Vi beskriver en metode til produktion af humane antistoffer specifikke for et antigen af interesse, med udgangspunkt i sjældne B celler cirkulerer i humant blod. Generation af disse naturlige antistoffer er effektiv og hurtig, og antistofferne fremstillet kan forskelsbehandle stærkt relaterede antigener.
Monoklonale antistoffer (papagøjesyge) er kraftfulde værktøjer nyttigt for både grundforskning og i biomedicin. Deres høj specificitet er uundværlig, når antistoffet skal skelne mellem stærkt relaterede strukturer (fx, en normal protein og en muteret version heraf). Den nuværende måde at generere sådanne diskriminerende mAbs indebærer omfattende screening af flere Ab-producerende B-celler, som er både kostbar og tidskrævende. Vi foreslår her en hurtig og omkostningseffektiv metode til generation af diskriminerende, fuldt humane mAbs startende fra humant blod cirkulerende B-lymfocytter. Originaliteten af denne strategi er Udvalget af specifikke antigen bindende B celler kombineret med Counter markeringen af alle andre celler, ved hjælp af let tilgængelige perifert blod mononukleære celler (PBMC). Når specifikke B-celler er isoleret, er cDNA (supplerende deoxyribonukleinsyre) sekvenser, der koder for den tilsvarende mAb opnået ved hjælp af enkelt celle Reverse transkription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) teknologi og efterfølgende udtrykt i menneskelige celler. Inden for så lidt som 1 måned er det muligt at producere milligram af yderst diskriminerende menneskelige mAbs rettet mod stort set alle ønskede antigen naturligvis opdaget af B-celle repertoire.
Metoden beskrevet her giver mulighed for hurtig og alsidig produktion af fuldt humane monoklonale antistoffer (papagøjesyge) mod en ønskede antigen (Ag). mAbs er uundværlige redskaber i mange grundlæggende forskning applikationer in vitro og i vivo: flow flowcytometri, histologi, western blotting og blokerende eksperimenter f.eks. Derudover anvendes mAbs mere og mere i medicin til behandling af autoimmune sygdomme, kræft, og til at styre transplantation afvisning1. For eksempel, blev anti-CTLA-4 og anti-PD-1 (eller anti-PD-L1) mAbs for nylig brugt som immun checkpoint hæmmere i kræft behandlinger2.
De første mAbs blev produceret af immunglobulin (Ig)-secernerende hybridomer fremstillet af milt cellerne i immuniserede mus eller rotter. Men den stærke immunrespons mod murine eller rotte mAbs hæmmer deres terapeutiske brug i mennesker, på grund af deres hurtig clearance og den sandsynlige fremkaldelse af overfølsomhed reaktioner3. For at tackle dette problem, er animalsk protein sekvenser af mAbs blevet delvist erstattet af menneskelige dem til at generere såkaldte kimære Mus-menneskelige eller humaniseret antistoffer. Denne strategi falder dog kun delvist immunogenicitet, samtidig væsentligt øge omkostningerne og tidshorisont for produktion. En bedre løsning er at skabe menneskelige mAbs direkte fra menneskelige B-celler og flere strategier for dette er tilgængelige. En af dem er brugen af phage eller gær display. Dette omfatter visning af variable domæner fra en kombinatorisk bibliotek af tilfældige menneskers Ig tunge og lys kæder på phages eller gær og foretage en udvælgelse trin ved hjælp af den specifikke antigen af interesse. En væsentlig ulempe ved denne strategi er, at tunge og lette kæder er tilfældigt forbundet, fører til en meget stor stigning i mangfoldigheden af genererede antistoffer. Antistoffer opnået er usandsynligt at svare til dem, der ville opstå fra en naturlige immunrespons mod en bestemt Ag. Desuden er menneskelige proteinfoldning og posttranslationelle modifikationer ikke systematisk gengivet i prokaryoter eller endda i gær. En anden humane mAb produktionsmetode er immortalization af naturlige menneskelige B-celler ved Epstein – Barr virusinfektion eller udtryk for anti-apoptotiske faktorer BCL-6 og BCL-XL4. Men denne metode gælder kun for hukommelse B-celler og er ineffektive, der kræver screening af talrige mAb-producerende udødeliggjort B celler til at identificere par (hvis nogen) mAb kloner med den ønskede antigene specificitet. Metoden er således både dyrt og tidskrævende.
En ny protokol er for nylig blevet beskrevet for produktion af menneskelige mAbs fra isolerede enkelt B celler5. Det bygger på en optimeret enkelt celle Reverse transkription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) til forstærkning af både heavy – og lys-kæden kodning segmenter fra en enkelt sorteret B celle. Dette er efterfulgt af kloning og udtryk for disse segmenter i en eukaryote ekspressionssystem, således at genopbygningen af et fuldt humane mAb. Denne protokol har været anvendt med held startende fra B-celler fra vaccinerede donorer. Celler er høstet adskillige uger efter vaccination til at opnå højere frekvenser af B-celler rettet mod den ønskede Ag, og dermed begrænse den tid, der kræves til screening af6. Andre fuldt humane mAbs er også fremstillet af HIV+ (Human immundefekt Virus) inficerede patienter7 og melanom patienter8. Trods disse fremskridt er der stadig ingen procedure tilgængelig, der muliggør dyrkning af Ag-specifikke B celler uafhængigt af deres hukommelse fænotype eller frekvens.
Proceduren beskrevet her fører til effektiv ex vivo isolation af menneskelige cirkulerende B-celler baseret på deres BCR specificitet, efterfulgt af produktionen af fuldt humane antigen-specifikke mAbs i højt udbytte og med en lav screening tid. Metoden er ikke begrænset til hukommelse B celler eller antistof-secernerende B celler inducerede efter en immunrespons, men kan også anvendes til menneskelige naive B-celle repertoire. At det virker endda med udgangspunkt i Ag-specifikke B celler stede ved meget lave frekvenser er en god indikation af dens effektivitet. Princippet om metoden er som følger: perifert blod mononukleære celler (PBMC) farves med to tetramers præsenterer antigen af interesse, hver mærket med en anden fluorokrom (fxPhycoerythrin (PE) og Allophycocyanin (APC)), og en tredje tetramer præsenterer et nært beslægtede antigen konjugeret med et tredje fluorokrom (fxBrillant Violet 421 (BV421)). For at berige for antigen-bindende celler, celler er derefter inkuberes med perler belagt med anti-PE og anti-APC Abs, og sorteret i celle adskillelse kolonner. PE+ APC+ celle brøkdel er valgt, farves med en bred vifte af mAbs specifikke for forskellige PBMC celletyper identificering af B-celler, og underkastet flyde flowcytometri celle sortering. B-celler, som er PE+ og APC+, men strålende Violet–, er isoleret. Dette skridt vælger mod celler, der er ikke B-celler eller ikke binder sig til den tetramerized antigen, men binder til enten PE eller APC (disse celler vil være PE+ APC– eller PE– APC+) eller til den antigen-del af tetramers anvendes (disse cellerne bliver BV421+). B-celler ikke meget specifikke for epitop af interesse er også mod valgt på dette trin (disse celler vil også være BV421+). Således, denne metode kan rense særdeles specifikke B-celler udtrykker B-celle receptorer (oplysningspligt) stand til at skelne mellem to meget nært beslægtede antigener. Enkelt specifikke B-celler er indsamlet i rør og deres PCR-forstærket Ig cDNAs (supplerende desoxyribonukleinsyre syrer) klonet og udtrykt af en human cellelinie som udskilles IgG mAbs.
Som en proof of concept, denne undersøgelse beskriver den effektive generation af menneskelige mAbs, som anerkender et peptid præsenteret ved et større histocompatibility komplekse klasse (MHC-jeg) molekylet og kan skelne mellem dette peptid og andre peptider indlæst på samme MHC-jeg allel. Selv om kompleksiteten af denne Ag er vigtig, tillader denne metode (i) højt udbytte opsving af Ag-specifikke mAbs; (ii) produktionen af mAbs stand til at skelne mellem to strukturelt tæt Ags. Denne fremgangsmåde kan udvides til at omfatte vaccineret eller inficerede patienter uden enhver aendring af protokollen, og også allerede har gennemført med succes i en humaniseret rotte system9. Således, denne undersøgelse beskriver en alsidig og effektiv fremgangsmåde for at generere fuldt humane mAbs, der kan bruges i grundforskning og immunterapi.
Den foreslåede protokol er en kraftfuld metode for generation af menneskelige mAbs direkte fra Ag-specifikke B celler cirkulerer i blodet. Det kombinerer tre vigtige aspekter: (i) anvendelse af en tetramer-associerede magnetiske berigelse, som giver mulighed for en ex vivo isolation af endda sjældne Ag-bindende B celler; (ii) en gating strategi, der bruger tre Ag tetramers (to relevante dem og en irrelevant én) mærket med tre forskellige fluorokromer til at isolere, ved flowcytometri, kun B-celler udtrykker …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker flowcytometri facilitet “CytoCell” (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) til teknisk ekspertbistand. Vi takker også alle ansatte af rekombinante protein produktion (P2R) og af virkningen platforme (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) for deres tekniske support. Vi takker Emmanuel Scotet og Richard Breathnach for konstruktive kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev økonomisk støttet af IHU-Cesti projektet finansieret af programmet «Investissements d’Avenir» franske regering, forvaltet af den franske nationale forskning agentur (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Projektets IHU-Cesti understøttes også af Nantes Métropole og Région Pays de la Loire. Dette arbejde blev realiseret i forbindelse med LabEX IGO program støttet af National forskning agenturet via investeringer i det fremtidige program ANR-11-LABX-0016-01.
HEK 293A cell line | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine |
RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
Bovine Serum Albumine (BSA) | PAA | K45-001 | |
Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
Fetal Bovine serum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
Ficoll – lymphocytes separation medium | EuroBio | CMSMSL01-01 | density 1,0777+/-0,001 |
streptavidin R-phycoerythrin conjugate | Invitrogen by Life Technologies | S21388 | premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide |
Streptavidin, allophycocyanin conjugate | Invitrogen by thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azide premium grade |
Brilliant violet 421 streptavidin | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
MidiMACs or QuadroMACS separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Used dilution 1:20 |
CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Used dilution 1:20 |
CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Used dilution 1:50 |
CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Used dilution 1:50 |
7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Used dilution 1:1000 |
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer | BD Biosciences | ||
8-strip PCR tubes | Axygen | 321-10-061 | |
Racks for 96 microtubes | Dominique Dutscher | 45476 | |
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) | Invitrogen by thermoFisher scientific | 10777-019 | qty:5000U (40U/ul) |
Distilled Water Dnase/Rnase Free | Gibco | 10977-035 | |
Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
Random hexamers | Invitrogen by thermoFisher scientific | N8080127 | qty : 50uM, 5nmoles |
Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 18080-044 | qty : 10000U (200U/ul) |
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
dNTP Set, Molecular biology grade | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening |
3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig |
5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
5'LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening |
5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeIVk1_9_1–13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening |
Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC |
Bacteria PCR screening |
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade | MP Bio | AGAH0500 | |
NucleoFast 96 PCR Plate | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
Enzyme Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
Enzyme SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
Enzyme Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
Enzyme BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
HCg1 (Genbank accession number FJ475055) | |||
LCk (Genbank accession number FJ475056 ) | |||
LCl (Genbank accession number FJ517647) | |||
T4 DNA ligase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
2X YT medium | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
Ampicillin | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification | Macherey Nagel | 740588.250 | |
Jet PEI DNA transfection reagent | PolyPlus | 101-40 | |
Flat bottom96-well plate | Falcon | 353072 | |
V-bottom 96-well plate | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
Nunc easy 175 cm2 flasks | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
ELISA/ELISPOT coating buffer | eBiosciences | 00-0044-59 | |
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | high protein binding |
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
TMB substrate | BD Biosciences | 555214 | |
Streptavidin | Sigma | S0677 | |
1 mL-HiTrap protein A HP column | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
ÄKTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517501 | |
NGC Quest 10 Plus Chromatography System | BioRad | 7880003 |