). Réanalysez une petite fraction de la population de cellules triées pour vérifier la pureté.
- Pousser les tubes contenant la myobla humaineM dans un tube de 15 ml et laver une fois en ajoutant 5 ml de GM. Centrifuger le tube à 200 xg et 20 ° C pendant 5 min; Aspirer et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de GM et déposer les cellules sur une plaque non revêtue de 6 cm contenant 4 mL de GM (2 x 10 5 cellules par plaque). Incuber à 37 ° C et 7% de CO 2 .
4. Maintenance cellulaire
- Changer la moitié du milieu de culture tous les 2 jours. Enlevez 2 ml d'ancien GM du plat de culture et ajoutez 2 ml de GM.
Note: Les myoblastes produisent des facteurs de croissance bénéfiques pour les conditions de culture. - Essaye les cellules lorsqu'elles atteignent 70 à 80% de confluence pour éviter la pré-différenciation. Après avoir rincé une fois avec du PBS, incuber les cellules adhérentes (dans la plaque de 6 cm) avec 1 ml de trypsine-EDTA 0,05% à 37 ° C et 7% de CO 2 pendant 3 min. Arrêtez la réaction en ajoutant 2 ml de GM et en recueillant les cellules dans un tube de 15 ml. Après centrifugation (200 xg pendant 5 min), ressusciterPendent les cellules dans 1 ml de GM.
- Comptez les cellules et préparez des plaques de 6 cm avec 2 x 10 5 cellules par plaque dans 4 mL de GM.
- Gardez les myoblastes humains jusqu'à 6 passages ou congéluez-les dans du GM contenant 10% de DMSO, 1 x 10 6 cellules par ml. Congeler les cellules dans une boîte de congélation progressive (1 ° C / min); Pour un stockage à long terme, placez les cellules dans de l'azote liquide.
5. Transfection de myoblastes humains avec siRNA
Note: Les myoblastes sont transfectés à l'aide d'un réactif de transfection commercial deux jours avant l'introduction de la différenciation. L'effet de siRNA spécifique contre un gène est toujours comparé à l'effet d'un siRNA de contrôle. Les ARNs sont des ARN à double brin qui doivent être conservés sur de la glace et manipulés avec des gants.
- Obtenir une monocouche confluente de 70 à 80% de myoblastes humains dans une plaque de 6 cm (environ 1,5 x 10 6 cellules).
Note: 5 x 10 5 cellules par transfection sont nécessaires pour obtenir un conMonocouche fluide de myoblastes transfectés après 2 jours dans GM. - Préparez des lamelles de verre (décrites pour l'imagerie au calcium à l'étape 7).
- Warm GM, 0,05% de trypsine-EDTA et PBS à 37 ° C.
- Effectuez toutes les étapes suivantes dans un capot de culture tissulaire de niveau II pour maintenir la stérilité.
- Dans un tube de 1,5 ml, dépêcher 500 μL de milieu sérique réduit, 3 μL de réactif de transfection et 1 μl de siRNA à 20 μM. Mélanger doucement et garder à température ambiante (RT) pendant 15 à 20 min.
- Pendant ce temps d'incubation, préparer les myoblastes pour la transfection. Après avoir rincé une fois avec du PBS, incuber les cellules adhérentes (dans la plaque de 6 cm) avec 1 ml de trypsine-EDTA 0,05% à 37 ° C et 7% de CO 2 pendant 3 min. Arrêtez la réaction en ajoutant 2 ml de GM et en recueillant les cellules dans un tube de 15 ml. Après centrifugation (200 xg pendant 5 min), remettre en suspension les cellules dans 1 ml de GM.
- Comptez les cellules en utilisant une chambre Neubauer.
- Ressusciter 5 x 10 5 cellulesDans 200 μL de GM pour chaque transfection ( c.-à-d. Pour 2 transfections, résister à 400 μL).
- Ajouter 200 μL de suspension cellulaire à chaque 500 μl de mélange de siRNA-transfectant. Pipeter et baisser deux fois et incuber pendant 5 minutes à la température ambiante.
- Ajouter les 700 μL (cellules + siRNA-transfectant) dans un plat de culture de 3,5 cm contenant une lamelle de verre. Ajoutez GM pour obtenir un volume final de 2 ml.
- Après 24 h à 37 ° C et 7% de CO 2 , remplacer complètement le milieu par 2 ml de GM frais. Après 24 heures supplémentaires, une monocouche confluente de cellules transfectées est habituellement présente; Si tel est le cas, induire la différenciation de myoblastes en remplaçant le GM par 2 mL de milieu de différenciation (DM, tableau 1 ).
- Effectuer des expériences d'imagerie au calcium 24 à 48 h après l'induction de la différenciation ou des myoblastes proliférants.
Note: L'immunofluorescence est généralement effectuée 48 h après l'induction de la différenciation.
6. ImmUnofluorescence Coloration des marqueurs de différenciation
Note: La coloration par immunofluorescence est effectuée après 48 h dans la DM, mais elle peut également être effectuée à d'autres moments de différenciation. La myogenine et le MEF2 sont des protéines nucléaires seulement exprimées dans des cellules différenciées (avant fusion dans des myotubes) et leur coloration permet l'évaluation du processus de différenciation. La chaîne lourde de Myosine (MyHC) n'est exprimée que dans des myotubes et est utilisée pour estimer la taille de myotubes et l'indice de fusion (nombre de noyaux dans les myotubes / nombre total de noyaux).
- Après 48 h dans le DM, laver la monocouche confluente de cellules différenciées deux fois avec 1 mL de PBS à la RT. Faites ceci avec soin pour éviter de détacher les myotubes.
- Fixer les cellules avec 1 ml de paraformaldehyde à 4% (PFA) pendant 15 minutes à la température ambiante. Lavez les cellules avec du PBS deux fois, pendant 5 minutes chacune.
- Perméabiliser les cellules avec 1 ml de PBS contenant 0,25% de Triton X-100 pendant 45 minutes et laver 3 fois avec 1 ml de PBS.
- Block unsSites de liaison pecific par incubation des cellules dans du PBS additionné de 0,2% de Tween-10 et de 2% de sérum de chèvre (solution de bloc) pendant 30 minutes à la RT.
- Préparer les anticorps primaires dilués dans une solution de bloc (600 μL par plaque de 3,5 cm).
Note: Les anticorps primaires suivants sont utilisés: anti-myogénine de souris (1: 600), anti-MEF2 de lapin (1: 300) et anticorps anti-MyHC de souris (MF20, 1: 1 000). Il est possible de mélanger la même solution de blocage, la chaîne lourde anti-myosine de souris ou l'anti-myogénine de souris, avec un anti-MEF2 de lapin. - Retirez la solution de bloc et ajoutez 600 μL de solutions d'anticorps primaires par plaque de 3,5 cm et incuber pendant une nuit à 4 ° C dans une chambre humidifiée.
- Laver les cellules 3 fois avec 1 ml de PBS. Incuber pendant 1 h à la RT dans une chambre sombre avec 600 μL des anticorps secondaires préparés dans la solution de bloc, comme suit: Alexa 488 (1: 1 000) de chèvre anti-souris, Alexa 546 de chèvre (1: 1 000), Et DAPI (1:50, solution stock à 15 μM).
CAUTION: DAPI est un composé toxique qui doit être manipulé avec des gants. - Aspirer et laver les cellules 3 fois avec 1 mL de PBS.
- Monter des lamelles en verre à l'aide d'un support de polyvinyl alcool avec une solution anti-adhésive. Gardez-les à 4 ° C et protégés de la lumière jusqu'à imagerie des cellules.
7. Imagerie au calcium
- Culture antérieure, préparer des lamelles de verre de 25 mm de diamètre. Mettez les lamelles dans 70% d'éthanol pendant 48 h pour éliminer toute graisse et saleté de la surface, ce qui réduit l'adhérence cellulaire à la lamelle.
- Après avoir rincé les couvre-plantres avec de l'eau, remettez-les dans l'eau et stérilisez-les (autoclavés).
- Mettez un lamelleau par plaque de culture de 3,5 cm et laissez-les sécher. Rangez les boîtes de Petri pour d'autres expériences ou utilisez-les immédiatement.
- Ajouter les myoblastes transfectés (5 - 6 x 10 5 cellules) à la lamelle de verre.
Note: Les expériences sont effectuées 24 à 48 h après l'introduction de la différentiationSur, ou sur des myoblastes proliférants. - Pour effectuer l'imagerie Ca 2+ , laver les cellules 2 fois avec du PBS ou directement avec le milieu utilisé pour les expériences (milieu contenant du calcium, tableau 3 ). Chargez les cellules avec 2 uM de Fura-2 / AM plus 1 μM d'acide pluronique pendant environ 30 minutes dans l'obscurité à la température ambiante.
Note: L'acide pluronique aide à solubiliser le Fura-2. Fura-2 / AM et l'acide pluronique sont dissous dans le milieu contenant du calcium. - Lavez les cellules deux fois dans le même milieu mais sans Fura-2 / AM et l'acide pluronique et laissez-les dans l'obscurité pendant 10 à 15 minutes supplémentaires pour permettre la désestérification de Fura-2 / AM.
- Si l'efficacité de chargement de Fura-2 est trop faible, ajoutez plus de Fura-2 ( par exemple, 4 μM) et / ou incupez les cellules pendant plus longtemps ( p. Ex. 40 min).
- Retirez le lamelle de la plaque de culture et installez-la dans la chambre expérimentale. Ajouter ~ 1 ml de milieu contenant du calcium (selon le volume de l'expérienceChambre mentale). Installez-le sur le microscope et démarrez l'enregistrement.
Note: La sonde sensible au Ca 2 + fluorescente Fura-2 est excitée alternativement à 340 nm et 380 nm, et la lumière d'émission est recueillie à 510 nm. Comme les fluctuations de la concentration de Ca 2+ sont relativement lentes, acquérir 1 rapport toutes les 2 s. - Pour activer SOCE, on utilise le protocole de ré-addition classique thapsigargine / Ca 2+ : laissez les cellules pendant 2-3 min dans du milieu contenant du calcium. Remplacez le milieu par un milieu sans calcium pendant 1 à 2 minutes.
- Ajouter 1 μM de thapsigargine pour épuiser les magasins de calcium internes.
Note: La thapsigargine est un bloqueur irréversible de l'activité de la pompe à l'ATPase Ca 2+ ATPase sarco-endoplasmique (SERCA). Après 8 à 10 minutes, remplacer rapidement le milieu par le milieu contenant du calcium. Ca 2+ entrera dans les cellules via les canaux SOCE. Attendez environ 5 min avant de terminer les expériences.
ATTENTION: Thapsigargin est un composé toxique qui doit être manipulé avec des gants.
- Ajouter 1 μM de thapsigargine pour épuiser les magasins de calcium internes.
8. Analyse de mesure de Ca 2+
Remarque: Effectuez l'analyse avec le logiciel d'acquisition.
- Ouvrez l'expérience. Dessinez la région 1 dans une zone où il n'y a pas de cellules (région d'arrière-plan) et dessinez les autres régions dans le cytoplasme des cellules à analyser (les régions peuvent être dessinées sur n'importe quelle image: 340 nm, 380 nm, Ou l'image ratio). Passez à "Exécuter des expériences"> "images de référence". Sous les canaux 340 et 380, sélectionnez "région 1", puis cliquez sur "Soustraire l'arrière-plan".
- Exécutez toute l'expérience (F4: avant) pour vous assurer que rien n'interfère avec la région de fond, comme un point de poussière fluorescent qui se déplace dans la région d'arrière-plan et que les cellules ne bougent pas pendant le temps des expériences.
Note: Les régions d'intérêt sélectionnéesNe devrait pas inclure les zones sombres; Sinon, la valeur du rapport apparaîtra bruyante, dans le cadre de l'analyse, seront inclus dans la mesure. - Cliquez sur «Log data» et rejouez l'expérience complète.
Remarque: Cela ouvrira une feuille de calcul dans laquelle l'heure et le ratio sont enregistrés. Il est également possible de sauvegarder les longueurs d'onde individuelles de 340 nm et 380 nm. - Pour obtenir des informations sur SOCE, extrayez les deux paramètres importants de l'expérience: l'amplitude de la ré-addition de Ca 2+ et la pente de la phase d'entrée Ca 2+ ( Figure 3 ).
- Obtenez l'amplitude en soustrayant la valeur du rapport juste avant la ré-addition de Ca 2+ de l'amplitude maximale de l'élévation du Ca 2+ . Obtenez la pente maximale en ajustant une régression linéaire des premières secondes après la ré-addition de Ca 2+ .
Remarque: La zone sous la courbe de la réponse thapsigargine est également un paramètre informatif pour extracT, car il reflète la quantité de calcium libre stockée dans le SR.
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Representative Results
Après la dissociation enzymatique d'un échantillon de muscle humain, les cellules ont été amplifiées dans GM. Les myoblastes humains, définis comme CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, ont été obtenus après FACS. Les myoblastes représentaient plus de 60% de la population analysée ( figure 1 ). Les myoblastes humains primaires ont été reconstitués, cultivés en confluence et cultivés en DM pendant 48 h. Après immunocoloration pour l'expression du facteur de transcription MEF2 et de la chaîne lourde de myosine de la protéine spécifique (MyHC), nous avons observé qu'une majorité de cellules ont formé des myotubes in vitro (cellules MyHC-positives), avec des valeurs d'indice de fusion de 60,9 ± 1,3% (N = 5; figure 2 ). Nous avons également observé qu'environ 40% des myoblastes humains, appelés cellules de réserve, échappaient à cette différenciation terminale et restaient des cellules mononucléées indifférenciées. Pour les études fonctionnelles, nous avons analysé la réponse de Ca 2+ des myoblastes ou des myotubes 48 h après l'initiation dedifférenciation. La figure 3 montre un protocole représentatif utilisé pour induire SOCE et les paramètres clés à extraire d'un tel enregistrement. Pour discerner l'information relative aux molécules impliquées dans SOCE, les cellules ont été transfectées avec de l'ARNsi contre la molécule d'intérêt. La figure 4 montre l'impact de la réduction des canaux perméables au Ca 2+ de la famille TRPC sur SOCE dans les myoblastes.
Figure 1 : FACS des myoblastes humains. Des cellules humaines dissociées ont été immunostained avec des anticorps pour les marqueurs de surface cellulaire suivants: CD45, CD56, CD34, CD144 et CD146. Après avoir exclu les cellules hématopoïétiques positives pour CD45, les cellules CD45-négatives ont été séparées en fonction de l'expression de CD56. La population positive pour CD56 a ensuite été fermée pour CD34, CD144 et CD146. Les myoblastes humains ont été définis comme CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, comme décrit précédemment 19 , 4 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Différenciation des myoblastes humains. ( A ) Une monocouche confluente de myoblastes humains a été exposée à DM pendant 48 h; fixé; Et colorés avec des anticorps contre MEF2 (rouge), MyHC (vert) et DAPI (bleu) pour identifier les noyaux. Barre d'échelle = 50 μm. ( B ) L'indice de fusion représente le nombre de noyaux incorporés dans les myotubes divisés par le nombre total de noyaux sur un certain champ. Les données sont moyennes ± SEM de 5 expériences indépendantes.Ank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Mesure représentative du calcium de la SOCE induite par Thapsigargin. Les myotubes ont été chargés avec du Fura-2 et la concentration cytosolique de Ca 2+ a été mesurée. ( A ) Les cellules se reposent pendant quelques minutes dans un milieu contenant du calcium, suivies de 2 min dans un milieu exempt de calcium. La thapsigargine 1 μM est ensuite utilisée pendant 8 minutes, suivie de la ré-addition de calcium. Les 3 paramètres importants à extraire d'un tel enregistrement sont: la zone sous la courbe de la réponse thapsigargin, la pente de la SOCE et l'amplitude de la SOCE. ( B ) Quantification des 3 paramètres. La zone sous la courbe fournit des informations sur la quantité de Ca 2+ stockée dans l'ER / SR, et les deux autres paramètres permettent le quantificDe la SOCE. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Implication de TRPC1 et TRPC4 dans SOCE. ( A ) La concentration cytosolique de Ca 2+ a été évaluée à l'aide de Fura-2 dans des myoblastes proliférants transfectés avec siTRPC1 ou siTRPC1 et siTRPC4. SOCE a été déclenché par l'épuisement interne des magasins avec 1 μM de thapsigargine en l'absence de Ca 2+ externe (Ca 2 + libre) et mesuré lors de la ré-addition de 2 mM externe Ca 2+ . Chaque trace représente la moyenne d'une lamelle couvre-partie représentative. ( B ) Quantification des effets de siRNA sur l'amplitude SOCE. Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 12 , avec autorisation. Les bars sont E signifie ± SEM, * p <0,05. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Moyen de croissance (GM): | Concentration | Moyen de différenciation (DM): | Concentration | |||||
| Ham's F10 | DMEM | |||||||
| FCS | 15% | albumine de sérum bovin | 0,5 mg / ml | |||||
| albumine de sérum bovin | 0,5 mg / ml | Facteur de croissance épidermique | "> 10 ng / ml||||||
| Fetuin | 0,5 mg / ml | insuline | 0,01 mg / ml | |||||
| Facteur de croissance épidermique | 10 ng / ml | La créatine | 1 mM | |||||
| Dexaméthasone | 0,39 μg / ml | Pyruvate | 100 ug / ml | |||||
| insuline | 0,04 mg / ml | Uridine | 50 μg / ml | |||||
| La créatine | 1 mM | Gentamicine | 10 μg / ml | |||||
| Pyruvate | 100 ug / ml | <Td colspan = "2"> | ||||||
| Uridine | 50 μg / ml | |||||||
| Gentamicine | 5 μg / ml | |||||||
Tableau 1: Composition moyenne pour la culture myoblaste.
| Tubes | Anticorps | |||||
| 1 | Aucun | |||||
| 2 | Isotype AlexaFluor 488-, Isotype PE-CF594, Isotype PE, Isotype PECy7Isotype APC | |||||
| 3 | Mouse anti-humain CD56-AlexaFluor 488 | |||||
| 4 | Mouse anti-humain CD45 PE-CF594 | |||||
| 5 | Mouse anti-humain CD144-PE | |||||
| 6 | Souris anti-humain CD146-PECy7 | |||||
| 7 | Mouse anti-humain CD34-APC | |||||
| 8 | Rat CD56-AlexaFluor 488-, souris anti-humaine CD45 PE-CF594, CD144-PE anti-humain de souris, CD34-APC anti-humain de souris, CD146-PECy7 anti-humain de souris | |||||
Tableau 2: Anticorps utilisés pour le triage des cellules.
| Milieu contenant du calcium | concentration | Moyen sans calcium | concentration | |||||
| NaCl | NaCl | 135 mM | ||||||
| KCl | 5 mM | KCl | 5 mM | |||||
| MgCl2 | 1 mM | MgCl2 | 1 mM | |||||
| CaCl2 | 2 mM | EGTA | 1 mM | |||||
| Hepes | 10 mM | Hepes | 10 mM | |||||
| Glucose | 10 mM | Glucose | 10 mM | |||||
| PH 7,45 ajusté avec NaOH | PH 7,45 ajusté avec NaOH | |||||||
Tableau 3: Composition moyenne pour les expériences d'imagerie au calcium.
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Discussion
L'isolement et la culture des myoblastes humains à partir du muscle squelettique adulte offrent un modèle in vitro pour étudier la différenciation musculaire et la régénération musculaire. Dans cet article, nous fournissons un protocole qui permet de purifier les rendements élevés de myoblastes humains d'une manière simple et limitée en termes de coûts. En outre, cette technique fournit des résultats fiables et reproductibles en termes de pourcentage de myoblastes isolés et de leur efficacité de différenciation myogénique. En effet, nous avons obtenu environ 60% des myoblastes humains après le tri des cellules. Ces cellules peuvent être maintenues en culture pour jusqu'à 6 passages (environ 30 doublings) et garder leurs capacités à se différencier. En outre, la différenciation myogénique se produit rapidement après avoir changé le milieu de GM à DM, car après 2 à 3 jours de DM, la fusion de myoblastes est maximale. Dans ce modèle, environ 60% des myoblastes se fondent dans les myotubes après 2 jours dans la DM. Un autre avantage est que ces cellules primairesL les cultures sont facilement transfectées avec siRNA. Les médias GM et DM utilisés dans notre laboratoire sont faits maison. Alternativement, les médias commerciaux peuvent être utilisés, mais nous n'avons jamais essayé leur efficacité dans les cultures primaires humaines.
Un inconvénient de la méthode mentionnée est l'utilisation de la trypsine pendant la digestion enzymatique des tissus. Cette procédure supprime une grande fraction des marqueurs de surface cellulaire et implique que nous quittions les cellules en culture pendant quelques jours avant d'effectuer FACS. La collagénase pourrait être utilisée à la place de la trypsine pour mieux préserver les protéines membranaires et permettre le triage des myoblastes humains immédiatement après la dissociation tissulaire. Cependant, le coût de la collagénase est significativement plus élevé que la trypsine, et une étape d'amplification serait encore nécessaire après le tri des cellules pour obtenir un nombre suffisant de cellules pour les expériences ultérieures. Une autre limitation de la technique est la «qualité» des échantillons musculaires obtenus à partir d'orthopédieChirurgie chirurgicale. En effet, les morceaux de tissu obtenus pourraient être plus ou moins endommagés en raison d'une intervention chirurgicale, et le temps entre la chirurgie et la dissociation cellulaire en laboratoire peut varier d'un jour à l'autre. Cependant, pour l'isolement, la purification et la différenciation des myo-blocs dans des myotubes, nous obtenons régulièrement des résultats satisfaisants. Enfin, l'âge du patient peut être un problème, car la quantité et la capacité de régénération des cellules satellites diminuent à l'âge de 20 ans. Ainsi, nous limitons nos expériences aux jeunes patients (moins de 40 ans).
Comme mentionné, les myoblastes se différencient rapidement et efficacement, ce qui est un grand avantage d'étudier les événements initiaux de la différenciation des muscles squelettiques. Cependant, comme les myotubes sont formés rapidement, ils ont également tendance à se contracter spontanément et à se détacher des plaques de culture. Cela empêche l'analyse des événements de fusion postérieurs. Pour étudier ces événements ultérieurs, il faudraitRevêtir la plaque de culture avec une matrice extracellulaire pour améliorer l'adhérence cellulaire et diminuer le détachement de myotubes 21 .
L'imagerie de calcium utilisant la sonde fluorescente Fura-2 est une technique largement utilisée, reproductible, facile à réaliser. Le chargement de Fura-2 est efficace et l'utilisation d'une sonde ratiométrique telle que Fura-2 présente plusieurs avantages par rapport à un colorant à une seule longueur d'onde. Il normalise les changements de concentration ou les différences dans le chargement entre les cellules et dans une cellule ( par exemple, le noyau contre le cytosol). Le protocole que nous avons décrit pour susciter et mesurer SOCE est régulièrement utilisé dans de nombreux systèmes cellulaires différents. Le silence des différents canaux ou des régulateurs de calcium permet d'élucider la composition moléculaire de SOCE et l'importance relative des différents joueurs, à la fois dans les myoblastes et dans les myotubes. Une approche alternative utilisant l'imagerie Fura-2 et Ca 2+ est l'application de laMn 2+ quench technique. Mn 2+ pénètre dans les cellules à travers des canaux perméables au Ca 2+ et apaise la fluorescence fura-2. La mesure du taux de trempe donne une mesure plus directe de la SOCE 22 , 23 . Cela nécessite toutefois l'utilisation d'équipements légèrement différents. La signalisation Ca 2+ pourrait également être effectuée à l'aide d'indicateurs de Ca 2+ codés génétiquement, qui ont le grand avantage d'être précisément localisés dans différents compartiments cellulaires. Les inconvénients sont l'exigence de transfection cellulaire et la dynamique du signal, qui est habituellement inférieure à celle des colorants chimiques 24 . Pour mesurer le Ca 2+ dans les organites comme les mitochondries ou le SR, les sondes génétiques sont l'étalon-or. Cependant, pour les mesures cytosoliques de Ca 2+ , le bénéfice de l'utilisation de Fura-2 sur les sondes génétiques reste.
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Disclosures
Les auteurs n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale suisse de la science (numéro 310030-166313), la Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires, la Fondation Marcel Levaillant et la Fondation pour la recherche ostéo-articulaire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 mL tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 mL tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 mL tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. |
References
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