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Summary
인간의 혈액에서 회람 하는 드문 B 세포에서 시작 인간 항 체의 항 원에 대 한 특정의 생산 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 자연 항 체의 생성은 효율적이 고 신속한, 그리고 얻은 항 체 매우 관련된 항 원 사이 차별 수 있습니다.
Abstract
단일 클론 항 체 (mAbs)는 모두 근본적인 연구와 의학에 유용한 강력한 도구입니다. 그들의 높은 특이성 항 체 매우 관련된 구조 (예를 들면, 정상적인 단백질 및 그 돌연변이 버전) 사이 구별 하는 경우 필수 되지 않습니다. 같은 구별 mAbs 생성의 현재 방법은 비용과 시간이 소요 여러 Ab 생산 하는 B 세포의 광범위 한 검사를 포함 한다. 우리 제안 여기 신속 하 고 비용 효과적인 방법의 구별, 세대에 대 한 완전히 인간의 mAbs B 림프 톨을 순환 하는 인간의 혈액에서 시작 합니다. 이 전략의 독창성은 쉽게 사용할 수 있는 주변 혈액 단 세포 (PBMC)를 사용 하 여 다른 모든 셀의 카운터 선택과 결합 하는 특정 항 원 바인딩 B 세포의 선택 때문 이다. 일단 특정 B 세포 격리, 해당 mAb 코딩 하는 cDNA (보완 deoxyribonucleic acid) 시퀀스는 얻은 단일 셀 반전 전사-연쇄 반응 (RT-PCR) 기술을 사용 하 여 이후 인간의 표현 셀입니다. 1 달 만큼 적게, 내 자연스럽 게 B 셀 레 퍼 토리에 의해 감지 하는 거의 모든 원하는 항 원에 대하여 지시 하는 매우 구별 인간의 mAbs의 밀리 그램을 생산 가능 하다.
Introduction
여기 설명 하는 방법을 완벽 하 게 인간 단일 클론 항 체의 (mAbs) 원하는 항 원 (Ag)에 대 한 신속 하 고 다양 한 생산 수 있습니다. mAbs는 많은 기초 연구 응용 프로그램 체 외 및 생체 내에서필수 도구: flow cytometry, 조직학, 서 럽 고 차단 실험 예. 또한, mAbs는 사용 되 고 더 의학에서 자가 면역 질환, 암, 치료 하 고 이식 거부1제어 하. 예를 들어 안티-CTLA-4 및 안티-PD-1 (또는 반대로 PD L1) mAbs 최근 암 치료2검사점 면역 억제제로 사용 되었다.
첫 번째 mAbs 면역 글로불린 (Ig)에 의해 제작-면역된 쥐 또는 쥐의 비장 세포에서 얻은 hybridomas 은닉. 그러나, murine 또는 쥐 mAbs에 대 한 강한 면역 반응을 그들의 신속한 통관 및 과민 반응3의 가능한 유도 인 간에 있는 그들의 치료 사용을 지장을 초래할 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 mAbs의 동물성 단백질 시퀀스 부분적으로 소위 공상 마우스 인간 또는 인간 답게 된 항 체를 생성 하 인간 그들에 의해 대체 되었습니다. 그러나,이 전략 부분적 으로만 immunogenicity, 실질적으로 비용 및 시간-생산의 규모를 증가 하는 동안 감소. 인간의 mAbs 인간 B 세포에서 직접 생성 하는 고이 대 한 몇 가지 전략을 사용할 수 있습니다. 그들 중 하나 살 균 소 또는 효 모 디스플레이의 사용 이다. 이 무거운 무작위 인간의 Ig의 조합 도서관에서 변수 도메인 표시과 빛 연결에 페이지 또는 효 모, 그리고 관심의 특정 항 원을 사용 하 여 선택 단계를 수행. 이 전략의 주요 단점은 무 겁 고 가벼운 사슬은 무작위로 연결 된, 생성 된 항 체의 다양성에 아주 큰 증가에 지도입니다. 얻은 항 체 특정 Ag에 대 한 자연 면역 반응에서 발생 하는 것을 그에 해당 하는 있지 않습니다. 또한, 인간 단백질 폴딩과 포스트 번역 상 수정은 체계적으로 복제 않을 원핵생물 또는 효 모에도. 두 번째 인간 mAb 생산 방법은 엡 스타인-바 바이러스 감염이 나 안티 apoptotic 요인 BCL-6 및 BCL XL4의 식에 의해 자연 인간 B 세포 immortalization입니다. 그러나,이 메서드는 메모리 B 세포에만 적용 이며 효율적인, 수많은 mAb 생성 불멸 하 게 B 세포의 몇 가지 (해당 되는 경우) mAb 클론 원하는 항 원 특이성을 식별 하는 검사를 요구 하지 않습니다. 방법은 이렇게 비용과 시간이 소요입니다.
최근 새로운 프로토콜에서 고립 된 단 하나 B 세포5인간의 mAbs의 생산에 대 한 설명 하고있다. 그것에 최적화 된 단일 셀 반전 전사-연쇄 반응 (RT-PCR) 증폭의 두 무거운-및 빛-체인 인코딩 단일 정렬 된 B 세포에서 세그먼트에 대 한 의존 합니다. 이것 완전히 인간의 mAb의 재건 되므로 진 핵 식 시스템에 복제 하 고 이러한 세그먼트의 표현에 의해 선행 된다. 이 프로토콜은 예방 접종된 기증자에서 B 세포에서 시작 하 고 성공적으로 사용 되었습니다. 셀 B 세포는 원하는 자세에 대 한 감독의 더 높은 주파수를 가져오고 따라서6심사에 필요한 시간을 제한 하는 예방 접종 후 몇 주를 수확 했다. 다른 완전히 인간 mAbs 또한 HIV+ (인간 면역 결핍 바이러스)에 감염 된 환자7 과 흑색 종 환자8에서 제작 되었습니다. 이러한 발전에도 불구 하 고 아직도 그들의 메모리 표현 형 또는 주파수의 독립적인 Ag 특정 B 세포의 분리를 가능 하 게 사용할 수 없는 절차가입니다.
절차 설명 여기 뒤에 높은 수율 및 낮은 심사 시간 완전 인간 항 원 특정 mAbs의 생산 그들의 BCR 특이성에 따라 인간의 순환 B 세포의 효율적인 비보 전 절연 리드. 메서드를 사용 하면 메모리 B 세포 또는 항 체 은닉 B 세포는 면역 반응 후 유도에 제한 되지 않습니다 하지만 인간의 순진한 B 셀 레 퍼 토리에도 적용 될 수 있습니다. 그것은 매우 낮은 주파수에 Ag 특정 B 세포에서 시작 작동 효율성의 좋은 표시 이다. 방법의 원리는 다음과 같습니다: 주변 혈액 단 세포 (PBMC)는 관심사의 항 원을 제시 하는 2 개의 tetramers 물, 각각 다른 형광 색소 (예를 들어, Phycoerythrin (PE) 및 Allophycocyanin (APC))와 함께 표시 그리고 세 번째 형광 색소 (예를 들어, 화려한 바이올렛 421 (BV421))와 밀접 하 게 관련 된 항 원 제시 3 tetramer 활용. 항 원 바인딩 셀에 대 한 풍부 하 셀은 다음 인 큐베이 팅 구슬 안티-PE 코팅 및 안티-APC Abs, 셀 분리 열에 정렬. APC PE+ + 셀 분수 선택, mAbs PBMC 셀 종류 B 세포의 식별을 허용에 대 한 특정의 다양 한 스테인드 그리고 복종 flow cytometry 셀 정렬 합니다. B 세포는 PE+ +, 화려한 바이올렛-, 그러나 APC 격리 됩니다. 이 단계는 카운터 B 세포 또는 항 원 tetramerized에 바인딩되지 않습니다 그러나 PE 또는 APC (이 셀 것 PE+ - APC 또는 PE- APC+) 또는 사용 (이 tetramers의 비 항 원 부분에 바인딩 할 셀을 선택 셀 BV421 될 것입니다+). 이 단계에서 B 세포 높은 관심의 피토 프에 대 한 특정 카운터 선택 또한 (이 셀 BV421 됩니다+). 따라서,이 메서드는 매우 구체적인 B 세포 B 세포 수용 체 (BCRs) 두 매우 밀접 하 게 관련 된 항 원 사이 차별 있게 표현 정화 수 있습니다. 튜브에 수집 되는 단일 특정 B 세포 그들의 PCR 증폭 Ig cDNAs (보완 deoxyribonucleic 산) 복제 하 고 IgG mAbs 분 비로 인간 세포 선으로 표현.
개념의 증거로 서이 연구는 펩 티 드 제시한 중요 한 조직 적합성 복잡 한 클래스 나 인식 인간의 mAbs의 효율적인 생성에 설명 합니다 (MHC-나) 분자가 펩 티이 드와 같은에 로드 된 다른 펩 티 드 사이 차별 수 있습니다 MHC-나 대립 유전자. 이 자세의 복잡성 수준을 중요 하지만이 방법을 사용 하면 (i) Ag 관련 mAbs;의 고수익 복구 (2) 두 개의 구조적으로 가까운 Ags 사이 차별 있게 mAbs의 생산. 이 방법은 프로토콜 수정 없이 예방 접종 또는 감염 된 환자에 게 확장 될 수 있습니다 그리고 또한 이미 성공적으로 인간 답게 쥐 시스템9에서 구현 되었습니다. 따라서,이 연구는 기초 연구에 immunotherapy 사용할 수 있는 완전 인간 mAbs를 생성 하는 다양 하 고 효율적인 접근 방식을 설명 합니다.
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Protocol
모든 인간 주변 혈액 샘플은 로컬 윤리 위원회 (Etablissement 프랑스어 뒤 상, EFS, 낭트, 프로시저 PLER 국세청-2016-08)에 따라 동의 후 익명 성인 기증자 로부터 얻은 했다.
1. 인간 주변 혈액 단 세포의 고립
참고: 시작 물자 수 총 인간 주변 혈액 또는 cytapheresis 샘플. 샘플 8 h 이상 해서는 안 되 고 응고 (예를들면, 헤 파 린)와 보충.
- 2 볼륨 (인간 주변 혈액) 혈액 또는 5 볼륨 (cytapheresis 샘플) RPMI (로스웰 파크 기념 연구소) 매체의 희석.
- 신중 하 게 35 mL 50 mL 원뿔 튜브에 그라데이션 중간 밀도의 15 mL에 희석된 세포 현 탁 액의 레이어. 모든 희석된 혈액을 배포 하는 데 필요한 만큼 많은 튜브를 확인 합니다. 브레이크에서 실내 온도 진동 물통 회전자에 25 분 1,290 x g에서 원심.
- 조심 스럽게 밀도 그라데이션 매체와 플라즈마 레이어 간의 인터페이스에 단 세포 층을 발음 하 고 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송.
- 튜브 RPMI 매체, 믹스를 실 온에서 10 분 동안 1,290 x g에서 원심. 조심 스럽게 제거는 상쾌한.
- 20 ml RPMI 매체와는 혈소판을 제거 하는 10 분 x g 200에서 원심 분리기의 셀 펠 릿을 resuspend. 조심 스럽게 제거는 상쾌한. 일단이 단계를 반복 합니다.
- 10%와 RPMI 매체에 셀 펠 릿 resuspend 태아 둔감 한 혈 청 (FBS).
참고: tetramer 라벨을 직접 진행 하거나 하룻밤 107 셀/mL의 농도에서 4 ° C에서 세포를 유지 합니다.
2. Ag 특정 B 세포의 자기 농축 tetramer 관련
- Ag-tetramers 중 PE 추가 하 여 준비 또는 APC 라는 프리미엄 학년 streptavidin 또는 BV421 표시 된 streptavidin biotinylated 항 원 단위체를 1: 4의 어 금 니 비율에서. 실 온에서 한 약 수 매 10 분을 추가 세 가지 별도 부분에 streptavidin 켤레의 적절 한 금액을 추가 합니다.
- 15 mL 원뿔 튜브에 세포 (3 x 10까지8 튜브 당) 고 5 분 동안 460 x g에서 원심.
참고: 다음 프로토콜 1 개의 관입니다. - 2%와 PBS (인산 염 버퍼)의 200 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend FBS. PE, APC 및 BV421 활용 된 tetramers, 10 µ g/mL의 최종 농도를 각각 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.
- PBS를 사용 하 여 0.5 %BSA (소 혈 청 알 부 민)과 EDTA (Ethylenediaminetetraacetic 산) 얼음 처럼 차가운 셀 분리 버퍼 (SB) 준비 2 m m.
- 5 분 동안 460 x g에서 원심 분리에 의해 하고있다 펠 릿 세포의 10 mL를 추가 합니다.
- 안티-APC 자기 microbeads의 안티-PE와 50 µ L의 얼음 처럼 차가운 하고있다 추가 50 µ L의 500 µ L 셀 resuspend
- 잘 혼합 하 고 4 ° c.에 20 분 동안 품 어
- 2.5 단계를 두 번 반복 합니다.
- 제거는 상쾌한 신중 하 게 andresuspend 얼음 차가운 SB에서 2 x 108 셀/mL의 농도에서 세포 펠 릿.
- SB의 3 mL와 자석에 큰 자석 열 equilibrate
- Equilibrated 칼럼의 상단에 2.9에서 세포 현 탁 액을 전송 하 고 완전히 방전 있습니다. 중요 한 단계: 열의 응집을 방지 하려면 70 µ m 나일론 메쉬를 통해 세포를 전달 합니다.
- 얼음 차가운 SB의 3 mL와 셀에 포함 된 튜브를 헹 구 고 (여과, 린스 70 µ m 나일론 메쉬)의 경우 열에 직접 버퍼 전송.
- 버퍼는 완전히 열에 물기를 때 열을 얼음 차가운 SB의 또 다른 3 mL를 추가 합니다.
- 또 다른 3 mL 세척을 위한 2.13 단계를 반복 합니다.
- 15 mL 원뿔 수집 관을 통해 자석과 장소에서 열을 제거 합니다.
- 열의 맨 위에 얼음 차가운 SB의 5 mL을 추가 하 고 즉시 플런저를 사용 하 여 열에서 셀을 플러시. 일단이 단계를 반복 합니다.
- 5 분 동안 460 x g에서 수집 된 세포 (농축된 관련 tetramer 포지티브 셀 분수) centrifuge 고 추가 항 체 얼룩이 계속 합니다.
참고: 수영장 셀에서에서 수집 모든 튜브, 적절 한 경우.
3. 자세-특정 인간 B 세포와 세포 분류의 얼룩
- C d 3에 대 한 반대로 인간 항 체의 칵테일 셀 펠 릿 resuspend (마지막 희석: 1시 20분), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50), 및 7AAD (1:1000) 2%와 PBS의 100 µ L의 최종 볼륨에서 FBS. 4 ° c.에 30 분 동안 품 어
- 셀, 5 분, 460 x g에서 원심 분리기에 PBS의 10 mL를 추가 하 고 제거는 상쾌한. 일단이 단계를 반복 합니다. PBS, 70 µ m 나일론 메쉬에 필터의 200 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
- 100 µ m-노즐 및 20 psi의 압력 셀 정렬 cytometer에 단일 세포 수준에서 특정 B 세포 1000 이벤트/s9를 초과 하지 않고 정렬로 이동 합니다.
참고: 사용 되는 제어 전략 그림 1. 에 표시 됩니다. 셀에 CD14 문이 먼저 했다-CD16-7AAD- 셀 제외 monocytes, NK, 죽은 세포 ( 그림 1에 표시 되지 않음). 다음 CD19+ B 셀 더블 스테인드 셀에 게이팅 하기 전에 PE와 송출 관련 Ag-tetramers에 의해 선정 됐다. 비 특정 B 세포 게이팅 BV421 부정적인 세포 (없는 Ag tetramer 여 흠 없는)에 의해 제외 되었습니다. - 8-스트립 PCR 튜브 10 µ L 1 x PBS의 RNAse 억제제의 10 단위 이전 가득 및 96 microtubes에 대 한 선반에 배치로 단일 B 세포를 수집 합니다. 즉시-80 ° c.에 PCR 튜브를 고정
참고: cytometer 악기에 선택 정렬 마스크는 마스크 수율: 0, 순도 마스크: 32, 그리고 위상 마스크: 0. 필요한 경우 단일 셀 보증금 96 또는 384 잘 PCR 접시에 조정 될 수 있었다. 단일 B 세포는 최대한 빨리 동결 해야 합니다 하 고 필요한 경우에 몇 주 동안-80 ° C에 남아 수 있습니다.
4. 단일 셀 RT-PCR
- 직접 건조 욕조에 5 분 동안 70 ° C에서 PCR 스트립에서 냉동된 샘플을가 열 하 여 세포를 lyse.
- 얼음 1 mM dNTP, 25 µ g/mL oligod(T) 뇌관, 5 µ M 임의의 hexamers, RNAse 억제제의 20 단위 및 역전사의 400 단위를 포함 하는 마스터 믹스 버퍼 x 2의 튜브 당 10 µ L을 추가 하 여 전송 (RT)를 진행 하는 스트립을 전송 합니다.
참고: 셀 녹고, 후 RT 수행 되어야 합니다 신속 하 게 RNA 강 직을 피하기 위해. - 교배, 50 ° C에서 1 시간에 대 한 품 어 그리고 반응을 중지를 3 분 동안 95 ° C에 외피와 마무리를 임의의 hexamers 수 있도록 5 분 동안 25 ° C에서 품 어.
- 각 인코딩 변수 무거운 (vH)와 카파 (vLκ) 또는 람다 경 쇄 (vLλ) 지역에 대 한 중첩 된 PCR 증폭의 2 라운드 진행.
참고: 또는, RT 샘플-20 ° C에서 냉동 고 1 주일 동안 보관.- PCR의 첫 번째 라운드에 대 한 추가 1.5 m m MgCl2, 0.25 m m dNTPs, DNA 중 합 효소의 2.5 단위 및 200를 포함 하는 40 µ L 최종 볼륨에 대 한 cDNA의 3 µ L 외부 뇌관 (뇌관 시퀀스 그림 2 및 테이블의 자료 를 참조)의 nM.
참고: 외부 뇌관 혼합의 구성입니다. 무거운 사슬 확대를 위한: 4 뇌관 (5' LVH 믹스) 전달 및 2 반전 뇌관 (3' CµCγ 믹스). 빛 카파 체인 확대를 위한 3는 앞으로 프라이 머 (5' LV | 혼합) 1 반전 뇌관 (3' Cκ543-566). 빛 람다 체인 확대, 7 전달 뇌관 (5' LVl 믹스) 및 1 반전 뇌관 (3' Cl).
참고: 뇌관은 모든 무 겁 고 가벼운 체인 가족 유전자5의 확대를 위한 경 운 기 외. 에 의해 디자인 되었다. - 자전거 다음과 적용: 4 분, 94 ° C 30의 40 주기 다음 94 ° C, 30에서 s s 58 ° C VH와 VLκ (VLλ에 대 한 60 ° C), 및 55에서 최종 신장으로 72 ° C에 7 분 동안 72 ° C에 단계.
- 두 번째 라운드 PCR에 대 한 사용 하 여 첫 번째 증폭 제품의 3 µ L 40의 최종 볼륨에 대 한 1.5 m m MgCl2, 0.25 m m dNTPs, DNA 중 합 효소의 2.5 단위 그리고 200 µ L 식으로 복제에 대 한 금지 효소 사이트를 포함 하는 내부 뇌관의 nM (뇌관 시퀀스 그림 2 및 테이블의 자료 를 참조)는 벡터
참고: 내부 뇌관 혼합의 구성입니다. 무거운 사슬 확대를 위한: 9 앞으로 프라이 머 (5' AgeIVH 믹스)와 3 반전 뇌관 (3' SalIJH 믹스). 빛 카파 체인 확대를 위한 9 뇌관 전달 (5' AgeIV | 믹스) 3 반전 뇌관 (3' BsiWIJκ 믹스). 빛 람다 체인 증폭 6 뇌관 (5' AgeIVl 믹스) 전달 및 1 반전 뇌관 (3' XhoICl).
참고: 뇌관 경 운 기 외., 모든5의 무 겁 고 가벼운 체인 가족 유전자 증폭에 의해 설계 되었습니다. - 자전거 다음과 적용: 4 분, 94 ° C 30의 40 주기 다음 s 94 ° C, 30에서 VH와 LCκ (LCλ에 대 한 60 ° C), 및 45 58 ° C에서 s s 최종 신장으로 72 ° C에서 7 분 동안 72 ° C에 단계.
- PCR의 첫 번째 라운드에 대 한 추가 1.5 m m MgCl2, 0.25 m m dNTPs, DNA 중 합 효소의 2.5 단위 및 200를 포함 하는 40 µ L 최종 볼륨에 대 한 cDNA의 3 µ L 외부 뇌관 (뇌관 시퀀스 그림 2 및 테이블의 자료 를 참조)의 nM.
- VH, vLκ 및 vLλ (500 bp 제품 가변 무거운 체인 인코딩 세그먼트에 대 한) 및 세그먼트를 인코딩 변수 빛 체인 350 bp 제품 1.5 %agarose 젤에 PCR 제품의 마이그레이션 5 μ에 의해 긍정적인 우물을 식별 합니다.
- 외 막 PCR 제품의 정화에 대 한 설계를 사용 하 여 양수 우물에서 남은 나머지 35 µ L PCR 제품을 정화.
- H2o.의 60 µ L PCR 제품을 elute
5. 식 복제
-
삽입을 준비
참고: 소화 60 µ L 각 순화 된 PCR의 적절 한 제한 효소 버퍼를 포함 하는 100 µ L의 최종 볼륨에서 제품.- VH PCR 제품, 사리의 50 단위와 AgeI의 50 대를 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어
- VLλ PCR 제품, XhoI의 50 단위와 AgeI의 50 대를 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어
- VLκ PCR 제품을 위한 AgeI의 50 단위를 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어 96 PCR 멤브레인을 사용 하 여 다이제스트를 정화 BsiWI 제한 효소 버퍼의 100 µ L의 최종 볼륨에서 60 µ L eluate H2o. 다이제스트의 60 µ L 함께 elute, BsiWI, 50 단위를 추가 하 고 1 h 55 ° c.에 품 어
- 15 분 동안 80 ° C에가 열 하 여 효소 비활성화.
-
표현 하는 벡터의 준비
참고: vH PCR 제품 지속적인 무거운 체인 IgG1 Cγ1를 포함 하는 식 벡터 (HCγ1)에 복제 됩니다. vLκ PCR 제품 상수 빛 체인 Cκ를 포함 하는 식 벡터 (LCκ)에 복제 됩니다. vLλ PCR 제품 상수 빛 체인 Cλ를 포함 하는 식 벡터 (LCλ)에 복제 됩니다.- 다음 소화를 수행.
- 믹스 1 µ g 식의 HCγ1 AgeI의 10 단위와 사리 endonucleases, 제조업체에서 권장 하는 제한 버퍼의 20 µ L의 총 볼륨에서의 10 단위 벡터 그리고 1 h 37 ° c.에 품 어
- 제한 버퍼의 20 µ L의 전체 볼륨에 AgeI 제한 효소의 10 단위 식 벡터 LCκ의 믹스 1 µ g는 제조업체에서 권장 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어 BsiWI 제한 효소의 10 단위를 추가 하 고 1 시간 55 ° c.에 대 한 품 어
- AgeI의 10 단위 및 XhoI endonucleases 제한 버퍼의 20 µ L의 총 볼륨에서의 10 단위 식 벡터 LCλ의 믹스 1 µ g는 제조업체에서 권장 하 고 37 ° C에서 1 시간에 대 한 품 어
- 10 분 제한 효소 비활성화 65 ° C에서 각 소화 혼합물이 열.
- 2 µ L로 소화 PCR 제품의 5 µ L의 결 찰을 수행 (100 ng) 4 ° c.에서 하룻밤 배양 하 여 T4 DNA 리가의 1 단위와 DNA 리가 버퍼 x 1의 20 µ L의 총 볼륨의 해당 선형화 식 벡터의
참고: 또는, 결 찰 3 h 4 ° c.에 대 한 수행 됩니다.
- 다음 소화를 수행.
-
복제
- 수 제 electrocompetent TOP10 대장균 (섹션 1.8.4-1.8.8 분자 생물학에 있는 현재 프로토콜)의 45 µ L로 20 µ L 결 찰 혼합물의 Electroporate 1 µ L. 즉시 2 X YT 매체의 500 µ L을 추가 하 고 변형 확산 박테리아 YT 암 피 실린 판 x 2에 30 분 동안 37 ° C에서 물 욕조에 품 어. 37 ° c.에서 밤새 품 어
- 각 변환에 대 한 8 개의 식민지 PCR에 의해 화면.
- 얼음에 다음과 같이 반응 프리 믹스를 설정: PCR 버퍼, MgCl2 (25 m m)의 12 µ L, (에서 각각의 주식 포함 10 mM) dNTPs의 4 µ L, 앞으로 뇌관 (주식 10 µ M) 벡터 시퀀스 (뇌관 Ab vec 감지) 하 교배 시키기의 10 µ L x 5의 45 µ L 그리고 지속적인 무거운 또는 가벼운 체인 지역 타겟팅 역방향 뇌관 (주식 10 µ M)의 10 µ L (뇌관 시퀀스에 대 한 재료의 표 참조). H2o. 200 µ L의 최종 볼륨을 구성 하 DNA 중 합 효소 효소 (5 U / µ L)의 4 µ L를 추가 합니다.
- 얼음에 8 스트립 PCR 튜브 당 반응 프리 믹스의 25 µ L를 배포 합니다.
- 메 마른이 쑤 시 게를 사용 하 여 개별 식민지를 데리 러. 복제 판을 구성 하 여 PCR 반응 관에 그것을 찍어 2 x TY 암 피 실린 접시에 이쑤시개 행진
- 다음 자전거 조건 심사 PCR을 수행: 10 분, 94 ° C 30의 25 주기 다음 s 94 ° C, 30에서 55 ° c, s 및 50 72 ° c.에 s
- 1.5 %agarose 젤에 PCR 제품의 마이그레이션 5 µ L에 의해 긍정적인 박테리아를 식별 합니다.
참고: 긍정적 식민지에 게 PCR 제품 약 850 무거운 체인 벡터 및 600 bp bp 빛 체인 벡터에 대 한.
- 복제 판에서 4 개의 긍정적인 식민지 파운드 매체의 2 mL에 접종 하 고 하룻밤 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어.
- 제조 업체에 의해 표시 된 대로 플라스 미드 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 액체 문화에서 추출 합니다.
- 생어 변수 도메인의 정확한 삽입 확인 Ab vec 감지 뇌관 플라스 미드의 연속.
참고: 올바른 삽입 (HC 및 해당 LC 인코딩) 플라스 미드는 분 비에 대 한 293A 셀으로 cotransfected 이다. 작은 규모 생산 mAbs의 특이성은 ELISA에 의해 분석 됩니다. 다음, 대규모 생산은 해당 하는 경우 수행 됩니다.
6입니다. mAbs의 생산
-
특이성 검사에 대 한 작은 규모의 생산
- 200 µ L의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 보충에 전날 transfection, 씨앗 15000 인간 미 발달 신장 293A (293A HEK) 세포 당 96 잘 접시에 잘 FBS. 37 ° c.에는 CO2 (5% CO2) 인큐베이터에서 밤새 품 어
- DMEM 매체 10% 포함 된 293A 셀 cotransfect FBS transfection 시 약으로 선형 polyethylenimine 파생을 사용 하 여.
참고: triplicates에 있는 transfection를 수행 합니다. 다음 프로토콜 플랫 바닥 96 잘 접시의 한 잘 이다.- 150 mM NaCl의 10 µ L에 0.5 µ L DNA transfection 시 약의 희석. 150 mM NaCl의 10 µ L로 0.125 µ g의 vH와 vL 표현 벡터의 0.125 µ g을 희석. 와 동 각 희석 10 s.
- 10 µ L 희석 DNA transfection 시 약 10 µ L DNA 솔루션에 추가 합니다. 소용돌이 15 s와 실 온에서 15 분 동안 품 어. 293A 셀에 drop-wise 20 µ L 믹스를 추가 하 고 부드럽게 접시 소용돌이 의해 혼합.
- 혈 청 무료 매체에서 5 일 동안 transfection 및 문화 셀 후 중간 16 h를 교체 합니다.
주: 혈 청 자유로운 매체를 사용 하 여 혈 청 Igs 항 체 생산된 오염 방지. - 5 분 동안 460 x g에서 원심 분리 하 여 세포와 파편을 제거 합니다.
- 다중 채널 피 펫과 포부에 의해 supernatants 수확 하 고 V-하단 96 잘 접시에 그들을 전송.
- 외 투 관련 Ag 재구성된 ELISA/ELISPOT 코팅의 당 100 µ L에 4 ° C에서 하룻밤 96-잘 ELISA 격판덮개에 2 µ g/mL의 최종 농도에 1 x를 버퍼링 합니다. 9에서 예제를 참조 하십시오.
- 37 ° C에서 2 시간에 대 한 10% FBS DMEM 매체와 웰 스 블록
- 6.1.5, 단계에서 transfected 293A 셀의 supernatants의 50 µ L을 추가 하 고 실시간에 2 h에 대 한 품 어
- 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 효소 1 µ g/mL에서 IgG Ab 활용 하는 반 인간의 100 µ L을 추가 하 고 실 온에서 1 h에 품 어. 50 µ L 비 기판 (TMB), 추가 하 고 20 분 동안 품 어.
- 450에서 광학 밀도 읽기는 분 광 광도 계에 nm.
참고: 특정 mAbs ELISA 분석 결과 의해 밝혀 더 큰 규모에서 생성 될 수 있다 고 순화 단백질에 인간 IgG에 대 한 선호도 제시 하는 열.
-
대규모 생산 및 특정 mAbs의 정화
- 전날 transfection, 씨앗 6 x 106 인간 미 발달 신장 293A (293A HEK) 25 mL DMEM 10% 보충을 포함 하는 175 cm2 플라스 크에 세포 FBS. 37 ° c.에는 CO2 (5% CO2) 인큐베이터에서 밤새 품 어
참고: 셀 70% 합칠 때 페 이어야 한다. - DMEM 매체 10% 포함 된 293A 셀 cotransfect FBS transfection 시 약으로 선형 polyethylenimine 파생을 사용 하 여.
- 150 mM NaCl의 450 µ L로 DNA transfection 시 약의 50 µ L를 희석. 150 mM NaCl의 500 µ L에 10 µ g의 vH와 vL 표현 벡터 10 µ g을 희석. 10 소용돌이 s 각 희석.
- DNA 솔루션을 희석된 DNA transfection 시 약을 추가 합니다. 소용돌이 15 s와 실 온에서 15 분 동안 품 어. 셀, drop-wise 1 mL 믹스를 추가 하 고 부드럽게 플라스 크를 소용돌이 의해 혼합.
- 혈 청 무료 매체에서 5 일 동안 transfection 및 문화 셀 후 중간 16 h를 교체 합니다.
- 25 mL 피 펫으로 발음 하 여 매체를 수확.
- 5 분 동안 460 x g에서 원심 분리 하 여 세포와 파편을 제거 합니다.
- 4 ° c.에 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템에 단백질 코팅 1 mL 열을 사용 하 여 항 체 정화
- 단백질 sepharose 열 20 m m 인산 버퍼 (pH 7) equilibrate
- 6.2.5 1.22 µ m 필터 다음 0.45 μ m 필터를 사용 하 여에서 세포 배양 매체를 필터링 합니다.
- 열에 필터링 된 매체를 로드 하십시오.
- 20 m m 인산 버퍼 (pH 7)로 세척 하 고 0.1 M 구 연산 염 버퍼 (pH 3.5)와 함께 elute.
- 280에서 광학 밀도 읽고 nm 흡수 분 광 광도 계에 그리고 즉시 중화 1 M Tris 버퍼 (pH 9) 단백질을 포함 하는 분수.
- 3.5 K 분자량 PBS 버퍼 (pH 7.4)에 대 한 차단으로 카세트에 4 ° C에서 하룻밤 순화 Ab dialyze
- 0.2 µ m 여과 및 제어 순으로 제조 업체에 의해 표시 된 크기 배제 크로마토그래피에 의해 소독.
- 전날 transfection, 씨앗 6 x 106 인간 미 발달 신장 293A (293A HEK) 25 mL DMEM 10% 보충을 포함 하는 175 cm2 플라스 크에 세포 FBS. 37 ° c.에는 CO2 (5% CO2) 인큐베이터에서 밤새 품 어
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Representative Results
이 프로젝트 선물 Pp65495 펩 티 드를 인식 인간의 mAbs의 세대 건강 한 기증자에서 PBMC에서 출발 (Pp65, 인간의 세포에서) 제시한 중요 한 조직 적합성 복잡 한 클래스 나 (MHC-나) 분자 HLA-A * 0201 ( HLA-A2). 이러한 mAbs이 복잡 하 고 다른 펩 티 드 같은 MHC에 적재를 대표 하는 단지 사이 차별 수-내가 분자.
PBMC는 HLA A2/Pp65 PE, HLA-A2/Pp65-APC와 HLA A2/MelA2 BV421 tetramers 위의 프로토콜에 설명 된 대로 얼룩이 있었다. Immunomagnetic PE 및 APC tetramer 포지티브 셀의 셀 농축, 후 eluted 셀 추가 mAbs와 얼룩이 있었다. 교류 cytometry 셀 정렬에서 자석으로 풍부한 셀 처음 가능한 CD14에 문이 했다-CD16-CD3-CD19+ singlets (B 세포). 그림 1 에서는 BCRs HLA A2/Pp65 다른 간을 구별할 수 있게 표현 하는 B 세포를 분리 하는 데 사용 하는 제어 전략 관련 HLA A2/펩 티 드 복합물. 다양 한 관심사의 B 세포 게이팅 HLA A2/Pp65 PE+ 및 HLA A2/Pp65 APC+ 더블-되었다면, PE+ 또는+APC 스테인드 홀로 된 형광 색소 특정 B 세포를 제외 후 수행 되었다. 마지막으로, 매우 구체적인 B 세포는 HLA A2/MelA2 BV421 부정적인 세포에 게이팅에 의해 확인 되었다. 이로써 BCRs HLA-A2/Pp65, 펩 티 드 및 HLA A2 종속 방식으로 바인딩할 수이 B 세포와 β2 microglobulin, biotin, HLA A2, 또는 그 어떤 차별 하지 않습니다에 대 한 감독 그 사이 감 별을 표현 하는 B 세포의 식별 사이 펩 티 드 MHC 바인딩 홈에. 이러한 후자의 셀 BV421 긍정적인 셀 것입니다. 이전 표시 하 고 추가 Ag의 다른 종류와 설명,이 제외 전략 Ag9에 대 한 B 세포의 구별 능력에 있는 증가 때문에 더 중요 하다.
일단 단일 특정 B 셀 정렬 했다, RT-PCR에 의해 증폭 했다 cDNAs 무거운 및 빛 Ig 체인에 대 한 인코딩. 무 겁 고 가벼운 사슬 세그먼트 코딩의 쌍 단 B 세포 테스트 (표 1)의 약 50%에서 얻은 했다. 시퀀스 식에 다음 복제 된 변수 도메인 포함 해당 상수 도메인 시퀀스 (무거운 일정 1 및 빛 상수 κ 또는 λ) 벡터 스 인간 미 발달 신장 세포 (HEK, 293A 세포)는 무 겁 고 가벼운 사슬 벡터와 cotransfected 했다. IgG1 isotype의 secreted mAbs transfection (참조 그림 3 완전히 인간의 mAbs 생산의 글로벌 전략에 대 한) 후 5 일 293A 세포의 문화 supernatants에서 수확 했다. 이 성공적으로 생산 하는 한 HLA A2/Pp65 특정 항 체 저조한 무 겁 고 가벼운 사슬 세그먼트 (표 1) 코딩의 쌍 3 하나의 B 림프 구 세포에서 시작. ELISA 분석 실험은 명확 하 게이 mAb 두 MHC와 펩 티 드-종속 HLA A2/Pp65 단지 (그림 4A)에 그것의 바인딩 위한 이었고 mAb의 몇 밀리 그램 (예를 들어, 선호도 분석, 추가 분석에 대 한 제작 쉽게 설명 기능 분석 실험)입니다. 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 결정 하는 바인딩 선호도 약 7 × 10-6 M (그림 4B) 했다.
따라서,이 문서에서는 설명 합니다 i) 관련 Ag 특정 B 세포의 탐지를 허용 하는 과민 하 고 효율적인 방법의 조합을, 심지어 때 건강 한 기증자의 혈액과 ii) 높은 구별 인간의 mAbs의 생성에 아주 낮은 주파수에서 제시.
그림 1: 인간의 PBMC에서 HLA A2/Pp65 특정 B 세포의 탐지.
3 x 108 PBMC HLA A2/Pp65 PE, HLA-A2/Pp65-APC, HLA-A2/MelA2-BV421 tetramers와 얼룩이 있었다. Immunomagnetic PE 및 APC tetramer 포지티브 셀의 셀 농축, 후 eluted 셀 추가 mAbs와 얼룩이 있었다. 셀에 가능한 내의 CD14 먼저 문이 했다 교류 cytometry 셀 정렬,-CD16 CD19 다음에 (표시 되지 않음),- 림프 톨+CD3- 셀. 다음, B 세포는 HLA A2/Pp65 PE와 HLA A2/Pp65 APC tetramers 물 문이 되었다. HLA A2/MelA BV421 tetramer HLA-A2/Pp65, 펩 티 드와 MHC 종속 방식으로 인식 하지 않았다 B 셀 제외 하 사용 되었다.
그림 2: 증폭 및 Ig 유전자의 복제에 대 한 전략. 빛과 무거운 Ig 체인 인코딩 유전자 중첩된 RT-PCR에 의해 증폭 되었다. 첫 번째 PCRs 지도자 지역 및 역방향 뇌관 적절 한 무거운, 카파, 또는 가벼운 람다 체인의 일정 지역에 대 한 특정을 교배 시키기 앞으로 뇌관의 믹스와 함께 수행 했다. 두 번째 PCRs 금지 사이트를 포함 한 뇌관으로 수행 되었다, 앞으로 역 뇌관 각각 V 세그먼트의 시작 및 J 세그먼트의 끝에 대 한 특정 했다. 금지 효소로 소화 하 고 식 벡터 포함 된 적절 한 상수 도메인에서에서 복제 된 PCR 제품 시퀀싱 했다. CMV: 세포 발기인; AmpR: 암 피 실린에 대 한 저항 유전자입니다.
그림 3: 재조합 인간 mAbs의 재건의 전반적인 전략.
Tetramer 기반 정렬 전략 관심의 B 세포의 탐지를 허용 한다. 매우 구체적인 B 세포 단일 셀 정렬 했다. 빛과 무거운 Ig 체인 인코딩 세그먼트 RT-PCR를 사용 하 여 증폭 했다. 변수 도메인 시퀀스 프레임에 별도 진 핵 식 벡터에 유전자 세그먼트 인코딩 상수 빛과 무거운 영역으로 복제 했다. 해당 완전히 인간의 mAbs 정도 페 HEK 293A 세포에 의해 표현 하 고 표면에 뜨는 문화에서 정화 했다. 이 수치는 Ouisse 그 외 여러분 에서 수정 된 (2017) 9.
HLA A2/Pp65 인간 주변 혈액 순환 하는 B 세포에서에서 생성 된에 대 한 대표적인 매우 구별 mAb의의 그림 4: 특성화
A) mAb HLA A2/Pp65에 대 한 PC1.02의 특이성 ELISA 테스트. 플레이트 관련 (HLA-A2/Pp65) 또는 HLA A2 제한 펩 티 드를 포함 하는 없는 HLA A2 단지 코팅 했다: MelA, n s 3 (HCV-1), 및 GagP17 (HIV-1) 2 µ g/mL, PC1.02 추가 되었습니다, mAb 및 IgG HRP Ab는 검색에 사용 되는 안티 인간에서. 광학 밀도 (OD) 450에서 읽어온 nm. B) mAb CM5 칩 바인딩된 mAb 통해 HLA A2/Pp65 단지의 다양 한 농도 흐르는 표면 플라스몬 공명 (SPR)를 사용 하 여 PC1.02의 선호도 결정. 이 수치는 Ouisse 그 외 여러분 에서 수정 된 (2017) 9.
| PBMC의 수 | PE + APC + 농축 후 셀의 수 | 제외 (BV421 +) 셀의 수 | 정렬 된 단일 셀의 수 | 분석 된 우물의 수 | HC와 LC 우물의 수 (% 복구) 관련 | 생산 mAbs의 수 | 특정 mAbs의 수 | |
| HLA A2/Pp65 mAb (PC1.02) | 3 x 108 | 818 | 117 | 161 | 7 | 3 (43%) | 3 | 1 |
표 1: HLA A2/Pp65 특정 B 세포의 분석.
난다 B 세포, Ig 유전자 증폭 및 절연된 HLA A2/Pp65 특정 B 세포에서 mAb 생산 수율의 배제 전략의 영향 평가/측정 했다.
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Discussion
제안 된 프로토콜 Ag 특정 B 세포는 혈액 순환에서 직접 인간의 mAbs의 세대에 대 한 강력한 방법입니다. 그것은 세 가지 중요 한 측면을 결합 한다: (i) tetramer 관련 자기 농축, 심지어 드문 Ag 바인딩 B 세포;의 비보 전 격리 수 있는의 사용 (ii)을 사용 하 여 3 Ag tetramers (2 개의 관련 것 들 그리고 한 없는 하나) 이라는 세 가지 다른 형광으로, cytometry, 여 BCR 특정 원하는 Ag;에 대 한 표현 B 셀만 제어 전략 (iii) 해당 재조합의 재건 mAb cDNAs RT-PCR에 의해 단일 세포 수준 및 인간 세포에서 cDNAs의 표현.
이전 연구는 mAbs는 격리 된 B 세포6,7,8에서 정렬 및 후속 생산 전에 인간 B 세포를 하나 또는 두 개의 형광 관련 항을 사용 하 여 제안 했다. 류 마티스 관절염 환자에서 한 분석 및 자가 면역 질환 마우스 모델에서 하나 autoreactive B 셀을 특성화 하 고 그들의 주파수10,11결정에 무관 한 형광 항 원을 관련 있다. 우리가 아는 두 형광 관련 항 원 tetramers의 조합을 사용 하 고 한 없는 항 tetramer 하지 완전히 인간의 mAbs의 생산을 위한 그들의 사용 전에 특정 B 세포의 농축에 대 한 이전 설명 하고있다. 이 최적화 방법은 완전히 인간의 구별 mAbs 약간 달에서 얻을 수 있으며 순진한 B 셀 레 퍼 토리에서 시작 하는 경우에 성공적으로 수행할 수 있습니다. 따라서, 그것은 인간 B 세포 immortalization 파지 디스플레이의 주요 결점의 아무도 또는 다른 이전 분자 생물학 기반 mAb 재건 절차 설명.
이 셀 전략 정렬 Ag 특정 인간의 mAbs의 고수익 복구 발생 합니다. 무 겁 고 가벼운 체인 세그먼트가 단일 격리 된 B 세포에서의 쌍은 약 50%의 성공률와 함께 증폭 됩니다. 가벼운 체인 세그먼트는 증폭 거의 항상, 하지만 이것은 무거운 사슬 세그먼트에 대 한 사실이 아니다. RT-PCR 효율 주로 다음 사항을 존중에 의존: 나) 정렬 된 단일 B 세포; 최대한 빨리 동결 해야 합니다 ii) RNase 억제제의 30 단위를 추가 하 고 냉동 실에서 B 세포를 복용 하 고 RT 반응; 발사 사이 시간을 최소화 iii) 녹고 얼음; 모든 뇌관 4) 결코 냉동/녹고 뇌관 3 배 이상; v) 1 년의 최대 뇌관 여기 비축과 됩니다.
원하는 구체적으로 해당 재조합 mAbs의 생산 효율성에 관하여 pMHC 특정 mAbs에 대 한 경우의 약 30 ~ 40%입니다. 이러한 특정 mAbs는 펩 티 드와 매우 요구 하는 MHC 분자를 인식 해야 하 고 우리가 이전 전통적인 항 원에 대하여 지시 하는 특정 mAbs의 복구의 전반적인 수확량은 우수, 최대 100%를 Β-galactosidase 항 원9. 그것 없는 tetramer에 대 한 적절 한 자세의 선택은 생산 mAbs의 특이성을 증가 하는 것이 중요 하는 스트레스를 해야 합니다.
현재 문서에서 설명 하는 안티-HLA-A2/Pp65 mAb (PC1.02)의 선호도 7 x 10-6 M, 유사는 TCR의 선호도 대 한 상대적으로 낮은입니다. 이 결과, B 세포 격리 순진한 기증자에서 수행한 예상 했다. 대부분 tetramer+ B 세포 IgM+IgG-, 좋은 Ag-바인더를 얻기의 확율을 감소 시키는 있었다. 그럼에도 불구 하 고,이 방법을 만들 수 있습니다 또한 가능한 정렬 cross-reactive 메모리 B 세포 순진한 기증자 로부터 원하는 Ag에 대 한 개인12의 면역학 과거 때문에. 또한,이 방법은 예방 접종 또는 감염 된 환자 또는 면역된 인간 답게 동물에 쉽게 적용 9에 설명 된 대로 친 화력 성숙 vivo에서 약 1 x 10-9 을 결과 mAbs의 선호도 높일 수 있습니다 M. 다양 한 절차는 또한 mAbs에서 생체 외에서특히 신체적인 hypermutation ( 13에서 검토) 항 체를 표현 하는 셀에서을 통해 재현의 선호도 향상 시키기 위해 기술 되었다.
결론적으로, 우리는 순진한 예방 접종된 기증자 또는 자가 면역 질환에서 고통의 환자 개별에서 상황의 다양 한 종류에 사용할 수 있는 매우 구별 mAbs 생산을 위한 다양 한 전략을 제안 합니다. 기초 연구와 immunotherapy 모두 원하는 피토 프에 대 한 이러한 방법으로 생성 하는 완전히 인간의 mAbs 유용할 수 있었다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 전문가 기술 지원을 위한 Cytometry 시설 "CytoCell" (SFR 건강, Biogenouest, 낭트) 감사합니다. 우리는 그들의 기술 지원에 대 한 또한 모든 직원을의 재조합 단백질 생산 (P2R) 및 영향 플랫폼 (INSERM 1232, SFR 건강, Biogenouest, 낭트)의 감사합니다. 우리에 대 한 건설적인 의견 원고 에마뉘엘 Scotet 및 리처드 Breathnach 감사합니다. 이 작품 «Investissements d'Avenir» 프랑스 정부 프로그램, 여는 프랑스 국가 연구 기관 (ANR) (ANR-10-IBHU-005) 관리에 의해 자금 IHU Cesti 프로젝트에 의해 재정적으로 지원 되었다. IHU-Cesti 프로젝트도 낭트 메트로 지구의 드 라 루아르에 의해 지원 됩니다. 이 작품은 미래의 프로그램 ANR-11-LABX-0016-01의 투자를 통해 국립 연구 기관에서 지 원하는 LabEX IGO 프로그램의 맥락에서 실현 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK 293A cell line | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine |
| RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | PAA | K45-001 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
| PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
| Fetal Bovine serum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
| Ficoll - lymphocytes separation medium | EuroBio | CMSMSL01-01 | density 1,0777+/-0,001 |
| streptavidin R-phycoerythrin conjugate | Invitrogen by Life Technologies | S21388 | premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide |
| Streptavidin, allophycocyanin conjugate | Invitrogen by thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azide premium grade |
| Brilliant violet 421 streptavidin | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
| Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| MidiMACs or QuadroMACS separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Used dilution 1:20 |
| CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Used dilution 1:20 |
| CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Used dilution 1:50 |
| CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Used dilution 1:50 |
| 7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Used dilution 1:1000 |
| FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer | BD Biosciences | ||
| 8-strip PCR tubes | Axygen | 321-10-061 | |
| Racks for 96 microtubes | Dominique Dutscher | 45476 | |
| RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) | Invitrogen by thermoFisher scientific | 10777-019 | qty:5000U (40U/ul) |
| Distilled Water Dnase/Rnase Free | Gibco | 10977-035 | |
| Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
| Random hexamers | Invitrogen by thermoFisher scientific | N8080127 | qty : 50uM, 5nmoles |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 18080-044 | qty : 10000U (200U/ul) |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| dNTP Set, Molecular biology grade | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
| 5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers |
| 5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers |
| 5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers |
| 5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers |
| 3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening |
| 3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig |
| 5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers |
| 5'LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG |
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG |
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers |
| 3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA |
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening |
| 5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1_9_1–13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening |
| Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC |
Bacteria PCR screening |
| QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade | MP Bio | AGAH0500 | |
| NucleoFast 96 PCR Plate | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
| Enzyme Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
| Enzyme SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
| Enzyme Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
| Enzyme BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
| HCg1 (Genbank accession number FJ475055) | |||
| LCk (Genbank accession number FJ475056 ) | |||
| LCl (Genbank accession number FJ517647) | |||
| T4 DNA ligase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
| 2X YT medium | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
| LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
| Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification | Macherey Nagel | 740588.250 | |
| Jet PEI DNA transfection reagent | PolyPlus | 101-40 | |
| Flat bottom96-well plate | Falcon | 353072 | |
| V-bottom 96-well plate | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
| Nunc easy 175 cm2 flasks | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
| ELISA/ELISPOT coating buffer | eBiosciences | 00-0044-59 | |
| Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | high protein binding |
| Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
| TMB substrate | BD Biosciences | 555214 | |
| Streptavidin | Sigma | S0677 | |
| 1 mL-HiTrap protein A HP column | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517501 | |
| NGC Quest 10 Plus Chromatography System | BioRad | 7880003 |
References
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- Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C.
- Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
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면역학 문제점 132 면역학 세포 생물학 인간 항 체 B 세포 tetramer cytometry 단일 셀 항 원 특정 자석 농축Erratum
Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.
The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes, Nantes, France
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France
