Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung von menschlichen Antikörpern, die spezifisch für ein Antigen des Interesses, ausgehend von seltenen B-Zellen im menschlichen Blut zirkulieren. Generation dieser natürliche Antikörper ist rasch und effizient, und die Antikörper erhalten können sehr ähnliche Antigene unterscheiden.
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Methodenartikel
Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Monoklonale Antikörper (mAbs) sind mächtige Werkzeuge nützlich für beide Grundlagenforschung und in der Biomedizin. Ihre hohe Spezifität ist unverzichtbar, wenn der Antikörper sehr ähnliche Strukturen (z.B., ein normales Protein und eine mutierte Version davon) unterscheiden muss. Der aktuelle Weg erzeugen solche diskriminierenden mAbs beinhaltet umfangreiche Screening von mehreren Ab-produzierenden B-Zellen, ist kostspielig und zeitaufwendig. Wir schlagen hier eine schnelle und kostengünstige Methode zur Erzeugung von diskriminierendem, vollständig humaner mAbs ausgehend von menschlichem Blut zirkulierenden B-Lymphozyten. Die Originalität dieser Strategie ist durch die Auswahl der spezifischen Antigen Bindung B Zellen kombiniert mit dem Counter Auswahl aller anderen Zellen, mit leicht verfügbaren peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMC). Sobald bestimmte B-Zellen isoliert sind, stammen cDNA (ergänzende Desoxyribonukleinsäure) Sequenzen Codierung für die entsprechenden mAb Einzelzelle Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Technologie und anschließend ausgedrückt in der Human- Zellen. Innerhalb von weniger als 1 Monat ist es möglich, Milligramm hochgradig diskriminierend menschlichen mAbs gegen nahezu jede gewünschte Antigen natürlich erkannt durch die B-Zell-Repertoires zu produzieren.
Einleitung
Die hier beschriebene Methode ermöglicht die schnelle und vielseitige Produktion vollständig humaner monoklonaler Antikörper (mAbs) gegen eine gewünschte Antigen (Ag). mAbs sind unverzichtbare Werkzeuge in vielen Grundlagenforschung Anwendungen in Vitro und in Vivo: flow Cytometry, Histologie, Western-Blot und blockierende Experimente zum Beispiel. Darüber hinaus werden mAbs mehr und mehr in der Medizin zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Krebs und Transplantation Ablehnung1Steuern eingesetzt. Anti-CTLA-4 und Anti-PD-1 (oder Anti-PD-L1) mAbs dienten zum Beispiel kürzlich als immun Checkpoint-Hemmern bei Krebs-Behandlunge....
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Protokoll
Alle menschlichen peripheren Blutproben stammen von anonymen Erwachsenen Spendern nach Einwilligung gemäß der lokalen Ethikkommission (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, Verfahren Les NTS-2016-08).
1. Isolierung der menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen
Hinweis: Ausgangsmaterial kann insgesamt menschlichen peripheren Blut oder Cytapheresis Proben sein. Proben sollten nicht älter als 8 h sein und mit Antikoagulantien (z.B. Heparin) ergänzt.
- Verdünnen Sie Blut mit 2 Bände (menschlichen peripheren Blut) oder 5 Bände (Cytapheresis Beispiel) von RPMI (Roswell Park Memorial Insti....
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Ergebnisse
Ausgehend von PBMC von gesunden Spendern dieses Projekt stellt die Erzeugung von menschlichen mAbs, die das Peptid Pp65495 erkennen (Pp65, von menschlichen Zytomegalievirus) durch die großen Histocompatibility complex-Klasse habe ich vorgelegt (MHC-ich) Molekül HLA - A * 0201 () HLA-A2). Diese mAbs können zwischen diesem Komplex und aus anderen Peptiden verladen der gleichen MHC-komplexe unterscheiden-ich Molekül.
PBM.......
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Diskussion
Das vorgeschlagene Protokoll ist eine leistungsfähige Methode für die Erzeugung von menschlichen mAbs direkt vom Ag-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden. Es vereint drei wichtige Aspekte: (i) die Verwendung von ein Tetramer-assoziierte magnetische Anreicherung, wodurch eine ex-Vivo -Isolierung auch seltene Ag-Bindung B-Zellen; (Ii) eine gating Strategie, die drei Ag-Tetramers (zwei relevante und irrelevante eins) beschriftet mit drei verschiedenen Fluorochromes verwendet, um durch Durchflusszytometrie, nu.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken der Zytometrie Anlage "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) für kompetente technische Unterstützung. Wir danken auch das gesamte Personal der Produktion rekombinanter Proteine (P2R) und der Auswirkungen Plattformen (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) für ihre technische Unterstützung. Wir danken Emmanuel Scotet und Richard Breathnach für konstruktive Kritik am Manuskript. Diese Arbeit wurde von der IHU-Cesti-Projekt gefördert durch die «Investissements Avenir» französische Regierung Programm, verwaltet von der französischen nationalen Forschung Agentur (ANR) (ANR-10-IBHU-005) finanziell unterstützt. IHU-Cesti-Projekt wird auch von Nantes Mét....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| HEK 293A Zelllinie | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco von life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Natriumpyruvat (-) L-Glutmine |
| RPMI Medium1640 (1X) | Gibco von life technologies | 31870-025 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | PAA | K45-001 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
| PBS-Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
| EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) 0,5M pH=8 | Invitrogen von Life Technologies | 15575-020 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
| Ficoll - Trennung von Lymphozyten mittel | EuroBio | CMSMSL01-01 | Dichte 1,0777+/-0,001 |
| Streptavidin R-Phycoerythrin Konjugat | Invitrogen von Life Technologies | S21388 | Premium-Qualität 1mg/ml enthält 5 mM Natriumazid |
| Streptavidin, Allophycocyanin-Konjugat | Invitrogen von thermoFisher scientific | S32362 | 1 mg/ml 2 mM Azid Premium-Brillantviolett |
| 421 Streptavidin | Biolegend | 405225 | Konz : 0,5mg/ml |
| Anti-PE konjugierte magnetische MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-APC konjugierte magnetische MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| MidiMACs oder QuadroMACS Separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
| LS Säulen | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Gebrauchte Verdünnung 1:20 |
| CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Gebrauchte Verdünnung 1:20 |
| CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Gebrauchte Verdünnung 1:50 |
| CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Gebrauchte Verdünnung 1:50 |
| 7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Verwendete Verdünnung 1:1000 |
| FACS ARIA III Cell Sorter Zytometer | BD Biosciences | ||
| 8-Streifen PCR Röhrchen | Axygen | 321-10-061 | |
| Racks für 96 Mikroröhrchen | Dominique Dutscher | 45476 | |
| RNAseOUT Ribonuklease-Inhibitor (rekombinant) | Invitrogen von thermoFisher scientific | 10777-019 | Menge:5000U (40U/ul) |
| Destilliertes Wasser Dnase/RNASE-frei | Gibco | 10977-035 | |
| Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
| Zufällige Hexamere | Invitrogen von thermoFisher scientific | N8080127 | Menge: 50uM, 5nmoles |
| Superscript III Reverse Transkriptase | Invitrogen von thermoFisher scientific | 18080-044 | Menge : 10000U (200U/ul) |
| GoTaq G2 Flexi DNA-Polymerase | Promega | M7805 | |
| dNTP Set, Molekularbiologie | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
| 5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG | Erste PCR-Runde - Amplifikation von Schwerketten - Äußere Primer - Forward Prmers |
| 5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG | Erste PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Äußere Primer - Forward Prmers |
| 5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG | Erste PCR-Runde - Amplifikation von schweren Ketten - Äußere Primer - Forward Prmers |
| 5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG | Erste PCR-Runde - Amplifikation von schweren Ketten - Äußere Primer - Forward Prmers |
| 3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT | Erste Runde der PCR - Amplifikation von schweren Ketten - Äußere Primer - Reverse Primer für humanes Ig - Bakterien PCR-Screening |
| 3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA | Erste Runde der PCR - Amplifikation von schweren Ketten - Äußere Primer - Reverse Primer für humanes Ig |
| 5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG | Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer -Forward Primer |
| 5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG | Zweite Runde der PCR - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer |
| 5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG | Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer |
| 5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG | Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer |
| 5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG | Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärts-Primer |
| 5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG | Zweite Runde der PCR - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer |
| 5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG | Zweite Runde der PCR - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer |
| 5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT Zweite | PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer |
| 5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG | Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Vorwärtsprimer |
| 3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG | Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Reverse Primer |
| 3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG | Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Reverse Primer |
| 3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGAGGGTGACCGTG | Zweite PCR-Runde - Amplifikation schwerer Ketten - Innere Primer - Reverse Primer |
| 5' LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG | Erste PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Äußere Primer -Vorwärtsprimer |
| 5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG | Erste PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten k - Äußere Primer - Vorwärtsprimer |
| 5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTCTG | Erste PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Äußere Primer -Vorwärtsprimer |
| 3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA | Erste PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Äußere Primer - Reverse Primer - Bakterien-PCR-Screening |
| 5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC | Zweite PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer |
| 5'AgeIVk1_9_1– 13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT Zweite | PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer -Vorwärtsprimer |
| 5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC | Zweite PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer |
| 5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC | Zweite PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer -Vorwärtsprimer |
| 5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC | Zweite Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer |
| 5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC Zweite | PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer |
| 5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC | Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer |
| 5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTGTTGACCAGTCT | Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer |
| 5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC | Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten k - Innere Primer - Vorwärtsprimer |
| 3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC | Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten k - Innere Primer - Vorwärts-Primer |
| 3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC | Zweite Runde der PCR - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer - Forward Primer |
| 3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTC Zweite | Runde der PCR - Amplifikation von Leichtketten k - Innere Primer - Forward Primers |
| 5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG | Erste PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten λ - Äußere Primer -Forward Primer |
| 5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG | Erste Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten λ - Äußere Primer -Forward Primer |
| 5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG | Erste Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten λ - Äußere Primer -Forward Primer |
| 5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG | Erste Runde der PCR - Amplifikation von Leichtketten λ - Äußere Primer -Forward Primer |
| 5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG | Erste Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten λ - Äußere Primer -Forward Primer |
| 5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG | Erste PCR-Runde - Amplifikation von Leichtketten λ - Äußere Primer -Forward Primer |
| 5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG | Erste Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten λ - Äußere Primer -Forward Primer |
| 3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG | Erste Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten λ - Äußere Primer - Forward Primer |
| 5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG | Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten λ - Innere Primer - Forward Primer |
| 5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG | Zweite PCR-Runde - Amplifikation von leichten Ketten λ - Innere Primer - Forward Primer |
| 5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG | Zweite Runde der PCR - Amplifikation von Leichtketten λ - Innere Primer - Forward Primer |
| 5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA | Zweite Runde der PCR - Amplifikation von Leichtketten λ - Innere Primer - Forward Primer |
| 5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGCC AATTTTATGCTGACTCAG | Zweite Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten λ - Innere Primer - Vorwärtsprimer |
| 5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG | Zweite Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten λ - Innere Primer - Vorwärtsprimer |
| 3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG | Zweite Runde der PCR - Amplifikation von leichten Ketten λ - Innere Primer - Reverse Primer - Bakterien-PCR-Screening |
| Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC | Bakterien-PCR-Screening |
| QA Agarose-TM, Molekularbiologie MP | Bio AGAH0500 | ||
| NucleoFast 96 PCR-Platte | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
| Enzym Alter I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
| Enzym SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
| Enzym Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
| Enzym BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
| HCg1 (Genbank-Zugangsnummer FJ475055) | |||
| LCk (Genbank-Zugangsnummer FJ475056 ) | |||
| LCl (Genbank-Beitritt Anzahl FJ517647) | |||
| T4 DNA-Ligase | Invitrogen von thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
| 2X YT medium | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
| LB (Luria Bertani) Bouillon (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
| Nukleospin Plasmid DNA, RNA und Proteinaufreinigung | Macherey Nagel | 740588.250 | |
| Jet PEI DNA-Transfektionsreagenz | PolyPlus | 101-40 | |
| 96-Well-Platte mit flachem Boden | Falcon | 353072 | |
| 96-Well-Platte mit V-Boden | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
| Nunc easy 175 cm2 Kolben | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
| ELISA/ELISPOT Beschichtungspuffer | eBiosciences | 00-0044-59 | |
| Nunc Maxisorp mit flachem Boden 96 Well ELISA-Platten | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | hohe Proteinbindung |
| Anti-Human-IgG Ab konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
| TMB-Substrat | BD Biosciences | 555214 | |
| Streptavidin | Sigma | S0677 | |
| 1 mL-HiTrap-Protein A HP-Säule | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
| Ä KTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
| Superdex 200 10/300 GL Säule | GE Healthcare | 17517501 | |
| NGC Quest 10 Plus Chromatographie System | BioRad | 7880003 |
Referenzen
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
- Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.
The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France
