Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generasjon av Discriminative menneskelige monoklonale antistoffer fra sjeldne Antigen-spesifikke B celler i blodet

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/56508
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

ERRATUM NOTICE

Summary

Vi beskriver en metode for produksjon av menneskelig antistoffer spesifikke for et antigen av interesse, fra sjeldne B celler i menneskelig blod. Generasjon av disse naturlige antistoffer er effektiv og rask antistoffer innhentet kan forskjellsbehandle meget relaterte antigener.

Abstract

Monoklonale antistoffer (mAbs) er kraftige verktøy nyttig for både grunnforskning og biomedisin. Deres høy spesifisitet er uunnværlig når antistoffer må skille mellom meget relaterte strukturer (f.eks, en vanlig protein og en mutert versjon av disse). Den nåværende måten å generere slike discriminative mAbs innebærer omfattende screening av flere Ab-produserende B celler, som er både kostbart og tidkrevende. Vi foreslår her en rask og kostnadseffektiv metode for generering av discriminative, fullt menneskelige mAbs fra menneskeblod sirkulerende B-lymfocytter. Originaliteten av denne strategien er valg av spesifikke antigen bindende B celler kombinert med mot valget av alle andre celler, ved hjelp av lett tilgjengelige perifert blod mononukleære celler (PBMC). Når bestemte B-celler er isolert, hentes cDNA (komplementære deoksyribonukleinsyre) sekvenser koding for den tilsvarende mAb ved hjelp av én celle reversere transkripsjon-polymerasekjedereaksjons (RT-PCR) teknologi og senere uttrykt i menneskelig celler. Innen så lite som 1 måned er det mulig å produsere milligram svært discriminative menneskelige mAbs rettet mot nesten alle ønsket antigen naturlig oppdaget av B celle repertoaret.

Introduction

Metoden beskrevet her kan rask og allsidig produksjon av fullstendig menneske monoklonale antistoffer (mAbs) mot en ønsket antigen (Ag). mAbs er essensielle verktøy i mange grunnleggende forskning programmer i vitro og i vivo: flow cytometri, histology, western-blotting og blokkerer eksperimenter for eksempel. Videre brukes mAbs mer i medisin å behandle autoimmune sykdommer, kreft, og å kontrollere transplantasjon avvisning1. For eksempel ble anti-CTLA-4 og anti-PD-1 (eller anti-PD-L1) mAbs sist brukt som immun checkpoint hemmere i kreft behandlinger2.

De første mAbs ble produsert av immunglobulin (Ig)-sekresjon hybridomas Hentet fra splenic cellene i vaksineres mus eller rotter. Imidlertid hemmer sterk immunrespons mot murint eller rotte mAbs deres terapeutisk bruk i mennesker, på grunn av deres raske klarering og sannsynlig induksjon av overfølsomhet reaksjoner3. For å håndtere dette problemet, erstattet animalsk protein sekvenser av mAbs delvis av menneskelig å generere såkalte chimeric mus-menneskelige eller humanized antistoffer. Men reduserer denne strategien bare delvis immunogenisitet, mens vesentlig øke både kostnadene og på tidsskalaen for produksjon. En bedre løsning er å generere menneskelige mAbs direkte fra menneskelige B celler og flere strategier for dette er tilgjengelig. En av dem er bruk av phage eller gjær. Dette innebærer å vise variabel domener en kombinasjon bibliotek av tilfeldige menneskelige Ig tunge og lys kjeder på phages eller gjær, og gjennomføre et utvalg skritt med spesifikke antigen rundt. En stor ulempe med denne strategien er at tunge og lette kjedene er tilfeldig tilknyttet, fører til en stor økning i mangfoldet av genererte antistoffer. Antistoffer innhentet er usannsynlig å korrespondere med de som vil oppstå fra en naturlig immunrespons mot en bestemt Ag. Videre er menneskelig proteinfolding og post-translasjonell modifikasjoner ikke systematisk reprodusert i prokaryoter eller i gjær. En annen menneskelig mAb produksjon metode er immortalization av naturlige menneskelige B celler, av Epstein - Barr virusinfeksjon eller uttrykk av anti-apoptotisk faktorer BCL-6 og BCL-XL4. Men denne metoden gjelder bare for minne B-celler og ineffektiv, som krever screening av mange mAb-produserende udødeliggjort B celler å identifisere få (om noen) mAb kloner med ønsket antigen spesifisitet. Metoden er dermed både kostbar og tidkrevende.

En ny protokoll har nylig blitt beskrevet for produksjon av menneskelig mAbs isolert enkelt B celler5. Det baserer seg på en optimalisert encellede reversere transkripsjon-polymerasekjedereaksjons (RT-PCR) for forsterkning av både tung - og lett-kjeden koding segmenter fra en enkelt sortert B-celle. Dette etterfølges av kloning og uttrykk for disse segmentene i en eukaryot uttrykk system, slik at rekonstruksjon av en fullstendig menneske mAb. Denne protokollen er brukt med hell fra B-celler fra vaksinert givere. Cellene ble høstet flere uker etter vaksinering å få høyere frekvenser av B-celler som er rettet mot ønsket Ag, og dermed begrense tiden som kreves for screening6. Også har produsert andre fullt menneskelige mAbs HIV+ (humant immunsviktvirus) infisert pasienter7 og melanom pasienter8. Til tross for disse framskrittene er det fortsatt ingen prosedyre tilgjengelig som gjør isolasjon av Ag-spesifikke B celler uavhengig av deres minne fenotype eller frekvens.

Fremgangsmåten beskrevet her fører til effektiv ex vivo isolasjon av mennesker sirkulerende B-cellene basert på deres BCR spesifisitet, etterfulgt av produksjonen av fullstendig menneske antigen-spesifikke mAbs i høy kapasitet og med en lav screening. Metoden er ikke begrenset til minne B-celler eller antistoff-sekresjon B celler indusert etter en immunrespons, men kan også brukes på menneskelig naiv B celle repertoaret. At det fungerer med utgangspunkt i Ag-spesifikke B celler på veldig lave frekvenser er en god indikasjon på sin effektivitet. Prinsippet om metoden er som følger: perifert blod mononukleære celler (PBMC) er farget med to tetramers presenterer antigen rundt, hver av dem merket med en annen fluorochrome (f.eksPhycoerythrin (PE) og Allophycocyanin (APC)), og en tredje tetramer presentere et nært beslektede antigen konjugert med en tredje fluorochrome (f.eksstrålende Violet 421 (BV421)). For å berike for antigen bindende celler, celler er deretter inkubert med perler belagt med anti-PE og anti-APC Abs, og sortert i cellen separasjon kolonner. PE+ APC+ celle brøken velges, beiset med en rekke mAbs spesifikke for ulike PBMC cellen å tillate identifikasjon av B-celler og utsatt å strømme cytometri celle sortering. B-celler som PE+ og APC+, men briljante Violet-, er isolert. Dette trinnet merker mot celler som er ikke B celler eller binder seg ikke til tetramerized antigen, men bind PE eller APC (disse cellene blir PE+ APC- eller PE- APC+) eller til den ikke-antigen delen av tetramers brukte (disse celler blir BV421+). B celler ikke svært spesifikke for av interesse er også mot merket på dette trinnet (disse cellene blir også BV421+). Dermed kan denne metoden rense svært spesifikke B-celler uttrykke B-celle reseptorer (BCRs) kunne skille mellom to veldig nært relaterte antigener. Én bestemt B-celler er samlet i rør og deres PCR-forsterket Ig cDNAs (utfyllende deoxyribonucleic syrer) klonet og uttrykt av en human celle linje som utskilles IgG mAbs.

Som et bevis på konseptet, denne studien beskriver effektiv generering av menneskelig mAbs, som anerkjenner et peptid presentert av en store histocompatibility kompleks klasse jeg (MHC-jeg) molekylet og kan diskriminere imellom denne peptid og andre peptider lastet på samme MHC-jeg allelet. Selv om kompleksiteten i denne Ag er viktig, kan denne måten (i) høykapasitets utvinning av Ag-spesifikke mAbs; (ii) produksjon av mAbs kunne skille mellom to strukturelt nær Ags. Denne tilnærmingen kan utvides til vaccinated eller infiserte pasienter uten endringer i protokollen, og har allerede blitt implementert i en humanized rotte systemet9. Derfor beskriver denne studien en allsidig og effektiv tilnærming vil generere fullt menneskelige mAbs som kan brukes i grunnforskning og immunotherapy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle menneskelige perifert blodprøver ble innhentet fra anonyme voksen givere etter samtykke, i samsvar med den lokale etikk (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, prosedyren PLER NTS-2016-08).

1. isolering av menneskelig perifert blod mononukleære celler

Merk: Starte materiale kan være totale menneskelige perifert blod eller cytapheresis prøver. Bør ikke være eldre enn 8 h og supplert med antikoagulanter (f.eks, heparin).

  1. Fortynne blod med 2 volumer (mennesker perifert blod) eller 5 volumer (cytapheresis utvalget) av RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium.
  2. Nøye lag 35 mL utvannet celle suspensjon på 15 mL tetthet gradert medium i en 50-mL konisk rør. Lag så mange rør som nødvendig for å distribuere alle utvannet blod. Sentrifuge 1,290 x g for 25 min ved romtemperatur i en svingende bøtte rotor med brems av.
  3. Nøye Sug opp mononukleære celle laget i grensesnittet mellom tetthet gradert mediet og plasma laget, og overføre cellene til en ny 50 mL konisk tube.
  4. Fylle røret med RPMI medium, bland og sentrifuge 1,290 x g i 10 min ved romtemperatur. Fjern forsiktig nedbryting.
  5. Resuspend celle pellet i 20 mL RPMI medium og sentrifuger 200 x g i 10 min å fjerne blodplater. Fjern forsiktig nedbryting. Gjenta dette trinnet når.
  6. Resuspend celle pellet i RPMI medium med 10% fosterets Bovine Serum (FBS).
    Merk: Gå direkte til tetramer merking eller holde celler på 4 ° C over natten i en konsentrasjon av 107 celler/mL.

2. tetramer-assosiert magnetiske anriking av Ag-spesifikke B celler

  1. Forberede Ag-tetramers ved å legge til enten PE eller APC-merket premie klasse streptavidin eller BV421-merket streptavidin i molar forholdet 1:4 til biotinylated antigen monomerer. Legge til riktig mengde streptavidin-konjugert i tre separate deler, legge til en aliquot hvert 10 min ved romtemperatur.
  2. Distribuere celler (opptil 3 x 108 per rør) i 15 mL konisk rør og sentrifuge 460 x g i 5 min.
    Merk: Følgende protokollen er en tube.
  3. Resuspend celle pellet i 200 µL av PBS (fosfat bufret saltvann) med 2% FBS. Legg PE - APC- og BV421-konjugerte tetramers, til en siste konsentrasjon av 10 µg/mL. Bland godt og ruge i 30 min ved romtemperatur.
  4. Forberede iskald celle separasjon buffer (SB) med PBS med 0,5% BSA (Bovine Serum Albumin) og EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 2 mM.
  5. Legge til 10 mL SB. Pellet celler med sentrifugering 460 x g i 5 min.
  6. Resuspend celler i 500 µL av iskalde SB. legge til 50 µL av anti-PE og 50 µL av anti-APC magnetisk microbeads.
  7. Bland godt og ruge etter 20 min på 4 ° C.
  8. Gjenta trinn 2.5 to ganger.
  9. Eliminere nedbryting nøye andresuspend celle pellet i en konsentrasjon av 2 x 108 celler/mL i isen kalde SB.
  10. Equilibrate en stor magnetisk kolonne på en magnet med 3 mL SB.
  11. Overføre celle suspensjon fra 2,9 på toppen av kolonnen equilibrated og la det renne helt. VIKTIGE trinn: For å unngå klumper av kolonnen, passere celler gjennom en 70 µm nylon maske.
  12. Skyll røret som inneholdt cellene med 3 mL av is kaldt SB og overføre bufferen direkte på kolonnen (ved filtrering, skyll 70 µm nylon maske).
  13. Når bufferen har drenert i kolonnen, kan du legge til en annen 3 mL av is kaldt SB til kolonnen.
  14. Gjenta trinn 2.13 for en annen 3 mL vask.
  15. Fjern kolonnen fra magnet og sted over et 15-mL konisk samle rør.
  16. Legg til 5 mL av is kaldt SB på toppen av kolonnen og umiddelbart tømme cellene av kolonnen bruker stempelet. Gjenta dette trinnet når.
  17. Sentrifuge det avhentet celler (beriket relevante tetramer positive celle brøkdel) 460 x g i 5 min og videre til flere antistoff flekker.
    Merk: Utvalg samlet celler fra alle rør, eventuelt.

3. farging av Ag-spesifikke menneskelig B celler og celle sortering

  1. Resuspend celle pellets med en cocktail av anti-menneskelige antistoffer mot CD3 (siste fortynning: 1:20), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50), og 7AAD (1:1000) i et siste volum på 100 µL av PBS med 2% FBS. Inkuber i 30 min på 4 ° C.
  2. Legge til 10 mL PBS celler, sentrifuge 460 x g for 5 min, og eliminere nedbryting. Gjenta dette trinnet når. Resuspend celle pellet i 200 µL av PBS, filter på 70 µm nylon maske.
  3. Fortsette å sortere bestemte B celler i én celle nivået på en cellen sorter cytometer med en 100 µm-dysen og en trykket av 20 psi uten å overskride 1000 hendelser/s9.
    Merk: Gating strategien som brukes er vist i figur 1. Cellene ble først gated på CD14-CD16-7AAD- celler å ekskludere monocytter og NK døde celler (ikke vist i figur 1). Deretter CD19+ B celler ble valgt før gating på doble farget celler av PE og APC relevante Ag-tetramers. Non-spesifikke B celler ble utelukket av gating på BV421 negativ celler (unstained kvinne av irrelevante Ag-tetramer).
  4. Samle B enkeltceller i 8-stripen PCR rør tidligere fylt med 10 µL av 1 x PBS og 10 enheter av RNAse hemmer og plassert på en rack på 96 microtubes. Umiddelbart fryse PCR rørene på-80 ° C.
    Merk: Sortere maskene valgt på cytometer apparatet er avkastning maske: 0, renhet maske: 32 og fase maske: 0. depositumet encellede kan justeres til en 96 - eller 384-godt PCR plate hvis nødvendig. B enkeltceller må være frosset så raskt som mulig og kan stå på-80 ° C i flere uker, hvis nødvendig.

4. enkeltcelle RT PCR

  1. Lyse cellene direkte oppvarming frosne prøvene i PCR strimler på 70 ° C i 5 minutter i en tørr bad.
  2. Overføre strimler is og fortsette å reversere transkripsjon (RT) ved å legge 10 µL per tube med en 2 x master mix bufferen som inneholder 1 mM dNTP, 25 µg/mL oligod(T) primere, 5 µM tilfeldig hexamers, 20 enheter av RNAse hemmer og 400 enheter av revers transkriptase.
    Merk: Etter celle tining, RT må utføres raskt for å unngå RNA degradering.
  3. Inkuber ved 25 ° C i 5 min å tillate tilfeldige hexamers hybridize, ruge 1t ved 50 ° C, og avslutt med en inkubasjon ved 95 ° C i 3 minutter å stoppe reaksjonen.
  4. Fortsett med to runder av nestede PCR forsterkning for hver av regionene koding for variabel tunge (vH) og kappa (vLκ) eller lambda lys kjeder (vLλ).
    Merk: Alternativt RT prøver kan fryses på 20 ° C og holdt i en uke.
    1. Den første runden av PCR, legge 3 µL av cDNA for en 40 µL endelige volumet som inneholder 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter av DNA Polymerase og 200 nM i ytre primere (se figur 2 og Tabell for materiale for primer sekvenser).
      Merk: Sammensetning av ytre primere blanding. For tung kjetting forsterkning: 4 vanlige primere (5' LVH mix) og 2 motsatte primere (3 CµCγ mix). For lett kappa kjeden forsterkning, 3 videresende primere (5' LV | blande) og 1 reversere primer (3' Cκ543-566). For lett lambda kjeden forsterkning, 7 frem primere (5' LVl mix) og 1 reversere primer (3' Cl).
      Merk: Primere ble designet av Tiller et al. for forsterkning av alle tunge og lette kjeden familie gener5.
    2. Bruk følgende sykling: 94 ° C i 4 min, etterfulgt av 40 sykluser av 30 s på 94 ° C, 30 s på 58 ° C for VH VLκ (60 ° C i VLλ) og 55 s ved 72 ° C, med en siste forlengelse trinn ved 72 ° C i 7 min.
    3. For det andre runde PCR, bruker 3 µL av første forsterkning produktet for et endelig antall 40 µL som inneholder 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, 2,5 enheter av DNA polymerase og 200 nM i indre primere med begrensning enzym nettsteder for kloning til uttrykk vektorer (se figur 2 og Tabell for materiale for primer sekvenser).
      Merk: Sammensetning av indre primere blanding. For tung kjetting forsterkning: 9 vanlige primere (5' AgeIVH mix) og 3 motsatte primere (3' SalIJH mix). For lett kappa kjeden forsterkning, 9 videresende primere (5' AgeIV | blande) og 3 reversere primere (3' BsiWIJκ mix). For lett lambda kjeden forsterkning, 6 frem primere (5' AgeIVl mix) og 1 reversere primer (3' XhoICl).
      Merk: Primere ble designet av Tiller et al., for forsterkning av alle de tunge og lette kjeden familie gener5.
    4. Bruk følgende sykling: 94 ° C i 4 min, etterfulgt av 40 sykluser av 30 s på 94° C, 30 s på 58 ° C for VH LCκ (60 ° C i LCλ) og 45 s ved 72 ° C med en siste forlengelse trinn ved 72 ° C i 7 min.
  5. Identifisere positive brønner ved overføring 5 μL PCR produkter vH, vLκ og vLλ på en 1,5% agarose gel (500 bp produkter for variabel tunge kjeden koding segmenter) og en 350 bp produkt for variabel lys kjeden koding segmenter.
  6. Rense de resterende 35 µL PCR produktene gjenværende fra positiv brønner med ultrafiltrasjon membraner designet for rensing av PCR produkter.
  7. Elute PCR produkter med 60 µL av H2O.

5. uttrykk kloning

  1. Forberede setter inn
    Merk: Oversikten 60 µL av hver renset PCR produktet i et siste volum på 100 µL som inneholder den aktuelle begrensning enzym-bufferen.
    1. For vH PCR produkter, legge til 50 enheter av AgeI og 50 enheter av SalI og ruge 1t på 37 ° C.
    2. For vLλ PCR produkter, legge til 50 enheter av AgeI og 50 enheter av XhoI og ruge 1t på 37 ° C.
    3. For vLκ PCR produkter, legge til 50 enheter av AgeI og ruge 1t på 37 ° C. Rense fordøyer bruker 96 PCR membraner og elute med 60 µL av H2O. Digest 60 µL eluate i et siste volum på 100 µL BsiWI begrensning enzym bufferen, legge til 50 enheter av BsiWI og ruge 1t på 55 ° C.
    4. Deaktiver enzymer ved 80 ° C i 15 min.
  2. Utarbeidelse av uttrykke vektorer
    Merk: vH PCR produkter er klonet i et uttrykk vektor (HCγ1) som inneholder konstant tunge kjeden Cγ1 av IgG1. vLκ PCR produkter er klonet i et uttrykk vektor (LCκ) som inneholder konstant lys kjeden Cκ. vLλ PCR produkter er klonet i et uttrykk vektor (LCλ) som inneholder konstant lys kjeden Cλ.
    1. Utfør følgende digestions:
      1. Mix 1 µg uttrykksformer vektor HCγ1 med 10 enheter av AgeI og 10 enheter av SalI endonucleases i et totalvolum på 20 µL begrensning-bufferen som er anbefalt av produsenten og ruge 1t på 37 ° C.
      2. Mix 1 µg av uttrykket vektor LCκ med 10 enheter av AgeI begrensning enzym i et totalvolum på 20 µL begrensning bufferen anbefalt av produsenten og ruge 1t på 37° C. Legge til 10 enheter av BsiWI begrensning enzym og ruge 1t på 55 ° C.
      3. Mix 1 µg av uttrykket vektor LCλ med 10 enheter av AgeI og 10 enheter av XhoI endonucleases i et totalvolum på 20 µL begrensning bufferen anbefalt av produsenten og ruge 1t på 37 ° C
    2. Varme hver fordøyelsen blanding ved 65 ° C i 10 min å deaktivere begrensningen enzymer.
    3. Utføre ligation av 5 µL av fordøyd PCR produkt med 2 µL (100 ng) av tilsvarende linearisert uttrykk vektor i et totalvolum på 20 µL av 1 x DNA ligase buffer med 1 enhet av T4 DNA-Ligase av inkubasjon overnatting på 4 ° C.
      Merk: Alternativt ligation utføres for 3t på 4° C.
  3. Kloning
    1. Electroporate 1 µL av 20 µL ligation blandingen i 45 µL av hjemmelaget electrocompetent TOP10 E. coli (gjeldende protokoller i molekylærbiologi, delen 1.8.4-1.8.8). Straks legge til 500 µL av 2 X YT medium og ruge i et vannbad ved 37 ° C i 30 min. oppslaget forvandlet bakterier på 2 x YT ampicillin plater. Ruge over natten på 37 ° C.
    2. For hver transformasjon, skjermen åtte kolonier av PCR.
      1. Definere en reaksjon premix slik på is: 45 µL av 5 x PCR Buffer, 12 µL MgCl2 (25 mM), 4 µL av dNTPs (fra et lager som inneholder 10 mM av hver), 10 µL av fremover primer (lager 10 µM) hybridizing vektor sekvensen (primer Ab-vec-følelse) , og 10 µL av omvendt primer (lager 10 µM) målretting regionen konstant tung eller lett kjede (se Tabell for materiale for primer sekvenser). Utgjør et endelig antall 200 µL med H2O. Deretter Legg 4 µL av DNA polymerase enzym (5 U/µL).
      2. Distribuere 25 µL av reaksjon premix per 8-stripen PCR rør på is.
      3. Bruk en steril tannpirker for å hente personlige kolonier. Strek tannpirker på en 2 x TY ampicillin tallerken utgjør en Repliker plate og deretter dypp den i et PCR reaksjon rør.
      4. Utføre screening PCR under sykling følgende: 94 ° C i 10 min, etterfulgt av 25 sykluser av 30 s på 94 ° C, 30 s ved 55 ° C og 50 s ved 72 ° C.
      5. Identifisere positive bakterier ved å overføre 5 µL av PCR-produkter på en 1,5% agarose gel.
        Merk: Positive kolonier gi et PCR-produkt rundt 850 bp for tunge kjeden vektoren og 600 bp for lys kjeden vektoren.
    3. Vaksinere fire positiv kolonier fra Repliker plate i 2 mL av LB medium og ruge over natten på 37 ° C med skjelvende på 200 rpm.
    4. Pakk ut plasmider fra flytende kulturer ved hjelp av en plasmider rensing kit, som angitt av produsenten.
    5. Kontrollere riktig innsetting av variabel domener av Sanger sekvensering av plasmider med Ab-vec-sense primer.
      Merk: Plasmider med riktig innsatsen (koding av HC og tilsvarende LC) er å være cotransfected i 293A celler for sekret. Spesifisiteten av liten skala-produsert mAbs er assayed med ELISA. Deretter utføres storskala produksjon hvis aktuelt.

6. produksjon av mAbs

  1. Småskala produksjon for spesifisitet sjekke
    1. Dagen før transfection, frø 15.000 menneskelige embryonale nyre 293A (HEK 293A) celler i 200 µL av Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) med 10% FBS per brønn i 96-brønnen plater. Ruge over natten i en CO2 inkubator (5% CO2) på 37 ° C.
    2. Cotransfect 293A celler i DMEM medium som inneholder 10% FBS bruker en lineær polyethylenimine derivat som transfection reagens.
      Merk: Utføre transfection triplicates. Følgende protokollen er en brønn av en flat bunn 96-brønns plate.
      1. Fortynne 0,5 µL av DNA transfection reagensen i 10 µL av 150 mM NaCl. Fortynne 0.125 µg av vH og 0.125 µg vL uttrykke vektorer i 10 µL av 150 mM NaCl. Vortex hver fortynning for 10 s.
      2. Legge 10 µL utvannet DNA transfection reagens i 10 µL DNA løsningen. Vortex 15 s og Inkuber i 15 min ved romtemperatur. Legg blandingen 20 µL drop-wise på 293A celler, og bland av forsiktig virvlende platen.
    3. Erstatt medium 16 h etter transfection og kultur celler i 5 dager i serum-free medium.
      Merk: Bruk serum-free medium for å unngå serum Igs forurensende produsert antistoffer.
    4. Fjerne celler og rusk med sentrifugering 460 x g i 5 min.
    5. Høste supernatants av aspirasjon med en flerkanals pipette og overføre dem i en V-bunn 96-brønns plate.
    6. Pelsen relevante Ag overnatting på 4 ° C i 100 µL per brønn av rekonstituert ELISA/ELISPOT belegg bufferen 1 x på en siste konsentrasjon av 2 µg/mL i 96-brønns ELISA plater. Se eksempler i 9.
    7. Blokk brønner med 10% FBS DMEM medium for 2t på 37 ° C
    8. Legge til 50 µL av supernatants transfekterte 293A celler fra trinn 6.1.5 og ruge 2 h på RT.
    9. Legg 100 µL av en anti-menneskelige IgG Ab konjugert til pepperrot peroxidase (HRP) enzymet på 1 µg/mL og ruge 1t ved romtemperatur. Legge til 50 µL kromogent substrat (TMB) og ruge for 20 min.
    10. Lese optisk tettheter ved 450 nm på et spektrofotometer.
      Merk: Den spesifikke mAbs avslørt av ELISA-analysen kan produseres ytterligere på stor skala og renset på protein en kolonne presentere affinitet for menneskelig IgG.
  2. Storskala produksjon og rensing av bestemte mAbs
    1. Dagen før transfection, frø 6 x 106 menneskelige embryonale nyre 293A (HEK 293A) celler til 175 cm2 flasker med 25 mL DMEM med 10% FBS. Ruge over natten i en CO2 inkubator (5% CO2) på 37 ° C.
      Merk: Celler skal 70% confluent når transfekterte.
    2. Cotransfect 293A celler i DMEM medium som inneholder 10% FBS bruker en lineær polyethylenimine derivat som transfection reagens.
      1. Fortynne 50 µL av DNA transfection reagensen i 450 µL av 150 mM NaCl. Fortynne 10 µg av vH og 10 µg vL uttrykke vektorer til 500 µL av 150 mM NaCl. Vortex 10 s hver fortynning.
      2. Legge utvannet DNA transfection reagens til DNA løsningen. Vortex 15 s og Inkuber i 15 min ved romtemperatur. Legg 1 mL mix drop-wise til cellene, og bland av forsiktig virvlende kolbe.
    3. Erstatt medium 16 h etter transfection og kultur celler i 5 dager i serum-free medium.
    4. Harvest medium av aspirating med en 25-mL pipette.
    5. Fjerne celler og rusk med sentrifugering 460 x g i 5 min.
    6. Rense antistoffer bruker en 1 mL kolonne belagt med protein A på en rask protein flytende kromatografi (FPLC) system på 4 ° C.
      1. Equilibrate protein en sepharose kolonne med 20 mM fosfatbuffer (pH 7).
      2. Filtrere celle kultur mediet 6.2.5 bruke filtere 1,22 µm og filtere 0,45 µm.
      3. Last filtrerte mediet på kolonnen.
      4. Vask med 20 mM fosfatbuffer (pH 7) og elute med en 0.1 M citrate buffer (pH 3,5).
      5. Lese optisk tettheter på 280 nm på en absorpsjon spektrofotometer og umiddelbart nøytralisere protein inneholder brøker med 1 M Tris buffer (pH 9).
    7. Dialyze renset Ab overnatting på 4 ° C i en kassett med en 3,5 K molekylvekt cutoff mot PBS buffer (pH 7.4).
    8. Sterilisere av 0,2 µm filtrering og kontroll renhet av størrelse-utestenging Ture, som indikert av produsenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Starter fra PBMC fra friske blodgivere, dette prosjektet presenterer generering av menneskelig mAbs, som anerkjenner peptid Pp65495 (Pp65, fra menneskelige cytomegalovirus) presenteres av store histocompatibility kompleks klassen jeg (MHC-jeg) molekyl HLA - A * 0201 ( HLA-A2). Disse mAbs kan skille mellom Dette komplekset og komplekser representerer andre peptider lastet inn den samme MHC-jeg molekylet.

PBMC var farget med HLA-A2/Pp65-PE og HLA-A2/Pp65-APC HLA-A2/MelA2-BV421 tetramers som beskrevet i over protokollen. Etter immunomagnetic celle berikelse av PE - og APC-tetramer positive celler, var eluted cellene farget med flere mAbs. På flyt cytometri cellen sorter, magnetisk beriket celler var første port på levedyktig CD14-CD16-CD3-CD19+ singleter (B celler). Figur 1 viser gating strategien som brukes til å isolere B-celler uttrykke BCRs kunne skille mellom HLA-A2/Pp65 og andre relaterte HLA-A2/peptid komplekser. Utvalg av B-celler av interesse ble utført etter gating HLA-A2/Pp65 PE+ og HLA-A2/Pp65 APC+ dobbel-positive, å utelukke fluorochrome bestemte B celler var enkeltvis farget PE+ eller APC+. Til slutt, svært spesifikke B-cellene ble identifisert av gating på HLA-A2/MelA2-BV421 negativ celler. Dette gjør at identifikasjonen B-celler uttrykke BCRs stand til å binde HLA-A2/Pp65, i en peptid og HLA-A2-avhengige måte, forskjellsbehandle disse B-celler og rettet mot β2 microglobulin, biotin, HLA-A2 eller de som ikke diskriminerer mellom peptider i MHC bindende sporet. Alle disse siste celler blir BV421 positive celler. Som tidligere vist og ytterligere dokumentert med andre typer Ag, denne utelukkelse strategien er viktigere på grunn av økningen i discriminative evne til B celler for Ag9.

Når én bestemt B-celler er sortert, cDNAs koding for tung og lett Ig-kjeder ble forsterket av RT PCR. Par av tunge og lette koding segmenter ble innhentet i ca 50% av enkelt B celler testet (tabell 1). Variabel domene sekvenser ble deretter klonet til uttrykk vektorer som inneholder tilsvarende konstant domene sekvenser (tunge konstant 1 og lys konstant κ eller λ). Menneskelige embryonale nyreceller (HEK, 293A celler) var cotransfected med tunge og lette kjeden vektorer. De secreted mAbs av IgG1 isotype ble høstet fra kultur-supernatants av 293A celler 5 dager etter transfection (se Figur 3 for den globale strategien fullstendig menneske mAbs produksjon). Dette produsert en HLA-A2/Pp65 spesifikt antistoff fra 3 enkelt B-lymfocytt celler gir par av tunge og lette koding segmenter (tabell 1). ELISA analyser tydelig demonstrert at dette mAb var begge MHC - og peptid-avhengige for sin binding til HLA-A2/Pp65 komplekser (figur 4A), og flere milligram mAb ble lett produsert for videre analyse (f.eks, affinitet analyser, funksjonell analyser). Den forpliktende tilhørighet, bestemmes av overflaten plasmon resonans (SPR), var ca 7 x 10-6 M (figur 4B).

Derfor denne artikkelen beskriver en kombinasjon av sensitiv og effektiv metoder gir i) oppdagelsen av relevante Ag-spesifikke B-celler, når tilstede selv på svært lave frekvenser i blodet av friske blodgivere og ii) generering av svært discriminative menneskelige mAbs.

Figure 1
Figur 1: Gjenkjenning av HLA-A2/Pp65 bestemt B celler fra menneskelige PBMC.
3 x 108 PBMC var farget med HLA-A2/Pp65-PE og HLA-A2/Pp65-APC HLA-A2/MelA2-BV421 tetramers. Etter immunomagnetic celle berikelse av PE - og APC-tetramer positive celler, var eluted cellene farget med flere mAbs. På flyt cytometri celle sortering, celler var gated først på levedyktig singlet CD14-CD16- lymfocytter (vises ikke), deretter på CD19+CD3- celler. Deretter var B-celler med både HLA-A2/Pp65-PE og HLA-A2/Pp65-APC tetramers gated. HLA-A2/MelA-BV421-tetramer ble brukt til å utelate B-celler som ikke gjenkjenner HLA-A2/Pp65, i en peptid og MHC-avhengige måte.

Figure 2
Figur 2: strategi for forsterkning og kloning av Ig gener. Lette og tunge Ig-kjeden koding gener ble forsterket av nestede RT PCR. Første PCRene ble utført med en blanding av fremover primere hybridizing leder regionen og omvendt primere bestemt for konstant regioner av aktuelle tunge, lys kappa eller lys lambda kjeder. Andre PCRene ble utført med primer som inneholder begrensningen nettsteder, forover og bakover grunning var henholdsvis spesifikk for begynnelsen av V segmenter og slutten av J segmenter. PCR produkter ble sekvensert, fordøyd med begrensning enzymer og klonet i uttrykket vektorer som inneholder riktige konstant domener. CMV: cytomegalovirus promoter; AmpR: motstand genet for ampicillin.

Figure 3
Figur 3: Generelle strategi med gjenoppbygging av rekombinant menneskelige mAbs.
En tetramer-basert sortering strategi tillater påvisning av B-celler av interesse. Svært spesifikke B-cellene var encellede sortert. Lette og tunge Ig-kjeden koding segmenter ble forsterket bruker RT PCR. Variabel domene sekvenser ble klonet i separat eukaryote uttrykk vektorer i rammen med genet segmenter koding konstant lette og tunge regioner. De tilsvarende fullstendig menneske mAbs ble uttrykt av transiently transfekterte HEK 293A celler og renset fra kultur supernatant. Dette tallet ble endret fra Ouisse et al. (2017) 9.

Figure 4

Figur 4: Karakteristikk av en representant svært discriminative mAb mot HLA-A2/Pp65 generert fra menneskelige perifert blod sirkulerende B celler.
A) spesifisitet av mAb PC1.02 mot HLA-A2/Pp65 testet av ELISA. Platene ble belagt med relevante (HLA-A2/Pp65) eller irrelevante HLA-A2 komplekser som inneholder HLA-A2-begrenset peptider: MelA, NS3 (HCV-1), og GagP17 (HIV-1) på 2 µg/mL, mAb PC1.02 ble lagt, og en anti-menneskelige IgG-HRP Ab ble brukt for påvisning. Optisk tetthet (OD) ble lest ved 450 nm. B) affinitet fastsettelse av mAb PC1.02 med overflaten Plasmon resonans (SPR) ved flyter ulike konsentrasjoner av HLA-A2/Pp65 komplekser over CM5 chip-bundet mAb. Dette tallet ble endret fra Ouisse et al. (2017) 9.

Antall PBMC Antall PE + APC + celler etter berikelse Antall utelatte (BV421 +) celler Antall sorterte enkeltceller Antall analysert brønner Antall brønner med HC og LC forbundet (% gjenoppretting) Antall mAbs produsert Antall bestemte mAbs
HLA-A2/Pp65 mAb (PC1.02) 3 x 10-8 818 117 161 7 3 (43%) 3 1

Tabell 1: Analyse av HLA-A2/Pp65 bestemt B-celler.
Virkningen av utelukkelse strategi uspesifikke B celler, avkastningen av Ig gene forsterkning og mAb produksjon fra isolert HLA-A2/Pp65 bestemte B celler ble evaluert eller måles.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Foreslåtte protokollen er en kraftig metode for generering av menneskelig mAbs direkte fra Ag-spesifikke B celler i blodet. Det kombinerer tre viktige aspekter: (i) bruk av en tetramer-assosiert magnetiske berikelse, som lar en ex vivo isolering av med sjeldne Ag-bindende B celler. (ii) en gating strategi som bruker tre Ag tetramers (to relevante enere og en irrelevante en) merket med tre ulike fluorochromes for å isolere, ved flowcytometri, bare B-celler uttrykke en BCR bestemt ønsket Ag; (iii) rekonstruksjon av den tilsvarende rekombinant mAb cDNAs av RT PCR enkeltcelle nivå og uttrykk for cDNAs i menneskeceller.

Tidligere studier foreslått å bruke ett eller to fluorescerende relevante antigener merke menneskelige B celler før sortering og påfølgende produksjonen av mAbs fra den isolerte B celler6,7,8. En analyse hos pasienter med revmatoid artritt og i en autoimmun musemodell, har tilknyttede et irrelevant fluorescerende antigen å karakterisere autoreactive B-celler og bestemme deres frekvens10,11. Så vidt vi vet, bruk en kombinasjon av to fluorescerende relevante antigen tetramers og en irrelevante antigen tetramer har ikke blitt beskrevet tidligere for anriking av bestemte B celler før bruk for produksjon av fullt menneskelige mAbs. Denne optimaliserte metoden tillater fullstendig menneske discriminative mAbs å oppnås i så lite som en måned, og kan utføre vellykket selv når du starter fra en naiv B celle repertoar. Således, det har ingen av de største ulempene med phage skjerm, human B celle immortalization, eller andre tidligere beskrevet molekylærbiologi-baserte mAb rekonstruksjon prosedyrer.

Denne cellen sortering strategi gir en høy avkastning utvinning av Ag-spesifikke menneskelig mAbs. Par av tunge og lette kjeden segmenter fra enkelt isolert B-celler er forsterket med en suksessrate på rundt 50%. Lys kjeden segmenter er nesten alltid forsterket, men dette er ikke tilfelle for tunge kjeden segmenter. RT-PCR effektiviteten avhenger av tungt respektere følgende punkter: jeg) sortert enkeltceller B må fryses så raskt som mulig; II) å legge 30 enheter av RNase hemmer og minimere tiden mellom tar B-cellene ut av fryseren og lansere RT reaksjonen; III) tining alle primere på is; IV) aldri tining fryser/primere mer enn tre ganger. v) strømpe primere for maksimalt ett år.

Om produksjonen effektiviteten av den tilsvarende rekombinant mAbs med ønsket spesifisitet er det ca 30-40% av saken for pMHC bestemte mAbs. Disse spesielle mAbs å gjenkjenne både peptid og MHC molekylet, som er ganske krevende, og vi har tidligere vist at den totale avkastningen for gjenoppretting av bestemte mAbs rettet mot mer konvensjonelle antigener er overlegen, opp til 100% for den Β-galactosidase antigen9. Det må sies at valg av en passende Ag irrelevant tetramer er viktig å øke spesifisiteten av mAbs produsert.

Affinitet til anti-HLA-A2/Pp65 mAb (PC1.02) beskrevet i denne artikkel er relativt lav, om 7 x 10-6 M, ligner affinitet til en TCR. Dette resultatet var ventet, som B-cellen aisolering ble utført fra naiv givere. De fleste tetramer+ B-cellene var IgM+IgG-, noe som reduserer sannsynligheten for å få god Ag-bindemidler. Likevel, denne metoden kan også gjøre mulig sorteringen cross-reactive minne B celler mot en ønsket Ag fra naiv givere, på grunn av immunologiske siste enkeltpersoner12. Videre er denne metoden gjelder lett vaccinated eller infiserte pasienter eller vaksineres humanized dyr, som beskrevet i 9, der i vivo affinitet modning kan øke affinitet av resulterende mAbs til ca 1 x 10-9 M. forskjellige prosedyrer har også blitt beskrevet for å forbedre slektskap av mAbs i vitro, særlig gjennom reproduserbar somatisk hypermutation i celler som uttrykker antistoffer (omtalt i 13).

I konklusjonen, foreslår vi en allsidig strategi for svært discriminative mAbs produksjon som kan brukes i ulike typer situasjonen, fra en naiv personlige vaksinert giver eller en pasient lider av en autoimmun sykdom. Fullstendig menneske mAbs generert på denne måten mot en ønsket epitope kan være nyttig både grunnforskning og immunterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker cytometri anlegget "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) for ekspert teknisk assistanse. Vi takker også betjening av rekombinant protein produksjon (P2R) og innvirkning plattformer (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) for deres teknisk støtte. Vi takker Emmanuel Scotet og Richard Breathnach for konstruktive kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble økonomisk støttet av IHU-Cesti prosjektet finansiert av «Investissements d'Avenir» franske regjering programmet administreres av den franske National Research Agency (ANR) (ANR-10-IBHU-005). IHU-Cesti prosjektet er også støttet av Nantes Métropole og Région Pays de la Loire. Dette arbeidet ble realisert i sammenheng med LabEX IGO programmet støttet av National Research Agency via investering av fremtidige programmet ANR-11-LABX-0016-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK 293A cell line Thermo Fisher scientific R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by life technologies 21969-035 (+) 4,5g/L D-Glucose
0,11g/L Sodium Pyruvate
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X) Gibco by life technologies 31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA) PAA K45-001
Nutridoma-SP Roche 11011375001 100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 Ambion AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 Invitrogen by Life Technologies 15575-020
Fetal Bovine serum (FBS) Dominique Dutscher S1810-500
Ficoll - lymphocytes separation medium EuroBio CMSMSL01-01 density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate Invitrogen by Life Technologies S21388 premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate Invitrogen by thermoFisher scientific S32362 1mg/ml
2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin Biolegend 405225 conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor Miltenyi Biotec 130-042-302/130-090-976
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
CD3 BV510 BD horizon BD Pharmingen / BD Biosciences 563109 Used dilution 1:20
CD19 FITC BD Pharmingen / BD Biosciences 345788 Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 561116 Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 338440 Used dilution 1:50
7AAD BD Pharmingen / BD Biosciences 51-68981E (559925) Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer BD Biosciences
8-strip PCR tubes Axygen 321-10-061
Racks for 96 microtubes Dominique Dutscher 45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) Invitrogen by thermoFisher scientific 10777-019 qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free Gibco 10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer New England BioLabs S1316S 5.0 A260unit
Random hexamers Invitrogen by thermoFisher scientific N8080127 qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen by thermoFisher scientific 18080-044 qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase Promega M7805
dNTP Set, Molecular biology grade Thermo Scientific R0182 4*100umol
5LVH1 Eurofins ACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH3 Eurofins AAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVL4_6 Eurofins CCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH5 Eurofins CAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
3HuIgG_const_anti Eurofins TCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1 Eurofins GGGAATTCTCACA
GGAGACGA		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2 Eurofins ATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk3 Eurofins CTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk4 Eurofins ATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566 Eurofins GTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5 Eurofins GCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'LVl1 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl2 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl3 Eurofins GCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5 Eurofins GGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl6 Eurofins GTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl7 Eurofins GGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5LVl8 Eurofins GAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
3'Cl Eurofins CACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3 Eurofins CTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5 Eurofins CTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6 Eurofins CTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8 Eurofins CTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
3'XhoICl Eurofins CTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense Eurofins GCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		 Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade MP Bio AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate Macherey Nagel 743.100.100
Enzyme Age I HF New England Biolabs R3552L 20000U/ml
Enzyme SalI HF New England Biolabs R3138L 20000U/ml
Enzyme Xho I New England Biolabs R0146L 20000U/ml
Enzyme BSIWI New England Biolabs R0553L 10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase Invitrogen by thermoFisher scientific 15224.017 100U (1U/ul)
2X YT medium Sigma Aldrich Y1003-500ML
Ampicillin Sigma Aldrich 10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification Macherey Nagel 740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent PolyPlus 101-40
Flat bottom96-well plate Falcon 353072
V-bottom 96-well plate Nunc/Thermofisher 055142
Nunc easy 175 cm2 flasks Nunc/Thermofisher 12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer eBiosciences 00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates Nunc/Thermofisher 44-2404-21 high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) BD Pharmingen / BD Biosciences 55788
TMB substrate BD Biosciences 555214
Streptavidin Sigma S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column GE Healthcare 17-0402-01
ÄKTA FPLC GE Healthcare 18190026
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System BioRad 7880003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
  7. Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532 (2011).
  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
  9. Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3 (2017).
  10. Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
  11. Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
  12. Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
  13. Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).

Tags

Immunologi problemet 132 immunologi mobilnettet biologi menneskelige antistoffer B celle tetramer flowcytometri enkelt celle antigen-spesifikke magnetiske berikelse

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes, Nantes, France

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

Generasjon av Discriminative menneskelige monoklonale antistoffer fra sjeldne Antigen-spesifikke B celler i blodet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devilder, M. C., Moyon, M.,… More

Devilder, M. C., Moyon, M., Saulquin, X., Gautreau-Rolland, L. Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood. J. Vis. Exp. (132), e56508, doi:10.3791/56508 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter