Vi beskriver en metode for produksjon av menneskelig antistoffer spesifikke for et antigen av interesse, fra sjeldne B celler i menneskelig blod. Generasjon av disse naturlige antistoffer er effektiv og rask antistoffer innhentet kan forskjellsbehandle meget relaterte antigener.
Monoklonale antistoffer (mAbs) er kraftige verktøy nyttig for både grunnforskning og biomedisin. Deres høy spesifisitet er uunnværlig når antistoffer må skille mellom meget relaterte strukturer (f.eks, en vanlig protein og en mutert versjon av disse). Den nåværende måten å generere slike discriminative mAbs innebærer omfattende screening av flere Ab-produserende B celler, som er både kostbart og tidkrevende. Vi foreslår her en rask og kostnadseffektiv metode for generering av discriminative, fullt menneskelige mAbs fra menneskeblod sirkulerende B-lymfocytter. Originaliteten av denne strategien er valg av spesifikke antigen bindende B celler kombinert med mot valget av alle andre celler, ved hjelp av lett tilgjengelige perifert blod mononukleære celler (PBMC). Når bestemte B-celler er isolert, hentes cDNA (komplementære deoksyribonukleinsyre) sekvenser koding for den tilsvarende mAb ved hjelp av én celle reversere transkripsjon-polymerasekjedereaksjons (RT-PCR) teknologi og senere uttrykt i menneskelig celler. Innen så lite som 1 måned er det mulig å produsere milligram svært discriminative menneskelige mAbs rettet mot nesten alle ønsket antigen naturlig oppdaget av B celle repertoaret.
Metoden beskrevet her kan rask og allsidig produksjon av fullstendig menneske monoklonale antistoffer (mAbs) mot en ønsket antigen (Ag). mAbs er essensielle verktøy i mange grunnleggende forskning programmer i vitro og i vivo: flow cytometri, histology, western-blotting og blokkerer eksperimenter for eksempel. Videre brukes mAbs mer i medisin å behandle autoimmune sykdommer, kreft, og å kontrollere transplantasjon avvisning1. For eksempel ble anti-CTLA-4 og anti-PD-1 (eller anti-PD-L1) mAbs sist brukt som immun checkpoint hemmere i kreft behandlinger2.
De første mAbs ble produsert av immunglobulin (Ig)-sekresjon hybridomas Hentet fra splenic cellene i vaksineres mus eller rotter. Imidlertid hemmer sterk immunrespons mot murint eller rotte mAbs deres terapeutisk bruk i mennesker, på grunn av deres raske klarering og sannsynlig induksjon av overfølsomhet reaksjoner3. For å håndtere dette problemet, erstattet animalsk protein sekvenser av mAbs delvis av menneskelig å generere såkalte chimeric mus-menneskelige eller humanized antistoffer. Men reduserer denne strategien bare delvis immunogenisitet, mens vesentlig øke både kostnadene og på tidsskalaen for produksjon. En bedre løsning er å generere menneskelige mAbs direkte fra menneskelige B celler og flere strategier for dette er tilgjengelig. En av dem er bruk av phage eller gjær. Dette innebærer å vise variabel domener en kombinasjon bibliotek av tilfeldige menneskelige Ig tunge og lys kjeder på phages eller gjær, og gjennomføre et utvalg skritt med spesifikke antigen rundt. En stor ulempe med denne strategien er at tunge og lette kjedene er tilfeldig tilknyttet, fører til en stor økning i mangfoldet av genererte antistoffer. Antistoffer innhentet er usannsynlig å korrespondere med de som vil oppstå fra en naturlig immunrespons mot en bestemt Ag. Videre er menneskelig proteinfolding og post-translasjonell modifikasjoner ikke systematisk reprodusert i prokaryoter eller i gjær. En annen menneskelig mAb produksjon metode er immortalization av naturlige menneskelige B celler, av Epstein – Barr virusinfeksjon eller uttrykk av anti-apoptotisk faktorer BCL-6 og BCL-XL4. Men denne metoden gjelder bare for minne B-celler og ineffektiv, som krever screening av mange mAb-produserende udødeliggjort B celler å identifisere få (om noen) mAb kloner med ønsket antigen spesifisitet. Metoden er dermed både kostbar og tidkrevende.
En ny protokoll har nylig blitt beskrevet for produksjon av menneskelig mAbs isolert enkelt B celler5. Det baserer seg på en optimalisert encellede reversere transkripsjon-polymerasekjedereaksjons (RT-PCR) for forsterkning av både tung – og lett-kjeden koding segmenter fra en enkelt sortert B-celle. Dette etterfølges av kloning og uttrykk for disse segmentene i en eukaryot uttrykk system, slik at rekonstruksjon av en fullstendig menneske mAb. Denne protokollen er brukt med hell fra B-celler fra vaksinert givere. Cellene ble høstet flere uker etter vaksinering å få høyere frekvenser av B-celler som er rettet mot ønsket Ag, og dermed begrense tiden som kreves for screening6. Også har produsert andre fullt menneskelige mAbs HIV+ (humant immunsviktvirus) infisert pasienter7 og melanom pasienter8. Til tross for disse framskrittene er det fortsatt ingen prosedyre tilgjengelig som gjør isolasjon av Ag-spesifikke B celler uavhengig av deres minne fenotype eller frekvens.
Fremgangsmåten beskrevet her fører til effektiv ex vivo isolasjon av mennesker sirkulerende B-cellene basert på deres BCR spesifisitet, etterfulgt av produksjonen av fullstendig menneske antigen-spesifikke mAbs i høy kapasitet og med en lav screening. Metoden er ikke begrenset til minne B-celler eller antistoff-sekresjon B celler indusert etter en immunrespons, men kan også brukes på menneskelig naiv B celle repertoaret. At det fungerer med utgangspunkt i Ag-spesifikke B celler på veldig lave frekvenser er en god indikasjon på sin effektivitet. Prinsippet om metoden er som følger: perifert blod mononukleære celler (PBMC) er farget med to tetramers presenterer antigen rundt, hver av dem merket med en annen fluorochrome (f.eksPhycoerythrin (PE) og Allophycocyanin (APC)), og en tredje tetramer presentere et nært beslektede antigen konjugert med en tredje fluorochrome (f.eksstrålende Violet 421 (BV421)). For å berike for antigen bindende celler, celler er deretter inkubert med perler belagt med anti-PE og anti-APC Abs, og sortert i cellen separasjon kolonner. PE+ APC+ celle brøken velges, beiset med en rekke mAbs spesifikke for ulike PBMC cellen å tillate identifikasjon av B-celler og utsatt å strømme cytometri celle sortering. B-celler som PE+ og APC+, men briljante Violet–, er isolert. Dette trinnet merker mot celler som er ikke B celler eller binder seg ikke til tetramerized antigen, men bind PE eller APC (disse cellene blir PE+ APC– eller PE– APC+) eller til den ikke-antigen delen av tetramers brukte (disse celler blir BV421+). B celler ikke svært spesifikke for av interesse er også mot merket på dette trinnet (disse cellene blir også BV421+). Dermed kan denne metoden rense svært spesifikke B-celler uttrykke B-celle reseptorer (BCRs) kunne skille mellom to veldig nært relaterte antigener. Én bestemt B-celler er samlet i rør og deres PCR-forsterket Ig cDNAs (utfyllende deoxyribonucleic syrer) klonet og uttrykt av en human celle linje som utskilles IgG mAbs.
Som et bevis på konseptet, denne studien beskriver effektiv generering av menneskelig mAbs, som anerkjenner et peptid presentert av en store histocompatibility kompleks klasse jeg (MHC-jeg) molekylet og kan diskriminere imellom denne peptid og andre peptider lastet på samme MHC-jeg allelet. Selv om kompleksiteten i denne Ag er viktig, kan denne måten (i) høykapasitets utvinning av Ag-spesifikke mAbs; (ii) produksjon av mAbs kunne skille mellom to strukturelt nær Ags. Denne tilnærmingen kan utvides til vaccinated eller infiserte pasienter uten endringer i protokollen, og har allerede blitt implementert i en humanized rotte systemet9. Derfor beskriver denne studien en allsidig og effektiv tilnærming vil generere fullt menneskelige mAbs som kan brukes i grunnforskning og immunotherapy.
Foreslåtte protokollen er en kraftig metode for generering av menneskelig mAbs direkte fra Ag-spesifikke B celler i blodet. Det kombinerer tre viktige aspekter: (i) bruk av en tetramer-assosiert magnetiske berikelse, som lar en ex vivo isolering av med sjeldne Ag-bindende B celler. (ii) en gating strategi som bruker tre Ag tetramers (to relevante enere og en irrelevante en) merket med tre ulike fluorochromes for å isolere, ved flowcytometri, bare B-celler uttrykke en BCR bestemt ønsket Ag; (iii) rekonstruksjo…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker cytometri anlegget “CytoCell” (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) for ekspert teknisk assistanse. Vi takker også betjening av rekombinant protein produksjon (P2R) og innvirkning plattformer (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) for deres teknisk støtte. Vi takker Emmanuel Scotet og Richard Breathnach for konstruktive kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble økonomisk støttet av IHU-Cesti prosjektet finansiert av «Investissements d’Avenir» franske regjering programmet administreres av den franske National Research Agency (ANR) (ANR-10-IBHU-005). IHU-Cesti prosjektet er også støttet av Nantes Métropole og Région Pays de la Loire. Dette arbeidet ble realisert i sammenheng med LabEX IGO programmet støttet av National Research Agency via investering av fremtidige programmet ANR-11-LABX-0016-01.
HEK 293A cell line | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine |
RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
Bovine Serum Albumine (BSA) | PAA | K45-001 | |
Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
Fetal Bovine serum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
Ficoll – lymphocytes separation medium | EuroBio | CMSMSL01-01 | density 1,0777+/-0,001 |
streptavidin R-phycoerythrin conjugate | Invitrogen by Life Technologies | S21388 | premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide |
Streptavidin, allophycocyanin conjugate | Invitrogen by thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azide premium grade |
Brilliant violet 421 streptavidin | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
MidiMACs or QuadroMACS separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Used dilution 1:20 |
CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Used dilution 1:20 |
CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Used dilution 1:50 |
CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Used dilution 1:50 |
7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Used dilution 1:1000 |
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer | BD Biosciences | ||
8-strip PCR tubes | Axygen | 321-10-061 | |
Racks for 96 microtubes | Dominique Dutscher | 45476 | |
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) | Invitrogen by thermoFisher scientific | 10777-019 | qty:5000U (40U/ul) |
Distilled Water Dnase/Rnase Free | Gibco | 10977-035 | |
Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
Random hexamers | Invitrogen by thermoFisher scientific | N8080127 | qty : 50uM, 5nmoles |
Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 18080-044 | qty : 10000U (200U/ul) |
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
dNTP Set, Molecular biology grade | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening |
3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig |
5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
5'LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening |
5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeIVk1_9_1–13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening |
Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC |
Bacteria PCR screening |
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade | MP Bio | AGAH0500 | |
NucleoFast 96 PCR Plate | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
Enzyme Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
Enzyme SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
Enzyme Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
Enzyme BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
HCg1 (Genbank accession number FJ475055) | |||
LCk (Genbank accession number FJ475056 ) | |||
LCl (Genbank accession number FJ517647) | |||
T4 DNA ligase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
2X YT medium | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
Ampicillin | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification | Macherey Nagel | 740588.250 | |
Jet PEI DNA transfection reagent | PolyPlus | 101-40 | |
Flat bottom96-well plate | Falcon | 353072 | |
V-bottom 96-well plate | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
Nunc easy 175 cm2 flasks | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
ELISA/ELISPOT coating buffer | eBiosciences | 00-0044-59 | |
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | high protein binding |
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
TMB substrate | BD Biosciences | 555214 | |
Streptavidin | Sigma | S0677 | |
1 mL-HiTrap protein A HP column | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
ÄKTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517501 | |
NGC Quest 10 Plus Chromatography System | BioRad | 7880003 |