Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Поколение дискриминационных человеческих моноклональных антител от редких антиген специфические клетки, циркулирующие в крови

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/56508
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

ERRATUM NOTICE

Summary

Мы описываем метод для производства человеческих антител специфических для антигена интереса, начиная от редких B-клетки, циркулирующие в крови человека. Поколение этих естественных антител является эффективным и быстрым, и полученные антитела могут различать высоки родствены антигены.

Abstract

Моноклональные антитела (mAbs) являются мощными инструментами, полезны для обеих фундаментальных исследований и в биомедицине. Их высокая специфичность незаменима, когда антитела необходимо различать высоко соответствующих структур (например, нормальный белок и мутировавших версии их). Текущий способ генерации такие дискриминационные mAbs включает в себя обширный показ нескольких Ab продуцирующих клеток, который является дорогостоящим и трудоемким. Мы предлагаем здесь быстрый и рентабельный метод для генерации дискриминационный, полностью человека mAbs, начиная от циркулирующих лимфоцитов крови человека. Оригинальность этой стратегии объясняется выбор специфического антигена привязки B клеток в сочетании с борьбе с выбором всех остальных ячеек, с помощью легко доступных периферической крови одноядерных клеток (КСДОР). После того, как конкретные клетки B изолированы, cDNA (дополнительных дезоксирибонуклеиновой кислоты) последовательности кодирования для соответствующего МАБ получаются с помощью технологии отдельной ячейки обратный транскрипции-полимеразной цепной реакции (ПЦР) и впоследствии выразил в человека клетки. В течение всего за 1 месяц можно производить миллиграммов весьма дискриминационный человека mAbs, направленных против практически любого желаемого антигена, естественно обнаружены клетки B репертуар.

Introduction

Метод, описанный здесь позволяет быстрый и универсальный производства полностью человеческих моноклональных антител (mAbs) против желаемого антигена (Ag). mAbs являются важнейшими инструментами во многих фундаментальных исследований приложений в пробирке и в естественных условиях: поток цитометрии, гистология, Западный blotting и блокирования эксперименты, например. Кроме того mAbs используются более в медицине для лечения аутоиммунных заболеваний, рака и для управления трансплантации отклонение1. Например анти CTLA-4 и анти PD-1 (или анти PD-L1) mAbs недавно использовались как ингибиторы иммунной контрольно-пропускной пункт в рака лечение2.

Первый mAbs были произведены иммуноглобулина (Ig)-секретирующих hybridomas полученные из клеток splenic иммунизированной мыши или крысы. Однако сильный иммунный ответ против мышиных или крыса mAbs препятствует их терапевтического использования в людей, из-за их быстрое разминирование и вероятных индукции реакций гиперчувствительности3. Для решения этой проблемы, животного белка последовательности mAbs были частично заменены на человека для создания так называемых химерных мыши человека или гуманизированные антитела. Однако эта стратегия лишь частично уменьшается иммуногенность, существенно увеличивая стоимость и сроки производства. Лучшее решение заключается в создании человека mAbs непосредственно из клеток человека B и несколько стратегий для этого. Один из них является использование фага или дрожжи дисплея. Это включает отображение переменной доменов из библиотеки комбинаторной случайных человеческий Ig тяжелых и легких цепей на бактериофаги или дрожжей и проведение отбора шаг, используя специфический антиген интереса. Основным недостатком данной стратегии является случайным образом связаны, приводит к очень большое увеличение в разнообразии сгенерированный антител тяжелых и легких цепей. Антитела, которые получены вряд ли соответствуют тем, которые возникнут в результате естественной иммунный ответ против особенно Ag. Кроме того сворачивание белков человека и столб-поступательные изменения не воспроизводятся систематически в прокариотах или даже дрожжей. Второй метод производства человека МАБ-увековечении естественных человеческих клеток B инфекции вирусом Эпштейна - Барр или выражением анти apoptotic факторов BCL-6 и BCL-XL4. Однако этот метод применим только к ячейкам памяти B и является неэффективным, требующие проверки многочисленных МАБ производители увековечен клеток B определить несколько (если таковые имеются) МАБ клоны с желаемой антигенной специфичности. Таким образом, этот метод является дорогостоящим и трудоемким.

Недавно был описан новый протокол для производства человеческого mAbs от изолированных одной клетки B5. Он полагается на оптимизированной одноклеточных обратный транскрипции-полимеразной цепной реакции (RT-PCR) для усиления из обоих тяжелых - и свет цепи кодирования сегменты из одной клетки B сортировки. Это сопровождается клонирования и выражение этих сегментов в системе эукариотических выражения, таким образом позволяя реконструкция полностью человека МАБ. Этот протокол был использован успешно начиная с B клеток от вакцинированных доноров. Клетки были собраны через несколько недель после вакцинации для получения высоких частот клеток B, направленных против желаемого Ag и таким образом ограничить время, необходимое для скрининга6. Были также подготовлены другие полностью человека mAbs от инфицированных ВИЧ (вирус иммунодефицита человека)+ больных7 и меланома пациентов8. Несмотря на эти успехи до сих пор не существует процедуры доступны, что позволяет изоляции Ag специфические клетки независимо от их памяти фенотип или частоты.

Процедура описана здесь приводит к изоляции эффективным ex vivo человека циркулирующих клеток B, основанный на специфике их BCR, следуют производство полностью человека антиген специфические mAbs высокой урожайности и с низкой скрининга время. Метод не ограничивается ячеек памяти B или антител секретирующие клетки B индуцированных после иммунного ответа, но может также применяться к Справочнику B клеток человека наивными. Что он работает даже начиная с B Ag специфические клетки присутствуют на очень низких частотах является хорошим показателем эффективности его работы. Принцип метода является следующим: мононуклеарных клеток периферической крови (КСДОР) окрашенных с двумя тетрамера, представляя антигена интереса, каждый обозначен с различными флюрохром (например, фикоэритрин (PE) и аллофикоцианин (APC)), и третий Тетрамер, представляя тесно связанных антигена проспряганное с третьего флюрохром (например, Brillant фиолетовый 421 (BV421)). Для обогащения для антиген связывая клетки, клетки затем инкубируют с бисером, с анти PE покрытием и анти APC Abs и отсортированных в ячейке разделения столбцов. Фракция клеток БТР PE+ + выбран, окрашенных с различными mAbs конкретные для различных типов клеток КСДОР для идентификации клеток B и подвергли течь цитометрии сортировки клеток. B-клетки, которые являются PE+ и APC+, но блестящий фиолетовый-, являются изолированными. Этот шаг выбирает часовой клетки, которые не являются клетки B или не связывайте к tetramerized антигену, но связывать PE или APC (эти клетки будет PE+ APC– или PE– APC+) или часть-антигена тетрамера используется (эти клетки будут BV421+). B не весьма специфический для эпитопов интерес также часовой выбраны ячейки на этом шаге (эти клетки также будут BV421+). Таким образом этот метод может очистить весьма специфические клетки B, выражая B-клеточные рецепторы (БКРС) способны различать два очень тесно связанных антигены. Отдельные конкретные ячейки B собираются в трубы и их усиленный ПЦР Ig cDNAs (дополнительных дезоксирибонуклеиновой кислоты) клонирован и выразил линией клеток человека как секретируемые mAbs IgG.

Как доказательство концепции, это исследование описывает эффективным поколения человека mAbs, которые признают пептид представлены классом комплекс гистосовместимости I (MHC-I) молекулы и может различать этот пептид и других пептидов, загружены на том же MHC-I аллеля. Хотя уровень сложности этого Ag имеет важное значение, этот метод позволяет (i) высокодоходных восстановления Ag конкретных mAbs; (ii) производство mAbs состоянии различать между двумя структурно закрыть Ags. Этот подход может быть расширен для прививки или зараженных пациентов без каких-либо изменений в протокол, а также уже успешно реализованы в системе гуманизированные крыса9. Таким образом это исследование описывает универсальный и эффективный подход к генерации mAbs полностью человеком, который может быть использован в фундаментальные исследования и иммунотерапии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все образцы периферической крови человека были получены от анонимных взрослых доноров после обоснованного согласия, в соответствии с местными Этический Комитет (Etablissement Français du пел, EFS, Нант, процедура PLER NTS-2016-08).

1. изоляция мононуклеаров периферической крови человека

Примечание: Начиная материал может быть всего периферической крови человека или cytapheresis образцов. Образцы должны быть не старше 8 h и дополнены с антикоагулянтами (например, гепарин).

  1. Разбавьте кровь с 2 тома (периферической крови человека) или 5 томов (cytapheresis образцов) среды RPMI (Розвелл парк Мемориальный институт).
  2. Тщательно слой 35 мл суспензии разреженных клеток на 15 мл градиента плотности среды в 50-мл Конические трубки. Сделайте столько трубы при необходимости распространить все разбавленной крови. Центрифуга в 1290 x g 25 мин при комнатной температуре в ротор размахивая ведро с тормозом выкл.
  3. Тщательно аспирационная слоя мононуклеарных клеток на стыке среднего градиента плотности и плазменный слой и клетки перехода к новой 50 мл Конические трубки.
  4. Заполнить трубу с RPMI среднего, смешать и центрифуги в 1290 x g 10 мин при комнатной температуре. Осторожно удалите супернатант.
  5. Ресуспензируйте Пелле клеток в 20 мл RPMI среднего и центрифуги на 200 x g 10 мин для удаления тромбоцитов. Осторожно удалите супернатант. Повторите этот шаг один раз.
  6. Ресуспензируйте Пелле клеток в среду RPMI с 10% плода Bovine сыворотки (ФБС).
    Примечание: Перейти непосредственно к Тетрамер маркировки или сохранить клетки на 4 ° C на ночь в концентрации 107 кл/мл.

2. Тетрамер связанные магнитного обогащения Ag специфических клеток

  1. Подготовить АГ тетрамера, добавляя либо PE или APC-меченых премиум класса стрептавидина или BV421-меченых стрептавидина на молярное соотношение 1:4 до биотинилированным антигена мономеров. Добавьте соответствующее количество стрептавидина конъюгата в трех отдельных частей, добавив один Алиготе каждые 10 мин при комнатной температуре.
  2. Распределить клетки (8 до 3 x 10 в трубку) в 15 мл конические трубы и центрифуги на 460 x g за 5 мин.
    Примечание: Следующий протокол предназначен для одной трубы.
  3. Ресуспензируйте Пелле клеток в 200 мкл PBS (фосфат буфер солевой) с 2% FBS. Добавьте PE-, APC и конъюгированных BV421 тетрамера, каждый в конечной концентрации 10 мкг/мл. Хорошо перемешайте и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.
  4. Подготовить ледяной клетки разделения буфера (SB) с помощью PBS с 0,5% BSA (бычий сывороточный альбумин) и ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) 2 мм.
  5. Добавьте 10 мл SB. Пелле клетки центрифугированием в 460 x g за 5 мин.
  6. Ресуспензируйте клетки в 500 мкл ледяной SB. Добавьте 50 мкл анти PE и 50 мкл магнитные микрошарики анти APC.
  7. Хорошо перемешайте и проинкубируйте втечение 20 мин при 4 ° C.
  8. Повторите шаг 2,5 дважды.
  9. Ликвидировать супернатант тщательно andresuspend клетки Пелле в концентрации 2 x 108 клеток/мл в лед холодной SB.
  10. Сбалансировать большой магнитной столбец позиционируется на магнит с 3 мл SB.
  11. Передача суспензию клеток с 2,9 на вершину столбце уравновешенной и позволить ему стечь полностью. ВАЖНЫЙ шаг: Во избежание слипания столбца, пройти 70 мкм нейлоновая сетка клетки.
  12. Промойте трубку, которая содержит ячейки с 3 мл холодного льда SB и передачи буфера непосредственно на столбце (в случае фильтрации, промыть 70 мкм нейлоновая сетка).
  13. Когда буфер полностью осушенных в столбец, добавьте еще 3 мл холодной SB льда в столбец.
  14. Повторите шаг 2.13 для другой 3 мл мыть.
  15. Удалите столбец из магнита и место над 15 мл конические собирая трубки.
  16. Добавьте 5 мл холодного льда SB на верхней части колонны и немедленно промойте клетки из столбца с помощью плунжера. Повторите этот шаг один раз.
  17. Центрифуга собранных клетки (обогащенный соответствующих Тетрамер положительный клеточный фракция) на 460 x g 5 мин и приступить к пятнать дополнительные антитела.
    Примечание: Бассейн собранные клетки из всех труб, если это уместно.

3. Окрашивание Ag конкретного человека B клеток и сортировки клеток

  1. Ресуспензируйте клетки лепешка с коктейлем античеловеческие антител против CD3 (окончательного растворения: 1:20), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50) и 7AAD (1: 1000) в конечный объем 100 мкл PBS с 2% FBS. Инкубируйте 30 мин при 4 ° C.
  2. Добавление в ячейки, центрифуги на 460 x g за 5 мин, 10 мл PBS и ликвидации супернатант. Повторите этот шаг один раз. Ресуспензируйте Пелле клеток в 200 мкл PBS, фильтр на 70 мкм нейлоновая сетка.
  3. Перейти к сортировки конкретные клетки B на уровне одной ячейки на сортировщик цитометр ячейки с насадкой 100 мкм и давлении 20 psi не превышает 1000 событий/s9.
    Примечание: Стробирования стратегия используется показан на рис. 1. Клетки были впервые воротами на CD14–CD16 7AAD–– клетки, чтобы исключить моноцитов, НК и мертвые клетки (не показан на рис. 1). Затем CD19+ B клетки были выбраны перед стробирования на двойной окрашенных клеток PE и APC соответствующих Ag тетрамера. Неспецифическая B клетки были исключены от стробирования на отрицательные клетки BV421 (незапятнанное нерелевантных Ag Тетрамер).
  4. Сбор одной клетки B в 8-газа ПЦР трубы ранее заполнены с 10 мкл ПБС и 10 единиц АБС битор РНКазы и помещены на стойке для 96 пробирок. Немедленно заморозить трубы ПЦР-80 ° c.
    Примечание: Маски сортировки, выбранного на инструменте цитометр являются урожайность маска: 0, чистоты маска: 32 и маска фаза: 0. Этот депозит одноклеточных могут быть скорректированы на тарелку ПЦР 96 - или 384-ну при необходимости. Одноместный B клетки должны быть заморожены как можно быстрее и можно оставить на-80 ° C в течение нескольких недель, в случае необходимости.

4. одну ячейку RT-PCR

  1. Лизируйте клетки непосредственно нагрев замороженной образцы в PCR полос при 70 ° C за 5 мин в сухом Бате.
  2. Передача полоски лед и приступить к обратный транскрипции (RT), добавив 10 мкл на трубку 2 x мастер смесь буфер, содержащий dNTP 1 мм, 25 мкг/мл oligod(T) грунты, 5 мкм случайных hexamers, 20 единиц АБС битор РНКазы и 400 единиц обратной транскриптазы.
    Примечание: После отогрева клетки, RT должны выполняться быстро чтобы избежать деградации РНК.
  3. Инкубируйте при 25 ° C за 5 минут позволить случайных hexamers гибридизируйте, затем инкубировать 1 час при температуре 50 ° C, и закончить с инкубации на 95 ° C в течение 3 мин до остановки реакции.
  4. Продолжите с двух раундов вложенных амплификации PCR для каждого из регионов, кодирование для переменной тяжелых (vH) и Каппа (vLκ) или лямбда легкие цепи (vLλ).
    Примечание: в качестве альтернативы, RT образцы могут быть заморожены при-20 ° C и хранится на одну неделю.
    1. Для первого раунда PCR, добавить 3 мкл cDNA для 40 мкл заключительного тома, содержащего 1,5 мм MgCl2, дНТФ 0,25 мм, 2,5 единиц ДНК-полимеразы и 200 Нм внешних грунтовки (см. рис. 2 и Таблица материалов для последовательностей праймера).
      Примечание: Состав внешних грунтовки смеси. Для усиления тяжелые цепи: 4 вперед грунтовки (5' ГЛЖ микс) и 2 назад грунтовки (3' CµCγ mix). Для усиления света Каппа цепи, 3 вперед грунтовки (5' LV | смесь) и 1 обратный грунтовки (3' Cκ543-566). Для усиления лямбда легкие цепи 7 вперед грунтовки (5' LVl микс) и 1 назад грунтовки (3' Cl).
      Примечание: Грунтовки были разработаны et al. культиватор для усиления всех семейных генов тяжелой и легкой цепи5.
    2. Применяются следующие условия Велоспорт: 94 ° C для 4 мин, после чего 40 циклов 30 s на 94 ° C, 30 s на 58 ° C для VH и VLκ (60 ° C VLλ) и 55 s при 72 ° C, с удлинением окончательный шаг в 72 ° C для 7 мин.
    3. Для второго раунда PCR, используйте 3 мкл первого продукта Усилители для окончательный объем 40 мкл, содержащего 1,5 мм MgCl2, дНТФ 0,25 мм, 2,5 единиц ДНК-полимеразы и 200 Нм праймеров внутреннего, содержащие сайты энзима ограничения для клонирования в выражение векторы (см. рис. 2 и Таблица материалов для последовательностей праймера).
      Примечание: Состав смеси внутренней грунтовки. Для усиления тяжелые цепи: 9 вперед грунтовки (5' AgeIVH микс) и 3 назад грунтовки (3' SalIJH микс). Для усиления света Каппа цепи, 9 вперед грунтовки (5' AgeIV | смесь) и 3 вспять грунтовки (3' BsiWIJκ микс). Для усиления лямбда легкие цепи 6 вперед грунтовки (5' AgeIVl микс) и 1 назад грунтовки (3' XhoICl).
      Примечание: Грунтовки были разработаны культиватор et al., для усиления всех семейных генов тяжелой и легкой цепи5.
    4. Применяются следующие условия Велоспорт: 94 ° C для 4 мин, после чего 40 циклов 30 s на 94° C, 30 s на 58 ° C для VH и LCκ (60 ° C LCλ) и 45 s при 72 ° C с окончательной удлинение шаг в 72 ° C для 7 мин.
  5. Определите положительные скважин, перенос 5 мкл продуктов ПЦР vH, vLκ и vLλ на 1,5% агарозном геле (500 bp продукты для кодирования сегментов переменной тяжелые цепи) и 350 bp продукт для переменной лёгкие цепи кодирования сегментов.
  6. Очищайте оставшиеся 35 продуктов ПЦР мкл, оставшиеся от положительных скважин с использованием ультрафильтрационных мембран для очистки продуктов ПЦР.
  7. Элюировать продуктов ПЦР с 60 мкл H2O.

5. выражение клонирования

  1. Подготовить вставок
    Примечание: Дайджест 60 мкл каждого очищенного ПЦР продукта в окончательный объем 100 мкл, содержащие соответствующие энзима ограничения буфера.
    1. Для продуктов ПЦР vH добавить 50 единиц АИОД и 50 единиц Сали и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
    2. Для vLλ продуктов ПЦР добавить 50 единиц АИОД и 50 единиц XhoI и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
    3. Для vLκ продуктов ПЦР добавить 50 единиц АИОД и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Очистить дайджесты, используя 96 мембран PCR и элюировать с 60 мкл H2O. дайджест 60 мкл элюата в окончательный объем 100 мкл буфера энзима ограничения BsiWI, добавить 50 единиц BsiWI и инкубировать 1 час при температуре 55 ° C.
    4. Инактивации ферментов путем нагрева при 80 ° C в течение 15 мин.
  2. Подготовка выражения векторов
    Примечание: продукты PCR vH клонируются в вектора выражения (HCγ1), содержащий постоянной тяжелой цепи Cγ1 IgG1. vLκ продукты PCR клонируются в вектор выражения (LCκ), содержащий постоянные лёгкие цепи Cκ. vLλ продукты PCR клонируются в вектор выражения (LCλ), содержащий постоянные лёгкие цепи Cλ.
    1. Выполните следующие пищеварения.
      1. Смешайте 1 мкг выражения вектор HCγ1 с 10 единиц АИОД и 10 единиц Сали эндонуклеазами в общем объеме 20 мкл ограничение буфера, рекомендованный производителем и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
      2. Смешайте 1 мкг вектора выражения LCκ с 10 единиц АИОД энзима ограничения в общем объеме 20 мкл ограничение буфера рекомендованный производителем и инкубировать 1 час при температуре 37° C. Добавить 10 единиц BsiWI энзима ограничения и инкубировать 1 час при температуре 55 ° C.
      3. Смешайте 1 мкг вектора выражения LCλ с 10 единиц АИОД и 10 единиц эндонуклеазами XhoI в общем объеме 20 мкл ограничение буфера рекомендованный производителем и инкубировать в течение 1 ч при 37 ° C
    2. Тепло каждый пищеварение смесь при 65 ° C для 10 мин для инактивации ферментов ограничение.
    3. Выполняют лигирование 5 мкл переваривается продукта PCR с 2 мкл (100 нг) соответствующего выражение линеаризованного вектора в общем объеме 20 мкл 1 x ДНК лигаза буфер с 1 величины T4 ДНК-лигаза инкубации на ночь при 4 ° C.
      Примечание: в качестве альтернативы, перевязка выполняется за 3 ч при 4° C.
  3. Клонирование
    1. Electroporate 1 мкл 20 мкл лигирование смесь в 45 мкл домашнее electrocompetent TOP10 E. coli (текущие протоколы в молекулярной биологии, раздел 1.8.4-1.8.8). Сразу же 500 мкл 2 X YT средних и инкубировать в водяной бане при 37 ° C на 30 мин превращается распространение бактерий на 2 x YT ампициллин пластины. Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    2. Для каждого преобразования экран восемь колоний методом ПЦР.
      1. Настройка реакции премикс следующим на льду: 45 мкл 5 x буфер ПЦР, 12 мкл MgCl2 (25 мм), 4 мкл дНТФ (от запасов содержащий 10 мм каждого), 10 мкл вперед праймера (фондовая 10 мкм) гибридизировать вектор последовательности (праймер Ab-vec чувство) и 10 мкл обратного праймера (фондовая 10 мкм) ориентация региона постоянно тяжелые или легкие цепи (см. Таблицу материалы для последовательностей праймера). Составляют окончательный объем 200 мкл с H2O. Затем 4 мкл фермента ДНК-полимеразы (5 U/мкл).
      2. Распространите 25 мкл реакции премикса на ПЦР-пробирки 8-полосы на льду.
      3. Используйте стерильные зубочистку, чтобы забрать отдельных колоний. Полоска зубочистку на 2 x TY пластину ампициллин составляют реплицировать тарелку и затем окуните его в пробирку реакции PCR.
      4. Выполнять PCR скрининг при следующих условиях Велоспорт: 94 ° C в течение 10 мин, после чего 25 циклов 30 s на 94 ° C, 30 сек при 55 ° C и 50 s при 72 ° C.
      5. Выявление положительных бактерий путем переноса 5 мкл продуктов ПЦР на 1,5% агарозном геле.
        Примечание: Срабатываний колоний дают продукт PCR около 850 bp для векторных тяжелые цепи и 600 bp для легкой цепи вектора.
    3. Прививок четыре положительных колоний от реплицировать пластины в 2 мл среды LB и инкубировать на ночь при 37 ° C при встряхивании в 200 об/мин.
    4. Экстракт плазмид из жидкого культур, используя набор для очищения плазмиды, как указано заводом-изготовителем.
    5. Проверьте правильность подсоединения переменной доменов Сэнгером секвенирования плазмид грунтом Ab-vec смысл.
      Примечание: Плазмид с правильной вставки (кодирование HC и соответствующие LC) должны быть cotransfected в 293A клетки для секреции. Специфика малого масштаба производства mAbs assayed по ELISA. Затем крупномасштабное производство выполняется, если применимо.

6. производство mAbs

  1. Малосерийное производство для специфичности проверять
    1. За день до трансфекции, семян 15 000 человеческих эмбриональных почек 293A (ГЭС 293A) клетки в 200 мкл из Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с 10% FBS в скважину в 96-луночных пластины. Инкубируйте на ночь в CO2 инкубатора (5% CO2) при 37 ° C.
    2. Cotransfect 293A клеток в среде DMEM, содержащие 10% FBS с помощью линейной polyethylenimine производная как трансфекции реагента.
      Примечание: Выполните transfection triplicates. Следующий протокол предназначен для одной скважиной плиты 96-луночных плоское дно.
      1. Разбавьте 0.5 мкл Реагента трансфекции ДНК в 10 мкл 150 мм NaCl. Разбавьте 0,125 мкг vH и 0,125 мкг vL выражая векторов в 10 мкл 150 мм NaCl. Вихревой каждого разведения 10 s.
      2. Добавьте 10 мкл разбавленный ДНК трансфекции реагента в 10 мкл раствора ДНК. Вихревой 15 s и Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре. Добавьте в смесь 20 мкл каплям на 293A клетки и смешайте нежно закрученного пластину.
    3. Замените средний 16 h после transfection и культуры клеток на 5 дней, в среде свободной от сыворотки.
      Примечание: Используйте сыворотки свободной среде, чтобы избежать сыворотки Igs, загрязняя производства антител.
    4. Ликвидации клеток и мусора центрифугированием в 460 x g за 5 мин.
    5. Урожай supernatants стремление с многоканальным пипетки и передавать их в V-дно 96-луночных плиту.
    6. Соответствующих Ag пальто на ночь при 4 ° C 100 мкл на хорошо восстановленный ELISA/ELISPOT покрытия буфера 1 x в конечной концентрации 2 мкг/мл в 96-луночных ELISA пластины. Смотрите примеры в 9.
    7. Уэллс блок с 10% среднего FBS DMEM втечение 2 ч при 37 ° C
    8. 50 мкл supernatants transfected 293A клеток из шага 6.1.5 и проинкубируйте втечение 2 ч на RT.
    9. Добавьте 100 мкл против человека, который IgG Ab конъюгированных фермента пероксидазы (ПХ) хрен на 1 мкг/мл и инкубировать 1 час при комнатной температуре. Добавьте 50 мкл Хромогенный субстрат (ТМБ) и проинкубируйте втечение 20 мин.
    10. Прочитано оптических плотностей на 450 Нм на спектрофотометре.
      Примечание: Конкретные mAbs выявили Пробирной ELISA Далее производится в крупных масштабах и очищается на протеине столбца представления сродство к IgG человека.
  2. Крупномасштабное производство и очищения конкретных mAbs
    1. За день до трансфекции, семян 6 x 106 человеческих эмбриональных почек 293A (ГЭС 293A) клетки в 175 см2 фляги, содержащих 25 мл DMEM дополнена 10% FBS. Инкубируйте на ночь в CO2 инкубатора (5% CO2) при 37 ° C.
      Примечание: Клетки должна быть 70% притока когда transfected.
    2. Cotransfect 293A клеток в среде DMEM, содержащие 10% FBS с помощью линейной polyethylenimine производная как трансфекции реагента.
      1. Развести 50 мкл Реагента трансфекции ДНК в 450 мкл 150 мм NaCl. Развести 10 мкг vH и 10 мкг vL выражая векторов в 500 мкл 150 мм NaCl. Вихревой 10 s каждого разведения.
      2. Добавьте разбавленные ДНК трансфекции реагента в ДНК решение. Вихревой 15 s и Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре. Добавьте в смесь 1 мл каплям клетки и смешайте нежно закрученного колбу.
    3. Замените средний 16 h после transfection и культуры клеток на 5 дней, в среде свободной от сыворотки.
    4. Средний урожай, аспирационных с пипеткой 25 мл.
    5. Ликвидации клеток и мусора центрифугированием в 460 x g за 5 мин.
    6. Очищение антитела используя столбец 1 мл, покрытые белок на систему быстрого белка жидкостной хроматографии (ПСОК) при 4 ° C.
      1. Сбалансировать белка sepharose столбец с 20 мм фосфатного буфера (рН 7).
      2. Фильтр средних культуры клеток от 6.2.5, используя 1.22 мкм фильтр, а затем 0,45 мкм фильтром.
      3. Загрузите отфильтрованные среднего на столбец.
      4. Вымойте с 20 мм фосфатного буфера (рН 7) и элюировать с буфером цитрат 0,1 М (рН 3,5).
      5. Прочитано оптических плотностей на 280 Нм на спектрофотометре поглощения и немедленно нейтрализовать-белковые фракции с 1 М трис-буфере (рН 9).
    7. Dialyze очищенный Ab на ночь при 4 ° C в кассету с молекулярной массой 3,5 K отсечки против PBS буфере (рН 7,4).
    8. Стерилизация фильтрации и контроля чистоты 0,2 мкм, размер-гель-проникающей хроматографии, как указано заводом-изготовителем.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Начиная от КСДОР от здоровых доноров, этот проект представляет поколения человека mAbs, которые признают пептидные Pp65495 (Pp65, от человека цитомегаловирус) представил комплекс гистосовместимости класса I (MHC-I) молекулы HLA - A * 0201 () HLA-A2). Эти mAbs можно различать этот комплекс и комплексы, представляющие другие пептиды, погружены же MHC-I молекулы.

КСДОР окрашивали с HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC и HLA-A2/MelA2-BV421 тетрамера, как описано в протоколе выше. После обогащения клеток в иммуномагнитная PE - и APC-Тетрамер позитивных клеток eluted клетки окрашивали дополнительные mAbs. В сортировщике клеток цитометрии потока магнитной обогащенного клетки были впервые закрытого на жизнеспособных CD14–CD16–CD3–CD19+ майки (B-клетки). Рисунок 1 показывает, что стробирования стратегия, используемая для изоляции клетки B, выражая БКРС способны различать HLA-A2/Pp65 и других связанных с HLA-A2/пептидных комплексов. Выбор клеток B интереса была выполнена после стробирования на PE HLA-A2/Pp65+ и APC HLA-A2/Pp65+ двойной срабатываний, чтобы исключить конкретные флюрохром B-клетки, которые окрашивали поодиночке PE+ или APC+. Наконец весьма специфические клетки B были определены стробирования на отрицательные клетки HLA-A2/MelA2-BV421. Это позволяет идентификации клеток B выражая БКРС способны связывать HLA-A2/Pp65, пептид и HLA-A2-зависимой образом, проведения различий между этими клетками B и направленные против β2-микроглобулин, биотин, HLA-A2 или те, которые не допускали дискриминации между пептидов в groove привязки MHC. Все эти последние клетки будет BV421 клеток. Как ранее и далее документально с другими типами Ag, эта стратегия исключения является более важное значение ввиду увеличения в дискриминационных способности клеток для Ag9.

После того, как отдельные конкретные ячейки B были отсортированы, cDNAs кодировку для тяжелых и легких цепей Ig были усилены RT-PCR. Пар тяжелые и легкие цепи, кодирование сегменты были получены около 50% из одной клетки B тестирование (Таблица 1). Переменной домена, который затем последовательности клонированы в выражение векторы содержащие соответствующее постоянное домена последовательности (тяжелой постоянной 1 и легких постоянным κ или λ). Человеческих эмбриональных почечных клеток (ГЭС, 293A клетки) были cotransfected с тяжелой и легкой цепи векторов. Выделяется mAbs изотипа IgG1 были собраны от supernatants культуры клеток 293A 5 дней после трансфекции (см. рис. 3 для глобальной стратегии полностью человека mAbs производства). Это успешно производит один HLA-A2/Pp65 специфическое антитело начиная с 3 клетки одного лимфоцитов приносит пар тяжелой и легкой цепи кодирования сегментов (Таблица 1). ELISA assays четко продемонстрировали, что этот МАБ был оба MHC - и пептид зависимой для его привязки к HLA-A2/Pp65 комплексов (Рисунок 4A), и для дальнейшего анализа (например, анализ сходства, легко были подготовлены несколько миллиграммов МАБ функциональные анализы). Его сродство, определяется поверхностного плазмон резонанс (СРП), был около 7 x 10-6 М (рис. 4В).

Таким образом эта статья описывает сочетание чувствительных и эффективные методы, позволяющие i) выявление соответствующих Ag специфических клеток, даже при их наличии на очень низких частотах в крови здоровых доноров и ii) поколения весьма дискриминационный человека mAbs.

Figure 1
Рисунок 1: Определение конкретных клеток B HLA-A2/Pp65 от человека КСДОР.
3 x 108 КСДОР окрашивали с HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC и HLA-A2/MelA2-BV421 тетрамера. После обогащения клеток в иммуномагнитная PE - и APC-Тетрамер позитивных клеток eluted клетки окрашивали дополнительные mAbs. В сортировщике потока цитометрии клетки, клетки были сначала закрытого на жизнеспособные синглетно CD14–CD16– лимфоцитов (не показан), затем на CD19+CD3– клетки. Затем были закрытого клетки B, окрашенных с HLA-A2/Pp65-PE и HLA-A2/Pp65-APC тетрамера. Тетрамер HLA-A2/мела-BV421 был использован для исключения B-клетки, которые не признают HLA-A2/Pp65, пептид и MHC-зависимых образом.

Figure 2
Рисунок 2: стратегия для усиления и клонирования генов Ig. Легкие и тяжелые кодирование генов Ig цепи были усилены вложенных RT-PCR. Первый PCR были исполнены с сочетанием вперед грунтовки гибридизировать лидера региона и обратный Праймеры для постоянной регионов соответствующие Каппа тяжелые, легкие, или лямбда легкие цепи. Второй PCR были выполнены с праймерами, содержащих ограничения сайтов, прямого и обратного грунтовки были соответственно конкретным, для начала V сегментов и конца J сегментов. Продукты PCR были упорядочены, переваривается с энзимами ограничения и клонированных в векторы выражения, содержащие соответствующие постоянные домены. ЦМВ: цитомегаловирус промоутер; AmpR: сопротивление ген для ампициллина.

Figure 3
Рисунок 3: Общая стратегия реконструкции рекомбинантного человеческого mAbs.
Тетрамер-стратегия на основе сортировки позволяет обнаружение клеток B интерес. Весьма специфические клетки B были одну ячейку Сортировка. Легких и тяжелых цепей Ig кодирования сегменты были усилены с помощью ПЦР. Переменной домена последовательности клонированы в векторы отдельные эукариотической экспрессии в рамке с сегментов гена кодирования постоянно темных и светлых областей. Соответствующего полностью человека mAbs были выраженные временно transfected клеток 293A ГЭС и очищенной от культуры супернатант. Эта цифра была изменена с Ouisse и др. (2017) 9.

Figure 4

Рисунок 4: Характеристика представителя весьма дискриминационный МАБ против HLA-A2/Pp65 генерируется из циркулирующих лимфоцитов периферической крови.
A) специфика МАБ PC1.02 против HLA-A2/Pp65 проверены ELISA. Плиты были покрыты с соответствующими (HLA-A2/Pp65) или не значения HLA-A2 комплексы, содержащие HLA-A2-ограничено пептиды: мела, NS3 (HCV-1) и GagP17 (ВИЧ-1) 2 мкг/мл, МАБ, PC1.02 был добавлен и против человека, IgG-ПХ Ab была использована для обнаружения. Оптическая плотность (OD) были читать в 450 Нм. B) определение сходства МАБ PC1.02 с помощью поверхности Plasmon резонанс (СРП), пропуская различных концентраций HLA-A2/Pp65 комплексов над CM5 чип прыгните МАБ. Эта цифра была изменена с Ouisse и др. (2017) 9.

Количество КСДОР Количество PE + APC + клеток после обогащения Количество исключенных клеток (BV421 +) Количество отсортированных единичных клеток Количество анализируемых скважин Количество скважин с HC и LC связанные (% восстановления) Количество произведенных mAbs Количество конкретных mAbs
МАБ HLA-A2/Pp65 (PC1.02) 3 x 108 818 117 161 7 3 (43%) 3 1

Таблица 1: Анализ конкретных клеток B HLA-A2/Pp65.
Воздействие стратегии исключение неспецифических B клеток, урожайность амплификации генов Ig и МАБ производства от изолированных HLA-A2/Pp65 конкретные клетки B были измерены и оценены.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Предлагаемый протокол является мощный метод для генерации человека mAbs непосредственно от Ag конкретных B клетки, циркулирующие в крови. Она сочетает в себе три важных аспекта: (i) использование связанных Тетрамер магнитного обогащения, который позволяет ex vivo изоляции даже редкие Ag привязки B клеток; (ii) стробирования стратегия, использующая три тетрамера Ag (два актуальными и один) помечены с трех различных флуорохромов изолировать подачей cytometry, только клетки B выражая конкретных BCR для желаемого Ag; (iii) восстановление соответствующего cDNAs рекомбинантных МАБ по RT-PCR на уровне одной ячейки и выражение cDNAs в клетках человека.

Предыдущие исследования предложил, используя одну или две люминесцентные соответствующих антигенов на этикетке человеческих клеток B до сортировки и последующего производства mAbs от изолированных B клетки6,,78. Один анализ у пациентов с ревматоидным артритом и один в аутоиммунных мыши модели, имеют связанные не значения флуоресцентные антигена характеризуют клетки аутореактивная B и определить их частоты10,11. Насколько мы знаем, использование сочетания двух люминесцентных соответствующим антигеном тетрамера и одного не значения антигена Тетрамер не был описан ранее для обогащения конкретных клеток B до их использования для производства полностью человека mAbs. Этот оптимизированный метод позволяет полностью человека дискриминационных mAbs должны быть получены в качестве лишь через месяц и может быть выполнена успешно, даже при начиная с репертуара клетки B наивными. Таким образом она имеет ни один из основных недостатков Фаговые дисплея, клетки человека B увековечении, или другие ранее описанные процедуры восстановления на основе молекулярной биологии МАБ.

Эту ячейку Сортировка стратегия приводит к высокой доходности восстановление Ag конкретного человека mAbs. Парами сегментов тяжелой и легкой цепи от одного изолированных клеток B усиливаются с успех ставке около 50%. Лёгкие цепи сегменты почти всегда усиливаются, но это не дело для сегментов тяжелые цепи. RT-PCR эффективность во многом зависит от соблюдения следующее: я) отсортированный одной клетки B должны быть заморожены так быстро, как можно скорее; II) Добавление 30 единиц битор РНКазы и минимизации времени между принимая клетки B из морозильника и запуск реакции RT; III) оттаивания все грунты на льду; IV) никогда не замораживания/оттаивания грунты более чем в три раза; v) чулок Праймеры для максимум на один год.

Что касается эффективности производства соответствующего рекомбинантных mAbs с желаемой специфичности это около 30-40% в случае конкретных mAbs реализует. Эти частности mAbs должны признать пептида и MHC молекулы, которая довольно требовательна, и ранее мы показали, что урожайность восстановления конкретных mAbs, направленных против обычных антигены превосходит, до 100% для Β-галактозидазы антиген9. Необходимо подчеркнуть, что выбор соответствующей Ag для не значения Тетрамер имеет важное значение для увеличения специфичности mAbs производства.

Сродство МАБ анти HLA-A2/Pp65 (PC1.02), описанных в настоящей статье является относительно низкой, около 7 x 10-6 М, похож на близость TCR. Ожидалось, что этот результат, как изоляция клетки B была выполнена от наивного доноров. Большинство клеток B Тетрамер+ были IgM+IgG-, что снижает вероятность получения хороших Ag связующие. Тем не менее этот метод может также сделать возможным сортировки из cross-reactive памяти B клетки против желаемого Ag от наивного доноров, из-за иммунологические прошлое лиц12. Кроме того, этот метод легко применимы к прививку или зараженных пациентов или прививки гуманизированные животных, как описано в 9, где в естественных условиях созревания близость может увеличить близость результате mAbs с около 1 x 10-9 м. различных также были описаны процедуры для улучшения близость mAbs в пробирке, в частности посредством воспроизведения соматических Гипермутационный в клетках, выражая антитела (обзор в 13).

В заключение мы предлагаем универсальные стратегии для производства весьма дискриминационный mAbs, который может использоваться в различных типах ситуацию от наивного индивидуальным донором прививку или пациент страдает от аутоиммунных заболеваний. Полностью человека mAbs, порожденных таким образом против желаемого epitope может быть полезным как для фундаментальных исследований и иммунотерапии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим цитометрии объекта «CytoCell» (SFR Santé, Biogenouest, Нант) за экспертной технической помощи. Мы благодарим также всех сотрудников производство рекомбинантных белков (P2R) и влияние платформ (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Нант) за их техническую поддержку. Мы благодарим Emmanuel Scotet и Ричард Breathnach за конструктивные комментарии по рукописи. Эта работа была финансово поддержана IHU-Сести проект, финансируемый программой «Investissements будущее» французское правительство, управляемых по французского национального исследования агентства (НРА) (АНР-10-IBHU-005). IHU-Сести проект поддерживается также Métropole Нант и округов Луары. Эта работа была реализована в рамках программы LabEX IGO, поддержке национального исследовательского агентства через инвестиций будущего программы НРУ-11-LABX-0016-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK 293A cell line Thermo Fisher scientific R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by life technologies 21969-035 (+) 4,5g/L D-Glucose
0,11g/L Sodium Pyruvate
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X) Gibco by life technologies 31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA) PAA K45-001
Nutridoma-SP Roche 11011375001 100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 Ambion AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 Invitrogen by Life Technologies 15575-020
Fetal Bovine serum (FBS) Dominique Dutscher S1810-500
Ficoll - lymphocytes separation medium EuroBio CMSMSL01-01 density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate Invitrogen by Life Technologies S21388 premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate Invitrogen by thermoFisher scientific S32362 1mg/ml
2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin Biolegend 405225 conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor Miltenyi Biotec 130-042-302/130-090-976
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
CD3 BV510 BD horizon BD Pharmingen / BD Biosciences 563109 Used dilution 1:20
CD19 FITC BD Pharmingen / BD Biosciences 345788 Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 561116 Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 338440 Used dilution 1:50
7AAD BD Pharmingen / BD Biosciences 51-68981E (559925) Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer BD Biosciences
8-strip PCR tubes Axygen 321-10-061
Racks for 96 microtubes Dominique Dutscher 45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) Invitrogen by thermoFisher scientific 10777-019 qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free Gibco 10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer New England BioLabs S1316S 5.0 A260unit
Random hexamers Invitrogen by thermoFisher scientific N8080127 qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen by thermoFisher scientific 18080-044 qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase Promega M7805
dNTP Set, Molecular biology grade Thermo Scientific R0182 4*100umol
5LVH1 Eurofins ACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH3 Eurofins AAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVL4_6 Eurofins CCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH5 Eurofins CAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
3HuIgG_const_anti Eurofins TCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1 Eurofins GGGAATTCTCACA
GGAGACGA		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2 Eurofins ATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk3 Eurofins CTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk4 Eurofins ATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566 Eurofins GTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5 Eurofins GCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'LVl1 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl2 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl3 Eurofins GCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5 Eurofins GGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl6 Eurofins GTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl7 Eurofins GGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5LVl8 Eurofins GAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
3'Cl Eurofins CACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3 Eurofins CTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5 Eurofins CTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6 Eurofins CTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8 Eurofins CTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
3'XhoICl Eurofins CTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense Eurofins GCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		 Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade MP Bio AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate Macherey Nagel 743.100.100
Enzyme Age I HF New England Biolabs R3552L 20000U/ml
Enzyme SalI HF New England Biolabs R3138L 20000U/ml
Enzyme Xho I New England Biolabs R0146L 20000U/ml
Enzyme BSIWI New England Biolabs R0553L 10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase Invitrogen by thermoFisher scientific 15224.017 100U (1U/ul)
2X YT medium Sigma Aldrich Y1003-500ML
Ampicillin Sigma Aldrich 10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification Macherey Nagel 740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent PolyPlus 101-40
Flat bottom96-well plate Falcon 353072
V-bottom 96-well plate Nunc/Thermofisher 055142
Nunc easy 175 cm2 flasks Nunc/Thermofisher 12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer eBiosciences 00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates Nunc/Thermofisher 44-2404-21 high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) BD Pharmingen / BD Biosciences 55788
TMB substrate BD Biosciences 555214
Streptavidin Sigma S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column GE Healthcare 17-0402-01
ÄKTA FPLC GE Healthcare 18190026
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System BioRad 7880003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
  7. Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532 (2011).
  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
  9. Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3 (2017).
  10. Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
  11. Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
  12. Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
  13. Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).

Tags

Иммунология выпуск 132 иммунологии клеточная биология человеческие антитела клетки B Тетрамер проточной цитометрии одну ячейку антиген специфические магнитного обогащения

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes, Nantes, France

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

Поколение дискриминационных человеческих моноклональных антител от редких антиген специфические клетки, циркулирующие в крови
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devilder, M. C., Moyon, M.,… More

Devilder, M. C., Moyon, M., Saulquin, X., Gautreau-Rolland, L. Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood. J. Vis. Exp. (132), e56508, doi:10.3791/56508 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter