Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

Summary

Descriviamo un metodo per la produzione di anticorpi umani specifici per un antigene di interesse, a partire da rari linfociti B circolanti nel sangue umano. Generazione di questi anticorpi naturali è efficiente e rapido, e gli anticorpi ottenuti in grado di discriminare tra antigeni altamente correlati.

Abstract

Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono potenti strumenti utili per entrambi ricerca fondamentale e della biomedicina. Loro alta specificità è indispensabile quando l'anticorpo è necessario distinguere tra strutture altamente correlate (ad es., una proteina normale e una versione mutata della stessa). L'attuale modo di generare tali mAbs discriminativo coinvolge vasta selezione di più celle di produzione di Ab B, che è sia costoso e richiede tempo. Vi proponiamo qui un metodo rapido ed economico per la generazione di discriminante, mAbs pienamente umana, a partire da sangue umano fare circolare i linfociti B. L'originalità di questa strategia è dovuto la selezione delle celle di associazione B antigene specifico combinato con il Counter-selezione di tutte le altre celle, utilizzando prontamente disponibili Peripheral Blood mononucleari cellule (PBMC). Una volta specifici linfociti B sono isolate, sequenze di cDNA (complementare dell'acido deossiribonucleico) che codifica per il mAb corrispondente sono ottenute utilizzando tecnologia single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) e successivamente espresse in umani cellule. In meno di 1 mese, è possibile produrre milligrammi di mAbs umano altamente discriminante nei confronti di praticamente qualsiasi antigene desiderato naturalmente rilevato dal repertorio musicale delle cellule di B.

Introduction

Il metodo qui descritto consente la produzione rapida e versatile di pienamente umana gli anticorpi monoclonali (mAbs) contro un antigene desiderato (Ag). mAbs sono strumenti essenziali per molte applicazioni di ricerca fondamentale in vitro e in vivo: flusso cytometry, istologia, esperimenti di western blotting e blocchi per esempio. Inoltre, mAbs vengono utilizzati più in medicina per curare le malattie autoimmuni, il cancro e per controllare il rigetto di trapianto¹. Ad esempio, mAb anti-CTLA-4 e anti-PD-1 (o anti-PD-L1) recentemente sono stati usati come inibitori di checkpoint immuni in cancro trattamenti².

Il primo mAbs sono state prodotte da immunoglobulina (Ig)-secernendo ibridomi ottenuti dalle cellule spleniche di topi immunizzati o ratti. Tuttavia, la forte risposta immunitaria contro anticorpi monoclonali murini o ratto ostacola il loro uso terapeutico negli esseri umani, a causa della loro rapida clearance e il probabile induzione di reazioni di ipersensibilità³. Per affrontare questo problema, sequenze di proteine animali di mAbs sono stati parzialmente sostituiti da quelli umani per generare i cosiddetti anticorpi chimerici topo-umani o umanizzati. Tuttavia, questa strategia diminuisce solo parzialmente immunogenicità, aumentando sostanzialmente sia il costo e il tempo-scala di produzione. Una soluzione migliore è quello di generare anticorpi monoclonali umani direttamente da linfociti B umani e sono disponibili diverse strategie per questo. Uno di loro è l'uso del display dei fagi o lievito. Questo comporta la visualizzazione di domini variabili da una libreria combinatoria di Ig umana casuale pesanti e catene leggere su fagi o lieviti e realizzazione di un punto di selezione usando l'antigene specifico di interesse. Un grande svantaggio di questa strategia è che le catene pesanti e chiare sono casualmente associate, portando ad un aumento molto grande nella diversità degli anticorpi generati. Gli anticorpi ottenuti difficilmente corrispondono a quelli che deriverebbero da una risposta immunitaria naturale contro un particolare Ag. Inoltre, modificazioni post-traduzionali e ripiegamento di proteine umane non sono sistematicamente riproducibili nei procarioti o anche nei lieviti. Un secondo metodo di produzione di mAb umana è l'immortalizzazione dei linfociti B umani naturali, dall'infezione del virus Epstein - Barr o espressione dei fattori anti-apoptotico BCL-6 e BCL-XL⁴. Tuttavia, questo metodo è applicabile solo alle cellule di B di memoria ed è inefficiente, che richiede la selezione delle cellule di B immortalizzate mAb-producendo numerose per identificare i cloni di mAb pochi (se presente) con la specificità antigenica desiderata. Il metodo è così costoso e che richiede tempo.

Recentemente è stato descritto un nuovo protocollo per la produzione di mAbs umana da isolato singolo B cellule⁵. Essa si basa su un ottimizzato unicellulare Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) per l'amplificazione di entrambi i pesanti - e della luce-catena codifica segmenti da una singola cellula B ordinata. Questo è seguito dalla clonazione e l'espressione di questi segmenti in un sistema di espressione eucariotico, permettendo così la ricostruzione di un mAb pienamente umana. Questo protocollo è stato usato con successo a partire da cellule B da donatori vaccinati. Le cellule sono state raccolte diverse settimane dopo la vaccinazione per ottenere frequenze più alte delle cellule di B dirette contro l'Ag desiderato e quindi limitare il tempo necessario per lo screening di⁶. Altri mAbs pienamente umana sono state prodotte anche da pazienti infetti da HIV⁺ (Virus dell'immunodeficienza umana)⁷ e melanoma pazienti⁸. Nonostante questi progressi, non c'è ancora nessuna procedura disponibile che permette l'isolamento di cellule B Ag-specifici indipendenti del loro fenotipo memoria o la frequenza.

La procedura descritta qui conduce all'isolamento efficiente ex vivo di cellule B circolanti umane basato sulla loro specificità BCR, seguita dalla produzione di pienamente umano mAbs antigene-specifiche nell'alto rendimento e con un tempo di proiezione bassa. Il metodo non è limitato a cellule B memoria o cellule B disecrezione indotte dopo una risposta immunitaria, ma può essere applicato anche al repertorio delle cellule di B ingenui umano. Che funziona anche a partire da cellule B Ag-specifici presenti a frequenze molto basse è una buona indicazione della relativa efficienza. Il principio del metodo è come segue: le cellule mononucleari di sangue periferico (PBMC) sono macchiati con due tetrameri che presentano l'antigene di interesse, ognuno etichettato con un fluorocromo diverso (ad es., ficoeritrina (PE) e Allophycocyanin (APC)), e un terzo tetramero presentando un antigene strettamente correlato coniugato con un fluorocromo terzo (ad es., Brillant Violet 421 (BV421)). Per arricchire per le cellule antigene-legante, le cellule sono poi incubate con perline rivestite con anti-PE e Abs anti-APC e ordinati in colonne di separazione delle cellule. La frazione di cellule APC PE^{+ +} è selezionata, macchiato con una varietà di anticorpi specifici per diversi tipi di cellule PBMC permettere l'identificazione delle cellule di B e sottoposto al flusso cytometry ordinamento delle cellule. Cellule di B che sono PE⁺ e APC⁺, ma brillante viola^-, sono isolate. Questo passaggio Counter-seleziona le celle che non sono le cellule B o non legarsi all'antigene tetramerized, ma associa al PE o APC (queste cellule saranno PE⁺ APC^– o PE^– APC⁺) o la parte non-antigene dei tetrameri utilizzato (questi le cellule saranno BV421⁺). Le cellule B non altamente specifiche per l'epitopo di interesse Counter-vengono selezionate anche in questa fase (queste cellule saranno anche BV421⁺). Pertanto, questo metodo può purificare altamente specifici linfociti B che esprimono recettori di cellule B (BCR) in grado di discriminare tra due antigeni molto strettamente correlati. Cellule B specifiche singole sono raccolti in provette e loro PCR-amplificato Ig cDNA (acidi desossiribonucleico complementari) clonato ed espresso da una linea cellulare umana come secrete IgG anticorpi monoclonali.

Come un proof of concept, questo studio descrive la generazione efficiente di mAbs umano, che riconosce un peptide ha presentato da una classe di complesso maggiore di istocompatibilità (MHC-I) molecola e in grado di discriminare tra questo peptide e altri peptidi caricati sullo stesso MHC-I allele. Anche se il livello di complessità di questa Ag è importante, questo metodo (i) permette il recupero di ad alto rendimento di Marazzi Ag-specifici; (ii) la produzione di anticorpi monoclonali in grado di discriminare tra due strutturalmente chiudere Ags. Questo approccio può essere esteso ai pazienti vaccinati o infetti senza alcuna modifica del protocollo e ha anche già stato implementato con successo in un ratto umanizzata sistema⁹. Quindi, questo studio descrive un approccio versatile ed efficiente per generare mAbs pienamente umano che può essere utilizzato nella ricerca di base e l'immunoterapia.

Protocol

Tutti i campioni di sangue periferico umano sono stati ottenuti da donatori anonimi adulti dopo consenso informato, secondo il comitato etico locale (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedura accoppiatore NTS-2016-08).

1. isolamento delle cellule mononucleari del sangue periferico umano

Nota: Il materiale di partenza può essere totale del sangue periferico umano o Citaferesi campioni. Campioni non devono essere più vecchi di 8 h e completati con anticoagulanti (ad es., eparina).

1. Diluire il sangue con 2 volumi (sangue periferico umano) o 5 volumi (esempio Citaferesi) di medium RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
2. Con attenzione strato 35 mL di sospensione cellulare diluito in 15 mL di medio gradiente di densità in una provetta conica da 50 mL. Faccia come molti tubi come necessarie per distribuire tutto il sangue diluito. Centrifugare a 1.290 x g per 25 min a temperatura ambiente in un rotore basculante con freno fuori.
3. Attentamente aspirare lo strato delle cellule mononucleari all'interfaccia fra il mezzo di gradienti di densità e il livello del plasma e trasferire le cellule ad un nuovo tubo conico di 50 mL.
4. Riempire il tubo con medium RPMI, mescolare e centrifugare a 1.290 x g per 10 min a temperatura ambiente. Rimuovere con cautela il supernatante.
5. Risospendere il pellet cellulare in 20 mL di medium RPMI e centrifugare a 200 x g per 10 min rimuovere le piastrine. Rimuovere con cautela il supernatante. Ripetere questo passaggio una volta.
6. Risospendere il pellet cellulare in medium RPMI con 10% siero bovino fetale (FBS).
   Nota: Passare direttamente alle tetramero etichettatura o mantenere le cellule a 4 ° C durante la notte ad una concentrazione di 10⁷ cellule/mL.

2. tetramero-collegata di arricchimento magnetico delle cellule B Ag-specifici

1. Preparare Ag-tetrameri aggiungendo entrambi PE o APC-etichetta premium grade streptavidina o BV421-labeled streptavidin con un rapporto molare di 1:4 ai monomeri di antigene biotinilato. Aggiungere la quantità appropriata di streptavidina-coniugato in tre porzioni separate, aggiungendo un'aliquota ogni 10 min a temperatura ambiente.
2. Distribuire le cellule (fino a 3 x 10⁸ a tubo) in provette coniche da 15 mL e centrifugare a 460 x g per 5 min.
   Nota: Il seguente protocollo è per un tubo.
3. Risospendere il pellet cellulare in 200 µ l di PBS (Phosphate Buffered Saline) con 2% FBS. Aggiungere PE - APC- e BV421-coniugato tetrameri, ciascuno a una concentrazione finale di 10 µ g/mL. Mescolare bene e incubare per 30 min a temperatura ambiente.
4. Preparare il tampone di separazione di cella ghiacciata (SB) con PBS con 0,5% BSA (albumina di siero bovino) ed EDTA (acido etilendiamminotetracetico) 2 mM.
5. Aggiungere 10 mL di Pellet SB. cellule mediante centrifugazione a 460 x g per 5 min.
6. Risospendere le cellule in 500 µ l di gelida SB. aggiungere 50 µ l di anti-PE e 50 µ l di anti-APC microperle magnetiche.
7. Mescolare bene e incubare per 20 min a 4 ° C.
8. Ripetere il passaggio 2.5 due volte.
9. Eliminare il surnatante attentamente andresuspend il pellet cellulare ad una concentrazione di 2 x 10⁸ cellule/mL in ghiaccio freddo SB.
10. Equilibrare una grande colonna magnetica posizionata su un magnete con 3 mL di SB.
11. Trasferire la sospensione cellulare da 2,9 sulla parte superiore della colonna equilibrata e lasciarlo scolare completamente. PASSAGGIO critico: Per evitare di agglutinamento della colonna, passare le cellule attraverso una rete di nylon 70 µm.
12. Sciacquare il tubo che conteneva le cellule con 3 mL di ghiaccio freddo SB e trasferire il tampone direttamente sulla colonna (in caso di filtrazione, maglia di nylon di sciacquare il 70 µm).
13. Quando il buffer è completamente a vuoto nella colonna, è possibile aggiungere un altro 3 mL di ghiaccio freddo SB alla colonna.
14. Ripetere il passaggio 2.13 per un altro lavaggio di 3 mL.
15. Rimuovere la colonna dal magnete e posto sopra un tubo di raccolta conico 15 mL.
16. Aggiungere 5 mL di ghiaccio freddo SB sulla parte superiore della colonna e sciacquare immediatamente le cellule fuori la colonna utilizzando lo stantuffo. Ripetere questo passaggio una volta.
17. Centrifugare le cellule raccolte (frazione di cellule positivo arricchito tetramero pertinenti) a 460 x g per 5 min e procedere alla colorazione di anticorpo supplementare.
    Nota: Piscina raccolti le cellule da tutti i tubi, se appropriato.

3. colorazione delle cellule umane B Ag-specifici e ordinamento delle cellule

1. Risospendere il pellet cellulare con un cocktail di anticorpi anti-umani CD3 (diluizione finale: 01:20), CD19 (01:20), CD14 (01:50), CD16 (01:50) e 7AAD (1: 1000) in un volume finale di 100 µ l di PBS con 2% FBS. Incubare per 30 min a 4 ° C.
2. Aggiungere 10 mL di PBS alle celle, centrifuga a 460 x g per 5 min ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio una volta. Risospendere il pellet cellulare in 200 µ l di PBS, filtro sulla maglia di nylon 70 µm.
3. Procedere per ordinare celle B specifiche a livello di singola cellula su un citometro di sorter delle cellule con un 100 µm-ugello e una pressione di 20 psi senza superare 1.000 eventi/s⁹.
   Nota: La strategia di gating utilizzata è illustrata nella Figura 1. Le cellule sono state prima gated il CD14^–CD16 7AAD^–– cellule per escludere i monociti, NK e cellule morte (non illustrate nella Figura 1). Quindi CD19⁺ B cellule sono state selezionate prima di gating su doppie cellule marcate da PE e APC pertinenti Ag-tetrameri. Cellule B non-specifici sono stati esclusi di gating su BV421 cellule negative (senza macchia da Ag-tetramero irrilevante).
4. Raccolta di singole cellule di B in strip 8 provette per PCR precedentemente riempito con 10 µ l di 1X PBS e 10 unità di inibitore di RNAsi e collocati su una rastrelliera per microprovette 96 da. Bloccare immediatamente le provette PCR a-80 ° C.
   Nota: Le maschere di ordinamento scelte sullo strumento citometro sono resa maschera: 0, maschera di purezza: 32 e maschera di fase: 0. questo deposito di singola cellula poteva essere regolato per una piastra PCR a 96 o 384 pozzetti, se necessario. Cellule B singole devono essere congelate nel minor tempo possibile e possono essere lasciate a-80 ° C per diverse settimane, se necessario.

4. singola cella RT-PCR

1. Lisare cellule riscaldando direttamente campioni congelati in strisce PCR a 70 ° C per 5 min in un bagno secco.
2. Trasferimento strisce per ghiaccio e procedere ad invertire la trascrizione (RT) aggiungendo 10 µ l per provetta di un 2 x mix master tampone contenente 1mm dNTP, 25 µ g/mL oligod(T) primer, 5 µM random esameri, 20 unità di inibitore di RNAsi e gli 400 unità della trascrittasi inversa.
   Nota: Dopo la cellula lo scongelamento, RT deve essere eseguita rapidamente per evitare la degradazione del RNA.
3. Incubare a 25 ° C per 5 min consentire esameri casuali ibridare, quindi incubare per 1 h a 50 ° C e finire con un'incubazione a 95 ° C per 3 min arrestare la reazione.
4. Procedere con due cicli di amplificazione di PCR annidata per ciascuna delle regioni codifica per variabile pesante (vH) e kappa (vLκ) o catene chiare di lambda (vLλ).
   Nota: In alternativa, i campioni di RT possono essere congelati a-20 ° C e tenuti per una settimana.
   1. Per il primo turno della PCR, aggiungere 3 µ l di cDNA per un volume finale di 40 µ l contenente 1,5 mM MgCl₂, 0,25 mM dNTPs, 2,5 unità della DNA polimerasi e 200 nM di primer esterno (Vedi Figura 2 e Tabella materiali per sequenze dell'iniettore).
      Nota: Composizione del mix di primer esterno. Per l'amplificazione della catena pesante: 4 avanti primer (LVH mix di 5') e 2 reverse primer (3' CµCγ mix). Per l'amplificazione di catena leggera kappa, 3 avanti primer (5' LV | mescolare) e 1 reverse primer (3' Cκ543-566). Per l'amplificazione di catena leggera lambda, 7 forward primer (5' LVl mix) e 1 reverse primer (3' Cl).
      Nota: Gli iniettori sono stati progettati da Tiller et per l'amplificazione di tutti i geni della famiglia catena pesante e chiara⁵.
   2. Applicano le seguenti condizioni di ciclismo: 94 ° C per 4 minuti, seguiti da 40 cicli di 30 s a 94 ° C, 30 s a 58 ° C per VH VLκ (60 ° C per VLλ) e 55 s a 72 ° C, con un allungamento finale passo a 72 ° C per 7 min.
   3. Per il secondo turno PCR, utilizzare 3 µ l del primo prodotto di amplificazione per un volume finale di 40 µ l contenente 1,5 mM MgCl₂, 0,25 mM dNTPs, 2,5 unità della DNA polimerasi e 200 nM di primers interna contenente siti di restrizione enzimatica per la clonazione in espressione vettori (Vedi Figura 2 e Tabella materiali per sequenze dell'iniettore).
      Nota: Composizione del mix di primer interno. Per l'amplificazione della catena pesante: 9 primer (5' AgeIVH mix) in avanti e 3 indietro primer (3' SalIJH mix). Per l'amplificazione di catena leggera kappa, 9 forward primer (5' AgeIV | mescolare) e 3 reverse primer (3' BsiWIJκ mix). Per l'amplificazione di catena leggera lambda, 6 forward primer (5' AgeIVl mix) e 1 reverse primer (3' XhoICl).
      Nota: Gli iniettori sono stati progettati da Tiller et al., per l'amplificazione di tutti i geni della famiglia di catena pesante e chiara⁵.
   4. Applicano le seguenti condizioni di ciclismo: 94 ° C per 4 minuti, seguiti da 40 cicli di 30 s a 94° C, 30 s a 58 ° C per VH LCκ (60 ° C per LCλ) e 45 s a 72 ° C con un allungamento finale passo a 72 ° C per 7 min.
5. Identificare i pozzetti positivi di migrazione 5 μL di prodotti di PCR di vH, vLκ e vLλ su un gel di agarosio 1.5% (500 bp prodotti per segmenti codifica variabile della catena pesante) e un prodotto bp 350 per la variabile catena chiara codifica segmenti.
6. Purificare i restanti 35 prodotti PCR µ l restanti da pozzetti positivi utilizzando membrane di ultrafiltrazione progettate per la purificazione dei prodotti di PCR.
7. Eluire i prodotti di PCR con 60 µ l di H₂O.

5. clonazione di espressione

1. Preparare inserti
   Nota: Digerire 60 µ l di ogni PCR purificato prodotto in un volume finale di 100 µ l contenente il tampone di enzima di restrizione appropriato.
   1. Per i prodotti PCR di vH, aggiungere 50 unità di AgeI e 50 unità di SalI e incubare per 1h a 37 ° C.
   2. Per i prodotti PCR di vLλ, aggiungere 50 unità di AgeI e 50 unità di XhoI e incubare per 1h a 37 ° C.
   3. Per i prodotti PCR di vLκ, aggiungere 50 unità di AgeI e incubare per 1h a 37 ° C. Purificare il digest utilizzando 96 PCR membrane ed eluire con 60 µ l di H₂O. Digest l'eluato 60 µ l in un volume finale di 100 µ l di tampone di enzima di restrizione BsiWI, aggiungere 50 unità di BsiWI e incubare per 1 h a 55 ° C.
   4. Inattivare gli enzimi da riscaldamento a 80 ° C per 15 min.
2. Preparazione di vettori di espressione
   Nota: i prodotti di PCR vH vengono clonati in un vettore di espressione (HCγ1) contenente la catena pesante costante Cγ1 di IgG1. vLκ i prodotti di PCR sono clonati in un vettore di espressione (LCκ) contenente la catena leggera costante Cκ. vLλ i prodotti di PCR sono clonati in un vettore di espressione (LCλ) contenente la catena leggera costante Cλ.
   1. Eseguire le digestioni seguenti:
      1. Mix 1 µ g di espressione HCγ1 di vettore con 10 unità di AgeI e 10 unità di endonucleasi di SalI in un volume totale di 20 µ l di tampone di restrizione raccomandati dal produttore e incubare per 1h a 37 ° C.
      2. Mescolare 1 µ g di vettore di espressione LCκ con 10 unità di enzima di restrizione di AgeI in un volume totale di 20 µ l di tampone di restrizione raccomandati dal produttore e incubare per 1h a 37° C. Aggiungere 10 unità di enzima di restrizione BsiWI e incubare per 1 h a 55 ° C.
      3. Mescolare 1 µ g di vettore di espressione LCλ con 10 unità di AgeI e 10 unità di XhoI endonucleasi in un volume totale di 20 µ l di tampone di restrizione raccomandati dal produttore e incubare per 1h a 37 ° C
   2. Riscaldare ogni miscela di digestione a 65 ° C per 10 min inattivare gli enzimi di restrizione.
   3. Eseguire la legatura di 5 µ l di prodotto PCR digerito con 2 µ l (100 ng) del corrispondente vettore linearizzato espressione in un volume totale di 20 µ l di tampone di DNA ligasi 1x con 1 unità di T4 DNA-ligasi di incubazione overnight a 4 ° C.
      Nota: In alternativa, la legatura viene eseguita per 3 h a 4° C.
3. Clonazione
   1. Electroporate 1 µ l della miscela legatura 20 µ l in 45 µ l di electrocompetent fatti in casa TOP10 Escherichia coli (protocolli correnti nella biologia molecolare, sezione 1.8.4-1.8.8). Immediatamente aggiungere 500 µ l di 2 X YT terreno ed incubare a bagnomaria a 37 ° C per 30 min. batteri diffusione trasformato su piastre di ampicillina YT: 2x. Incubare per una notte a 37 ° C.
   2. Per ogni trasformazione, schermo otto colonie mediante PCR.
      1. Impostare una premiscela di reazione come segue su ghiaccio: 45 µ l di tampone di PCR, 12 µ l di MgCl₂ (25 mM), 4 µ l di dNTP (da un magazzino contenente 10 mM di ciascuno), 10 µ l di primer forward (magazzino 10 µM) ibridando alla sequenza di vettore (primer Ab-vec-senso): 5x e 10 µ l di primer reverse (magazzino 10 µM) targeting per la regione costante catena pesante o leggero (Vedi Tabella materiali per sequenze dell'iniettore). Portare a un volume finale di 200 µ l con H₂O. Quindi aggiungere 4 µ l di enzima DNA polimerasi (5 U / µ l).
      2. Distribuire 25 µ l di premiscela di reazione per ogni provetta PCR 8-striscia sul ghiaccio.
      3. Utilizzare uno stuzzicadenti sterile per raccogliere diverse colonie. Striscia lo stuzzicadenti su un piatto di ampicillina 2 x TY costituiscono un piatto di replicare e quindi immergerlo in una provetta di reazione di PCR.
      4. Eseguire lo screening PCR sotto le seguenti condizioni di ciclismo: 94 ° C per 10 minuti, seguiti da 25 cicli di 30 s a 94 ° C, 30 s a 55 ° C e 50 s a 72 ° C.
      5. Identificare batteri positivi migrazione 5 µ l dei prodotti di PCR su un gel di agarosio al 1.5%.
         Nota: Colonie positivi danno un prodotto PCR circa 850 bp per il vettore di catena pesante e 600 bp per il vettore di catena leggera.
   3. Inoculare quattro colonie positive dalla piastra di replicare in 2 mL di terreno LB e incubare per una notte a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min.
   4. Estrarre i plasmidi da colture liquide utilizzando un kit di purificazione del plasmide, come indicato dal produttore.
   5. Verificare il corretto inserimento dei domini variabili di Sanger sequenziamento dei plasmidi con il primer Ab-vec-senso.
      Nota: Plasmidi con l'inserto corretto (codifica l'HC e la corrispondente LC) devono essere cotransfected nelle cellule 293A per secrezione. La specificità della piccola scala-prodotto mAbs è analizzata da ELISA. Produzione su larga scala viene eseguito se applicabile.

6. produzione di anticorpi monoclonali

1. Produzione su piccola scala per il controllo di specificità
   1. Il giorno prima la transfezione, rene embrionale umano seme 15.000 293A (HEK 293A) cellule in 200 µ l di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con 10% FBS per pozzetto in piastre da 96 pozzetti. Incubare per una notte in un incubatore a CO₂ (5% CO₂) a 37 ° C.
   2. Cotransfect 293A cellule in medium DMEM contenente 10% FBS usando un derivato di polyethylenimine lineare come reagente di transfezione.
      Nota: Eseguire la transfezione in triplici copie. Il seguente protocollo è per un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fondo piatto.
      1. Diluire 0,5 µ l di reagente di transfezione del DNA in 10 µ l di NaCl 150 mM. Diluire 0.125 µ g di vH e 0.125 µ g di vettori esprimenti vL in 10 µ l di NaCl 150 mM. Vortice ogni diluizione per 10 s.
      2. Aggiungere 10 µ l diluito reagente di transfezione del DNA nei 10 µ l di soluzione di DNA. Vortice 15 s e incubare per 15 min a temperatura ambiente. Aggiungere il mix di 20 µ l drop-wise sulle cellule 293A e miscelare agitando delicatamente la piastra.
   3. Sostituire il medio 16 h dopo trasfezione e cellule di cultura per 5 giorni in medium senza siero.
      Nota: Utilizzare medium senza siero per evitare siero Igs contaminando gli anticorpi prodotti.
   4. Eliminare le cellule e i detriti mediante centrifugazione a 460 x g per 5 min.
   5. Raccogliere i surnatanti di aspirazione con una pipetta multicanale e trasferirli in un piatto fondo V 96 pozzetti.
   6. Cappotto Ag rilevanti durante la notte a 4 ° C in 100 µ l di rivestimento ELISA/ELISPOT ricostituito nel buffer 1x ad una concentrazione finale di 2 µ g/mL in piastre da 96 pozzetti ELISA. Vedere esempi in ⁹.
   7. Blocco pozzi con il mezzo di FBS DMEM 10% per 2 ore a 37 ° C
   8. Aggiungere 50 µ l di surnatanti delle cellule trasfettate 293A dal punto 6.1.5 e incubare per 2 h a TA.
   9. Aggiungere 100 µ l di un essere anti-umano IgG Ab coniugato all'enzima perossidasi (HRP) rafano a 1 µ g/mL e incubare per 1 h a temperatura ambiente. Aggiungere 50 µ l substrato cromogenico (TMB) e incubare per 20 minuti.
   10. Leggere la densità ottica a 450 nm in uno spettrofotometro.
       Nota: MAbs specifici ha rivelato mediante ELISA può essere prodotto ulteriore a larga scala e purificato proteina una colonna che presenta affinità per IgG umane.
2. Produzione su larga scala e purificazione di anticorpi monoclonali specifici
   1. Il giorno prima la transfezione, seme 6 x 10⁶ embrionali umane del rene 293A (HEK 293A) di celle in boccette di² cm 175 contenente 25 mL DMEM supplementato con 10% FBS. Incubare per una notte in un incubatore a CO₂ (5% CO₂) a 37 ° C.
      Nota: Le cellule dovrebbero essere 70% confluenti quando trasfettate.
   2. Cotransfect 293A cellule in medium DMEM contenente 10% FBS usando un derivato di polyethylenimine lineare come reagente di transfezione.
      1. Diluire 50 µ l di reagente di transfezione del DNA in 450 µ l di NaCl 150 mM. Diluire 10 µ g di vH e 10 µ g di vettori esprimenti vL in 500 µ l di NaCl 150 mM. Vortice 10 s ogni diluizione.
      2. Aggiungere alla soluzione di DNA diluito reagente di transfezione del DNA. Vortice 15 s e incubare per 15 min a temperatura ambiente. Aggiungere il mix di 1 mL drop-wise per le cellule e mescolare agitando delicatamente il pallone.
   3. Sostituire il medio 16 h dopo trasfezione e cellule di cultura per 5 giorni in medium senza siero.
   4. Raccolto medio aspirando con una pipetta 25 mL.
   5. Eliminare le cellule e i detriti mediante centrifugazione a 460 x g per 5 min.
   6. Purificare gli anticorpi usando una colonna di 1 mL rivestita con proteina A in un sistema di cromatografia in fase liquida (FPLC) proteine veloci a 4 ° C.
      1. Equilibrare la proteina una colonna sepharose con 20 mM di tampone fosfato (pH 7).
      2. Filtrare il mezzo di coltura cellulare da 6.2.5 utilizzando un filtro 1.22 µm, quindi un filtro da 0,45 µm.
      3. Caricare il mezzo filtrato sulla colonna.
      4. Lavare con 20 mM di tampone fosfato (pH 7) ed eluire con un tampone di citrato di 0.1 M (pH 3.5).
      5. Leggere la densità ottica a 280 nm in uno spettrofotometro di assorbimento e subito neutralizzare le frazioni contenenti proteine con 1 tampone Tris M (pH 9).
   7. Dializzare Ab purificata durante la notte a 4 ° C in una cassetta con un peso molecolare di 3,5 K taglio contro tampone PBS (pH 7,4).
   8. Sterilizzare in purezza di filtrazione e controllo di 0,2 µm mediante cromatografia di esclusione dimensionale, come indicato dal produttore.

Representative Results

A partire da PBMC da donatori sani, questo project presenta la generazione di anticorpi monoclonali umani, che riconoscono il peptide Pp65₄₉₅ (Pp65, da citomegalovirus umano) presentata dalla classe complesso maggiore di istocompatibilità I (MHC-I) molecola HLA - A * 0201 ( HLA-A2). Questi anticorpi monoclonali in grado di discriminare tra questo complesso e complessi che rappresentano altri peptidi caricati su stesso MHC-ho molecola.

PBMC sono stati macchiati con HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC e tetrameri HLA-A2/MelA2-BV421 come descritto nel protocollo di cui sopra. Dopo immunomagnetiche arricchimento delle cellule delle cellule positive PE - e APC-tetramero, le cellule eluite erano macchiate con ulteriori mAbs. Il classificatore celle la citometria a flusso, magneticamente arricchite cellule erano prima gated il CD14 vitali^–CD16^–CD3^–CD19⁺ canottiere (cellule B). La figura 1 Mostra la strategia di gating utilizzata per isolare le cellule di B che esprimono BCRs in grado di discriminare tra HLA-A2/Pp65 e altri relativi complessi HLA-A2/peptide. Selezione delle cellule di B di interesse è stato effettuato dopo gating su HLA-A2/Pp65 PE⁺ e HLA-A2/Pp65 APC⁺ doppio-lati positivi, per escludere specifiche cellule di B fluorocromo che singolarmente sono state macchiate PE⁺ o APC⁺. Infine, altamente specifici linfociti B sono stati identificati di gating sulle cellule negative HLA-A2/MelA2-BV421. Ciò permette l'individuazione delle cellule di B che esprimono BCRs in grado di legare HLA-A2/Pp65, in un peptide e HLA-A2-dipendente, discriminare tra queste cellule di B e quelli diretti contro β2 microglobulina, biotina, HLA-A2 o quelli che non fanno discriminazioni tra peptidi nella scanalatura associazione MHC. Tutte queste cellule di quest'ultime sarà BV421 cellule positive. Come precedentemente dimostrato e documentato ulteriormente con altri tipi di Ag, questa strategia di esclusione è più importante a causa dell'aumento nella capacità discriminative delle cellule di B per l' Ag⁹.

Una volta singolo specifici linfociti B sono stati ordinati, cDNAs codifica per pesanti e leggeri Ig-catene sono stati amplificati da RT-PCR. Coppie di catena pesante e chiara codifica segmenti sono state ottenute in circa il 50% delle singole cellule B testate (tabella 1). Dominio variabile sequenze poi sono state clonate in espressione vettori contenenti sequenze corrispondenti di dominio costante (costante pesante 1 e luce costante κ o λ). Cellule embrionali umane del rene (HEK, 293A cellule) sono stati cotransfected con vettori di catena pesante e chiara. MAbs secrete di isotipo IgG1 sono state raccolte i surnatanti delle cellule 293A 5 giorni dopo la trasfezione (vedere la Figura 3 per la strategia globale della produzione di mAbs pienamente umana). Questo prodotto con successo HLA-A2/Pp65 un anticorpo specifico a partire da 3 singolo linfocita B cellule producendo coppie di catena pesante e chiara codifica segmenti (tabella 1). I dosaggi ELISA ha dimostrato chiaramente che questo mAb era entrambi MHC-peptide-dipendente e per la relativa associazione a HLA-A2/Pp65 complessi (Figura 4A), e diversi milligrammi di mAb prontamente sono state prodotte per un'ulteriore analisi (ad es., analisi di affinità, saggi funzionali). L'affinità di legame, determinato dalla risonanza plasmonica di superficie (SPR), era circa 7 x 10^-6 M (Figura 4B).

Così, questo articolo viene descritto una combinazione di metodi sensibili ed efficienti che permettono i) rilevazione delle cellule di B di Ag-specifici pertinenti, anche quando è presente a frequenze molto basse nel sangue di donatori sani e ii) la generazione di anticorpi monoclonali umani altamente discriminante.

Figura 1: Rilevazione di HLA-A2/Pp65 specifici linfociti B da PBMC umano.
3 x 10⁸ PBMC sono stati macchiati con HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC e tetrameri HLA-A2/MelA2-BV421. Dopo immunomagnetiche arricchimento delle cellule delle cellule positive PE - e APC-tetramero, le cellule eluite erano macchiate con ulteriori mAbs. Su un Classificatore celle di flusso cytometry, cellule erano gated in primo luogo il singoletto praticabile CD14^–CD16 linfociti^– (non illustrati), quindi il CD19⁺CD3 cellule^– . Quindi, le cellule B colorate con tetrameri HLA-A2/Pp65-APC e HLA-A2/Pp65-PE erano gated. Il tetramero di HLA-A2/MelA-BV421 è stato utilizzato per escludere le cellule di B che non hanno riconosciuto il HLA-A2/Pp65, in un peptide e MHC-dipendente.

Figura 2: strategia per l'amplificazione e la clonazione dei geni Ig. Leggera e pesante Ig-catena geni codificanti sono stati amplificati da RT-PCR annidata. PCRs prima sono stati effettuati con un mix di primer forward ibridando la regione leader e reverse primer specifici per regioni costante di appropriato kappa pesante, leggero, o catene lambda luce. Secondo PCRs sono stati effettuati con i primer contenenti siti di restrizione, forward e reverse primer erano rispettivamente specifiche per l'inizio dei segmenti V e per la fine dei segmenti J. Prodotti di PCR sono stati ordinati, digerito con enzimi di restrizione e clonato in vettori di espressione contenenti domini costante appropriati. CMV: promotore del citomegalovirus; AmpR: gene di resistenza per ampicillina.

Figura 3: Strategia globale di ricostruzione di anticorpi monoclonali umani ricombinanti.
Una strategia basata su tetramero di ordinamento permette la rilevazione delle cellule di B di interesse. Altamente specifici linfociti B sono stato ordinato a cella singola. Segmenti di codifica Ig-catena leggera e pesante sono stati amplificati usando RT-PCR. Sequenze di dominio variabile sono stati clonati in vettori di espressione eucariotici separata nel telaio con segmenti del gene codifica costante regioni leggeri e pesanti. Corrispondente mAbs pienamente umana erano espresse da transitoriamente transfected le cellule HEK 293A e purificato dal surnatante della cultura. Questa figura è stata modificata da Ouisse et al. (2017) ⁹.

Figura 4: Caratterizzazione di un rappresentante mAb altamente discriminante contro HLA-A2/Pp65 generato da B cellule circolanti del sangue periferico umano.
A) specificità di mAb PC1.02 contro HLA-A2/Pp65 testato da ELISA. Piastre sono stati rivestiti con rilevanti (HLA-A2/Pp65) o irrilevante HLA-A2 complessi contenenti peptidi HLA-A2-limitati: MelA, NS3 (HCV-1) e GagP17 (HIV-1) a 2 µ g/mL, il mAb PC1.02 è stato aggiunto e un essere anti-umano IgG-HRP Ab è stato utilizzato per il rilevamento. Densità ottica (OD) erano leggere a 450 nm. B) determinazione di affinità del mAb PC1.02 utilizzando superficie Plasmon Resonance (SPR) di che scorre le varie concentrazioni di HLA-A2/Pp65 complessi su mAb associato a chip CM5. Questa figura è stata modificata da Ouisse et al. (2017) ⁹.

	Numero di PBMC	Numero di cellule PE + APC + dopo arricchimento	Numero di cellule (BV421 +) esclusione	Numero di celle singole ordinate	Numero di pozzi analizzati	Numero di pozzi con HC e LC associati (% di recupero)	Numero di mAbs prodotta	Numero di anticorpi monoclonali specifici
HLA-A2/Pp65 mAb (PC1.02)	3 x 108	818	117	161	7	3 (43%)	3	1

Tabella 1: Analisi di HLA-A2/Pp65 specifici linfociti B.
L'impatto della strategia di esclusione non specifiche delle cellule di B, i rendimenti di amplificazione del gene di Ig e produzione di mAb da isolato HLA-A2/Pp65 specifici linfociti B sono stati valutati, misurato.

Discussion

Il protocollo proposto è un metodo potente per la generazione di anticorpi monoclonali umani direttamente dalle cellule di B di Ag-specifici circolanti nel sangue. Essa combina tre importanti aspetti: (i) l'uso di un arricchimento magnetico tetramero-collegato, che permette un isolamento ex vivo di cellule B Ag-associazione anche rare; (ii) una strategia di gating che utilizza tre tetrameri di Ag (due più rilevanti e irrilevanti uno) etichettati con tre diversi fluorocromi per isolare, mediante citometria a flusso, solo le cellule di B che esprime una specifica BCR per l'Ag desiderato; (iii) la ricostruzione dei corrispondenti cDNA ricombinante mAb mediante RT-PCR a livello di singola cellula e di espressione dei cDNA in cellule umane.

Gli studi precedenti propose di usare uno o due antigeni rilevanti fluorescenti per etichettare i linfociti B umani prima di ordinamento e la successiva produzione di anticorpi monoclonali isolato B cellule^6,7,8. Una analisi in pazienti con l'artrite reumatoide e uno in un modello murino autoimmune, hanno associato un antigene fluorescente irrilevante per caratterizzare le cellule B autoreattive e determinare la loro frequenza^10,11. Per quanto ne sappiamo, utilizzare una combinazione di due tetrameri antigene pertinenti fluorescente e un tetramero di antigene irrilevante non è stata descritta in precedenza per arricchimento di cellule B specifiche prima del loro impiego per la produzione di mAbs pienamente umana. Questo metodo ottimizzato consente pienamente umano mAbs discriminante essere ottenuti in meno di un mese e può essere eseguito correttamente anche quando a partire da un repertorio delle cellule di B ingenui. Così, non ne ha degli inconvenienti principali del display dei fagi, immortalizzazione umana delle cellule di B, o altro precedentemente descritte procedure di ricostruzione di mAb basati sulla biologia molecolare.

Questa cella ordinamento strategia si traduce in un recupero ad alto rendimento di anticorpi monoclonali umani Ag-specifici. Coppie di segmenti di catena pesante e chiara da singole cellule B isolate sono amplificate con un tasso di successo del 50% circa. Segmenti di catena leggera sono quasi sempre amplificati, ma questo non è il caso per i segmenti di catena pesante. RT-PCR efficienza dipende pesantemente rispettando i seguenti punti: io) ordinati celluli B devono essere congelati più rapidamente possibile; II) l'aggiunta di 30 unità di inibitore di RNAsi e riducendo al minimo il tempo tra fare le cellule di B fuori dal freezer e per lanciare la reazione di RT; III) lo scongelamento tutti i primer su ghiaccio; IV) mai gelo/disgelo primer più di tre volte; v) calza primer per un massimo di un anno.

Per quanto riguarda l'efficienza di produzione del corrispondente mAbs ricombinante con la specificità desiderata, è circa 30-40% del caso per pMHC anticorpi monoclonali specifici. Questi mAbs particolare deve riconoscere sia il peptide e la molecola MHC, che è abbastanza impegnativo, e precedentemente abbiamo indicato che il rendimento complessivo del recupero di specifici anticorpi monoclonali diretti contro gli antigeni più convenzionali è superiore, fino al 100% per il Β-galattosidasi antigen⁹. Va sottolineato che la scelta di un appropriato Ag per il tetramero irrilevante è importante per aumentare la specificità di mAbs prodotta.

L'affinità del mAb anti-HLA-A2/Pp65 (PC1.02) descritto nel presente articolo è relativamente basso, circa 7 x 10^-6 M, simile all'affinità di un TCR. Questo risultato era atteso, come isolamento delle cellule B è stato effettuato da donatori ingenuo. La maggior parte delle cellule di B del tetramero⁺ erano IgM⁺IgG^-, che riduce la probabilità di ottenere buone Ag-leganti. Tuttavia, questo metodo inoltre può rendere possibile l'ordinamento fuori memoria Cross-reattivo B cellule contro un Ag desiderato da donatori ingenuo, a causa del passato immunologica di individui¹². Inoltre, questo metodo è facilmente applicabile ai pazienti infettati o vaccinati o immunizzati animali umanizzati, come descritto in ⁹, dove nel vivo maturazione di affinità può aumentare l'affinità della risultante mAbs con circa 1 x 10^-9 M. varie le procedure sono state descritte anche per migliorare l'affinità degli anticorpi monoclonali in vitro, in particolare attraverso riproduzione hypermutation somatico in cellule che esprimono l'anticorpo (rivisto in ¹³).

In conclusione, proponiamo una strategia versatile per la produzione di anticorpi monoclonali altamente discriminante che può essere utilizzato in vari tipi di situazione, da un ingenuo individuo a un donatore vaccinato o un paziente affetto da una malattia autoimmune. MAbs pienamente umano generato in questo modo contro un epitopo desiderato potrebbe essere utile sia per la ricerca di base e l'immunoterapia.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK 293A cell line	Thermo Fisher scientific	R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)	Gibco by life technologies	31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)	PAA	K45-001
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4	Ambion	AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8	Invitrogen by Life Technologies	15575-020
Fetal Bovine serum (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Ficoll - lymphocytes separation medium	EuroBio	CMSMSL01-01	density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate	Invitrogen by Life Technologies	S21388	premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate	Invitrogen by thermoFisher scientific	S32362	1mg/ml 2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin	Biolegend	405225	conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor	Miltenyi Biotec	130-042-302/130-090-976
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
CD3 BV510 BD horizon	BD Pharmingen / BD Biosciences	563109	Used dilution 1:20
CD19 FITC	BD Pharmingen / BD Biosciences	345788	Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	561116	Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	338440	Used dilution 1:50
7AAD	BD Pharmingen / BD Biosciences	51-68981E (559925)	Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer	BD Biosciences
8-strip PCR tubes	Axygen	321-10-061
Racks for 96 microtubes	Dominique Dutscher	45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)	Invitrogen by thermoFisher scientific	10777-019	qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free	Gibco	10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer	New England BioLabs	S1316S	5.0 A260unit
Random hexamers	Invitrogen by thermoFisher scientific	N8080127	qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen by thermoFisher scientific	18080-044	qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
dNTP Set, Molecular biology grade	Thermo Scientific	R0182	4*100umol
5LVH1	Eurofins	ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH3	Eurofins	AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVL4_6	Eurofins	CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH5	Eurofins	CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
3HuIgG_const_anti	Eurofins	TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1	Eurofins	GGGAATTCTCACA GGAGACGA	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2	Eurofins	ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk3	Eurofins	CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk4	Eurofins	ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566	Eurofins	GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5	Eurofins	GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'LVl1	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl2	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl3	Eurofins	GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5	Eurofins	GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl6	Eurofins	GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl7	Eurofins	GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5LVl8	Eurofins	GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
3'Cl	Eurofins	CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
3'XhoICl	Eurofins	CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense	Eurofins	GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC	Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade	MP Bio	AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate	Macherey Nagel	743.100.100
Enzyme Age I HF	New England Biolabs	R3552L	20000U/ml
Enzyme SalI HF	New England Biolabs	R3138L	20000U/ml
Enzyme Xho I	New England Biolabs	R0146L	20000U/ml
Enzyme BSIWI	New England Biolabs	R0553L	10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase	Invitrogen by thermoFisher scientific	15224.017	100U (1U/ul)
2X YT medium	Sigma Aldrich	Y1003-500ML
Ampicillin	Sigma Aldrich	10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification	Macherey Nagel	740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent	PolyPlus	101-40
Flat bottom96-well plate	Falcon	353072
V-bottom 96-well plate	Nunc/Thermofisher	055142
Nunc easy 175 cm2 flasks	Nunc/Thermofisher	12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer	eBiosciences	00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates	Nunc/Thermofisher	44-2404-21	high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP)	BD Pharmingen / BD Biosciences	55788
TMB substrate	BD Biosciences	555214
Streptavidin	Sigma	S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column	GE Healthcare	17-0402-01
ÄKTA FPLC	GE Healthcare	18190026
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System	BioRad	7880003