ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Biz insan kanında dolaşan nadir B hücreleri başlayarak insan antikorlar faiz, bir antijen için belirli üretim için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu doğal antikorlar nesil verimli ve hızlı ve elde edilen antikor arasında son derece ilgili antijenleri ayırt edebilirsiniz.
Abstract
Monoklonal antikor (mAbs) güçlü her iki temel araştırma ve Biyomedikal yararlı araçlardır. Antikor (örneğin, bir normal protein ve bunların mutasyona uğramış bir sürüm) son derece ilgili yapılar arasında ayırt etmek gerektiğinde yüksek olmalarından vazgeçilmezdir. Böyle discriminative mAbs üreten geçerli yolu, pahalı ve zaman alıcı olan birden fazla Ab üreten B hücrelerinin geniş tarama içerir. Biz burada tamamen insan mAbs B lenfositler dolaşan kan grubundan başlayan discriminative, nesil için hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem öneriyorum. Diğer tüm hücrelerin hazır periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) kullanarak karşı seçim ile kombine spesifik antijen bağlayıcı B hücre seçimini bu strateji özgünlük kaynaklanmaktadır. Belirli B hücreleri izole olduğunda, karşılık gelen mAb için kodlama cDNA (tamamlayıcı deoksiribonükleik asit) dizileri tek hücre ters transkripsiyon-Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) teknolojisini kullanan ve daha sonra insan ifade elde edilir hücreleri. Gibi az içinde 1 ay olarak, doğal olarak B hücre repertuar tarafından algılanan hemen hemen herhangi bir istenen antijen karşı son derece discriminative insan mAbs miligram üretmek mümkündür.
Introduction
Burada açıklanan yöntemi istenen antijen (Ag) karşı tamamen insan Monoklonal antikor (mAbs) hızlı ve çok yönlü üretimini sağlar. mAbs birçok temel araştırma uygulamaları içinde in vitro ve in vivotemel araç vardır: Örneğin Akış Sitometresi, Histoloji, western Blot, engelleme deneyleri. Ayrıca, mAbs daha fazla tıpta otoimmün hastalıklar, kanser, tedavisi için ve nakli ret1kontrol etmek için kullanılıyor. Örneğin, anti-CTLA-4 ve anti-PD-1 (ya da anti-PD-L1) mAbs son zamanlarda kanser tedavileri2bağışıklık denetim noktası inhibitörleri olarak kullanılmıştır.
İlk mAbs immünglobulin (Ig) tarafından üretildi-hybridomas salgılayan aşılı fare ya da sıçan dalak hücrelerinden elde. Ancak, fare ya da sıçan mAbs karşı güçlü bağışıklık yanıtı hızlı onların temizlik ve aşırı duyarlılık reaksiyonları3olası indüksiyon nedeniyle insanlarda terapötik kullanımları engellemektedir. Bu sorunu çözmek için hayvansal protein dizileri mAbs kısmen sözde chimeric fare-insan veya insanlaşmış antikorlar oluşturmak için insan olanlar tarafından değiştirilmiş. Ancak, bu strateji yalnızca kısmen önemli ölçüde maliyet ve zaman ölçekli üretim artırırken immünojenisite, azaltır. İnsan mAbs doğrudan insan B hücreleri oluşturmak için daha iyi bir çözümdür ve bunun için çeşitli stratejiler mevcuttur. Onlardan biri fajının veya Maya display kullanımıdır. Bu rastgele insan IG ağır Kombinatorik kitaplığından değişken etki alanları görüntüleme içerir ve ışık phages veya Mayalar ve ilgi spesifik antijen kullanarak bir seçim adım taşıyan zincirleri. Bu stratejinin büyük bir dezavantaj ağır ve hafif zincirleri rastgele ilişkili, çok büyük bir artış için oluşturulan antikorlar çeşitlilik içinde lider olmasıdır. Elde edilen antikor üzerinden belirli bir Ag karşı doğal bir bağışıklık yanıtı ortaya çıkacak karşılık gelmesi olası değildir. Ayrıca, insan protein katlanması ve translasyonel modifikasyonlar sistematik olarak prokaryot ve Mayalar hatta çoğaltılamaz değil. İkinci bir insan mAb üretim yöntem doğal insan B hücreleri, Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu veya anti-apoptotik faktörler BCL-6 ve BCL-XL4ifade tarafından əbadoləşdirmək olduğunu. Ancak, bu yöntem yalnızca bellek B hücreleri için geçerlidir ve az (varsa) mAb klonlar istenen antijenik özgüllük ile tanımlamak için çok sayıda mAb üreten ölümsüzleştirdi B hücreleri ile taranması gerektiren verimli değildir. Böylece pahalı ve zaman alıcı bir yöntemdir.
Yeni bir protokol son zamanlarda insan mAbs izole tek B hücreleri5üretiminin tarif edilmiştir. Bunun üzerine bir en iyi duruma getirilmiş tek hücreli ters transkripsiyon-Polimeraz zincir tepkimesi (RT-PCR) amplifikasyon her iki ağır - ve ışık-segmentleri bir tek sıralanmış B hücreden kodlama zinciri için dayanır. Bu böylece tamamen insan mAb yeniden inşası izin bir ökaryotik ifade sisteminde, klonlama ve ifade Bu kesimler tarafından takip ediyor. Bu iletişim kuralı başarıyla B hücreleri aşı bağışçılardan başlayarak kullanılmıştır. Hücreleri birkaç hafta sonra aşı B hücre istenen Ag karşı yönetmen yüksek frekansları almak ve böylece6eleme için gereken süreyi sınırlamak için hasat edildi. Tamamen insan diğer mAbs aynı zamanda enfekte HIV+ (insan immün yetmezlik virüsü) hastalar7 ve melanom hastalarda8üretilmektedir. Bu gelişmeler rağmen bu hala bir işlemdir Ag özgü B hücreleri kendi bellek fenotip veya frekans bağımsız yalıtım sağlayan kullanılabilir.
Prosedür tanımlamak burada verimli ex vivo yalıtım insan dolaşımdaki B hücreleri tamamen insan antijen spesifik mAbs yüksek verim ve düşük tarama süresi ile üretim ardından BCR olmalarından temel yol açar. Yöntem bellek B hücreleri veya antikor salgılayan B hücreleri bağışıklık yanıtının sonra indüklenen için sınırlı değildir, ama insan naif B hücre repertuar için de uygulanabilir. O bile Ag özgü B hücreleri çok düşük frekanslarda mevcut başlayarak inşaat verimlilik iyi bir göstergesidir. Yönteminin prensibi aşağıdaki gibidir: periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) iki tetramers faiz antijen sunan lekeli, her bir farklı fluorochrome ile (örneğin, Phycoerythrin (PE) ve Allophycocyanin (APC)), etiketli ve üçüncü bir tetramer yakından ilgili bir antijen sunan bir üçüncü fluorochrome ile (örneğin, parlak mor 421 (BV421)) Birleşik. Antijen bağlayıcı hücreleri için zenginleştirmek için hücreleri daha sonra anti-PE ile kaplı boncuk ile inkübe ve anti-APC Abs ve hücre ayrılık sütunlarda sıralanabilir. PE+ APC+ hücre kesir, mAbs farklı PBMC hücre türlerine B hücreleri tanımlanmasına izin özgü çeşitli lekeli ve tabi Akış Sitometresi hücre sıralama için seçilir. PE+ ve APC+, parlak mor-, ama olan B hücreleri izole edilmiştir. Bu adımı karşı olan B hücreleri olmayan veya tetramerized antijen bind yapmak ama ya PE veya APC (Bu hücreler PE+ APC- veya PE- +APC olacak) veya tetramers (Bunlar kullanılan antijen parçası bağlamak hücreleri seçer hücre-ecek var olmak BV421+). B hücreleri değil son derece ilgi epitope için belirli karşı bu adımda belirlenmişse de (Bu hücreler-ecek da var olmak BV421+). Bu nedenle, bu yöntem B-hücre reseptörleri (BCRs) iki çok yakından ilgili antijenleri arasında ayrımcılık mümkün ifade son derece belirli B hücreleri arındırmak. Tek belirli B hücreleri tüplerde toplanır ve onların PCR güçlendirilmiş IG cDNAs (tamamlayıcı deoksiribonükleik asit) klonlanmış ve tarafından salgılanan IgG mAbs insan hücre çizgilerle ifade.
Kavramının bir kanıtı olarak, bu çalışmada bir peptid ben MHC kompleksi sınıf tarafından sunulan tanıyan insan mAbs, verimli nesil açıklar (MHC-ben) molekül ve bu peptid ve aynı yüklü diğer peptidler arasında ayırt edebilirsiniz MHC-ben gen. Bu AG karmaşıklık düzeyi önemli olmakla birlikte, bu yöntem, (i) Ag özel mAbs yüksek verimli kurtarma sağlar; (ii) üretim mAbs iki yapısal olarak yakın Ags arasında ayırımcılık yapması mümkün. Bu yaklaşım herhangi bir iletişim kuralı yapılmaksızın aşı veya enfekte hastalar için genişletilmiş ve ayrıca zaten başarıyla bir insanlaşmış sıçan sistem9' uygulamaya konmuştur. Böylece, bu çalışmada temel araştırma ve immünoterapi kullanılabilir tamamen insan mAbs oluşturmak için çok yönlü ve verimli bir yaklaşım açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm insan periferik kan örnekleri anonim yetişkin bağışçılardan uygun olarak yerel Etik Komitesi (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, yordam Yayındayız NTS-2016-08) aydınlatılmış onam sonra elde edilmiştir.
1. insan periferik kan mononükleer hücre izolasyon
Not: malzeme başlayan toplam insan periferik kan ya da cytapheresis örnekleri olabilir. Örnekleri 8 h büyük olmamalıdır ve antikoagülanlar (örneğin, heparin) ile desteklenmiştir.
- Kan ile 2 cilt (İnsan periferik kan) veya RPMI (Roswell Park Memorial Enstitüsü) orta 5 cilt (cytapheresis örnek) oranında seyreltin.
- Dikkatle seyreltilmiş hücre süspansiyon üzerine 50 mL konik tüp yoğunluk gradient ortamda 15 mL 35 mL katman. Çok sayıda tüpler seyreltilmiş kan dağıtmak için gerekli yapmak. Sallanan-kova Open End oda sıcaklığında 25 min için 1.290 x g de kapalı tut ile santrifüj kapasitesi.
- Dikkatle yoğunluk gradient orta ve plazma katmanın arasında arayüz mononükleer hücre katmanında Aspire edin ve hücreleri yeni bir 50 mL konik tüp aktarın.
- Tüp RPMI orta ile doldurmak, mix ve oda sıcaklığında 10 dakika için 1.290 x g de santrifüj kapasitesi. Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın.
- Hücre Pelet RPMI orta ve santrifüj 200 x g trombosit kaldırmak 10 min için de 20 ml resuspend. Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın. Bir kez bu adımı yineleyin.
- RPMI orta % 10 ile hücre Pelet resuspend Fetal sığır Serum (FBS).
Not: doğrudan tetramer etiketleme için devam etmek ya da bir konsantrasyon 107 hücre/mL, gecede 4 ° C'de hücreler tutmak.
2. tetramer ilişkili manyetik zenginleştirme Ag özgü B hücre
- Her iki PE ekleyerek AG-tetramers hazırlamak veya APC etiketli premium sınıf streptavidin veya BV421 etiketli streptavidin molar oranı 1:4 biotinylated antijen monomer için de. Bir aliquot her 10 min oda sıcaklığında ekleyerek üç ayrı bölümlerinde streptavidin eşlenik uygun miktarda ekleyin.
- 15 mL konik tüpler (3 x 108 tüp başına) hücrelerde dağıtmak ve 5 min için 460 x g, santrifüj kapasitesi.
Not: Aşağıdaki protokol için bir tüp var. - PBS (fosfat tamponlu tuz) 200 µL % 2 ile hücre Pelet resuspend FBS. PE, APC ve tetramers, her bir son konsantrasyonu 10 µg/ml BV421 Birleşik ekleyin. Mix iyi ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
- Buz gibi hücre ayrılık arabelleği (SB) % 0.5 BSA (sığır Serum albümin) ve EDTA (Ethylenediaminetetraacetic asit) ile PBS kullanarak hazırlamak 2 mM.
- SB. Pelet hücre 10 mL aralıklarla 460 x g 5 min için de ekleyebilirsiniz.
- Buz gibi SB. ekle 50 µL anti-APC manyetik lastikteki anti-PE ve 50 µL olan 500 µL hücrelerde resuspend.
- Mix iyi ve 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya
- Adım 2.5 iki kez tekrarlayın.
- Dikkatle süpernatant ortadan andresuspend 2 x 108 hücre/mL buz soğuk SB bir konsantrasyon, hücre Pelet.
- Bir mıknatıs SB 3 mL ile üzerinde konumlandırılmış büyük bir manyetik sütun equilibrate.
- Hücre süspansiyon 2,9 dengelenmiş sütunun üst üzerine aktarmak ve tamamen drenaj sağlar. : Kritik sütun topaklanma önlemek için hücreleri bir 70 µm naylon ağ geçiş adım.
- Hangi hücrelerin buz soğuk SB 3 mL ile bulunan tüp durulama ve arabellek sütun (durumunda filtrasyon, durulama 70 µm naylon mesh) doğrudan üzerine aktarın.
- Arabellek sütuna tamamen süzülmüş, buz soğuk SB başka bir 3 mL için sütun ekleyin.
- 2.13 başka bir 3 mL yıkama için yineleyin.
- Sütun üzerinde 15 mL konik toplama tüp mıknatıs ve yer çıkarın.
- Buz soğuk SB sütunun üst üzerine 5 mL ekleyin ve hemen pistonu kullanarak sütun hücreleri temizle. Bir kez bu adımı yineleyin.
- 460 x g 5 min için de kendine hakim hücre (zenginleştirilmiş ilgili tetramer pozitif hücre kesir) santrifüj kapasitesi ve ek antikor boyama için devam edin.
Not: Havuz, hücreleri uygunsa tüm tüpler toplanan.
3. Ag özgü insan B hücreleri ve hücre sıralama boyama
- Hücre Pelet CD3 karşı anti-insan antikorların bir kokteyl ile resuspend (son seyreltme: 1:20), CD19 (1:20) CD14 (1:50), CD16 (1:50) ve 7AAD (1: 1000) PBS 100 µL % 2 ile son bir hacim içinde FBS. 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
- Hücreleri, 460 x g, santrifüj 5 min için PBS 10 mL ekleyin ve süpernatant ortadan kaldırmak. Bir kez bu adımı yineleyin. Hücre Pelet PBS, filtre üzerine 70 µm naylon mesh 200 µL resuspend.
- Belirli B hücreleri tek hücre düzeyinde bir hücre sıralayıcısı sitometresi 100 µm meme ve 20 psi basınç ile üzerinde 1.000 olaylar/s9aşmadan sıralamak için devam edin.
Not: kullanılan gating strateji şekil 1'. de gösterilen Hücreleri ilk geçişli CD14 üzerinde-CD16-7AAD- hücreleri monosit, NK ve ölü hücreleri ( şekil 1' de gösterilen değil) dışlamak için. O zaman CD19+ B hücre seçildi Çift Kişilik lekeli hücrelerdeyse çoğunluğuna önce PE ve APC ilgili Ag-tetramers tarafından. Spesifik olmayan B hücreleri (alakasız Ag-tetramer tarafından günahı) BV421 negatif hücreleri üzerinde perdeleme tarafından dışlandı. - Daha önce 1 x PBS 10 µL ve RNAse inhibitörü ile 10 birim dolu ve bir raf 96 mikrotüpler için yerleştirilen 8-şerit PCR tüpleri içine tek B hücreleri toplamak. Hemen PCR tüpleri-80 ° C'de dondurmak
Not: sitometresi araç üzerinde seçilen sıralama maskeleri verim maske vardır: 0, saflık maskesi: 32 ve faz maskesi: 0. bu tek hücreli depozito bir 96 - veya 384-da PCR plakasına gerekirse ayarlanmış olabilir. Tek B hücreleri kısa zamanda dondurulmuş olması ve-80 ° C'de birkaç hafta için gerekirse bırakılabilir.
4. tek hücre RT-PCR
- Hücreleri doğrudan PCR şeritler kuru bir banyoda 5 min için 70 ° C'de Donmuş numuneler Isıtma tarafından parçalayıcı.
- Buz ve transkripsiyon (RT) 2 x 1 mM dNTP, 25 µg/mL oligod(T) astar, 5 µM rastgele hexamers, 20 birim RNAse inhibitörü ve transkriptaz 400 Ünite içeren ana mix tampon tüp başına 10 µL ekleyerek tersine çevirmek için devam etmek için şeritler aktarın.
Not: hücre çözdürme sonra RT hızlı bir şekilde RNA yıkımı önlemek için gerçekleştirilmesi gerekir. - 25 ° c melez, sonra 1s 50 ° c için kuluçkaya ve 95 ° c reaksiyonu durdurmak 3 min için bir kuluçka ile bitirmek rasgele hexamers izin vermek 5 min için kuluçkaya.
- İç içe geçmiş PCR güçlendirme için her değişken ağır (vH) ve kappa (vLκ) veya lambda hafif zincirleri (vLλ) için kodlama bölgede iki tur ile devam edin.
Not: Alternatif olarak, RT örnekleri olabilir-20 ° C'de donmuş ve bir hafta boyunca devam etti.- CDNA 1.5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, DNA polimeraz 2.5 birimleri ve 200 içeren bir 40 µL son birim için 3 µL PCR ilk turu için eklemek nM dış astar (bkz: Şekil 2 ve Tablo malzemeler için astar serileri).
Not: Kompozisyon dış astar karıştırın. Ağır zincir amplifikasyon için: 4 ileri astar (5' SVH mix) ve 2 ters astar (3' CµCγ mix). Işık kappa zinciri amplifikasyon için astar 3 ileri (5' LV | mix) ve 1 ters astar (3' Cκ543-566). Işık lambda zinciri amplifikasyon için astar (5' LVl mix) 7 ileri ve astar (3' Cl) 1 ters.
Not: Astar tarafından Tiller vd. tüm ağır ve hafif zincir aile genleri5amplifikasyon için tasarlanmış. - Bisiklete binme aşağıdaki koşullar geçerlidir: 94 ° C 4 dk, 30 40 döngüsü tarafından takip 94 ° c, 30 s s VH ve VLκ VLλ için (60 ° C) ve 55 58 ° C'de s son bir uzama ile 72 ° C'de adım 7 dk 72 ° C'de.
- İkinci yuvarlak PCR için ilk amplifikasyon ürünü 3 µL 40 son bir hacim için kullanın µL 1.5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, DNA polimeraz 2.5 birimleri ve 200 içeren iç astar ifadeye klonlama için restriksiyon enzimi siteleri içeren nM (astar dizileri için bkz: Şekil 2 ve Malzemeler tablo ) vektörel çizimler.
Not: Kompozisyon iç astar karıştırın. Ağır zincir amplifikasyon için: 9 ileriye astar (5' AgeIVH mix) ve 3 geriye doğru astar (3' SalIJH mix). Işık kappa zinciri amplifikasyon için 9 astar ileri (5' AgeIV | mix) ve 3 ters astar (3' BsiWIJκ mix). Işık lambda zinciri amplifikasyon için astar (5' AgeIVl mix) 6 ileri ve astar (3' XhoICl) 1 ters.
Not: Astar tarafından Tiller vd., tüm ağır ve hafif zincir aile genleri5amplifikasyon için tasarlanmış. - Bisiklete binme aşağıdaki koşullar geçerlidir: 94 ° C 4 dk, 30 40 döngüsü tarafından takip 94° c, 30 s s VH ve LCκ LCλ için (60 ° C) ve 45 58 ° C'de s son bir uzama ile 72 ° C'de adım 7 dk 72 ° C'de.
- CDNA 1.5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, DNA polimeraz 2.5 birimleri ve 200 içeren bir 40 µL son birim için 3 µL PCR ilk turu için eklemek nM dış astar (bkz: Şekil 2 ve Tablo malzemeler için astar serileri).
- PCR ürünlerinin vH, vLκ ve vLλ (500 bp ürünler değişken ağır zincir kodlama segmentler için) ve bir 350 bp ürün segmentleri kodlama değişken hafif zinciri için % 1.5 özel jel üzerinde geçirme 5 μL tarafından olumlu wells tanımlayın.
- PCR ürünlerinin arıtma için tasarlanmış Ultrafiltrasyon membranları kullanarak pozitif kuyulardan kalan kalan 35 µL PCR ürün arındırmak.
- H2O. 60 µL PCR ürünleri elute
5. ifade klonlama
-
Ekler hazırlamak
Not: 60 µL saflaştırılmış her PCR sindirmek son hacmi 100 µL uygun restriksiyon enzimi arabellek içeren ürün.- VH PCR ürünleri, AgeI 50 birim ve SalI 50 birim eklemek ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
- VLλ PCR ürünleri, AgeI 50 birim ve XhoI 50 birim eklemek ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
- VLκ PCR ürünlerinin, AgeI 50 birim eklemek ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya 96 PCR membranlar kullanarak özetleri arındırmak ve H2o Digest 60 µL ile BsiWI restriksiyon enzimi arabelleği 100 µL son hacmi 60 µL eluate elute, BsiWI 50 birim eklemek ve 55 ° C'de 1 h için kuluçkaya
- Isıtma için 15 dk 80 ° C'de tarafından enzimler devre dışı bırakabilirsiniz.
-
Vektörel çizimler ifade hazırlık
Not: vH PCR ürünleri sürekli ağır zincir Igg1 Cγ1 içeren bir ifade vektör içinde (HCγ1) klonlanır. vLκ PCR ürünleri sürekli hafif zincir Cκ içeren bir ifade vektör içinde (LCκ) klonlanır. vLλ PCR ürünleri sürekli hafif zincir Cλ içeren bir ifade vektör içinde (LCλ) klonlanır.- Aşağıdaki sindirim gerçekleştirin:
- Mix 1 µg ifade HCγ1 AgeI 10 ünite ve toplam hacmi 20 µL üretici tarafından önerilen kısıtlama arabelleği SalI endonucleases 10 ünite ile vektör ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
- İfade vektör LCκ Mix 1 µg AgeI restriksiyon enzimi 20 µL kısıtlama arabelleğinin toplam hacmi 10 ünite ile üretici tarafından önerilen ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya 10 ünite BsiWI restriksiyon enzimi ekleyin ve 1 h 55 ° C'de için kuluçkaya
- İfade vektör LCλ Mix 1 µg AgeI 10 ünite ve toplam hacmi 20 µL kısıtlama arabelleği XhoI endonucleases 10 ünite ile üretici tarafından önerilen ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
- Her sindirim karışımı enzimleri devre dışı bırakabilirsiniz 10 dk 65 ° C'de ısı.
- Sindirilir PCR ürünü 5 µL 2 µL ile birleştirmesini gerçekleştirmek (100 ng) 1 DNA ligaz arabellek x 20 µL tarafından kuluçka gecede 4 ° C'de 1 adet T4 DNA-ligaz ile toplam hacmine karşılık gelen doğrusallaştırılmış ifade vektör
Not: Alternatif olarak, 4 ° C'de 3 h için ligasyonu gerçekleştirilir
- Aşağıdaki sindirim gerçekleştirin:
-
Klonlama
- Electroporate 1 µL ev yapımı electrocompetent TOP10 E. coli (Moleküler Biyoloji, Bölüm 1.8.4-1.8.8 geçerli protokoller) 45 µL içine 20 µL ligasyonu karışımı. 2 X YT orta 500 µL eklenir ve bir su banyosunda 30 dakika süreyle 37 ° C'de 2 x YT Ampisilin plakaları dönüştürülmüş yayılan bakteri kuluçkaya. Gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- Her dönüşüm için PCR tarafından sekiz kolonileri ekran.
- Bir reaksiyon Premiks aşağıdaki gibi buza ayarla: 45 µL PCR tampon, 12 µL MgCl2 (25 mM), dNTPs (üzerinden bir hisse senedi içeren 10 mM her) 4 µL, 10 µL ileri astar (hisse senedi 10 µM) vektör sıra (astar Ab vec anlamda) hybridizing x 5 ve geriye doğru astar (hisse senedi 10 µM) sürekli ağır veya hafif zincir bölge hedefleme 10 µL ( Tablo reçetesi astar dizileri için bakınız). H2O. ile 200 µL son hacmi için makyaj Daha sonra 4 µL DNA polimeraz enziminin (5 U/µL) ekleyin.
- Reaksiyon Premiks 8-şerit PCR tüp buz üzerinde başına 25 µL dağıtın.
- Bireysel koloniler almak için steril bir kürdan kullanın. Kürdan Çoğalt bir tabak oluşturur ve sonra bir PCR reaksiyon tüp içine daldırma için 2 x TY Ampisilin plaka üzerine çizgi.
- Bisiklete binme aşağıdaki koşullarda PCR tarama gerçekleştirmek: 94 ° C için 10 min, 30 25 döngüsü tarafından takip 94 ° c, 30 s s 55 ° c ile 50 72 ° C'de s
- Pozitif bakteriler tarafından geçirme 5 µL PCR ürünlerinin % 1.5 özel jel üzerinde tanımlayın.
Not: Pozitif kolonileri bir PCR ürünü yaklaşık 850 vermek ağır zincir vektör ve 600 için bp bp hafif zincir vektör için.
- Dört olumlu kolonileri Çoğalt plaka 2 mL LB orta aşılamak ve gecede 37 ° C'de 200 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya.
- Plazmid sıvı kültürleri bir plazmid arıtma kit kullanarak üreticisi tarafından belirtildiği şekilde ayıklayın.
- Değişken etki alanı Sanger tarafından doğru yerleştirilmesi doğrulayın Plasmid'ler ile Ab vec anlamda astar, sıralama.
Not: Plazmid (HC ve karşılık gelen LC kodlama) doğru eklemek ile 293A hücrelere salgılanması için cotransfected olacaksın. Küçük ölçekli üretilen mAbs özgüllük tarafından ELISA denetlesinler. Sonra büyük ölçekli üretim varsa gerçekleştirilir.
6. mAbs imalatı
-
Özgüllük kontrol etmek için küçük ölçekli üretim
- Transfection, tohum 15,000 insan embriyonik böbrek 293A önceki gün (HEK 293A) hücreleri 200 µL olan Dulbecco'nın modifiye kartal orta (% 10 ile desteklenmiş DMEM) içinde FBS 96-şey plakaları bir kuyu başına. Gecede 37 ° C'de CO2 kuluçka (%5 CO2) kuluçkaya
- DMEM orta % 10 içeren hücrelerde 293A cotransfect FBS doğrusal polyethylenimine türev transfection reaktifi kullanarak.
Not: transfection triplicates içinde gerçekleştirin. Bir düz dipli 96-şey plaka bir şey için aşağıdaki iletişim kuralıdır.- DNA transfection reaktif 0.5 µL 150 mM NaCl 10 µL sulandırmak. VH 0,125 µg ve vL ifade vektörlerin 0,125 µg 150 mM NaCl 10 µL oranında seyreltin. Girdap her seyreltme için 10 s.
- 10 µL DNA transfection reaktif seyreltilmiş 10 µL DNA çözüm ekleyin. Girdap 15 s ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. 20 µL mix drop-wise 293A hücreleri üzerinde ve yavaşça plaka dönen tarafından karıştırın.
- Orta 16 h serum-Alerjik orta 5 gün boyunca transfection ve kültür hücreleri sonra değiştirin.
Not: serum-Alerjik orta serum IGS üretilen antikorlar kirletici önlemek için kullanın. - Hücreleri ve enkaz Santrifüjü 460 x g 5 min için de tarafından ortadan kaldırmak.
- Aspirasyon ile çok kanallı pipet tarafından supernatants hasat ve V-alt 96-şey plaka aktarabilirsiniz.
- Gecede 4 ° C'de Sulandırılan ELISA/ELISPOT kaplama kuyu başına 100 µL içinde kat ilgili Ag 1 x 96-Peki ELISA tabak 2 µg/mL nihai bir konsantrasyon, tampon. 9örneklere bakın.
- Blok wells ile % 10 FBS DMEM orta 37 ° C'de 2 h için
- Supernatants transfected 293A hücre 50 µL 6.1.5 adımından ekleyin ve RT. 2 h için kuluçkaya
- Horseradish peroksidaz (HRP) enzim 1 µg/mL, 100 µL IgG Ab Birleşik bir anti-insan ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. 50 µL chromogenic substrat (TMB) ekleyin ve 20 dk için kuluçkaya.
- 450 de optik yoğunlukları okumak nm bir Spektrofotometre üzerinde.
Not: ELISA tahlil tarafından ortaya belirli mAbs daha büyük ölçekte üretilmektedir ve protein saf insan IgG için ilgi gösteren bir sütun.
-
Büyük ölçekli üretim ve belirli mAbs arıtma
- Transfection, tohum 6 x 106 insan embriyonik böbrek 293A önceki gün (HEK 293A) hücreleri 25 mL % 10 ile desteklenmiş DMEM içeren 175 cm2 şişe içine FBS. Gecede 37 ° C'de CO2 kuluçka (%5 CO2) kuluçkaya
Not: Hücreleri transfected zaman % 70 birleşmesi olmalıdır. - DMEM orta % 10 içeren hücrelerde 293A cotransfect FBS doğrusal polyethylenimine türev transfection reaktifi kullanarak.
- DNA transfection reaktif 50 µL 150 mM NaCl 450 µL sulandırmak. VH 10 µg ve vL ifade vektörlerin 10 µg 150 mM NaCl 500 µL oranında seyreltin. Girdap 10 s her seyreltme.
- Seyreltilmiş DNA transfection reaktif DNA ekleyin. Girdap 15 s ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. 1 mL karışımı drop-wise hücrelere ve yavaşça şişeye dönen tarafından karıştırın.
- Orta 16 h serum-Alerjik orta 5 gün boyunca transfection ve kültür hücreleri sonra değiştirin.
- Hasat orta tarafından 25 mL pipet ile alıyorum.
- Hücreleri ve enkaz Santrifüjü 460 x g 5 min için de tarafından ortadan kaldırmak.
- Protein A 4 ° C'de bir hızlı protein sıvı Kromatografi (FPLC) sistemde ile kaplı bir 1 mL sütun kullanarak antikorlar arındırmak
- Protein sepharose sütun 20 mM fosfat tampon (pH 7) ile equilibrate.
- Hücre kültür ortamından 6.2.5 1.22 µm filtre sonra 0,45 µm filtre kullanarak filtre.
- Sütuna filtre uygulanmış orta yük.
- 20 mM fosfat tampon (pH 7) yıkama ve 0.1 M sitrat arabellek (pH 3.5) ile elute.
- 280, optik yoğunlukları okumak nm Absorpsiyon Spektrofotometre ve hemen protein içeren kesirler 1 M Tris arabelleği (pH 9) ile nötralize.
- Gecede 4 ° C'de karşı PBS tampon (pH 7,4) kesme 3.5 K Moleküler ağırlığı ile bir kaset içinde arıtılmış Ab diyaliz.
- 0.2 µm filtrasyon ve denetim saflık olarak üretici tarafından belirtilen boyut-dışlama Kromatografi tarafından sterilize.
- Transfection, tohum 6 x 106 insan embriyonik böbrek 293A önceki gün (HEK 293A) hücreleri 25 mL % 10 ile desteklenmiş DMEM içeren 175 cm2 şişe içine FBS. Gecede 37 ° C'de CO2 kuluçka (%5 CO2) kuluçkaya
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PBMC bu proje hediye peptid Pp65495 tanıyan insan mAbs, nesil sağlıklı bağışçılardan başlayan (Pp65, insan Sitomegalovirüs üzerinden) sunulan MHC kompleksi sınıf tarafından ben (MHC-ben) molekül HLA - A * 0201 () HLA-A2). Bu mAbs bu karmaşık ve aynı MHC yüklenen diğer peptidler temsil eden konut projeleri arasında ayırt edebilirsiniz-ben molekül.
PBMC HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC ve yukarıdaki protokolünde açıklandığı gibi HLA-A2/MelA2-BV421 tetramers ile lekeli. Sonra immunomagnetic hücre zenginleştirme PE ve APC tetramer pozitif hücrelerinin eluted hücreleri ile ek mAbs lekeli. Akış Sitometresi hücre sıralayıcıda manyetik olarak zenginleştirilmiş hücreleri ilk uygun CD14 geçişli-CD16-CD3-CD19+ gömlek (B hücreleri). HLA-A2/peptid kompleksi B hücreleri BCRs HLA-A2/Pp65 ve diğer arasında ayrımcılık mümkün ifade izole etmek için kullanılan gating strateji ilgili şekil 1 gösterir. Seçim ilgi B hücrelerinin HLA-A2/Pp65 PE+ ve HLA-A2/Pp65 APC+ PE+ veya APC+tek başına lekeli fluorochrome belirli B hücreleri dışlamak için çift-mutlak, perdeleme sonra gerçekleştirildi. Son olarak, çok özel B hücreleri HLA-A2/MelA2-BV421 negatif hücrelerdeyse çoğunluğuna tarafından tespit edilmiştir. Bu BCRs bir peptid ve HLA-A2-bağımlı bir şekilde, HLA-A2/Pp65, bağlamak mümkün bu B hücreleri ve bu B2 Mikroglobulin, biotin, HLA-A2, ya da hangi ayrımcılık yok karşı yönetmen arasında ayrımcılık ifade B hücreleri tanımlaması sağlar MHC bağlama oluk içinde peptidler arasında. Bu ikinci hücrelerin BV421 pozitif hücrelerinin olacak. Daha önce gösterilen ve daha da belgelenen Ag diğer türleri gibi bu dışlama strateji daha Ag9B hücrelerinin discriminative yeteneği artışlar nedeniyle önemlidir.
Bir kez tek belirli B hücreleri sıralanmış, cDNAs ağır ve hafif IG-zincirler için kodlama güçlendirilmiş RT-PCR tarafından. Ağır ve hafif zincir kesimleri kodlama çiftlerini test tek B hücreleri (Tablo 1) yaklaşık % 50 elde edilmiştir. Değişken etki alanı dizileri sonra ifadeye klonlanmış içeren ilgili sürekli etki alanı dizileri (ağır sürekli 1 ve ışık sürekli κ veya λ) Vektörler. İnsan embriyonik böbrek hücreleri (HEK, 293A hücreleri) ağır ve hafif zincir vektörleri ile cotransfected. Igg1 izotip salgılanan mAbs 293A hücre kültür supernatants 5 gün sonra transfection (bkz: şekil 3 küresel strateji tamamen insan mAbs üretim için) hasat edildi. Bu başarılı bir HLA-A2/Pp65 spesifik antikor ağır ve hafif zincir kesimleri (Tablo 1) kodlama çiftlerini verimli 3 tek B lenfosit hücreleri başlayan üretilen. ELISA deneyleri bu mAb her iki MHC ve peptid bağımlı HLA-A2/Pp65 kompleksleri (4A rakam) için onun bağlama için yapıldı ve mAb birkaç miligram kolayca daha fazla çözümleme için (örneğin, benzeşim analizleri, üretildi sergilenmez fonksiyonel deneyleri). Yüzey plasmon rezonans (SPR), tarafından belirlenen onun bağlama benzeşme yaklaşık 7 x 10-6 M (şekil 4B) yapıldı.
Böylece, i) ilgili Ag özgü B hücreleri algılanmasını sağlayan hassas ve verimli yöntemlerini bir arada bu makalede, hatta ne zaman sağlıklı bağış kan ve II) son derece discriminative insan mAbs üretimi çok düşük frekanslarda mevcut.
Resim 1: Algılama HLA-A2/Pp65 belirli B hücre insan PBMC.
3 x 108 PBMC lekeli HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC ve HLA-A2/MelA2-BV421 tetramers. Sonra immunomagnetic hücre zenginleştirme PE ve APC tetramer pozitif hücrelerinin eluted hücreleri ile ek mAbs lekeli. Akış Sitometresi hücre sıralayıcıda hücreleri ilk uygun singlet CD14 geçişli-CD16 (gösterilmez),- lenfosit CD19 üzerinde o zaman+CD3- hücreleri. O zaman, B hücreleri ile HLA-A2/Pp65-PE ve HLA-A2/Pp65-APC tetramers lekeli kapı. HLA-A2/MelA-BV421 tetramer HLA-A2/Pp65, peptid ve MHC-bağımlı bir şekilde tanımadı B hücreleri dışlamak için kullanıldı.
Şekil 2: amplifikasyon ve IG genler klonlama için strateji. Hafif ve ağır IG-zinciri kodlama genler iç içe RT-PCR ile güçlendirilmiş. İlk PCR ileri astar lideri bölge ve ters astar uygun ağır, hafif kappa ve lambda hafif zincirleri sürekli bölgeler için belirli hybridizing bir karışımı ile yapıldı. İkinci PCR kısıtlama siteleri içeren astar ile gerçekleştirilen, ileriye ve geriye doğru astar sırasıyla belirli V kesimleri başlangıcı ve J kesimleri sonuna vardı. PCR ürünleri, enzimleri ile sindirilir ve klonlanmış uygun sabit etki alanları içeren ifade vektörel çizimler içinde sıralı. CMV: Sitomegalovirüs organizatörü; AmpR: Ampisilin direnç geni.
Şekil 3: Genel stratejisi rekombinant insan mAbs yeniden inşası.
Bir tetramer tabanlı sıralama strateji B hücreleri ilgi olarak algılanmasını sağlar. Çok özel B hücreleri tek hücre göre edildi. Hafif ve ağır IG-zinciri kodlama kesimleri RT-PCR kullanarak güçlendirilmiş. Değişken etki alanı dizileri ayrı ökaryotik ifade vektör çerçeve içinde içine gen segmentlerinin sürekli hafif ve ağır bölgeleri kodlama klonlanmış. Karşılık gelen tamamen insan mAbs geçici transfected HEK 293A hücreleri tarafından ifade ve kültür süpernatant saf. Bu rakam Ouisse ve ark. güncellenmiştir (2017) 9.
Resim 4: Bir temsilcisi son derece discriminative mAb HLA-A2/Pp65 insan periferik kan B hücreleri dolaşan oluşturulan karşı karakterizasyonu.
A) mAb HLA-A2/Pp65 karşı PC1.02 özgüllük test tarafından ELISA. Tabak kaplı ilgili (HLA-A2/Pp65) veya HLA-A2-sınırlı peptidler içeren alakasız HLA-A2 kompleksleri ile: MelA, NS3 (HCV-1) ve GagP17 (HIV-1) 2 µg/mL, PC1.02 eklendi mAb ve bir anti-insan IgG-HRP Ab algılama için kullanıldı. Optik yoğunlukları (OD) olduğunu okuyun 450 nm. B) mAb HLA-A2/Pp65 kompleksleri çeşitli konsantrasyonları CM5 çip bağlı mAb akan tarafından yüzey Plasmon rezonans (SPR) kullanarak PC1.02 benzeşme belirlenmesi. Bu rakam Ouisse ve ark. güncellenmiştir (2017) 9.
| PBMC sayısı | Zenginleştirme sonra PE + APC + hücre sayısı | Dışlanan (BV421 +) hücre sayısı | Sıralanmış tek hücre sayısı | Analiz kuyu sayısı | HC ve LC kuyu sayısı (% kurtarma) ilişkilendirilmiş | Üretilen mAbs sayısı | Belirli mAbs sayısı | |
| HLA-A2/Pp65 mAb (PC1.02) | 3 x 108 | 818 | 117 | 161 | 7 | 3 (% 43) | 3 | 1 |
Tablo 1: HLA-A2/Pp65 belirli B hücreleri analizi.
Belirsiz B hücreleri, IG gen amplifikasyon ve izole HLA-A2/Pp65 belirli B hücreleri mAb üretim verimleri dışlama stratejisinin etkisi değerlendirilir/ölçülür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önerilen protokol doğrudan kanda dolaşan Ag özgü B hücreleri insan mAbs üretimi için güçlü bir yöntem olmasıdır. Bu üç önemli yönleri birleştirir: (i) bile nadir Ag bağlayıcı B hücreleri; bir ex vivo yalıtım sağlayan bir tetramer ilişkili manyetik zenginleştirme, kullanımı (II) etiketli üç Ag tetramers (iki ilgili olanlar ve bir alakasız bir) ile üç farklı fluorochromes izole, Akış Sitometresi tarafından yalnızca B hücreleri BCR belirli istenen Ag için bir ifade kullanır bir perdeleme strateji; (iii) karşılık gelen rekombinant mAb cDNAs RT-PCR tek hücre düzeyinde ve insan hücrelerinde cDNAs ifade tarafından yeniden inşası.
Önceki çalışmalarda insan B hücreleri izole B hücreleri6,7,8mAbs sıralama ve sonraki üretimi önce etiketlemek için bir ya da iki floresan ilgili antijenleri kullanarak evlenme teklif etti. Romatoid Artritli hastalarda bir analiz, diğeri ise bir otoimmün fare modeli ilişkili autoreactive B hücreleri karakterize ve onların frekans10,11belirlemek için alakasız bir floresan antijen. Bildiğimiz gibi iki floresan ilgili antijen tetramers birleşimi kullanın ve bir alakasız antijen tetramer daha önce bunların kullanımı tamamen insan mAbs üretimi için önce belirli B hücrelerinin zenginleştirme için tarif edilmiştir değil. En iyi duruma getirilmiş bu yöntem tamamen insan discriminative mAbs kadar az bir ay içinde elde sağlar ve başarıyla bile bir naif B hücre repertuar başlatırken gerçekleştirilebilir. Böylece, fajının ekran, insan B hücre əbadoləşdirmək, büyük sakıncaları vardır ya da diğer daha önce mAb moleküler biyoloji tabanlı yeniden yapılanma yordamlarda açıklandığı.
Bu hücre strateji sıralama Ag özgü insan mAbs bir yüksek verimli kurtarma sonuçlanır. Ağır ve hafif zincir parçalarını tek izole B hücreleri çiftlerini bir başarı oranı yaklaşık % 50 ile güçlendirilmiş. Hafif zincir parçalarını hemen hemen her zaman güçlendirilmiş ama ağır zincir segmentler için durum böyle değildir. RT-PCR verimliliği bağlıdır ağır aşağıdaki noktaları saygı: Ben) sıralanmış tek B hücreleri kısa zamanda; dondurulmuş gerekir II) 30 adet RNase inhibitörü ve B hücreleri dondurucudan alarak ve RT reaksiyon başlatma arasında geçen zamanı en aza indirerek ekleme; III) tüm astar buz çözdürme; IV) hiç donma/astar üç defadan fazla çözdürme; v) en fazla bir yıl için astar çorap.
İstenen özgüllük ile ilgili rekombinant mAbs üretim verimliliği ile ilgili olarak, bu pMHC özel mAbs için durum yaklaşık % 30-40 var. Bu belirli mAbs peptid ve oldukça talep ediyor, MHC molekül tanımak zorunda ve biz daha önce genel verimi daha geleneksel antijenlere karşı yönettiği belirli mAbs kurtarılması için % 100 üstün, yukarı olduğunu göstermiştir Β-galaktozidaz antigen9. Bu alakasız tetramer için uygun bir Ag seçiminde üretilen mAbs özgüllüğü artırmak önemli olan vurguladı olmalı.
7 x 10-6 M, benzer bir TCR benzeşimi hakkında mevcut makalesinde açıklanan anti-HLA-A2/Pp65 mAb (PC1.02) benzeşme nispeten azdır. B hücre izolasyon saf bağışçılardan gerçekleştirildi olarak bu sonucu bekleniyordu. Çoğu tetramer+ B hücreleri IgM+IgG-, iyi Ag-bağlayıcı elde etme olasılığını azaltır olduğunu. Yine de, bu yöntem de cross-reactive bellek B hücreleri saf bağışçılardan istenen bir Ag karşı bireylerin12immünolojik geçmiş nedeniyle sıralama başarabilir. Ayrıca, bu yöntem 9' da açıklandığı gibi nerede vivo içinde afinite olgunlaşma elde edilen mAbs benzeşimi için yaklaşık 1 x 10-9 artırabilir aşı veya enfekte hastalar veya aşılı insanlaşmış hayvanlar, kolayca uygulanabilir M. çeşitli yordamlar da mAbs vitroözellikle aracılığıyla ( 13' te gözden) antikor ifade hücrelere somatik Hipermutasyon üreyen, benzeşim geliştirmek için tarif edilmistir.
Sonuç olarak, çeşitli tip-in durum, saf bir aşı bir donör veya otoimmün bir hastalığı bir hasta için bireysel olarak kullanılan son derece discriminative mAbs üretim için çok yönlü bir strateji öneriyorum. Tamamen insan mAbs istenen epitope karşı bu şekilde oluşturulan temel araştırma ve immünoterapi için hem de yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Sitometresi tesis "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) uzman teknik destek için teşekkür ederiz. Ayrıca tüm personel rekombinant protein üretim (P2R) ve etkisi platformları (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) onların teknik destek için teşekkür ederiz. Biz Emmanuel Scotet ve Richard Breathnach el yazması yapıcı yorumlar için teşekkür ederim. Bu eser mali Fransız Ulusal araştırma Ajansı (ANR tarafından) (ANR-10-IBHU-005) yönetilen «Investissements d'Avenir» Fransız hükümeti programı tarafından finanse edilen IHU Cesti projesi tarafından desteklenmiştir. IHU Cesti projesi de Nantes Métropole ve Région Pays de la Loire tarafından desteklenmektedir. Bu eser gelecek program ANR-11-LABX-0016-01 yatırım üzerinden ulusal araştırma ajansı tarafından desteklenen LabEX IGO program kapsamında gerçekleşmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK 293A cell line | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine |
| RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | PAA | K45-001 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
| PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
| Fetal Bovine serum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
| Ficoll - lymphocytes separation medium | EuroBio | CMSMSL01-01 | density 1,0777+/-0,001 |
| streptavidin R-phycoerythrin conjugate | Invitrogen by Life Technologies | S21388 | premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide |
| Streptavidin, allophycocyanin conjugate | Invitrogen by thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azide premium grade |
| Brilliant violet 421 streptavidin | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
| Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| MidiMACs or QuadroMACS separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Used dilution 1:20 |
| CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Used dilution 1:20 |
| CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Used dilution 1:50 |
| CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Used dilution 1:50 |
| 7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Used dilution 1:1000 |
| FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer | BD Biosciences | ||
| 8-strip PCR tubes | Axygen | 321-10-061 | |
| Racks for 96 microtubes | Dominique Dutscher | 45476 | |
| RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) | Invitrogen by thermoFisher scientific | 10777-019 | qty:5000U (40U/ul) |
| Distilled Water Dnase/Rnase Free | Gibco | 10977-035 | |
| Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
| Random hexamers | Invitrogen by thermoFisher scientific | N8080127 | qty : 50uM, 5nmoles |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 18080-044 | qty : 10000U (200U/ul) |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| dNTP Set, Molecular biology grade | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
| 5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers |
| 5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers |
| 5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers |
| 5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers |
| 3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening |
| 3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig |
| 5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers |
| 5'LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG |
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG |
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers |
| 3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA |
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening |
| 5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1_9_1–13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening |
| Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC |
Bacteria PCR screening |
| QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade | MP Bio | AGAH0500 | |
| NucleoFast 96 PCR Plate | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
| Enzyme Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
| Enzyme SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
| Enzyme Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
| Enzyme BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
| HCg1 (Genbank accession number FJ475055) | |||
| LCk (Genbank accession number FJ475056 ) | |||
| LCl (Genbank accession number FJ517647) | |||
| T4 DNA ligase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
| 2X YT medium | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
| LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
| Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification | Macherey Nagel | 740588.250 | |
| Jet PEI DNA transfection reagent | PolyPlus | 101-40 | |
| Flat bottom96-well plate | Falcon | 353072 | |
| V-bottom 96-well plate | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
| Nunc easy 175 cm2 flasks | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
| ELISA/ELISPOT coating buffer | eBiosciences | 00-0044-59 | |
| Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | high protein binding |
| Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
| TMB substrate | BD Biosciences | 555214 | |
| Streptavidin | Sigma | S0677 | |
| 1 mL-HiTrap protein A HP column | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517501 | |
| NGC Quest 10 Plus Chromatography System | BioRad | 7880003 |
References
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
- Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
- Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
- Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
- Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532 (2011).
- Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
- Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3 (2017).
- Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
- Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
- Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
- Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).
Tags
İmmünoloji sayı 132 İmmünoloji hücresel biyoloji insan antikorlar B hücresi tetramer Akış Sitometresi tek hücre antijen spesifik manyetik zenginleştirmeErratum
Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.
The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes, Nantes, France
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France
