IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) est une protéine kinase de Ser/Thr qui participe à une myriade d’activités cellulaires principalement grâce à l’activation de facteurs de transcription NF-κB. Nous décrivons ici les principales étapes nécessaires à la production et la détermination de structure cristalline de cette protéine.
Une classe de stimuli extracellulaires nécessite l’activation de IKK1/α pour induire la production d’une sous-unité de NF-κB, p52, grâce à la transformation de son précurseur p100. P52 fonctionne comme un homodimère ou un hétérodimère avec une autre sous-unité NF-κB, RelB. Ces dimères à son tour régulent l’expression de centaines de gènes impliqués dans l’inflammation, la survie des cellules et le cycle cellulaire. IKK1/α reste avant tout associé de l’IKK2/β et NEMO comme un complexe ternaire. Cependant, on observe aussi une petite piscine de celui-ci comme un complex(es) de faible poids moléculaire. On ne sait pas si l’activité de traitement p100 est déclenchée par l’activation de IKK1/α dans la plus grande ou la plus petite piscine complexe. L’activité constitutive de IKK1/α a été détectée dans plusieurs cancers et maladies inflammatoires. Pour comprendre le mécanisme d’activation de IKK1/α et permettre son utilisation comme cible de drogue, nous avons exprimé IKK1/α recombinant dans des systèmes hôte différent, comme e. coli, insecte et les cellules de mammifères. Nous avons réussi à exprimer IKK1/α soluble dans baculovirus infectés par des cellules d’insecte, obtenir des quantités de mg de protéine très pure, il cristallise en présence d’inhibiteurs et déterminer sa structure cristalline. Nous décrivons ici les étapes détaillées pour produire la protéine recombinante, sa cristallisation et sa détermination de structure cristalline aux rayons x.
Activités de transcriptionnelles de la famille NF-κB de facteurs de transcription dimère sont requises pour les fonctions cellulaires variées allant de l’inflammation et l’immunité à la survie et la mort. Ces activités sont strictement contrôlées dans les cellules et une perte du règlement conduit à diverses conditions pathologiques, y compris les maladies auto-immunes et du cancer1,2,3. En l’absence d’un stimulus, les activités de NF-κB restent inhibées par IκB (inhibiteur de – κB) protéines4. La phosphorylation des résidus Ser spécifiques sur les protéines IκB les marque pour l’ubiquitination et dégradation ultérieure proteasome ou traitement sélectif5. Deux kinases hautement homologues de Ser/Thr, IKK2/β et IKK1/α, agissent comme des régulateurs centrales des activités de NF-κB en effectuant ces phosphorylation événements6,7.
Interactions entre un ligand et un récepteur transduit un signal à travers une série de médiateurs conduisant à l’activation de facteurs de NF-κB. Le processus de signalisation NF-κB peuvent être classé en deux voies distinctes – canoniques et non canoniques (alternative)8. L’activité de l’IKK2/β régit principalement le NF-κB signalisation de la voie canonique qui est essentielle pour des réponses immunitaires innées et inflammatoires9. Une caractéristique particulière de cette voie est une activation rapide et de courte durée de l’IKK2/β10 au sein d’un complexe de IKK jusque-là biochimiquement indéterminé — présumé se compose de IKK1 et IKK2, mais aussi un volet réglementaire, NEMO (NF-κB Essential Modulator )11,12,13. Entre les deux sous-unités IKK catalytiques du complexe IKK, IKK2 est principalement responsable14 pour la phosphorylation des résidus spécifiques de prototypes IκBs (α, β – et γ-) lié au NF-κB et également une protéine IκB atypique, NF-κB1/p105, qui est un précurseur de la NF-κB p50 sous-unité5. La phosphorylation induit par ubiquitination et dégradation de proteasome de IκB (ou traitement des p105) conduit à la libération et l’activation d’un ensemble spécifique de NF-κB dimères15. Activité de NF-κB aberrante grâce à une fonction mal réglementée de l’IKK2 a été observée dans nombreux cancers, ainsi que dans des maladies auto-immunes2,3,16.
Contrairement à l’IKK2/β, activité de IKK1/α réglemente NF-κB, signalisation de la voie non canonique, qui est essentielle pour le développement et l’immunité. IKK1 phosphoryle des résidus spécifiques de NF-κB2/p100 sur son segment C-terminal IκBδ, qui mène à son traitement et la génération de p52. La formation de p52:RelB transcriptionnellement actif hétérodimère initie une réponse lente et soutenue aux signaux du développement7,17,18,19,20. Fait intéressant, la génération de la p52 de facteur NF-κB central de cette voie est gravement dépendante sur un autre facteur,21,NF-κB induisant Kinase (NIK)22, mais pas sur IKK2 ou NEMO. Dans les cellules au repos, le niveau de NIK reste faible en raison de la dégradation constante de le dépendant du protéasome23,24,25. Lors de la stimulation des cellules par des ligands « non canoniques » et dans certaines cellules malignes, NIK devient stabilisé afin de recruter et d’activer IKK1 / α. les activités de Kinase de NIK et IKK1 sont essentielles pour le traitement efficace des p100 dans p527. IKK1 et NIK phosphorylent trois sérines (Ser866, 870 et 872) de NF-κB2/p100 sur son segment C-terminal IκBδ menant à son traitement et la génération de p52. Aberrante activation de la voie non canoniques a été impliquée dans nombreuses tumeurs malignes dont le myélome multiple26,27,28.
Plusieurs inhibiteurs hautement efficaces et spécifiques pour IKK2/β sont connus, même si aucun jusqu’à présent ont avéré pour être un médicament efficace. En revanche, les inhibiteurs α-IKK1/spécifiques sont rares. Cela peut s’expliquer en partie par notre manque d’informations structurales et biochimiques sur IKK1/α, ce qui limite notre compréhension de la base mécaniste de l’activation de NF-κB par IKK1 dans les cellules et design rationnel des médicaments. Les structures des IKK2/β nous a fourni un aperçu du mécanisme d’activation de l’IKK2/β29; Cependant, ces structures ne pourraient pas révéler comment différents stimuli en amont déclencher l’activation du IKK1/α ou IKK2/β pour réguler des ensembles distincts de NF-κB activités 30,31. Pour comprendre les bases mécanistiques qui sous-tendent la fonction signalisation distincte de IKK1/α et d’établir une plate-forme pour la conception rationnelle de médicaments, nous nous sommes concentrés sur la détermination de la structure de IKK1/α.
Solution de production, la cristallisation et la structure de deux protéines IKK reliées
Nous partons pour déterminer la structure cristalline du IKK1/α la notion qu’il serait un exercice relativement simple étant donné notre expérience avec la production de protéines IKK2/β, cristallisation et détermination de la structure. Cependant, nous avons été très surpris que ces deux protéines apparentées se sont comportés très différemment au sujet de la facilité de la cristallisation. M…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le personnel de la 19ID de ces faisceaux, 24ID et 13ID à Advanced Photon Source, Lemont (Illinois), pour le soutien au cours de la collecte de données sur différents cristaux. Nous sommes reconnaissants à Dmitry Lyumkis, Salk Institute pour nous aller chercher la carte de cryo-EM basse résolution des stades précoces de EM carte/modèle de construction, qui a été utilisé pour construire le modèle initial de la recherche du remplacement moléculaire IKK1. La recherche ayant abouti à ces résultats a reçu un financement de subventions de NIH AI064326, CA141722 et GM071862 à GG. SP est actuellement Wellcome Trust DBT Inde intermédiaire boursier.
Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
Compound A | Bayer | ||
Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
MLN120B | Millenium | Gift item | |
AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
Crystallization Screens | |||
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |