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Immunology and Infection

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/56508
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

ERRATUM NOTICE

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung von menschlichen Antikörpern, die spezifisch für ein Antigen des Interesses, ausgehend von seltenen B-Zellen im menschlichen Blut zirkulieren. Generation dieser natürliche Antikörper ist rasch und effizient, und die Antikörper erhalten können sehr ähnliche Antigene unterscheiden.

Abstract

Monoklonale Antikörper (mAbs) sind mächtige Werkzeuge nützlich für beide Grundlagenforschung und in der Biomedizin. Ihre hohe Spezifität ist unverzichtbar, wenn der Antikörper sehr ähnliche Strukturen (z.B., ein normales Protein und eine mutierte Version davon) unterscheiden muss. Der aktuelle Weg erzeugen solche diskriminierenden mAbs beinhaltet umfangreiche Screening von mehreren Ab-produzierenden B-Zellen, ist kostspielig und zeitaufwendig. Wir schlagen hier eine schnelle und kostengünstige Methode zur Erzeugung von diskriminierendem, vollständig humaner mAbs ausgehend von menschlichem Blut zirkulierenden B-Lymphozyten. Die Originalität dieser Strategie ist durch die Auswahl der spezifischen Antigen Bindung B Zellen kombiniert mit dem Counter Auswahl aller anderen Zellen, mit leicht verfügbaren peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMC). Sobald bestimmte B-Zellen isoliert sind, stammen cDNA (ergänzende Desoxyribonukleinsäure) Sequenzen Codierung für die entsprechenden mAb Einzelzelle Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Technologie und anschließend ausgedrückt in der Human- Zellen. Innerhalb von weniger als 1 Monat ist es möglich, Milligramm hochgradig diskriminierend menschlichen mAbs gegen nahezu jede gewünschte Antigen natürlich erkannt durch die B-Zell-Repertoires zu produzieren.

Introduction

Die hier beschriebene Methode ermöglicht die schnelle und vielseitige Produktion vollständig humaner monoklonaler Antikörper (mAbs) gegen eine gewünschte Antigen (Ag). mAbs sind unverzichtbare Werkzeuge in vielen Grundlagenforschung Anwendungen in Vitro und in Vivo: flow Cytometry, Histologie, Western-Blot und blockierende Experimente zum Beispiel. Darüber hinaus werden mAbs mehr und mehr in der Medizin zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Krebs und Transplantation Ablehnung1Steuern eingesetzt. Anti-CTLA-4 und Anti-PD-1 (oder Anti-PD-L1) mAbs dienten zum Beispiel kürzlich als immun Checkpoint-Hemmern bei Krebs-Behandlungen2.

Der erste mAbs stammen von Immunglobulin (Ig)-sezernierenden Hybridome aus der Milz Zellen der immunisierten Mäusen oder Ratten gewonnen. Allerdings behindert die starke Immunantwort gegen Murine oder Ratte mAbs ihre therapeutische Anwendung beim Menschen, durch ihre schnelle Abfertigung und die wahrscheinlich Induktion von Überempfindlichkeit Reaktionen3. Um dieses Problem anzugehen, haben teilweise tierisches Eiweiß-Sequenzen von mAbs menschlich, so genannte Chimäre Maus-Mensch oder humanisierte Antikörper erzeugen abgelöst. Diese Strategie verringert sich jedoch nur teilweise Immunogenität, während deutlich erhöht, die Kosten und die Zeit-Skala der Produktion. Eine bessere Lösung besteht darin, menschliche mAbs direkt aus humanen B-Zellen zu generieren und mehrere Strategien hierfür zur Verfügung. Eine davon ist die Verwendung von Phagen oder Hefe Display. Dies umfasst Anzeigen Variable Domänen aus einer kombinatorischen Bibliothek von zufälligen menschlichen Ig schwere und Licht Ketten auf Phagen oder Hefen und Durchführung einer Auswahlschritt mit den spezifischen Antigen des Interesses. Ein großer Nachteil dieser Strategie ist, dass schwere und leichte Kette nach dem Zufallsprinzip verbunden, was zu einer sehr großen Zunahme in der Vielfalt der erzeugten Antikörper sind. Antikörper, die erhalten sind voraussichtlich nicht denen entsprechen, die durch eine natürliche Immunantwort gegen ein bestimmtes Ag entstehen würde. Darüber hinaus sind menschliche Protein-Falte und post-translationalen Modifikationen nicht systematisch in Prokaryoten oder sogar in Hefen reproduziert. Eine zweite menschliche mAb-Produktions-Methode ist die Verewigung der natürlichen menschlichen B-Zellen durch Epstein - Barr-Virus-Infektion oder Ausdruck der Anti-apoptotische Faktoren BCL-6 und BCL-XL4. Allerdings ist diese Methode gilt nur für B-Gedächtniszellen und ist ineffizient, dass Screening von zahlreichen mAb-produzierenden verewigt B-Zellen, die nur wenige (wenn überhaupt) mAb-Klone mit der gewünschten Antigen-Spezifität zu identifizieren. Die Methode ist so teuer und zeitaufwändig.

Vor kurzem wurde ein neues Protokoll für die Produktion von menschlichen mAbs von isolierten einzelnen B Zellen5beschrieben. Es stützt sich auf eine optimierte einzellige Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur Verstärkung der beiden die Heavy - und Lichterkette Codierung Segmente aus einer einzigen sortierten B-Zelle. Darauf folgt das Klonieren und die Expression dieser Segmente in einer eukaryotischen Expressionssystems, wodurch Wiederaufbau vollständig humaner MAB. Dieses Protokoll wurde erfolgreich ausgehend von B-Zellen von geimpften Spendern verwendet. Zellen wurden mehrere Wochen nach der Impfung zu höhere Frequenzen der B-Zellen gerichtet gegen die gewünschte Ag erhalten, und den Zeitaufwand für das screening von6geerntet. Anderen vollständig humaner mAbs wurden auch von+ (Human Immunodeficiency Virus) HIV-infizierten Patienten7 und Melanom Patienten8produziert. Trotz dieser Fortschritte gibt es noch keine Verfahren zur Verfügung, die die Isolation der Ag-spezifische B-Zellen unabhängig von ihrer Erinnerung Phänotyp oder Frequenz ermöglicht.

Hier beschriebenen Verfahrens führt zu effizienten ex Vivo Isolation der menschlichen zirkulierenden B-Zellen basierend auf ihre BCR Spezifität, gefolgt von der Produktion von vollständig humaner antigenspezifischen mAbs in hoher Ausbeute und mit einer niedrigen Screening-Zeit. Die Methode ist nicht zu B-Gedächtniszellen oder Antikörper-sezernierenden B-Zellen nach einer Immunantwort induziert beschränkt, sondern kann auch auf das menschliche naive B-Zelle Repertoire angewendet werden. Es funktioniert sogar ab Ag-spezifische B-Zellen bei sehr tiefen Frequenzen ist ein guter Indikator für die Effizienz. Das Prinzip der Methode ist wie folgt: periphere Blut mononukleären Zellen (PBMC) sind mit zwei Tetramers präsentiert das Antigen des Interesses befleckt, jeder gekennzeichnet mit einem unterschiedlichen Fluorochrom (z. B.Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (APC)), und eine dritte Tetramer präsentiert eine eng verwandte Antigen konjugiert mit einem dritten Fluorochrom (z. B.Brillant violett 421 (BV421)). Um für Antigen-bindenen Zellen anzureichern, Zellen werden dann mit Perlen mit Anti-PE beschichtet inkubiert und Anti-APC Abs, und in Zelle Trennung Spalten sortiert. Die APC PE+ + Zelle Bruchteil ausgewählt ist, gebeizt mit einer Vielzahl von mAbs spezifisch für verschiedene PBMC Zelltypen zur Identifizierung von B-Zellen und unterworfenen Zytometrie Zellsortierung fließen. B-Zellen sind PE+ und APC+, aber brillant violett-, sind isoliert. Dieser Schritt wählt gegen Zellen, die nicht B-Zellen oder binden Sie nicht an die tetramerized Antigen, sondern binden PE oder APC (diese Zellen werden PE+ APC– oder PE– APC+) oder zum Teil nicht-Antigen der Tetramers verwendet (diese Zellen werden BV421+). B-Zellen nicht hochspezifisch für das Epitop von Interesse sind auch Counter bei diesem Schritt ausgewählt (diese Zellen werden auch BV421+). Somit kann diese Methode hochspezifische B-Zellen, B-Zell-Rezeptoren (BCR) in der Lage ist zu unterscheiden zwischen zwei eng verwandte Antigene ausdrücken reinigen. Einzelne spezifische B-Zellen sind in Tuben gesammelt und ihre PCR verstärkt Ig cDNAs (ergänzende Deoxyribonucleic Säuren) geklont und durch eine menschliche Zelllinie als sekretierten IgG mAbs ausgedrückt.

Diese Studie beschreibt, wie ein Proof of Concept, die effiziente Erzeugung von menschlichen mAbs, die erkennen, eine Peptid mit einem großen Histocompatibility complex-Klasse habe ich vorgelegt (MHC-ich) Molekül und kann unterscheiden dieses Peptid und anderen Peptiden beladen auf dem gleichen MHC-ich Allel. Obwohl der Grad der Komplexität dieser AG wichtig ist, können mit dieser Methode (i) high-Yield-Rückgewinnung von Ag-spezifische mAbs; (Ii) Produktion von mAbs in der Lage, zwischen zwei strukturell enger Ags zu unterscheiden. Dieser Ansatz zu geimpften oder infizierten Patienten ohne jegliche Änderung Protokoll erweitert werden und hat auch bereits in einem humanisierten Ratte System9erfolgreich umgesetzt. Diese Studie beschreibt also, eine vielseitige und effiziente Vorgehensweise um vollständig humaner mAbs, die verwendet werden können in Grundlagenforschung und Immuntherapie zu generieren.

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Protocol

Alle menschlichen peripheren Blutproben stammen von anonymen Erwachsenen Spendern nach Einwilligung gemäß der lokalen Ethikkommission (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, Verfahren Les NTS-2016-08).

1. Isolierung der menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen

Hinweis: Ausgangsmaterial kann insgesamt menschlichen peripheren Blut oder Cytapheresis Proben sein. Proben sollten nicht älter als 8 h sein und mit Antikoagulantien (z.B. Heparin) ergänzt.

  1. Verdünnen Sie Blut mit 2 Bände (menschlichen peripheren Blut) oder 5 Bände (Cytapheresis Beispiel) von RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Medium.
  2. Sorgfältig Schicht 35 mL verdünnter Zellsuspension auf 15 mL Dichte Gradienten Medium in einem 50 mL konische Röhrchen. Machen Sie so viele Rohre wie nötig, um das verdünnte Blut verteilen. Zentrifugieren Sie bei 1.290 x g für 25 min bei Raumtemperatur in ein Schwingen-Eimer-Rotor mit Bremse ab.
  3. Vorsichtig aspirieren Sie der mononukleären Zellschicht an der Schnittstelle zwischen dem Dichte-Gradienten-Medium und der Plasmaschicht und übertragen Sie die Zellen auf ein neues 50 mL konische Rohr.
  4. Füllen Sie das Rohr mit RPMI Medium, mischen und Zentrifugieren bei 1.290 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den überstand.
  5. Aufschwemmen der Zelle-Pellets in 20 mL RPMI Medium und Zentrifuge bei 200 X g für 10 min um die Thrombozyten zu entfernen. Entfernen Sie vorsichtig den überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
  6. Aufschwemmen der Zelle Pellet in RPMI Medium mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS).
    Hinweis: Gehen Sie direkt zu Tetramer zu beschriften oder zu halten Sie Zellen bei 4 ° C über Nacht in einer Konzentration von 107 Zellen/mL.

2. Tetramer-assoziierte magnetische Anreicherung von Ag-spezifische B-Zellen

  1. Ag-Tetramers vorbereiten, indem man entweder PE oder APC-Label Premium Grade Streptavidin oder BV421-mit der Bezeichnung Streptavidin in einem Molverhältnis von 1:4 bis biotinylierte Antigen Monomere. Fügen Sie die entsprechende Menge an Streptavidin-Konjugat in drei getrennte Teile, Hinzufügen einer aliquoten alle 10 min bei Raumtemperatur.
  2. Zellen (bis zu 3 x 108 pro Röhre) in 15 mL konische Röhrchen zu verteilen und bei 460 X g für 5 min zentrifugieren.
    Hinweis: Das folgende Protokoll ist für eine Röhre.
  3. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 200 µL PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) mit 2 % FBS. Hinzufügen von PE, APC und BV421 konjugiert Tetramers, jeweils um eine Endkonzentration von 10 µg/mL. Gut mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Bereiten Sie eiskalte Zelle Trennung Puffer (SB) mit PBS mit 0,5 % BSA (Bovine Serum Albumin) und EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Säure) 2 mM.
  5. 10 mL GBL Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 460 X g für 5 min zugeben.
  6. Zellen in 500 µL eiskalte SB hinzufügen 50 µL Anti-PE und 50 µL Anti-APC magnetische Microbeads aufzuwirbeln.
  7. Gut mischen und 20 min bei 4 ° c inkubieren
  8. Wiederholen Sie Schritt 2.5 zweimal.
  9. Den Überstand sorgfältig beseitigen Andresuspend Zelle Pellet in einer Konzentration von 2 x 108 Zellen/mL in Eis kalt SB.
  10. Equilibrate eine große magnetische Spalte auf einen Magneten mit 3 mL SB positioniert.
  11. Übertragen Sie Zellsuspension von 2,9 auf den oberen Teil der äquilibriert Spalte und lassen Sie ihn vollständig zu entleeren. WICHTIGER Schritt: Zur Vermeidung von Verklumpung der Spalte durchlaufen Sie Zellen eine 70 µm-Nylon-Netzgewebe.
  12. Spülen Sie das Rohr enthielt die Zellen mit 3 mL Eis kalt SB und übertragen Sie den Puffer direkt auf die Spalte (bei Filtration, spülen die 70 µm Nylon-Mesh) zu.
  13. Wenn der Puffer in der Spalte vollständig entleert hat, ein weiteres 3 mL Eis kalt SB hinzufügen der Spalte.
  14. Wiederholen Sie Schritt 2.13 für ein anderes 3 mL waschen.
  15. Entfernen Sie die Spalte aus der Magnet und über eine 15 mL konische Sammelrohr.
  16. Fügen Sie 5 mL Eis kalt SB auf der Oberseite der Spalte hinzu und sofort spülen Sie die Zellen aus der Spalte mit den Kolben. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
  17. Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen (angereicherte relevanten Tetramer positive Zelle Bruch) bei 460 X g für 5 min und fahren Sie mit zusätzlichen Antikörper Färbung.
    Hinweis: Pool gesammelt Zellen aus allen Rohren, falls zutreffend.

3. Färbung des Ag-spezifischen menschlichen B-Zellen und Zellsortierung

  1. Aufschwemmen der Zelle Pellet mit einem Cocktail aus Anti-Human-Antikörper gegen CD3 (Endverdünnung: 01:20), CD19 (01:20), CD14 (01:50), CD16 (01:50), und 7AAD (1: 1000) in einem Endvolumen von 100 µL PBS mit 2 % FBS. 30 min bei 4 ° c inkubieren
  2. Zellen, Zentrifuge bei 460 X g für 5 min, 10 mL PBS hinzu und beseitigen Sie den Überstand zu. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 200 µL PBS, Filter auf 70 µm-Nylon-Netzgewebe.
  3. Fahren Sie mit bestimmte B-Zellen auf der Ebene der einzelnen Zelle auf eine Zelle Sorter Cytometer 100 µm-Düse mit einem Druck von 20 Psi zu sortieren, ohne mehr als 1.000 Veranstaltungen/s9.
    Hinweis: Gating Strategie verwendet, ist in Abbildung 1. dargestellt. Zellen wurden zuerst auf CD14 gated–CD16–7AAD– -Zellen, Monozyten, NK und abgestorbenen Zellen (nicht in Abbildung 1dargestellt) auszuschließen. Dann CD19+ B Zellen vor Anspritzung auf doppelte gefärbten Zellen von PE und APC relevanten Ag-Tetramers ausgewählt wurden. Nicht-spezifische B-Zellen wurden durch Anspritzung auf BV421 negative Zellen (unbefleckt von irrelevanten Ag-Tetramer) ausgeschlossen.
  4. Sammeln Sie einzelne B-Zellen in 8 Streifen PCR Schläuche zuvor gefüllt mit 10 µL 1 X PBS und 10 Einheiten von RNAse-Inhibitor und platziert auf einem Gestell für 96 Mikroröhrchen. Sofort frieren Sie die PCR-Röhrchen bei-80 ° C ein.
    Hinweis: Die Art Masken auf dem Cytometer Instrument gewählt sind Ertrag Maske: 0, Reinheit Maske: 32 und Phase Maske: 0. einzellige Kaution könnte eine 96 oder 384-Well-PCR-Platte angepasst werden, wenn nötig. Einzelne B-Zellen müssen so schnell wie möglich eingefroren werden und können bei-80 ° C für mehrere Wochen gelassen werden, wenn nötig.

4. einzelne Zelle RT-PCR

  1. Lösen Sie Zellen durch direkt erhitzen die gefrorenen Proben in PCR-Streifen bei 70 ° C für 5 min in ein Trockenbad.
  2. Übertragen Sie Streifen um Eis und fahren mit reverse Transkription (RT) durch Zugabe von 10 µL pro Röhre eines 2 x master-Mix-Puffer mit 1 mM dNTP, 25 µg/mL oligod(T) Primer 5 µM zufällige Hexamers, 20 Einheiten der RNAse-Inhibitor und 400 Einheiten der reversen Transkriptase.
    Hinweis: Nach dem Auftauen Zelle muss RT schnell durchgeführt, um RNA-Abbau zu vermeiden.
  3. Inkubation bei 25 ° C für 5 min um zufällige Hexamers zu hybridisieren, dann 1 h bei 50 ° C inkubieren und enden mit einer Inkubation bei 95 ° C für 3 min um die Reaktion zu stoppen zu ermöglichen.
  4. Fahren Sie mit zwei Runden der verschachtelten PCR Verstärkung für jede der Regionen Codierung für Variable schwere (vH) und Kappa (vLκ) oder Lambda-Leichtketten (vLλ).
    Hinweis: Alternativ RT Proben können bei-20 ° C eingefroren und gehalten werden für eine Woche.
    1. Für die erste Runde der PCR hinzufügen 3 µL cDNA für eine 40 µL Endvolumen mit 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, 2,5 Einheiten der DNA-Polymerase und 200 nM von äußeren Primern (siehe Abbildung 2 und Tabelle der Materialien für Primer-Sequenzen).
      Hinweis: Zusammensetzung der äußeren Primern Mischung. Für die Verstärkung der schweren Kette: 4 vorwärts Primer (5' LVH Mix) und 2 reverse Primer (3' CµCγ Mix). Für leichte Kappa Kette Verstärkung, 3 vorwärts Primer (5' LV | mischen) und 1 Rückwärtsgang Grundierung (3' Cκ543-566). Für leichte Lambda-Kette Verstärkung 7 forward Primer (5' LVl Mischung) und 1 Rückwärtsgang Grundierung (3' Cl).
      Hinweis: Tiller Et Al. zur Verstärkung von allen schweren und leichten Kette Familie Gene5wurden Grundierungen entworfen.
    2. Gelten die folgenden Bedingungen wie Radsport: 94 ° C für 4 min, gefolgt von 40 Zyklen von 30 s bei 94 ° C, 30 s bei 58 ° C VH und VLκ (60 ° C für VLλ) und 55 s bei 72 ° C, mit einer endgültigen Dehnung Schritt bei 72 ° C für 7 Minuten.
    3. Verwenden Sie für die zweite Runde PCR 3 µL das erste Amplifikationsprodukt für einem Endvolumen von 40 µL mit 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTPs, 2,5 Einheiten der DNA-Polymerase und 200 nM inneren Zündkapseln mit Restriktionsenzym Standorten für das Klonen in Ausdruck Vektoren (siehe Abbildung 2 und Tabelle der Materialien für Primer-Sequenzen).
      Hinweis: Zusammensetzung des inneren Primer-Mix. Für schwere Kette Verstärkung: 9 vorwärts Primer (5' AgeIVH-Mix) und 3 reverse Primer (3' SalIJH Mix). Für leichte Kappa Kette Verstärkung, 9 vorwärts Primer (5' AgeIV | mischen) und 3 reverse Primer (3' BsiWIJκ Mix). Für leichte Lambda-Kette Verstärkung 6 forward Primer (5' AgeIVl Mischung) und 1 Rückwärtsgang Grundierung (3' XhoICl).
      Hinweis: Tiller Et Al., zur Verstärkung aller von der schweren und leichten Kette Familie Gene5wurden Grundierungen entworfen.
    4. Gelten die folgenden Bedingungen wie Radsport: 94 ° C für 4 min, gefolgt von 40 Zyklen von 30 s bei 94° C, 30 s bei 58 ° C VH und LCκ (60 ° C für LCλ) und 45 s bei 72 ° C mit einer endgültigen Dehnung Schritt bei 72 ° C für 7 Minuten.
  5. Identifizieren Sie positive Vertiefungen durch Migration von 5 μl des PCR-Produkte von vH, vLκ und vLλ auf einem 1,5 % Agarosegel (500 bp Produkte für Variable schwere Codierung Kettensegmente) und ein 350 bp-Produkt für Variable Lichterkette Codierung Segmente.
  6. Reinigen Sie die restlichen 35 µL PCR-Produkte aus positiven Vertiefungen mit Ultrafiltration Membranen für die Reinigung der PCR Produkte entwickelt.
  7. Eluieren Sie PCR-Produkte mit 60 µL H2O.

(5) Ausdruck Klonen

  1. Vorbereiten der Einsätze
    Hinweis: Verdauen 60 µL jeder gereinigten PCR Produkt in einem Endvolumen von 100 µL, enthält des entsprechende Restriktionsenzym Puffers.
    1. Für vH-PCR-Produkte 50 Einheiten von AgeI und 50 Einheiten von SalI und 1 h bei 37 ° c inkubieren
    2. Für vLλ-PCR-Produkte 50 Einheiten von AgeI und 50 Einheiten von XhoI und 1 h bei 37 ° c inkubieren
    3. VLκ-PCR-Produkte fügen Sie 50 Einheiten von AgeI und 1 h bei 37 ° c inkubieren Reinigen mit 96 PCR Membranen verdaut und eluieren mit 60 µL H2O. Digest 60 µL Eluat in einem Endvolumen von 100 µL der BsiWI Restriktionsenzym Puffer, 50 Einheiten von BsiWI und 1 h bei 55 ° c inkubieren
    4. Deaktivieren Sie die Enzyme durch Erhitzen auf 80 ° C für 15 Minuten.
  2. Vorbereitung des Ausdrückens Vektoren
    Hinweis: vH-PCR-Produkte werden in einem Ausdruck Vektor (HCγ1), enthält die ständige schwere Kette Cγ1 IgG1 geklont. vLκ-PCR-Produkte werden in einem Ausdruck Vektor (LCκ), enthält die ständige leichte Kette Cκ geklont. vLλ-PCR-Produkte werden in einem Ausdruck Vektor (LCλ), enthält die ständige leichte Kette Cλ geklont.
    1. Führen Sie die folgenden Verdauung:
      1. Mix 1 µg der Ausdruck Vektor-HCγ1 mit 10 Einheiten von AgeI und 10 Einheiten von SalI jedoch in einem Gesamtvolumen von 20 µL Einschränkung Puffer vom Hersteller empfohlenen und 1 h bei 37 ° c inkubieren
      2. Mix 1 µg der Expressionsvektor LCκ mit 10 Einheiten von AgeI Restriktionsenzym in einem Gesamtvolumen von 20 µL Einschränkung Puffer vom Hersteller empfohlenen und 1 h bei 37° c inkubieren Fügen Sie 10 Einheiten des BsiWI Restriktionsenzym, und 1 h bei 55 ° c inkubieren
      3. Mix 1 µg der Expressionsvektor LCλ mit 10 Einheiten von AgeI und 10 Einheiten von XhoI jedoch in einem Gesamtvolumen von 20 µL Einschränkung Puffer vom Hersteller empfohlenen und 1 h bei 37 ° C inkubieren
    2. Erhitzen Sie die Mischung jedes Verdauung bei 65 ° C für 10 min, die Beschränkung-Enzyme zu inaktivieren.
    3. Unterbindung von 5 µL der verdauten PCR-Produkt mit 2 µL durchführen (100 ng) der entsprechenden linearisierten Expressionsvektor in einem Gesamtvolumen von 20 µL 1 x DNA Ligase Puffer mit 1 Einheit des T4 DNA-Ligase durch Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
      Hinweis: Alternativ Ligatur für 3 h bei 4 ° c erfolgt
  3. Klonen
    1. Electroporate 1 µL 20 µL Ligatur Mischung in 45 µL hausgemachte Electrocompetent TOP10 E. Coli (Current Protocols in der Molekularbiologie, Abschnitt 1.8.4-1.8.8). Sofort 500 µL 2 X YT Medium hinzufügen und Ausbreitung verwandelt Bakterien auf 2 x YT Ampicillin Platten in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min. inkubieren. Über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    2. Für jede Transformation Bildschirm acht Kolonien durch PCR.
      1. Eine Vormischung Reaktion auf Eis wie folgt eingerichtet: 45 µL 5 x PCR-Puffer, 12 µL MgCl2 (25 mM), 4 µL von dNTPs (ab ein Lager mit 10 mM von jedem), 10 µL vorwärts Grundierung (Lager 10 µM) Hybridisierung der Vektor-Sequenz (Primer Ab-Vec-Sense) , und 10 µL des rückwärts-Primer (Lager 10 µM) die ständige schwere oder leichte Kette Region (siehe Tabelle der Materialien für Primer-Sequenzen). Make-up zu einem Endvolumen von 200 µL mit H2O. Dann fügen Sie 4 µL des Enzyms DNA-Polymerase (5 U/µL).
      2. Verteilen Sie 25 µL Reaktion Premix pro 8-Streifen PCR-Röhrchen auf dem Eis.
      3. Benutzen Sie einen sterilen Zahnstocher zu einzelnen Kolonien holen. Streifen Sie den Zahnstocher auf einen 2 X TY Ampicillin Teller bilden eine Replicate Platte und Tauchen Sie es in einer PCR-Reaktion-Röhre.
      4. Führen Sie das Screening PCR unter den folgenden Bedingungen Radsport: 94 ° C für 10 min, gefolgt von 25 Zyklen von 30 s bei 94 ° C, 30 s bei 55 ° C und 50 s bei 72 ° C.
      5. Identifizieren Sie positive Bakterien durch Migration von 5 µL des PCR-Produkte auf einem 1,5 % Agarosegel.
        Hinweis: Positive Kolonien ein PCR-Produkt geben rund 850 bp für die schwere Kette Vektor und 600 bp für die Lichterkette Vektor.
    3. Vier positive Kolonien von der replizieren Platte in 2 mL LB-Medium zu impfen und über Nacht bei 37 ° C mit Schütteln bei 200 u/min inkubieren.
    4. Extrahieren Sie Plasmide aus flüssigen Kulturen mit einem Plasmid-Reinigung-Kit, wie vom Hersteller angegeben.
    5. Überprüfen Sie die korrekte Einfügen von Variablen Domänen von Sanger Sequenzierung der Plasmide mit Ab-Vec-Sense Primer.
      Hinweis: Plasmide mit dem richtigen Einsatz (Codierung der HC und die entsprechenden LC) sollen cotransfected in 293A Zellen für Sekretion. Die Besonderheit des kleinen Maßstab produziert mAbs ist durch ELISA untersucht. Anschließend wird die Produktion in großem Maßstab ggf. durchgeführt.

6. Herstellung von mAbs

  1. Kleinserienfertigung für die Überprüfung der Spezifität
    1. Am Vortag die Transfektion, Samen 15.000 menschlichen embryonalen Niere 293A (HEK 293A) Zellen in 200 µL der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % FBS pro Bohrloch in 96-Well Platten. Über Nacht in eine CO2 Inkubator (5 % CO2) bei 37 ° c inkubieren
    2. Cotransfect 293A Zellen in DMEM Medium mit 10 % FBS mit einem linear Polyethylenimine-Derivat als Transfection Reagens.
      Hinweis: Führen Sie die Transfektion in Triplicates. Das folgende Protokoll ist für einen Brunnen von einem Flachboden-96-Well-Platte.
      1. Verdünnen Sie 0,5 µL DNA Transfection Reagens in 10 µL 150 mm NaCl. 0,125 µg vH und 0,125 µg vL mit dem Ausdruck ihrer Vektoren in 10 µL 150 mm NaCl zu verdünnen. Vortex jeder Verdünnung für 10 s.
      2. Fügen Sie 10 µL DNA Transfection Reagens in 10 µL DNA-Lösung verdünnt. S Wirbel 15 und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Hinzufügen der 20 µL Mischung tropfenweise 293A Zellen, und durch die Platte vorsichtig umschwenken mischen.
    3. Ersetzen Sie die mittlere 16 h nach Transfektion und Zellkulturen für 5 Tage in serumfreien Medium.
      Hinweis: Verwenden Sie serumfreien Medium Serum Igs verunreinigen die produzierten Antikörper zu vermeiden.
    4. Beseitigen Sie Zellen und Schmutz durch Zentrifugation bei 460 X g für 5 min.
    5. Überstände durch Absaugen mit einem Multi-Kanal-Pipette zu ernten und in einem V-Boden-96-Well-Platte übertragen.
    6. Mantel relevanten Ag über Nacht bei 4 ° C in 100 µL pro Bohrloch rekonstituierte ELISA/ELISPOT Beschichtung Puffer 1 X auf eine Endkonzentration von 2 µg/mL in 96-Well-ELISA-Platten. Siehe Beispiele in 9.
    7. Block-Brunnen mit 10 % FBS DMEM Medium für 2 h bei 37 ° C
    8. Fügen Sie 50 µL Überstände 293A transfizierten Zellen aus Schritt 6.1.5 und 2 h bei RT inkubieren
    9. Fügen Sie 100 µL eines Anti-Menschen, die IgG Ab konjugiert mit Meerrettich Peroxidase (HRP) Enzym bei 1 µg/mL und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie 50 µL chromogenen Substrat (TMB) und 20 min inkubieren.
    10. Lesen der optischen Dichte bei 450 nm auf einem Spektrophotometer.
      Hinweis: Die spezifischen mAbs durch ELISA-Test enthüllt weiter in großem Maßstab hergestellt werden können und gereinigtes Protein eine Spalte präsentiert Affinität für menschliche IgG.
  2. Produktion in großem Maßstab und Reinigung von bestimmten mAbs
    1. Am Vortag die Transfektion, Samen 6 x 106 menschlichen embryonalen Niere 293A (HEK 293A) Zellen in 175 cm2 Fläschchen mit 25 mL DMEM mit 10 % ergänzt FBS. Über Nacht in eine CO2 Inkubator (5 % CO2) bei 37 ° c inkubieren
      Hinweis: Zellen sollte 70 % Zusammenfluss bei transfiziert.
    2. Cotransfect 293A Zellen in DMEM Medium mit 10 % FBS mit einem linear Polyethylenimine-Derivat als Transfection Reagens.
      1. Verdünnen Sie 50 µL DNA Transfection Reagens in 450 µL 150 mm NaCl. 10 µg vH und 10 µg vL mit dem Ausdruck ihrer Vektoren in 500 µL 150 mm NaCl zu verdünnen. Vortex 10 s jeder Verdünnung.
      2. Die DNA-Lösung verdünnt DNA Transfection Reagens hinzufügen. S Wirbel 15 und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie 1 mL Mischung tropfenweise auf die Zellen, und durch den Kolben vorsichtig umschwenken mischen.
    3. Ersetzen Sie die mittlere 16 h nach Transfektion und Zellkulturen für 5 Tage in serumfreien Medium.
    4. Ernten Sie Medium durch Absaugen mit einer 25-mL-Pipette.
    5. Beseitigen Sie Zellen und Schmutz durch Zentrifugation bei 460 X g für 5 min.
    6. Reinigen Sie die Antikörper mit einer 1 mL-Spalte mit Protein A auf einem schnellen Protein Flüssigkeitschromatographie (FPLC) System bei 4 ° c beschichtet
      1. Equilibrate das Protein eine Sepharose-Säule mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7).
      2. Filtern Sie das Zellkulturmedium von 6.2.5 mit 1,22 µm Filter, dann einen 0,45 µm-Filter.
      3. Laden Sie die gefilterten Medium auf die Säule.
      4. Waschen mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7) und eluieren mit einem 0,1 M Citrat-Puffer (pH 3,5).
      5. Lesen der optischen Dichte bei 280 nm auf eine Absorption Spektrofotometer und sofort neutralisieren proteinhaltigen Fraktionen mit 1 M Tris-Puffer (pH 9).
    7. Dialyse gereinigten Ab über Nacht bei 4 ° C in einer Kassette mit einem Molekulargewicht von 3,5 K cutoff gegen PBS-Puffer (pH 7,4).
    8. Sterilisieren von 0,2 µm Filtrierung und Kontrolle Reinheit von Größe-Ausschluss-Chromatographie, wie vom Hersteller angegeben.

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Representative Results

Ausgehend von PBMC von gesunden Spendern dieses Projekt stellt die Erzeugung von menschlichen mAbs, die das Peptid Pp65495 erkennen (Pp65, von menschlichen Zytomegalievirus) durch die großen Histocompatibility complex-Klasse habe ich vorgelegt (MHC-ich) Molekül HLA - A * 0201 () HLA-A2). Diese mAbs können zwischen diesem Komplex und aus anderen Peptiden verladen der gleichen MHC-komplexe unterscheiden-ich Molekül.

PBMC waren voller Flecken mit HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC und HLA-A2/MelA2-BV421-Tetramers wie im obigen Protokoll beschrieben. Nach Immunomagnetic Cell Anreicherung von PE und APC-Tetramer positive Zellen waren die eluierten Zellen mit zusätzlichen mAbs befleckt. Auf der Flow Cytometry Zelle Sorter, magnetisch angereicherte Zellen wurden zuerst auf tragfähige CD14 gated–CD16–CD3–CD19+ Unterhemden (B-Zellen). Abbildung 1 zeigt, dass gating Strategie verwendet, um auszudrücken BCR in der Lage ist zu unterscheiden zwischen HLA-A2/Pp65 und andere B-Zellen zu isolieren im Zusammenhang mit HLA-A2/Peptid-komplexe. Auswahl der B-Zellen von Interesse erfolgte nach Anspritzung auf HLA-A2/Pp65 PE+ und HLA-A2/Pp65 APC+ doppelt-positiven, um spezifische B-Zellen Fluorochrom auszuschließen, die einzeln PE+ oder APC+gefärbt waren. Zu guter Letzt wurden hoch spezifische B-Zellen durch Anspritzung auf negative Zellen HLA-A2/MelA2-BV421 identifiziert. Dies ermöglicht die Identifikation von B-Zellen, die mit dem Ausdruck BCR binden HLA-A2/Pp65, in einem Peptid und HLA-A2-abhängigen Weise, Unterscheidung zwischen diese B-Zellen und gegen β2-Mikroglobulin, Biotin, HLA-A2 oder diejenigen, die nicht diskriminieren zwischen den Peptiden in der MHC-Bindung-Nut. Diese letzteren Zellen werden BV421 positive Zellen. Wie zuvor gezeigt und weiter mit anderen Arten von Ag dokumentiert, ist diese Strategie der Ausgrenzung wichtiger durch die Erhöhungen in der diskriminierenden Fähigkeit der B-Zellen für die Ag-9.

Sobald einzelne spezifische B-Zellen sortiert wurden, cDNAs Codierung für schwere und leichte Ig-Ketten durch RT-PCR verstärkt wurden. Paare von schweren und leichten Kette Codierung Segmente wurden in etwa 50 % der einzelnen B-Zellen getestet (Tabelle 1). Variable Domäne, die Sequenzen in den Ausdruck dann geklont wurden Vektoren mit entsprechenden Konstanten Domäne-Sequenzen (schwere konstant 1 und leichte konstante κ oder λ). Menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK, 293A Zellen) wurden mit schweren und leichten Kette Vektoren cotransfected. Die sekretierten mAbs IgG1 Isotype wurden aus der Kultur-Überstände 293A Zellen 5 Tage nach Transfektion (siehe Abbildung 3 für die globale Strategie der Produktion vollständig humaner mAbs) geerntet. Dies führte erfolgreich einen spezifischen Antikörper, die HLA-A2/Pp65 ab 3 einzigen B-Lymphozyten Zellen nachgeben Paare von schweren und leichten Kette Codierung Segmente (Tabelle 1). ELISA-Assays zeigten deutlich, dass diese mAb beide MHC und Peptid-abhängige für die Bindung an HLA-A2/Pp65-komplexe (Abbildung 4A war), und mehrere Milligramm mAb wurden leicht für weitere Analysen (z.B., Affinität Analysen, produziert funktionelle Assays). Die Bindungsaffinität, bestimmt durch Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), war ca. 7 x 10-6 M (Abbildung 4 b).

Damit dieser Artikel beschreibt eine Kombination von sensibel und effiziente Methoden, was i) Erkennung der jeweiligen Ag-spezifische B-Zellen, auch wenn bei sehr niedrigen Frequenzen im Blut von gesunden Spendern und (Ii) die Erzeugung von hochgradig diskriminierend menschlichen mAbs präsentieren.

Figure 1
Abbildung 1: Nachweis von HLA-A2/Pp65 bestimmte B-Zellen aus menschlichen PBMC.
3 x 108 PBMC wurden mit HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC und HLA-A2/MelA2-BV421-Tetramers befleckt. Nach Immunomagnetic Cell Anreicherung von PE und APC-Tetramer positive Zellen waren die eluierten Zellen mit zusätzlichen mAbs befleckt. Auf einen Flow Cytometry Zelle Sorter, wurden Zellen zuerst auf tragfähige Singulett CD14 gated–CD16– Lymphozyten (nicht dargestellt), dann auf CD19+CD3 Zellen– . Dann wurden B-Zellen befleckt mit HLA-A2/Pp65-PE und HLA-A2/Pp65-APC Tetramers bewachte. Die HLA-A2/MelA-BV421-Tetramer wurde verwendet, um die B-Zellen ausschließen, die nicht HLA-A2/Pp65, in einem Peptid und MHC-abhängigen Weise erkannte.

Figure 2
Abbildung 2: Strategie zur Verstärkung und der Ig-Gene Klonen. Leichte und schwere Ig-Kette codieren Gene wurden durch nested RT-PCR verstärkt. Mit einer Mischung aus forward Primer hybridisieren die Leader Region und reverse Primer spezifisch für konstante Regionen entsprechende schwere, leichte Kappa oder leichte Lambda-Ketten wurden erste PCRs durchgeführt. Zweite PCRs wurden mit Primer mit Restriktionsschnittstellen durchgeführt, forward und reverse Primer wurden bzw. speziell für den Beginn des V-Segmente und für das Ende des J-Segmente. PCR-Produkte wurden mit Restriktionsenzymen verdaut und geklont in Expressionsvektoren mit entsprechenden Konstanten Domänen sequenziert. CMV: Zytomegalievirus Veranstalter; AmpR: Resistenz-Gen für Ampicillin.

Figure 3
Abbildung 3: Insgesamt Strategie der Rekonstruktion des rekombinanten menschlichen mAbs.
Eine Tetramer-basierte Sortierung Strategie ermöglicht die Erkennung von B-Zellen von Interesse. Hochspezifische B-Zellen waren einzellige sortiert. Leichte und schwere Ig-Codierung Kettensegmente wurden verstärkt mittels RT-PCR. Variable Domäne Sequenzen wurden in separate eukaryotischen Expressionsvektoren in Frame mit gen-Abschnitte, die konstanten Regionen der leichte und schwere Codierung geklont. Der entsprechenden vollständig humaner mAbs waren vorübergehend transfiziert HEK 293A Zellen zum Ausdruck gebrachten und von der Kultur überstand gereinigt. Diese Zahl wurde von Ouisse Et Al. modifiziert. (2017) 9.

Figure 4

Abbildung 4: Charakterisierung der eine repräsentative höchst diskriminierend mAb gegen HLA-A2/Pp65 aus menschlichen peripheren Blut zirkulierenden B-Zellen erzeugt.
A) Spezifität der mAb PC1.02 gegen HLA-A2/Pp65 von ELISA getestet. Platten wurden mit entsprechenden (HLA-A2/Pp65) oder irrelevant HLA-A2-komplexe mit HLA-A2-eingeschränkt Peptide beschichtet: MelA, NS3 (HCV-1) und GagP17 (HIV-1) bei 2 µg/mL, die mAb PC1.02 wurde hinzugefügt und ein Anti-Human-IgG-HRP Ab zur Erkennung diente. Optische Dichte (OD) verlesen bei 450 nm. B) Affinität Bestimmung der mAb PC1.02 mit Surface Plasmon Resonance (SPR) durch verschiedene Konzentrationen von HLA-A2/Pp65-komplexe über CM5 Chip-gebundenen mAb fließt. Diese Zahl wurde von Ouisse Et Al. modifiziert. (2017) 9.

Anzahl der PBMC Anzahl der PE + AHK + Zellen nach Anreicherung Anzahl der ausgeschlossenen (BV421 +) Zellen Anzahl der sortierten Einzelzellen Anzahl der analysierten Brunnen Anzahl der Bohrungen mit HC und LC verbunden (% Wiederherstellung) Anzahl der mAbs produziert Anzahl der spezifischen mAbs
HLA-A2/Pp65 mAb (PC1.02) 3 x 10-8 818 117 161 7 3 (43 %) 3 1

Tabelle 1: Analyse der HLA-A2/Pp65 spezifische B-Zellen.
Die Auswirkungen der Ausgrenzung Strategie der unspezifischen B-Zellen, die Erträge der Ig gen Amplifikation und mAb-Produktion aus isolierten HLA-A2/Pp65 spezifische B-Zellen bewertet/gemessen wurden.

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Discussion

Das vorgeschlagene Protokoll ist eine leistungsfähige Methode für die Erzeugung von menschlichen mAbs direkt vom Ag-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden. Es vereint drei wichtige Aspekte: (i) die Verwendung von ein Tetramer-assoziierte magnetische Anreicherung, wodurch eine ex-Vivo -Isolierung auch seltene Ag-Bindung B-Zellen; (Ii) eine gating Strategie, die drei Ag-Tetramers (zwei relevante und irrelevante eins) beschriftet mit drei verschiedenen Fluorochromes verwendet, um durch Durchflusszytometrie, nur die B-Zellen mit dem Ausdruck einer BCR bestimmtes für die gewünschte Ag zu isolieren; (Iii) die Rekonstruktion der entsprechenden rekombinanten mAb cDNAs mittels RT-PCR auf der Ebene der einzelnen Zelle und Ausdruck von cDNAs in menschlichen Zellen.

Frühere Studien vorgeschlagen, mit ein oder zwei fluoreszierende relevanten Antigene, um menschlichen B-Zellen vor der Sortierung und die anschließende Produktion von mAbs aus der isolierten B Zellen6,7,8zu kennzeichnen. Eine Analyse bei Patienten mit rheumatoider Arthritis und in einem Autoimmun Mausmodell sind irrelevant fluoreszierende Antigen autoreaktiven B-Zellen zu charakterisieren und bestimmen ihre Frequenz10,11zugeordnet. Soweit wir wissen, verwenden Sie eine Kombination von zwei fluoreszierende relevanten Antigen-Tetramers und ein irrelevant Antigen Tetramer ist nicht für die Anreicherung von bestimmten B-Zellen vor ihrer Verwendung für die Herstellung von vollständig humaner mAbs zuvor beschrieben worden. Diese optimierte Methode ermöglicht vollständig humaner diskriminierende mAbs in weniger als einem Monat einzuholen und erfolgreich durchgeführt werden kann, selbst wenn eine naive B-Zelle Repertoire ab. So es hat keines der größten Nachteile von Phagen-Display, menschlichen B-Zelle Immortalisierung oder andere zuvor Molekularbiologie-basierte mAb Rekonstruktion Verfahren beschrieben.

Diese Zelle sortieren Strategie führt zu einer high-Yield-Erholung der Ag-spezifische menschliche mAbs. Paare von schweren und leichten Kettensegmente aus einzelnen isolierten B-Zellen werden mit einer Erfolgsquote von rund 50 % verstärkt. Lichterkette Segmente werden fast immer verstärkt, aber dies ist nicht der Fall für schwere Kettensegmente. RT-PCR Effizienz hängt stark von der Beachtung der folgenden Punkte: ich) sortierte einzelne B-Zellen müssen eingefroren werden, so schnell wie möglich; (II) hinzufügen von 30 Einheiten der RNase-Inhibitor und Minimierung der Zeit zwischen der B-Zellen aus dem Gefrierschrank nehmen und Einleitung der Funktelegrafie-Reaktion; (III) Auftauen alle Grundierungen auf Eis; (IV) nie Auftauen Einfrieren/Primer mehr als dreimal; (V) Strumpf Primer für maximal ein Jahr.

Hinsichtlich der Effizienz der Produktion der entsprechenden rekombinanten mAbs mit der gewünschten Spezifität ist es ca. 30-40 % des Falles für pMHC bestimmten mAbs. Diese besondere mAbs haben zu erkennen, das Peptid und das MHC-Molekül, die sehr anspruchsvoll ist, und wir haben bereits gezeigt, dass die Gesamtausbeute der Verwertung von bestimmten mAbs gegen konventionelle Antigene gerichtet überlegen, bis zu 100 % für die Β-Galaktosidase Antigen9. Es muss betont werden, die die Wahl einer geeigneten AG für irrelevant Tetramer wichtig, erhöhen die Spezifität der mAbs produziert wird.

Die Affinität der Anti-HLA-A2/Pp65-MAB (PC1.02) in diesem Artikel beschriebenen ist relativ niedrig, ca. 7 x 10-6 M, ähnlich wie die Affinität von einem TCR. Dieses Ergebnis war zu erwarten, wie B-Zell-Isolierung von naiven Spendern durchgeführt wurde. Die meisten Tetramer+ -B-Zellen waren IgM+IgG-, die Wahrscheinlichkeit der Erlangung der guten Ag-Bindemittel reduziert. Allerdings kann diese Methode auch ermöglichen die Sortierung kreuzreaktiven Arbeitsspeicher B Zellen gegen eine gewünschte Ag aus naiven Geber wegen immunologische Vergangenheit von Personen12. Diese Methode ist übrigens leicht anwendbare geimpften oder infizierten Patienten oder immunisierten vermenschlichten Tieren, wie beschrieben in 9, wo in Vivo Affinität Reifung kann erhöhen die Affinität der daraus resultierenden mAbs, ca. 1 x 10-9 M. verschiedenen Verfahren sind auch beschrieben worden, um die Affinität der mAbs in Vitro, insbesondere durch Vervielfältigung somatische Hypermutation in Zellen, die mit dem Ausdruck des Antikörpers (rezensiert in 13) zu verbessern.

Zusammenfassend schlagen wir eine vielseitige Strategie für hochgradig diskriminierend mAbs-Produktion, die in verschiedenen Situation, von einem naiven individuell zu einem geimpften Spender oder einem Patienten mit einer Autoimmunerkrankung verwendet werden kann. Vollständig humaner mAbs erzeugt auf diese Weise gegen eine gewünschte Epitop könnte nützlich sowohl für die Grundlagenforschung und Immuntherapie sein.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir danken der Zytometrie Anlage "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) für kompetente technische Unterstützung. Wir danken auch das gesamte Personal der Produktion rekombinanter Proteine (P2R) und der Auswirkungen Plattformen (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) für ihre technische Unterstützung. Wir danken Emmanuel Scotet und Richard Breathnach für konstruktive Kritik am Manuskript. Diese Arbeit wurde von der IHU-Cesti-Projekt gefördert durch die «Investissements Avenir» französische Regierung Programm, verwaltet von der französischen nationalen Forschung Agentur (ANR) (ANR-10-IBHU-005) finanziell unterstützt. IHU-Cesti-Projekt wird auch von Nantes Métropole und Région Pays De La Loire unterstützt. Diese Arbeit wurde im Rahmen des Programms LabEX IGO unterstützt vom nationalen Institut über die Investition des zukünftigen Programms ANR-11-LABX-0016-01 realisiert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK 293A cell line Thermo Fisher scientific R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by life technologies 21969-035 (+) 4,5g/L D-Glucose
0,11g/L Sodium Pyruvate
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X) Gibco by life technologies 31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA) PAA K45-001
Nutridoma-SP Roche 11011375001 100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 Ambion AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 Invitrogen by Life Technologies 15575-020
Fetal Bovine serum (FBS) Dominique Dutscher S1810-500
Ficoll - lymphocytes separation medium EuroBio CMSMSL01-01 density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate Invitrogen by Life Technologies S21388 premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate Invitrogen by thermoFisher scientific S32362 1mg/ml
2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin Biolegend 405225 conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor Miltenyi Biotec 130-042-302/130-090-976
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
CD3 BV510 BD horizon BD Pharmingen / BD Biosciences 563109 Used dilution 1:20
CD19 FITC BD Pharmingen / BD Biosciences 345788 Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 561116 Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 338440 Used dilution 1:50
7AAD BD Pharmingen / BD Biosciences 51-68981E (559925) Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer BD Biosciences
8-strip PCR tubes Axygen 321-10-061
Racks for 96 microtubes Dominique Dutscher 45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) Invitrogen by thermoFisher scientific 10777-019 qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free Gibco 10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer New England BioLabs S1316S 5.0 A260unit
Random hexamers Invitrogen by thermoFisher scientific N8080127 qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen by thermoFisher scientific 18080-044 qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase Promega M7805
dNTP Set, Molecular biology grade Thermo Scientific R0182 4*100umol
5LVH1 Eurofins ACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH3 Eurofins AAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVL4_6 Eurofins CCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH5 Eurofins CAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
3HuIgG_const_anti Eurofins TCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1 Eurofins GGGAATTCTCACA
GGAGACGA		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2 Eurofins ATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk3 Eurofins CTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk4 Eurofins ATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566 Eurofins GTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5 Eurofins GCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'LVl1 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl2 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl3 Eurofins GCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5 Eurofins GGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl6 Eurofins GTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl7 Eurofins GGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5LVl8 Eurofins GAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
3'Cl Eurofins CACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3 Eurofins CTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5 Eurofins CTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6 Eurofins CTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8 Eurofins CTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
3'XhoICl Eurofins CTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense Eurofins GCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		 Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade MP Bio AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate Macherey Nagel 743.100.100
Enzyme Age I HF New England Biolabs R3552L 20000U/ml
Enzyme SalI HF New England Biolabs R3138L 20000U/ml
Enzyme Xho I New England Biolabs R0146L 20000U/ml
Enzyme BSIWI New England Biolabs R0553L 10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase Invitrogen by thermoFisher scientific 15224.017 100U (1U/ul)
2X YT medium Sigma Aldrich Y1003-500ML
Ampicillin Sigma Aldrich 10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification Macherey Nagel 740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent PolyPlus 101-40
Flat bottom96-well plate Falcon 353072
V-bottom 96-well plate Nunc/Thermofisher 055142
Nunc easy 175 cm2 flasks Nunc/Thermofisher 12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer eBiosciences 00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates Nunc/Thermofisher 44-2404-21 high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) BD Pharmingen / BD Biosciences 55788
TMB substrate BD Biosciences 555214
Streptavidin Sigma S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column GE Healthcare 17-0402-01
ÄKTA FPLC GE Healthcare 18190026
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System BioRad 7880003

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References

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Immunologie Ausgabe 132 Immunologie Zellbiologie menschliche Antikörper B-Zellen Tetramer Durchflusszytometrie Einzelzelle Antigen-spezifische magnetische Anreicherung

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes, Nantes, France

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden
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Devilder, M. C., Moyon, M.,… More

Devilder, M. C., Moyon, M., Saulquin, X., Gautreau-Rolland, L. Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood. J. Vis. Exp. (132), e56508, doi:10.3791/56508 (2018).

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