Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

En behändig metod för extraktion och analys med vätskekromatografi högtrycks av katekolamin signalsubstanser och deras metaboliter

Published: March 1, 2018 doi: 10.3791/56445
Automatic Translation
1, 3, 4, 1, 2
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

Summary

Vi presenterar en bekväm fasta fasen extraktion kopplad till högtrycks vätskekromatografi (HPLC) med elektrokemisk detektion (ECD) för samtidig bestämning av tre Mao signalsubstanser och två av deras metaboliter i spädbarn urin. Vi identifierar också metaboliten MHPG som en potentiell biomarkör för tidig diagnos av hjärnskador för spädbarn.

Abstract

Utvinning och analys av katekolamin signalsubstanser i biologiska vätskor är av stor betydelse vid bedömningen av nervsystemets funktion och sjukdomar, men deras exakta mätningar är fortfarande en utmaning. Många protokoll har beskrivits för signalsubstansen mätning av en mängd olika instrument, inklusive högtrycks vätskekromatografi (HPLC). Men det finns brister, såsom komplicerad operation eller svårt att identifiera flera mål, som inte kan undvikas, och för närvarande dominerande analys tekniken är fortfarande HPLC tillsammans med känsliga elektrokemiska eller fluorimetriskt upptäckt, tack vare dess höga känslighet och bra selektivitet. Här, beskrivs ett detaljerat protokoll för förbehandling och detektion av katekolaminer med högtryck vätskekromatografi med elektrokemisk detektion (HPLC-ECD) i verkliga urinprov av spädbarn, genom att använda electrospun sammansatta nanofibrer består av Polymera crown eter med polystyren som adsorbent, även känd som metoden packade-fiber fast fas utvinning (PFSPE). Vi visar hur urin prover kan vara lätt precleaned av en nanofiber-packade solid phase-kolonn, och hur analyter i provet kan berikas snabbt, desorberats och upptäcks på en ECD-system. PFSPE förenklar förbehandling förfarandena för biologiska prover, vilket möjliggör minskad tid, kostnader och minskning av förlust av mål.

Övergripande, detta arbete illustrerar en enkel och bekväm protokoll för fasta fasen extraktion kopplad till en HPLC-ECD system för samtidig bestämning av tre Mao signalsubstanser (noradrenalin (NE), epinefrin (E), dopamin (DA)) och två av deras metaboliter (3-metoxi-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) och 3,4-dihydroxi-fenylättiksyra (DOPAC)) i spädbarn urin. Etablerade protokollet användes för att bedöma skillnaderna av urin katekolaminer och deras metaboliter mellan högrisk spädbarn med perinatal hjärnskada och friska kontroller. Jämförande analysen visade en signifikant skillnad i urin MHPG mellan de två grupperna, som visar att katekolamin metaboliterna kan vara en viktig kandidat markör för tidig diagnos av fall risk för hjärnskador hos spädbarn.

Introduction

Katekolamin signalsubstanser och metaboliten innehållet i kroppsvätskor kan påverka neurala funktion och påverka balansen staters svar-till-stimulans till en stor grad1. Abnormiteter kan orsaka en mängd sjukdomar, såsom pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastom och neurologiska1,2. Utvinning och bestämning av katekolaminer i kroppsvätskor är meningsfullt att diagnos av de relevanta sjukdomarna. Dock katekolaminer i biologiska prover finns i låga koncentrationer och oxideras lätt. Dessutom är de mycket svåra att eluera på grund av den stora mängden störningar i medium3. Samtidiga detektion av katekolaminer i biologiska vätskor är således fortfarande en utmaning.

Det har förekommit recensioner visar att urin katekolaminer kan vara ett mått på stress, och att deras nivåer är viktiga biologiska markörer svara till taktil stimulering bearbetning i nyfödda5. Enligt forskning, alla spädbarn som utsatts för tidig incidenter är i riskzonen för hjärnan skada4,5,6, och skada kan orsaka onormal frisättning av katekolaminer och relaterade frågor med vätskorna. Det finns avancerade magnetresonans tekniker som kan upptäcka hjärnskador i tidigare faser7,8. Men, inom de första 48 h, en onormal neurodevelopmental process kommer att orsaka permanent hjärnskada som inte kommer att tydligt i medicinska bilder11. Förutom de instrument hög kostnad och knappa resurserna, tillsammans med andra faktorer, gör det omöjligt för alla neonatala enheter att få tillgång till dessa specialiserade neuro-imaging tekniker. Men användningen av en lätt åtkomlig och praktiska biomarkör (såsom katekolaminer och deras metaboliter) kunde övervinna dessa brister och screening av en biomarkör i mänskliga vätskor kan hjälpa i tidig diagnos av hjärnskada och leda till snabb identifiering av nyfödda barn som behöver neuroprotektion9. Katekolaminer i urin kan vara ett enkelt och självklart index, tack vare det direkta sambandet mellan beloppet av dem släpptes in i vätskor och neuroactivity funktion.

Bland biologiska vätskor, cerebrospinalvätska (CSF) och plasmaprover är inte lätt att få via befintliga traumatisk förfaranden, och det är också mycket svårt att bli av störningar på grund av proteinklister och andra orenheter, leder till en besvärlig och tidskrävande samplingsprocessen som är olämplig för upprepad upptäckt. Även för barn är det nästan omöjligt att få proverna i en traumatisk mode. Därför urin provtagning är bättre än andra former av provtagning, eftersom det är icke-invasiv, lätt att använda, och kan göras flera gånger. Urinprov är riklig och lätt att lagra och Visa stora fördelar över andra former av biologiska prover.

De viktigaste metoderna att kvantifiera katekolaminer i biologiska vätskor inkluderar radioenzymic analyser10, enzymkopplad immun-sorbent analyser11, voltametri12 och termisk lins spektrometri13. Men det finns brister, såsom komplicerade operationer och svårt att identifiera flera mål. Idag är dominerande analys teknik högpresterande vätskekromatografi (HPLC)14, tillsammans med känsliga elektrokemiska15 eller fluorimetriskt upptäckt16, på grund av dess höga känslighet och bra selektivitet. Med tandem mass spectrometry teknik, såsom vätskekromatografi/masspektrometri (LC/MS) och liquid chromatography/mass spectrometry/masspektrometri (LC/MS/MS), analys och kvantifiering av signalsubstanser kan nå hög noggrannhet och specificitet17,18. MS tekniken kräver dock dyra instrumentering samt väsentligen kvalificerad arbetskraft, vilket gör metoden svårt att tillämpas allmänt i de flesta konventionella laboratorier. HPLC-ECD system utrustas vanligen mest konventionella och kliniska laboratorier, och har således blivit ett vanligt och bra val för forskargrupper att använda för kemisk bestämning, men de kräver provet införs i systemet för att vara rena och av Hur provtagningsutrustningen skall volym19. Det är således av stor betydelse att rena och kondensera provet före analys. Den klassiska metoden för reningssteg är vätska-vätska utvinning14,15,20 och off-line fasta fasen extraktion, inklusive aktiverad aluminiumoxid kolumn21,22 och diphenylborate (DPBA) komplexering23,24,25,26.

Myeongho Lee et al. har använt polymer harts kemiskt modifierade med crown eter som adsorbenten till selektivt extraktet katekolaminer från mänsklig urin sedan 200727. Också i 2006, Haibo han et al. visat en lättköpt syntes strategi för boronate affinitet utvinning sorbent byutilizing en functionalizable nanomagnetic polyedriska Oligomera silsesquioxane (POSS) baserat nanomagnetic komposit, och tillämpa det till ett berikande av katekolaminer i mänsklig urin (noradrenalin, adrenalin och isoprenalin)28. De drog också fördel av nanomaterialen att fullfölja arbetet, med en teknik som kallas nano-electrospinning och bildar det polymer fibrösa materialet i nanoskala. Electrospinning processen kan justera diametern, morfologi och rumslig justering av produkten genom att kontrollera arbetsspänning och ändra innehållet i den snurrande lösningen tillsammans med andra parametrar29. Jämfört med konventionella SPE patronen, electrospun nanofibrer är mycket lämpliga att extrahera och berika mål analyter från en komplex matris, eftersom de är utrustade med hög yta-området-till-volym nyckeltal att adsorbera analyter med hög effektivitet, och uppvisa mer lättkontrollerad kemiska ytegenskaper, möjliggör praktisk fastsättning av föreningarna som mål. Dessa egenskaper gör dem bra val för SPE adsorbents, vilket avsevärt minskar den fasta fasen och desorption lösningsmedel belopp30,31,32,33. För katekolaminer i urinprover användes electrospun nanofibrer består av apolymeric crown eter med polystyren (PCE-PS) till selektivt extraktet tre katekolaminer (NE, E och DA)34. Papperet anges att selektiv crown eter adsorberat målen i NE, E och DA, som var baserad på dess rätta geometri för bindande katekolaminer via bilda vätebindningar. Resultaten visas material crown eter effektivt, ta bort andra störande föreningar som ingår i biologiska prover. Inspirerad av detta betänkande, en roman metod utvecklades för selektiv extraktion av katekolaminer genom användning av electrospun sammansatta nanofibrer består av PCE-PS.

I detta papper rapporterats metoden tidigare34 var förbättrade och anställda inte bara för att framgångsrikt analysera E, NE, och DA, men också deras metaboliter, MHPG och DOPAC, i urinen. Vi utforskar också nya möjligheter för mekanismen av adsorptionsprocessen. Metoden visar tillfredsställande utvinning effektivitet och selektivitet för de fem analyterna, och metoden var verifierade i analysen av urin från högriskområden spädbarn med perinatal hjärnskada och friska kontroller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Informerat samtycke från föräldrarna erhölls, och institutionella granskning styrelsens godkännande erhölls för studien. Studien utfördes i enlighet med koden för etik av World Medical Association (Helsingforsdeklarationen) för experiment med människor. Vårdgivare av alla deltagare förutsatt samtycke för att vara inskrivna i studien. Etiska kommitténs godkännande från anonym Hospital, affiliate med Southeast universitet, erhölls också.

1. beredning av kolumner och lösningar som behövs för extraktion och bestämning av katekolaminer

  1. Förbereda den PFSPE kolumnen. Dela 1-2 mg PCE-PS nanofibrer i 5-6 portioner och använda en fin stålstav med 0,5 mm diameter på komprimera dem ordnad in i slutet av en pipettspetsen med en volym på 200 µL.
  2. Förbereda den konstgjord urinen genom vägning 2,427 g urea, urinsyra 0,034 g, 0,09 g kreatinin, 0,297 g Trinatriumcitrat, 0.634 g natriumklorid, 0,45 g kaliumklorid, 0,161 g ammoniumklorid, 0.089 g kalciumkloriddihydrat, 0,1 g magnesiumsulfat heptahydrat, 0,034 g natriumbikarbonat, 0,003 g natrium oxalat, 0.258 g natriumsulfat, 0,1 g natriumdivätefosfat, och 0,011 g dinatriumvätefosfat och lös upp ovan kemikalier till 200 mL avjoniserat vatten.
  3. Förbered 2 mg/mL stamlösning av diphenylborate (DPBA) lösning genom upplösning 2 mg av föreningen i 1 mL destillerat vatten. Förvara lösningen i mörker vid 4 ° C.
  4. Analyt standard
    Obs: Kemisk struktur och egenskaper av katekolaminer är instabila, och de sönderfaller lätt. Förberedelseprocessen standarder måste vara mycket snabb och måste förhindra exponering för direkt solljus.
    1. Väga 1,0 mg av NE, E, DA, MHPG, DOPAC och intern standard 3,4-dihydroxybenzylamine hydrobromid DHBA i separata 1,5 mL mikrocentrifugrör. Späd DHBA lösningen i vatten till 100 ng/mL före användning.
    2. Oscillerar beredda normerna i mörkret på hög hastighet tills analyter upplösas helt. Detta är den primära materielen. förvaras vid-20 ° C i upp till flera veckor.
    3. Förbereda de sekundära 1000 ng/mL analyt bestånd. NE, E, DA, DOPAC och MHPG, överför 5 µL av varje primär analyten bestånd till 4.975 µL destillerat vatten i en 5 mL centrifugrör och lagra den i mörker vid 4 ° C fram till användning. Förbereda dessa lösningar färska dagligen. För DHBA, överför 5 µL av primära lager till 4,995 µL destillerat vatten i en 5 mL centrifugrör och förvara den mörkt separat vid 4 ° C.
    4. Göra ytterligare utspädningar med sekundära analyten beståndet att skapa en standardkurva (t.ex., kompletterande tabell2). Lagra lösningar i mörker vid 4 ° C och förbereda färska dagligen.
    5. Testa den optimala spänningen i ECD detektorn med hjälp av standard beståndet med rätt koncentration. Variera spänningen för att hitta ett värde där analyterna har de bästa topp-utseendet.
  5. Förbereda eluant som innehåller 30% fosforsyra, 15% acetonitril, och 55% destillerat vatten. För 10 mL eluant lösningsmedel, använder 5,5 mL destillerat vatten och tillsätt 1,5 mL acetonitril och 3 mL fosforsyra droppvis i vattnet.

2. beredning av riktiga urinprov och mobil fas

  1. Har mödrar samlar den första morgonurin av sina spädbarn använder aseptisk urin cups. Överföra proverna i polypropylene rören och etikett omedelbart. Sedan förvaras proverna i-20 ° C frys.
  2. Vortex och centrifugera urin proverna vid 1 510 x g under 10 minuter vid rumstemperatur (RT) att bli av med de flesta partiklar störningar. Kassera sediment och samla supernatanterna för ytterligare experiment. För att utvinna analyter effektivt, gå vidare till PFSPE förbehandling (steg 3) omedelbart efter centrifugering.
  3. Förbereda den mobila fasen
    1. Förbered en ren flaska, minst 1 L. Mobila fasens sammansättning anges i kompletterande Tabell1; för 1 L Rörlig fas, åtgärd 6.7242 g citronsyra, 93.06 mg eten diamine tetra ättiksyra (EDTA) dinatriumsalt, 7.02 g monometallic natrium fosfat, återfukta 404,5 mg 1-heptanesulfonic acid natriumsalt och 3.5 g natrium i flaskan. Tillsätt 40 mL acetonitril och destillerat vatten till 1 000 mL. Skaka och vibrera ultraljud för 15 min tills ärendet i lösningen är alla upplöst.
    2. Med en pH-mätare med en glaselektrod, justera pH värdet i den mobila fasen till 4,21 med en mättad natriumhydroxidlösning.
    3. Filtrera den mobila fasen med en 0.45 µm polyvinylidene fluor mikroporös membran och en vakuum suganordning att bli av med orenheter.
    4. Använda ultraljud vibrationer för 15 min för att avlufta den mobila fasen varje gång före användning.

3. PFSPE utvinning och HPLC analys

  1. Aktivera nanofibrer. Tryck på 100 µL av metanol och 100 µL av vatten sekventiellt genom kolumnen PFSPE med en 5 mL spruta i en långsam, droppvis sätt.
  2. Mix 100 µL urin prov med 100 µL 2 mg/ml DPBA lösning och 30 µL 100 ng/ml DHBA lösning (IS, intern standard) i 0,5 mL EP rör och sedan överföra den blanda lösningen till kolumnen PFSPE. Tryck på blandade provlösningen genom kolumnen PFSPE med en 5 mL gastät Plastspruta med styrkan av lufttrycket.
  3. Leach kolumnen tre gånger av lastning 100 µL av DPBA lösning (2 mg/mL) i kolumnen SPE och skjut lösningen långsamt genom patronen med lufttrycket med hjälp av en 5 mL gastät Plastspruta.
  4. Fyll 50 µL av eluant på kolumnen PFSPE och driva igenom kolumnen, samla eluatet med ett 0,5 mL EP rör.
  5. Slå på den HLPC degasser att degas luft i systemet. Före provet analyser, bör systemet köra för mer än 0,5 h med den rörliga fasen att temperera och minska baslinjen buller. Se kompletterande Tabell1 visar inställningsparametrar för HPLC systemet.
  6. Prova 20 µL av eluatet med hjälp av en automatisk provtagare och sedan injicera det i HPLC-ECD systemet.
  7. När körningarna är klar, Stäng av cellen detektor i detektor-gränssnittet. Stäng inte av cellen med växeln på baksidan detektorn, eftersom detta kan skada instrumentet.
  8. Manuellt ändra den mobila fas sammansättningen till 10% metanol och 90% vatten. Kör i minst 30 min. Sedan manuellt ändra den mobila fasen till HPLC-kvalitet metanol. Kör i ca 15 min att skydda systemet i metanol. Underlåtenhet att köra detta steg efter den rekommendera rinnande tiden kan resultera i skador att kolumnen och detektorn. Stäng av strömmen, stäng sedan av degasser.

4. Phenylboronic syra patroner (PBA) utvinning

PBA patron extraktionsprocessen liknade ordningen i Kumar et al. (2011) 25. alla lösningar skjuts genom PBA patronen (100 mg, 1 mL) med luft som tvingas av en spruta.

  1. Villkora patronen med 1 mL 80: 20 acetonitril-vatten (v/v) som innehåller 1% myrsyra och 1 mL 50 mM fosfatbuffert (pH 10) sekventiellt.
  2. Tryck på buffrade urinprovet (1 mL urin och 2 mL fosfatbuffert, pH 8,5) genom PBA patronen.
  3. Tvätta patronen med 1 mL 50: 50 v/v acetonitril-fosfat buffert (10 mM, pH 8,5).
  4. Eluera patronen med 1 mL acetonitril-vatten (80: 20 v/v) som innehåller 1% myrsyra.

5. identifiering och kvantifiering av katekolaminer

  1. Linjäritet
    1. Späd det sekundära analyter lagret med konstgjord urin till sex koncentrationer (1,5, 3, 12, 25, 50 och 100 ng/mL); utspädning volymen av konstgjord urin följer kompletterande tabell2. Gör tre parallella prov med varje koncentration att få 18 analyten experimentella lösningar för att konstruera kalibreringskurvor.
    2. Späd DHBA sekundär lager med konstgjord urin 10 gånger för att få 100 ng/mL experimentella lösning.
    3. Förbehandla alla analyten lösningar från 5.1.1, enligt steg 3 (PFSPE extraktionsprocessen). Injicera 20 µL av varje motsvarande eluatet i HPLC-ECD systemet att få en HPLC kromatogram som i steg 3.
    4. Konstruera kalibreringskurvorna av de fem analyterna genom plottning förhållandet mellan topparean (mål/IS) som Y-axeln mot förhållandet mellan koncentrationerna (mål/IS) som X-axeln, som kompletterande figur1.
  2. LOD och LOQ värde för känslighet
    1. Injicera 20 µL av den tomma konstgjord urinen i HPLC-ECD systemet (som i steg 3), för att erhålla HPLC kromatogrammet för provet.
    2. I kromatogrammet från 5.2.1, samla 11 tom signalen värden och beräkna medelvärdet Xb och standardavvikelsen Sb. Beräkna den minsta signalen av ett ämne som kan upptäckas vid en viss nivå av förtroende, XL, som XL = Xb+ K * Sb (K är den koefficient som fastställs av konfidensnivå, Sb speglar ljudnivå för den mätmetoden och maskinen bullernivån). Således, LOD = (XL-Xb) / s = (K * Sb) /S (S står för lutning värdet av arbetande kurvan).
    3. Definiera ett S/N på 3:1 (K = 3) som detektionsgränsen (LOD) och en S/N av 10:1 (K = 10) som kvantifieringsgränsen (LOQ).
  3. Utvärdera återkrav
    1. Laga äkta och spetsade urinprov. Späd det sekundära analyter lagret med äkta urin tre koncentrationer (5, 50, 100 ng/mL) att få de spetsiga urinprov. Förbered tre parallella prover för varje analyt lösning. Räkna spetsade koncentrationen som en mängd av målet föreningar spetsade i urinprovet. Definiera detta värde som ens.
    2. Späd DHBA lager till 100 ng/mL, som i steg 5.1.2.
    3. Behandla varje provlösning från 5.3.1 enligt steg 3 (PFSPE extraktionsprocessen) och injicera den 20 µL av varje motsvarande eluant i HPLC-ECD systemet att få kromatogrammet resultat. Värdet av analyter kommer att räknas som en mängd av målet föreningar kvantifieras i spetsiga urinprovet. Definiera detta värde som ent.
    4. Injicera 20 µL av urinprov i HPLC-ECD (som i steg 3) systemet att få kromatogrammet resultat. Värdet av analyter kommer att räknas som en ursprungliga mängd mål föreningar kvantifieras i urinprovet. Definiera detta värde som ettjag.
    5. Beräkna mängden mål föreningar i proverna från standardkurvan ekvationen. Andel återvinning uppskattas som metodologiska återhämtning % = (t - Ajag) × 100 / (ens). Genomsnittliga värden visas i tabell 1.
  4. Utvärdera den vaghet
    1. Förbereda spetsade konstgjord urinprover till 5, 50 och 100 ng/mL koncentrationer som i steg 5.3.1. Förbereda sex parallella prover för varje analyt lösning. Förbereda färska experimentella prover varje dag.
    2. Späd DHBA lager till 100 ng/mL som i steg 5.1.2.
    3. Utvärdera intradaglig precision (n = 6). Behandla varje provlösning i 5.4.1 enligt steg 3 och injicera den 20 µL av varje korrespondent eluant i HPLC-ECD systemet att få kromatogrammet. Göra samma operation sex gånger i samma dag.
    4. Beräkna mängden mål föreningar i proverna från standardkurvan ekvationen. Under samma koncentration av samma förening bestäms den relativa standardavvikelsen (RSD) av sex analyserna i en dag som intradaglig precision. Genomsnittliga värden visas i tabell 1.
    5. Utvärdera mellan dag precision (n = 6). Vid samma tid varje dag i sex sekventiella dagar, förbereda spetsade konstgjord urinprover för tre koncentrationer av 5, 50, 100 ng/mL, som i 5.4.1 och 5.4.2., och bearbeta varje analyt provlösning enligt steg 3.
    6. Injicera den 20 µL av varje motsvarande eluatet från 5.4.5 i HPLC-ECD systemet att få kromatogrammet resultat varje dag. Beräkna mängden mål föreningar i proverna från standardkurvan ekvationen. Mellan dag precision uttrycks av RSD av analyser kvantiteten från de spetsiga konstgjorda urinprov vid de tre koncentrationerna i sex sekventiella dagar. Genomsnittliga värden visas i tabell 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll är en enkel och bekväm PFSPE metod att förbehandla urinprov och berika fem katekolaminer för upptäckt via ett system för HPLC-ECD. ett diagram över processen visas i figur 1. Protokollet omfattar i huvudsak fyra steg-aktiverande, lastning, sköljning, och eluering - tillsammans med en liten mängd PCE-PS nanofibrer och en enkel fasta fasen extraktion enhet. Morfologi av PCE-PS nanofibrer bedömdes med hjälp av en yta och porositet analyzer (se Tabell för material). Textural egenskaper-satsningen (Brunauer, Emmett och Teller) yta, porvolym och porstorlek-var 2.8297 m2 g-1, 0,009 cm3 g-1och 12,76 nm, respektive. Dessa data indikerar att det material som används i protokollet har nanoskala porer på ytan, vilket kan bidra till hög adsorption effektivitet och sänkta bindande pH i protokollet.

Detta protokoll används provet ingredienser, eluant, lakvatten, optimerad volymer, etc., samt fungerande pH och tid förbrukas under förfarandena. Chen et al., eluant var en 12,0 M ättiksyra eftersom sura förhållanden orsaka adsorbenten att bli protonerade och laddade positivt, vilket är gynnsamt för elueringen av CAs34,35. I denna studie eluant receptet renoverades för att vara 30% fosforsyra, 15% acetonitril, och 55% destillerat vatten. Slutliga pH av eluant justerades till 3.0. Eluant lösningsmedel bör hållas i en sur miljö när eluering, men mycket mer moderat än 12,0 M ättiksyra, som kan leda till dålig topp utseende och skada till HPLC-systemet.

För identifiering av katekolaminer jämförs kromatogrammet retentionstiderna för topparna i proverna med standardlösning toppar. Figur 2 visar exempel på HPLC-ECD kromatogram från de olika lösningarna. Om protokollet följs framgångsrikt, ska kromatografiska profiler av tre katekolaminer och deras metaboliter erhållas genom HPLC-ECD med tydlig symmetrisk, väl definierade toppar och med minimala bakgrundsljud, som illustreras i figur 2 . För jämförelse med den konventionella metoden valdes en kommersiell PBA-patron som en kontroll. I figur 2(en–c), fem mål topparna i (b) är betydligt högre än thaosein (c), vilket indikerar att metoden PFSPE är känsligare än metoden PBA patron. DOPAC topp visade också, inte i PBA patron utvinning resultatet, som anger att kolumnen PBA inte var ägnat att utvinna DOPAC. Figur 2 (d) skildrar kromatogrammet för Tom urinprovet utan någon förbehandling, och figur 2(e) visar kromatogram av urinprovet utvinns med hjälp av PCE-PS sammansatta nanofibrer. Figur 2 (f) visar kromatogram av urinprovet efter extraktion med kolumnen PBA, som också visar ingen DOPAC utvinning överensstämmer med resultatet i figur 2(c). Diagrammet anger att metoden PFSPE inte kan bara extrahera mål med god effekt, men också kunde bli av med de flesta av störningen i urinen, vilket ger bra peak identifiering för föreningarna som mål.

Statistisk analys visade att mätningar för de tre katekolaminer och de två metaboliterna var tillförlitligt reproduceras (tabell 1). Alla målet föreningar visade bra linjäritet mellan 1,5 och 100 ng/mL (R2> 0,99), och standardkurvan för varje analyt kan hittas i kompletterande figur 1. Kurvor och R2 värden påvisa att analyterna ha bra linjäritet och relativitetsteorin inom ett visst linjära intervall, lämplig för beräkningen av koncentrationer av analyter i urinprov. Gränsen för upptäckt (LOD) varierade från 0,25 till 0,54 ng/mL, och gränserna för kvantifieringsgränsen (LOQ) var 0,83 till 1,81 ng/mL, respektive. Signal-brus (S/N) värdet motsvarade 3. Spänna av de metodologiska återkrav av de fem mål föreningarna var från 97,4% (MHPG) till 124,2% (DOPAC), vilket tillfredsställande för tillämpning på verkliga prover. Intradaglig precisionen var från 2,7 till 4,8% (uttryckt som relativ standardavvikelse) och mellan dag precisionen var 2-8,1%, visar god precision och repeterbarhet.

För påvisande av mål i real urinprov rekryterades 28 högrisk barn och 22 friska spädbarn i uppdelningen av barnomsorg, Suzhou kommunala sjukhus. Alla 50 spädbarn använt i studien var pojkar. När de var sex månader gamla, togs de till en rutinmässig hälsokontroll i September 2016. Alla urinprover samlades in och förbehandlade efter protokollstegen 3.1 och 3.2, och proverna analyserades med hjälp av resten av steg 3. Koncentrationerna har beräknats mot kalibreringskurvorna. Statistiska skillnader analyserades av variansanalys (ANOVA). Resultaten kan ses i tabell 2. Skillnaden av katekolaminer och metaboliter mellan de två grupperna var jämförs och analyseras. P-värden visar att katekolaminer inte var signifikant mellan hög risk och friska grupper, medan halten metabolit MHPG var olika i dessa grupper (p = 0,001). Gruppen högrisk spädbarn haft högre mängder av MHPG än i kontrollgruppen (14,8 ± 3.6 ng/mL vs 1,4 ± 0,2 ng/mL), vilket innebär att nivån på urin MHPG kan vara en potentiell markör för tidig identifiering av högrisk spädbarn.

Diagram 3 och tabell 3 beskriver den klassiska kvantifiering metoden för fastställande Mao material och jämföra med andra metoder som de operation förlopp och siffror av intresse ges. PFSPE metod jämfört med klassiska metoder, och har fördelar som en kort tid (5-10 min), förenklade operation förlopp, mindre organiskt lösningsmedel och mer miljövänlighet med tillfredsställande metodologiska parametrar. Eluant beloppet har låg volym (50 µL) och det mål anrikning steget kräver ingen avdunstning, vilket kraftigt främjar upptäckt känslighet för föreningarna som mål i urinen. Jämfört med konventionella partikel-baserade SPE, denna metod förbättrad effektivitet, förenklad förberedelseprocessen och minskat tid av analysen med godtagbar tillförlitlighet, selektivitet och känslighet.

Figure 1
Figur 1 : Schematisk flödesschema PFSPE förfarande i uppsatsen och en representation av dess enhet. (1), Gastight sprutan, (2), pipett tip och (3), Packed nanofibrer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Kromatogram av olika prover. (en) Spiked vattenprov med mål och IS i (100 ng/mL) utan extraktion. (b), Spiked vatten provet extraheras med PFSPE metod och (c) av kommersiella phenylboronic syra (PBA) bläckpatron. (d), riktig tom urin prov utan extraktion. (e), riktiga urin prov extraherats med hjälp av metoden PFSPE. (f), riktiga urin prov utvinns av kommersiella PBA bläckpatron. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Analytisk flödesschema av bestämningsmetoder. (a, b) Tidigare rapporterade klassiska extraktionsmetoder. (en) extraktion av aluminiumoxid, (b) av DPBA komplex, och (c) av metoden som föreslås i detta dokument. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande Figur1: Standard kurvor och ekvationer. Standard kurvorna för de fem analyterna är konstruerade för att kunna använda ekvationen för linjen för att beräkna okänd analyter koncentrationen i provet. (en) NE, (b) E, (c) DA, (d) MHPG och (e), DOPAC. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.

Kompletterande figur 2: Boronate affinitet interaktion mellan boronic syra och cis-diol grupp eller angränsande två hydroxigrupper. (A) Schematisk bild av samspelet mellan boronic syror och flera OH - grupper till formuläret fem - eller sex-membered cykliska estrar. (B) Cis-diol grupp eller angränsande två hydroxylgrupper i röda cirklar skildra den största reaktion platser för de fem analyterna till boronic syra förening. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.

NE MHPG E ÄR DOPAC DA
Linjära området (ng/mL) 1.5-400 1.5-200 1,5-100 1,5-100 1.5-400
R-kvadratvärden 0.9945 0,995 0.9976 0.9902 0.9954
LOD (ng/mL) 0.323 0,322 0.313 0.657 0.249 0.543
LOQ (ng/mL) 1.076 1.072 1.043 2.191 0,83 1.809
Återhämtning ± RSD (%)(n=9) 110.7±2.9 97.4±9.1 103.9±5.2 86.5±7.3 124.2±3.1 117.3±5.4
Precision (RSD %) (n = 9)
Intra-dag 4.5 4 2.7 4.8 3.3 4.7
Mellan dag 4.1 8.1 2 6.3 3.2 5,9
NE, noradrenalin; MHPG, 3-metoxi-4-hydroxyphenylglycol; E, epinefrin; IS, intern standard; DOPAC, 3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid; DA, dopamin;

Tabell 1: Analysresultat för föreslagna protokollet för bestämning av tre katekolaminer och två metaboliter med standardlösningar.

Koncentration (ng mL-1) Kontrollgruppen (22) Hög Risk spädbarn grupp (28) P-värde
NE 7.52±1.34 5.56±1.7 0,37
MHPG 1.4±0.2 14.8±3.6 0,001
E 24±15.8 20.9±5.87 0.841
DOPAC 106.36±30.1 72.12±18.07 0,312
DA 55.53±11.9 48.12±20.9 0,76
P < 0,05 *** visar en betydande skillnad mellan två grupper

Tabell 2: jämförelse av koncentrationer för tre katekolaminer och två metaboliter i urinen mellan friska barn och högrisk spädbarn. Resultaten analyserades statistiskt med variansanalys (ANOVA) med en signifikansnivå av p = 0,05 för skillnader mellan MHPG innehåll. Medel ± standardavvikelser visas.

Prov Utmattad lösningsmedel (mL) Provets volym (mL) Förbehandling tid (min) Linjära området LOD Relativa återhämtning (%) Avdunstar och
Lös		 Analysmetod
lösningsmedel volym tid (min) återhämtning (%) lösningsmedel och
(mL) (mL) beredning
rester
Urinen 0,5 0,05 10 2.0 – 200 ng/mL (NE, E, DA) 0,2-0,5 ng/mL (NE, E, DA) 88,5-94,5 (NE, E, DA) Nej HPLC-ECD (Chen et al., 2016)
Urinen 19 0,7 — 47 – 167 µg/L (DA) 166-500 nM (DA) 98,3-101,1 (DA) Nej HPLC-UV (Piotr et al., 2016)
Urinen 1.3 0,01 — 0,5 – 1250 ng/mL (NE, E, DA, NMN, MN) 0,5-2,5 ng/mL (NE, E, DA, NMN, MN) 74,1 – 97,3 (NE, E, DA, NMN, MN) Nej LC-MS/MS (Li et al., 2016)
Urin och plasma 20 0,05 10 0,04-2,5 ng/mL (NE, E, DA) 0,01-0,02 ng/mL (NE, E, DA) 87,0-97,5 (NE, E, DA) Nej HPLC-UV (Mohammad et al., 2016)
Urinen < 0.5 0,1 5 1.5-400 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 0.249-0.543 ng/mL (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) 97,4-124,2 (NE, MHPG, E, DOPAC, DA) Nej Detta arbete
—, Odefinierad.
PBA, Phenylboronic syra

Tabell 3: Jämförelse av detta arbete med studier på förbehandling av monoaminer eller andra Tangerande under de senaste åren.

Kompletterande Tabell1: Instrument parametrar för detektion och kvantifiering av analyter i uppsatsen av HPLC-ECD. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.

Kompletterande Tabell2: beredning av standardkurvan för fem analyter. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den föreslagna PFSPE-metoden i detta dokument kan vara betydande och meningsfull med avseende på dess snabbhet, enkelhet och bekvämlighet. De adsorbents används i protokollet är electrospun nanofibrer, som har hög yta området till volym nyckeltal, och adsorbera analyter med hög verkningsgrad. Förfarandet bara behöver några milligram nanofiber och en liten volym av eluant lösningsmedel, och kräver inte en avdunstning steg att koncentrera analyter. Här har vi presenterat en detaljerad översikt av en HPLC-ECD baserat protokoll som tillåter nya användare att upprätta en effektiv metod för detektion och kvantifiering av tre katekolaminer och två av deras metaboliter (NE, E, DA, och MHPG, DOPAC).

Överlägsenhet i detta protokoll härrör främst från de fyra kritiska steg under förfarandena, som visas i figur 1: använda PCE-PS nanofibrer för att fånga föreningarna som mål för att minska storleken på sorbentens till några milligram, vilket leder till en snabb adsorption / desorption, och som endast behöver en liten volym av eluering vätska (1); lägga till DPBA i urinen i komplex med de analyter att förbättra deras vattenavvisande egenskaper (2). skölja nanofibrer med lösningen innehållande DPBA för att behålla analyter och ta bort orenheter (3). och optimering av villkoret extraktion och analys för att få bra känslighet och selektivitet för analyter (4).

För steg (1), kan mekanismen av överlägsna prestanda för adsorbent förmåga för PCE-PS hänföras till en mängd faktorer. Crown eter polymererna dopade i nanofibrer kan bilda ett värd-gäst komplex med gäst molekyler innehåller amine grupper av H-obligationer, såsom katekolaminer i denna uppsats. Dessutom Hongyou Hu et al. och Jishun Chen et al. föreslog också att boronic syra kan bond med kväveatomer i den kemiska strukturen genom B-N interaktioner, och att den hydrofoba skelettet kan interagera med bensenringar och andra alifatiska grupper av analyter36,37. Även under processen desorption är av vätebindningar och B-N interaktioner lätt bryts vid mycket låga pH; Således, elueringsmedel med sura pH är vanligen lämpligt för prospektering för desorption. Dessutom finns det också flera sekundära interaktioner, inklusive hydrofoba, Joniska, och väte bindning, som kan uppstå mellan boronic kemikalier och besläktade föreningar36,37,38. Alla dessa interaktioner kan bidra till adsorption av analyter i material.

För steg (2), med hjälp av tillsatt DPBA adsorbera PCE-PS nanofibrer DPBA-katekolamin komplex snabbt. Zhen Liu et al. visade att boronate affinitet material har dykt upp som viktiga medier för selektiv separation och molekylär igenkänning av organiska föreningar, såsom nukleosider, sackarider, glycans, glykoproteiner, och så på38. Komplexering uppstår huvudsakligen från boronate affinitet samspel mellan boronic syra och cis-diol grupper eller två angränsande hydroxylgrupper, till form fem eller sex membered cykliska estrar, som visas i kompletterande figur 2A. Kompletterande figur 2B skildrar de stora reaktion platserna för de fem analyterna i detta arbete till boronic syra föreningen. När omgivningen blir sura, dissocierar boronic syra-cis-diol komplexet. Samspelet mellan boronic syra och cis-diol gruppen eller de angränsande två hydroxigrupper finns omfattande och relativt starkt.

I steg (3), komplexet som bildas mellan analyter och DPBA håll dem på adsorbenten medan andra orenheter sköljs från PCE-PS ytan, att uppnå den bästa bokningen för målen. För steg (4) har det en rapport som visar att den optimala pH var cirka 9,0 för limning av borsyra och katekol sammansatta39. Dock Chen et al. utforskade det bästa pH-värdet för komplexbildande av katekolamin-DPBA och fann att adsorption utförandet av den sammansatta PS-PCE nanofibrer för CAs var optimal när pH-värdet har ändrats till mellan 6,0 och 7,034,35. LiU et al. inblandade att strukturen av stödjande material för boronate sura föreningar, särskilt med rumsliga nedkomsten av hålrum och nanoskala porer och de B-N-ligander som bildas under reaktionen, också avsevärt kan sänka den bindande pH och förbättra bindande affinitet38. Den PCE-PS struktur samt katekolamin struktur är alla utrustade med - NH-grupper. Således, egenskaper och nanoskala porerna i PCE-PS (data som visas i Representativa resultat), samt B-N ligander bildas, kan bidra till sänkt bindande pH i protokollet. Således, optimala pH-värdet i detta protokoll kan vara neutral, vilket förenklar förfarandena och undviker nedbrytning av analyter.

De viktigaste begränsningarna catcholamine beslutsamhet är att deras koncentrationer i biologiska prover är mycket låg och att deras strukturer är instabil (lätt oxiderat); Dessutom är det svårt att bli av med orenheter i media. Således, för analys av katekolamin i biologiska prover, förbehandling, vanligtvis genom fasta fasen extraktion, är nödvändigt. Den PFSPE metod som föreslås i detta dokument tillhandahålls en enkel och bekväm före koncentrationen för analyter i urinprover. Men när du gör experimentet, villkoret experiment måste kontrolleras noggrant, med hjälp av exempelvis undvika ljusexponering och förkortning förbehandling tid så mycket som möjligt.

Tillämpligheten av metoden utvärderades av dess användning för att fastställa koncentrationerna av tre katekolaminer och två metaboliter i urinen hos friska barn och högrisk spädbarn. Det fanns en signifikant skillnad mellan de två grupperna i urin MHPG. Sammanfattade tidigare, redovisas MHPG beloppet i den mänskliga kroppen nu främst som ett index att återspegla noradrenerga neuronala tonar, aktiviteten katekolamin metabolism i centrala och perifera nervsystemet40,41, 42, och är en användbar plasma/urin markör för centrala NE ämnesomsättning43. För högrisk spädbarn orsakar en mängd faktorer såsom hypoxisk-ischemisk encefalopati (HIE) hjärna trauma och hjärnan förolämpningar, leder till olika grader av barndom neurodevelopmental underskott. Detta hjärnskador kommer att i sin tur leda till frisättningen av signalsubstanser (MHPG ingår) i kroppsvätskor44,45. Enligt rapporter av J.W. Maas finns det signifikanta korrelationer mellan hjärnan, CSF, plasma och urin koncentrationer av MHPG46,47. Mätning av totala (gratis + konjugerade) MHPG i urin har länge använts för att bedöma metabolismen av centrala NE och perifera NE metabolism i människor41,48,49. Det kan således konstateras att hög risk spädbarn har noradrenerga neuronala tonen skador jämfört med friska, som påverkar katekolamin metabolism i centrala och perifera nervsystemet. Denna diskrepans indikerar att ytterligare forskning bör göras på förhållandet mellan urin MHPG nivå och utvecklingsrelaterade underskotten. Det har visats att den föreslagna metoden kan användas för bestämning av katekolamin närvaro i urinen, med en lovande utsikter för användning i kliniken för att bedöma sjukdomar som är relevanta för dessa signalsubstanser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna intyga att det inte finns någon intressekonflikt med någon finansiell organisation om det material som diskuteras i denna artikel.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av National Science Foundation Kina (No.81172720, nr 81673230), sociala utveckling forskning Program av Jiangsu provinsen vetenskap och teknik Institutionen (No. BE2016741), vetenskap & teknikprojekt av Kina allmänna administrationen av Quality Supervision, Inspection and Quarantine (2015QK055), programmet öppna projekt i centrala laboratorium på barns utveckling och lärande vetenskap av undervisningsministeriet, Southeast universitet (CDLS-2016-04). Vi erkänner uppriktigt Yuan låt och Ping Liu som hjälpt oss prover samling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µL pipette tip column to contain nanofibers
PCE-PS nanofibers material for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter) fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml) compress solution into the end of the tip
methanol Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) Sigma-Aldrich.Inc A-106408 complex reagent
norepinephrine(NE) Sigma-Aldrich.Inc A-9512 analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) Sigma-Aldrich.Inc H1377 analyte
epinephrine(E) Sigma-Aldrich.Inc 100154-200503 analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) Sigma-Aldrich.Inc D-9128 analyte
dopamine(DA) Sigma-Aldrich.Inc H-8502 analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) Sigma-Aldrich.Inc 858781 interior label
acetonitrile Sigma-Aldrich.Inc 75-05-8 eluriant and mobile phase
phosphoric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7664-38-2 eluriant
uric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 69-93-2 artifical urine
creatinine Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 60-27-5 artifical urine
trisodium citrate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 6132-04-3 artifical urine
KCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7447-40-7 artifical urine
NH4Cl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 12125-02-9 artifical urine
NaHCO3 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd SWC0140326 artifical urine
C2Na2O4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 62-76-0 artifical urine
NaSO4 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7757-82-6 artifical urine
disodium hydrogen phosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10039-32-4 artifical urine
urea Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 57-13-6 artifical urine
NaCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-14-5 artifical urine
MgSO4.7H2O Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10034-99-8 artifical urine
CaCl2 Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10035-04-8 artifical urine
HCl Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7647-01-0 artifical urine
citric acid Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 77-92-9 artifical urine and mobile phase
EDTA disodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 34124-14-6 mobile phase
monometallic sodium orthophosphate Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 7558-80-7 artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium salt Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 22767-50-6 mobile phase
sodium hydroxide Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 1310-73-2 mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column) Aglilent 12102018 PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column Dikma 5020-06731 HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER Shimadzu Corporation, Japan SIL-20AC auto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Corporation, Japan LC-20AD HPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector Shimadzu Corporation, Japan L-ECD-60A detector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System Micromeritics, USA surface and porosity analyzer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
  2. Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376 (2010).
  3. Varley, H., Gowenlock, A. H. The clinical chemistry of monoamines. Brit. Med. J. 2, 1330 (1963).
  4. Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin. Fetal. Neonatal. Med. 11, 343-353 (2006).
  5. Inder, T. E., Volpe, J. J. Mechanisms of perinatal brain injury. Semin. Neonatol. 5, 3-16 (2000).
  6. Miller, S. P., Ferriero, D. M. From selective vulnerability to connectivity: Insights from newborn brain imaging. Trends. Neurosci. 32, 496-505 (2009).
  7. Barkovich, A. J., et al. Proton MR spectroscopy for the evaluation of brain injury in asphyxiated, term neonates. Am. J. Neuroradiol. 20, 1399-1405 (1999).
  8. Liauw, L., van Wezel-Meijler, G., Veen, S., van Buchem, M. A., van der Grond, J. Do apparent diffusion coefficient measurements predict outcome in children with neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy? Am. J. Neuroradiol. 30, 264-270 (2009).
  9. Varsami, M., et al. Inflammation and oxidative stress biomarkers in neonatal brain hypoxia and prediction of adverse neurological outcome: A review. J. Pediatr. Neonat. Individual. Med. 2, e020203 (2013).
  10. Cooper, R. L., Walker, R. F. Microradioenzymic assays for the measurement of catecholamines and serotonin. Methods. Enzymol. 103, 483-493 (1983).
  11. Murphy, J. F. The development of enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) for the catecholamines adrenaline and noradrenaline. J. Immunol. Methods. 154, 89-98 (1992).
  12. Jones, S. R., Mickelson, G. E., Collins, L. B., Kawagoe, K. T., Wightman, R. M. Interference by pH and Ca2+ ions during measurements of catecholamine release in slices of rat amygdala with fast-scan cyclic voltammetry. J. Neurosci. Methods. 52, 1-10 (1994).
  13. Sanchismallols, J. M., Villanuevacamañas, R. M., Ramisramos, G. Determination of unconjugated catecholamine in urine as dopamine by thermal lens spectrometry. Analyst. 117, 1367-1371 (1992).
  14. Lan, C., Liu, W. Determination of catecholamines by HPLC-ECD in urine. Medical Laboratory Science and Clinics. , (2007).
  15. Tsunoda, M., Aoyama, C., Ota, S., Tamura, T., Funatsu, T. Extraction of catecholamines from urine using a monolithic silica disk-packed spin column and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection. Anal. Methods. 3, 582-585 (2011).
  16. Bartolini, B., et al. Determination of monoamine oxidase activity by HPLC with fluorimetric detection. Neurobiology (Bp). 7, 109-121 (1999).
  17. Dunand, M., Gubian, D., Stauffer, M., Abid, K., Grouzmann, E. High throughput and sensitive quantitation of plasma catecholamines by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometryusing a solid phase microwell extraction plate. Anal. Chem. 85, 3539-3544 (2013).
  18. He, H., Carballo-Jane, E., Tong, X., Cohen, L. H. Measurement of catecholamines in rat and mini-pig plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid phase extraction. J. Chromatogr. B. 997, 154-161 (2015).
  19. Simon, N., Young, P. How to increase serotonin in the human brain without drugs. J. Psychiatry. Neurosci. 32, 394-399 (2007).
  20. Grossi, G., et al. Improvements in automated analysis of catecholamine and related metabolites in biological samples by column-switching high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 541, 273-284 (1991).
  21. Iwamot, T., Yoshiura, M., Iriyama, K. Liquid chromatographic identification of urinary catecholamine metabolites adsorbed on alumina. J. Liq. Chromatogr. R. T. 10, 1217-1235 (1987).
  22. Maycock, P. F., Frayn, K. N. Use of alumina columns to prepare plasma samples for liquid-chromatographic determination of catecholamines. Clin. Chem. 33, 286-287 (1987).
  23. Grossi, G., Bargossi, A., Lippi, A., Battistoni, R. A fully automated catecholamines analyzer based on cartridge extraction and HPLC separation. Chromatographia. 24, 842-846 (1987).
  24. Rondelli, I., et al. New method for the resolution of the enantiomers of 5,6-dihydroxy-2-methyl-aminotetralin by selective derivatization and HPLC analysis: Application to biological fluids. Chirality. 8, 381-389 (1996).
  25. Kumar, A., Hart, J. P., McCalley, D. V. Determination of catecholamines in urine using hydrophilic interaction chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. A. 1218, 3854-3861 (2011).
  26. Sabbioni, C., et al. Simultaneous liquid chromatographic analysis of catecholamines and 4-hydroxy-3-methoxyphenylethylene glycol in human plasma: Comparison of amperometric and coulometric detection. J. Chromatogr. A. 1032, 65-71 (2004).
  27. Lee, M., et al. Selective solid-phase extraction of catecholamines by the chemically modified polymeric adsorbents with crown ether. J. Chromatogr. A. 1160, 340-344 (2007).
  28. He, H., et al. Facile synthesis of a boronate affinity sorbent from mesoporous nanomagnetic polyhedral oligomeric silsesquioxanes composite and its application for enrichment of catecholamines in human urine. Anal. Chim. Acta. 944, 1-13 (2016).
  29. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. J. Appl. Polym. Sci. 96, 557-569 (2005).
  30. Hu, W. Y., et al. Packed-fiber solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for determination of diethylstilbestrol, hexestrol, and diedestrol residues in milk. J. Chromatogr. B. 957, 7-13 (2014).
  31. Liu, Z., Kang, X., Fang, F. Solid phase extraction with electrospun nanofibers for determination of retinol and α-tocopherol in plasma. Microchim. Acta. 168, 59-64 (2010).
  32. Qi, D., Kang, X., Chen, L., Zhang, Y., Wei, H., Gu, Z. Electrospun polymer nanofibers as a solid-phase extraction sorbent for the determination of trace pollutants in environmental water. Anal. Bioanal. Chem. 390, 929-938 (2008).
  33. Kang, X. J., Chen, L. Q., Zhang, Y. Y., Liu, Y. W., Gu, Z. Z. Performance of electrospun nanofibers for SPE of drugs from aqueous solutions. J. Sep. Sci. 31, 3272-3278 (2008).
  34. Chen, L. Q., Wang, Y., Qu, J. S., Deng, J. J., Kang, X. J. Selective extraction of catecholamines by packed fiber solid-phase using composite nanofibers composing of polymeric crown ether with polystyrene. Biomed. Chromatogr. 29, 103-109 (2015).
  35. Chen, L. Q., Zhu, X. H., Shen, J., Zhang, W. Q. Selective solid-phase extraction of catecholamines from plasma using nanofibers doped with crown ether and their quantitation by HPLC with electrochemical detection. Anal. Bioanal. Chem. 408, 4987-4994 (2016).
  36. Hu, H., Zhang, Y., Zhang, Y., Huang, X., Yuan, D. Preparation of a new sorbent based on boronate affinity monolith and evaluation of its extraction performance for nitrogen-containing pollutants. J. Chromatogr. A. 1342, 8-15 (2014).
  37. Chen, J., et al. Sensitive determination of four camptothecins bysolid-phase microextraction-HPLC based on a boronic acid contained polymer monolithic layer. Anal. Chim. Acta. 879, 41-47 (2015).
  38. Li, D., Chen, Y., Liu, Z. Boronate affinity materials for separation and molecular recognition: structure, properties and applications. Chem. Soc. Rev. 44, 8097-8123 (2015).
  39. Yan, J., Springsteen, G., Deeter, S., Wang, B. The relationship among pKa, pH, and binding constants in the interactions between boronic acids and diols: It is not as simple as it appears. Tetrahedron. 60, 11205-11209 (2004).
  40. Reuster, T., Rilke, O., Oehler, J. High correlation between salivary MHPG and CSF MHPG. Psychopharmacology. 162, 415-418 (2002).
  41. Beckmann, H., Goodwin, F. K. Urinary MHPG in subgroups of depressed patients and normal controls. Neuropsychobiology. 6, 91-100 (1980).
  42. Mitoma, M., et al. Stress at work alters serum brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels and plasma 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) levels in healthy volunteers: BDNF and MHPG as possible biological markers of mental stress? Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 32, 679-685 (2008).
  43. Ressler, K. J., Nemeroff, C. B. Role of Norepinephrine in the Pathophysiology and Treatment of Mood Disorders. Biol. Psychiatry. 46, 1219-1233 (1999).
  44. Alonso-Spilsbury, M., et al. Perinatal asphyxia pathophysiology in pig and human: A review. Anim. Reprod. Sci. 90, 1-30 (2005).
  45. Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant: Current concepts. Early. Hum. Dev. 80, 125-141 (2004).
  46. Maas, J. W., Leckman, J. F. relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary MHPG and other norepinephrine metabolites. MHPG: Basic Mechanisms and Psychopathology. , Academic Press. 33-43 (1983).
  47. Maas, J. W. Relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary concentrations of norepinephrine metabolites. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 39, 45-55 (1984).
  48. Peyrin, L., Pequignot, J. M., Chauplannaz, G., Laurent, B., Aimard, G. Sulfate and glucuronide conjugates of 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) in urine of depressed patients: Central and peripheral influences. J. Neural. Transm. 63, 255-269 (1985).
  49. Peyrin, L. Urinary MHPG sulfate as a marker of central norepinephrine metabolism: A commentary. J. Neural. Transm. 80, 51-65 (1990).

Tags

Kemi fråga 133 katekolaminer polymera crown electrospun nanofiber packade-fiber fasta fasen extraktion (PFSPE) högtrycks vätskekromatografi med elektrokemisk detektion (HPLC-ECD) högrisk spädbarn
En behändig metod för extraktion och analys med vätskekromatografi högtrycks av katekolamin signalsubstanser och deras metaboliter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L.,… More

Xie, L., Chen, L., Gu, P., Wei, L., Kang, X. A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites. J. Vis. Exp. (133), e56445, doi:10.3791/56445 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter