Vi beskriver en metod för framställning av humana antikroppar specifika för antigen av intresse, start från sällsynta B-celler som cirkulerar i blod. Generation av dessa naturliga antikroppar är snabbt och effektivt, och antikroppar erhållits kan diskriminera mellan starkt relaterade antigener.
Monoklonala antikroppar (mAbs) är kraftfulla verktyg som är användbara för både grundforskning och i biomedicin. Deras hög specificitet är oumbärlig när antikroppen måste skilja mellan mycket relaterade strukturer (t.ex., ett protein som normal och en muterad version därav). Det nuvarande sättet att generera sådana diskriminerande mAbs innebär omfattande screening av flera Ab-producerar B-celler, vilket är både kostsamt och tidskrävande. Vi föreslår här en snabb och kostnadseffektiv metod för generering av diskriminerande, helt human mAbs start från humant blod cirkulerar B-lymfocyter. Originaliteten i denna strategi beror på valet av specifika antigen bindande B celler kombinerat med kampen mot valet av alla andra celler, med hjälp av lättillgängliga perifert blod mononukleära celler (PBMC). När specifika B-celler är isolerade, erhålls cDNA (kompletterande deoxiribonukleinsyra) sekvenser som kodar för den motsvarande mAb med enstaka cell omvänd Transkription-polymeras-kedjereaktion (RT-PCR) teknik och därefter uttryckt i mänskliga celler. Inom så lite som 1 månad är det möjligt att producera milligram mycket diskriminerande mänskliga mAbs mot valfri önskad antigen naturligt upptäcks av B-cell repertoaren.
Den metod som beskrivs här tillåter snabb och mångsidig produktion av fullt humana monoklonala antikroppar (mAbs) mot en önskad antigen (Ag). mAbs är viktiga verktyg i många grundläggande forskning program in vitro och i vivo: flow flödescytometri, histologi, western-analys, och blockering experiment till exempel. Dessutom används mAbs mer och mer i medicin för behandling av autoimmuna sjukdomar, cancer, och att styra transplantation avslag1. Anti-CTLA-4 och anti-PD-1 (eller anti-PD-L1) mAbs användes exempelvis nyligen som immun checkpoint-hämmare i cancer behandlingar2.
De första mAbs producerades av immunglobulin (Ig)-utsöndrar hybridomceller erhållits från mjälten cellerna av immuniserade möss eller råttor. Men hämmar det starkt immunsvaret mot murint eller råtta mAbs deras terapeutiska användning på människor, på grund av deras snabba clearance och sannolikt induktion av överkänslighet reaktioner3. För att tackla detta problem, har animaliskt proteinsekvenser av mAbs delvis ersatts av mänskliga sådana att generera så kallade chimär mus-mänskliga eller humaniserade antikroppar. Denna strategi minskar dock endast delvis immunogenicitet, samtidigt väsentligen öka både kostnaden och tidsskalan för produktion. En bättre lösning är att skapa mänskliga mAbs direkt från mänskliga B-celler och flera strategier för detta finns. En av dem är användningen av phage eller jäst display. Detta innebär att Visa variabla domäner från ett kombinatoriska bibliotek med slumpmässiga mänskliga Ig tung och ljus kedjor på Fager eller jäst, och genomför ett urval steg med specifika antigen av intresse. En stor nackdel med denna strategi är att tunga och lätta kedjor är slumpmässigt förknippade, leder till en mycket stor ökning i mångfalden av genererade antikroppar. Antikroppar som erhålls är osannolikt att motsvara till de som skulle uppstå genom en naturlig immunsvar mot en viss Ag. Övrigt mänskliga proteinveckning och post-translationella modifieringar återges inte systematiskt i prokaryoter eller ens i jäst. En andra mänskliga mAb produktionsmetod är immortalization av naturliga mänskliga B celler, av Epstein – Barr-virusinfektion eller uttryck av de anti-apoptotiska faktorer BCL-6 och BCL-XL4. Dock denna metod gäller endast för minne B celler och är ineffektiv, som kräver screening av talrika mAb-förevigade B celler att identifiera de få (om några) mAb-klonerna med önskad antigen specificitet. Metoden är således både kostsamt och tidskrävande.
Ett nytt protokoll har nyligen beskrivits för produktion av mänskliga mAbs från isolerade enda B celler5. Det bygger på en optimerad encelliga omvänd Transkription-polymeras-kedjereaktion (RT-PCR) för förstärkning av både tunga – och ljus-kedjan kodning segment från en enda sorterade B-cell. Detta följs av kloning och uttryck av dessa segment i en eukaryota uttryck systemet, vilket möjliggör återuppbyggnad av en fullt human mAb. Detta protokoll har använts framgångsrikt start från B-celler från vaccinerade givare. Celler skördats flera veckor efter vaccination att få högre frekvenser av B-celler som riktas mot önskad Ag, och därmed begränsa den tid som krävs för screening6. Andra helt human mAbs har också producerats från+ (humant immunbristvirus) HIV-infekterade patienter7 och melanom patienter8. Trots dessa framsteg finns det fortfarande inget förfarande som är tillgängliga som gör det möjligt för isolering av Ag-specifika B-celler som är oberoende av deras minne fenotyp eller frekvens.
Förfarandet beskrivs här leder till effektiv ex vivo isolering av mänskliga cirkulerande B celler baserat på deras BCR specificitet, följt av produktionen av fullt humana antigen-specifika mAbs i hög avkastning och med en låg screening tid. Metoden är inte begränsad till B-minnesceller eller antikropp-utsöndrar B celler inducerad efter ett immunsvar, men kan också tillämpas på mänskliga naiva B-celler repertoaren. Den funkar även start från Ag-specifika B-celler som är närvarande vid mycket låga frekvenser är en bra indikation på dess effektivitet. Principen för metoden är följande: perifert blod mononukleära celler (PBMC) färgas med två tetramers presenterar antigen av intresse, var märkt med en annan fluorokrom (t.ex., fykoerytrin (PE) och från (APC)), och en tredje tetramer presenterar ett närbesläktade antigen konjugerat med ett tredje fluorokrom (t.ex., Brillant Violet 421 (BV421)). För att berika för antigen-bindande celler, celler inkuberas därefter med pärlor belagd med anti-PE och anti-APC Abs, och sorterade i cell Separationskolonner. PE+ APC+ cell fraktionen är markerad, färgade med en mängd mAbs specifika för olika Laboratoriestammar celltyper att medge identifiering av B-celler och betvingade flöda flödescytometri cell sortering. B-celler som är PE+ och APC+, men lysande violett–, är isolerade. Detta steg markerar räknaren celler som inte är B-celler eller binder inte till tetramerized antigen, men binda till antingen PE eller APC (dessa celler kommer att PE+ APC– eller PE– APC+) eller till den icke-antigen delen av de tetramers som används (dessa celler kommer att BV421+). B-celler inte mycket specifika för epitop av intresse väljs också kontraproduktivt i detta steg (dessa celler kommer också att vara BV421+). Denna metod kan således rena mycket specifika B-celler som uttrycker B-cellernas receptorer (BCR) kunna diskriminera mellan två mycket närbesläktade antigener. Enda specifika B-celler samlas i rör och deras PCR-förstärkta Ig cDNAs (kompletterande deoxiribonukleinsyra syror) klonade och uttryckt av en human cellinje som utsöndrade IgG mAbs.
Som ett proof of concept, denna studie beskriver effektiv generering av mänskliga mAbs, som erkänner en peptid som presenteras av en större histocompatibility komplex klass jag (MHC-jag) molekyl och kan diskriminera mellan denna peptid och andra peptider som lastats på samma MHC-jag allel. Även om graden av komplexitet i detta Ag är viktigt, kan med denna metod (i) hög kapacitet återvinning av Ag-specifika mAbs; (ii) produktion av mAbs kunna diskriminera mellan två strukturellt nära Ags. Detta tillvägagångssätt kan förlängas till vaccinerade eller infekterade patienter utan ändringar protokoll, och också redan har genomförts framgångsrikt i en humaniserad rat system9. Således, denna studie beskriver en mångsidig och effektiv strategi för att generera fullt humana mAbs som kan användas i grundforskning och immunterapi.
Föreslagna protokollet är en kraftfull metod för generering av mänskliga mAbs direkt från Ag-specifika B-celler som cirkulerar i blodet. Den kombinerar tre viktiga aspekter: (i) användning av en tetramer-associerade magnetiska berikning, som tillåter en ex vivo -isolering av även sällsynta Ag-bindande B-celler; (ii) en Usenets strategi som använder tre Ag tetramers (två relevanta ettor och en irrelevant en) märkt med tre olika fluorokromer för att isolera, genom flödescytometri, bara de B-celler so…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar flödescytometri anläggningen ”CytoCell” (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) för teknisk experthjälp. Vi tackar också alla personalen av rekombinant proteinproduktion (P2R) och påverkan plattformar (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) för deras tekniska support. Vi tackar Emmanuel Scotet och Richard Breathnach för konstruktiva synpunkter på manuskriptet. Detta arbete fick ekonomiskt stöd av IHU-Cesti projektet finansieras av programmet «Investissements pris» franska regeringen, förvaltas av den franska nationella Research Agency (ANR) (ANR-10-IBHU-005). IHU-Cesti projektet stöds även av Nantes Métropole och Région Pays de la Loire. Detta arbete genomfördes i samband med LabEX IGO programmet stöds av National Research Agency via investeringar av framtida programmet ANR-11-LABX-0016-01.
HEK 293A cell line | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine |
RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
Bovine Serum Albumine (BSA) | PAA | K45-001 | |
Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
Fetal Bovine serum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
Ficoll – lymphocytes separation medium | EuroBio | CMSMSL01-01 | density 1,0777+/-0,001 |
streptavidin R-phycoerythrin conjugate | Invitrogen by Life Technologies | S21388 | premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide |
Streptavidin, allophycocyanin conjugate | Invitrogen by thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azide premium grade |
Brilliant violet 421 streptavidin | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
MidiMACs or QuadroMACS separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Used dilution 1:20 |
CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Used dilution 1:20 |
CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Used dilution 1:50 |
CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Used dilution 1:50 |
7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Used dilution 1:1000 |
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer | BD Biosciences | ||
8-strip PCR tubes | Axygen | 321-10-061 | |
Racks for 96 microtubes | Dominique Dutscher | 45476 | |
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) | Invitrogen by thermoFisher scientific | 10777-019 | qty:5000U (40U/ul) |
Distilled Water Dnase/Rnase Free | Gibco | 10977-035 | |
Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
Random hexamers | Invitrogen by thermoFisher scientific | N8080127 | qty : 50uM, 5nmoles |
Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 18080-044 | qty : 10000U (200U/ul) |
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
dNTP Set, Molecular biology grade | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening |
3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig |
5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
5'LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening |
5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeIVk1_9_1–13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening |
Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC |
Bacteria PCR screening |
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade | MP Bio | AGAH0500 | |
NucleoFast 96 PCR Plate | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
Enzyme Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
Enzyme SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
Enzyme Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
Enzyme BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
HCg1 (Genbank accession number FJ475055) | |||
LCk (Genbank accession number FJ475056 ) | |||
LCl (Genbank accession number FJ517647) | |||
T4 DNA ligase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
2X YT medium | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
Ampicillin | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification | Macherey Nagel | 740588.250 | |
Jet PEI DNA transfection reagent | PolyPlus | 101-40 | |
Flat bottom96-well plate | Falcon | 353072 | |
V-bottom 96-well plate | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
Nunc easy 175 cm2 flasks | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
ELISA/ELISPOT coating buffer | eBiosciences | 00-0044-59 | |
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | high protein binding |
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
TMB substrate | BD Biosciences | 555214 | |
Streptavidin | Sigma | S0677 | |
1 mL-HiTrap protein A HP column | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
ÄKTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517501 | |
NGC Quest 10 Plus Chromatography System | BioRad | 7880003 |