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Summary
我们描述了一种生产人类抗体特异性抗原的方法, 从人类血液中的稀有 B 细胞开始。这些天然抗体的产生是高效和快速的, 而获得的抗体可以区分高度相关的抗原。
Abstract
单克隆抗体 (抗体) 是一种强有力的工具, 对基础研究和生物医学都很有用。当抗体需要区分高度相关的结构 (如、正常蛋白质和其突变版本) 时, 它们的高特异性是不可或缺的。目前产生这种歧视性抗体的方法包括广泛筛选多 Ab 生产的 B 细胞, 这既费钱又费时。本文提出了一种快速、成本效益高的方法, 从人血循环 B 淋巴细胞出发, 对人类抗体进行区分。这一策略的独创性是由于选择了特定的抗原结合 B 细胞结合所有其他细胞的反选择, 使用现成的外周血单个核细胞 (PBMC)。一旦分离出特定的 B 细胞, 使用单细胞逆转录-聚合酶链反应 (rt-pcr) 技术, 在人体内表达 cDNA (互补脱氧核糖核酸) 序列细胞.在短短的1月内, 有可能产生毫克的高度歧视性的人类抗体针对几乎任何所需的抗原自然检测的 B 细胞的剧目。
Introduction
这里描述的方法允许快速和多才多艺的生产完全人的单克隆抗体 (抗体) 反对期望抗原 (Ag)。抗体是许多基础研究应用的重要工具在体外和在体内: 流式细胞术, 组织学, 西部印迹, 和阻断实验, 例如。此外, 抗体正在越来越多地用于治疗自身免疫性疾病, 癌症, 并控制移植排斥1。例如, anti-CTLA-4 和 anti-PD-1 (或 anti-PD-L1) 抗体最近被用作癌症治疗的免疫检查站抑制剂2。
第一抗体是由免疫球蛋白 (Ig) 分泌的杂交从脾细胞中获得的小鼠或大鼠。然而, 强的免疫反应对鼠或大鼠抗体阻碍他们的治疗用途在人, 由于他们的快速的清除和可能的感应性过敏反应3。为了解决这个问题, 动物蛋白序列的抗体已部分被人类的替代, 以产生所谓的嵌合体的小鼠-人类或人性化的抗体。然而, 这一战略只部分降低了免疫原性, 同时大大增加了成本和生产的时间尺度。一个更好的解决方案是直接从人类 B 细胞中生成人抗体, 并提供了几种策略。其中之一是使用噬菌体或酵母显示。这包括在噬菌体或酵母中的随机人类 Ig 重和轻链的组合库中显示可变域, 并使用特定的兴趣抗原进行选择步骤。这一战略的一个主要缺点是, 重和轻链随机关联, 导致一个非常大的增加, 产生抗体的多样性。获得的抗体不太可能与天然免疫应答对某一特定的 Ag 产生的反应相对应。此外, 人类蛋白质折叠和后转化的修改没有系统地复制在原, 甚至在酵母。第二个人类单克隆生物的生产方法是永生的自然人 B 细胞, 由 eb 病毒感染或表达的抗凋亡因素 BCL-6 和总格-XL4。然而, 这种方法仅适用于记忆 b 细胞, 而且效率低下, 需要筛选出大量的单克隆抗体生成永生化 b 细胞, 以确定少数 (如果有的话) 克隆人的抗原特异性。因此, 这种方法既费钱又耗时。
一个新的协议最近被描述用于生产人类抗体从孤立的单一 B 细胞5。它依赖于一个优化的单细胞逆转录聚合酶链反应 (RT PCR) 放大的重和轻链编码段从一个单一的排序 B 细胞。其次是在一个真核表达系统中, 这些片段的克隆和表达, 从而允许重建一个完全人类的单克隆。该协议已成功地用于从接种疫苗的捐献者 B 细胞开始。在接种疫苗数周后, 细胞获得了针对所需 Ag 的 B 细胞的更高频率, 从而限制了筛查6所需的时间。其他完全人类抗体也已经产生了艾滋病毒的+ (人体免疫缺陷病毒) 感染患者的7和黑色素瘤患者8。尽管有这些进展, 仍然没有可用的程序, 可以独立于其记忆表型或频率的 Ag 特定 B 细胞的分离。
这里描述的过程导致了有效的体外分离人循环 B 细胞基于他们的 BCR 特异性, 其次生产完全人抗原特异抗体在高产和以低筛选时间. 该方法不限于记忆 b 细胞或抗体分泌 b 细胞后诱导免疫应答, 但也可以应用于人类的幼稚 b 细胞的剧目。它运作甚而从 Ag 特定 B 细胞存在在非常低频率是它的效率的一个好征兆。该方法的原理如下: 外周血单个核细胞 (PBMC) 染色的两个体呈现的抗原的兴趣, 每个标记有不同的荧光 (例如, 藻 (PE) 和复方 (APC)),和第三聚丙烯提出一个紧密相关的抗原共轭与第三荧光 (如, 高明紫 421 (BV421))。为了丰富抗原结合细胞, 细胞然后孵化的珠子涂敷反 PE 和反 APC Abs, 并排序在细胞分离列。选择 PE+ APC+单元格部分, 用各种不同的抗体特定的 PBMC 细胞类型进行染色, 以允许识别 B 细胞, 并进行流式细胞仪细胞分类。B 单元格是 PE+和 APC+, 但明亮的紫罗兰-是孤立的。此步骤计数器-选择不是 B 细胞或不绑定到 tetramerized 抗原的细胞, 但要绑定到 pe 或 apc (这些单元格将是 pe+ apc-或 pe apc+), 或者是使用体的非抗原部分 (这些单元格将 BV421+)。B 细胞不是高度具体的表位的兴趣也是计数器选择在此步骤 (这些单元也将是 BV421 的+)。因此, 这种方法可以纯化高特异 b 细胞表达 b 细胞受体 (BCRs) 能够区分两个非常密切的相关抗原。在试管中收集单个特定的 B 细胞, 并将其 PCR 扩增的 Ig 基因 (补充脱氧核糖核酸) 克隆出来, 由人类细胞系作为分泌的 IgG 抗体表达。
作为概念的证明, 本研究描述了人类抗体的有效生成, 它能识别出由一个主要的组织相容性复合 i 类 (MHC i) 分子所呈现的肽, 并能区别这一肽和其他加载在同一MHC I 等位基因。虽然这个 ag 的复杂程度是重要的, 这个方法允许 (i) ag 特定抗体的高收率的补救;(二) 生产抗体能够区分两个结构密切 Ags。这种方法可以扩大到接种疫苗或感染的病人没有任何协议的修改, 也已经成功地实现了一个人性化的大鼠系统9。因此, 这项研究描述了一个多才多艺的和有效的方法, 以产生充分的人类抗体, 可用于基础研究和免疫治疗。
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Protocol
根据当地道德委员会 (景区法国, EFS, 南特, 程序采样 NTS-2016-08), 所有的人外周血样本都是在知情同意后从匿名成年献血者那里获得的。
1. 人外周血单个核细胞的分离
注: 起始物料可为总人外周血或 cytapheresis 样。样品不应超过8小时, 并辅以抗凝血剂 (例如, 肝素)。
- 稀释血液与2容量 (人的外周血) 或5容量 (cytapheresis 样品) RPMI (罗斯威尔公园纪念学院) 媒介。
- 在50毫升锥形管中仔细地将35毫升稀释的细胞悬浮液放在15毫升的密度梯度介质上。使尽可能多的管, 以分配所有稀释的血液。离心机在 1290 x g 为25分钟的室温在一个摆动斗转子与刹车。
- 在密度梯度介质和等离子体层之间的界面上仔细地吸取单个核细胞层, 并将细胞转移到新的50毫升锥形管上。
- 用 RPMI 介质填充管, 在室温下在 1290 x g 处混合和离心10分钟。小心地除去上清液。
- 重20毫升 RPMI 培养基中的细胞颗粒, 离心 200 x g, 10 分钟取出血小板。小心地除去上清液。重复此步骤一次。
- 用10% 胎牛血清 (FBS) 重 RPMI 培养基中的细胞颗粒。
注: 直接进行聚丙烯标记或将细胞保持在4° c 过夜, 浓度为 107细胞/毫升。
2. 聚丙烯与银特异 B 细胞的磁性富集
- 在1:4 至化抗原单体的摩尔比下加入 PE 或 APC 标记的优质亲和或 BV421-labeled 亲和, 制备银体。在三单独的部分中加入适量的亲和共轭, 在室温下每10分钟加一分。
- 在15毫升锥形管中分布单元 (最多 3 x 108 ), 在460分钟内将离心机放在每根 x g 处。
注意: 下面的协议是一个管。 - 重200µL (磷酸缓冲盐水) 与 2% FBS 的细胞颗粒。添加 PE, APC 和 BV421-conjugated 体, 每一个最终浓度为10µg/毫升。拌匀, 室温孵育30分钟。
- 用 PBS 制备 0.5% BSA (牛血清白蛋白) 和 EDTA (乙酸酸) 2 毫米的冰冷细胞分离缓冲液 (SB)。
- 用离心法在 460 x g 处增加10毫升的颗粒细胞, 5 分钟。
- 重细胞在500µL 冰冷 SB 中添加50µL 抗 PE 和50µL 的反 APC 磁性微。
- 拌匀, 孵育20分钟, 在4° c。
- 重复步骤2.5 次。
- 清除上清液仔细 andresuspend 细胞颗粒在 2 x 108细胞/毫升的浓度在冰寒 SB。
- 平衡在磁铁上放置一个大的磁性柱子, 有3毫升的。
- 将电池悬挂从2.9 转移到平衡柱顶部, 使其完全耗尽。关键步骤: 为了避免柱状结块, 通过70µm 尼龙网格。
- 将含有3毫升冰冷的细胞的管子冲洗干净, 将缓冲器直接转移到柱子上 (如过滤, 冲洗70µm 尼龙网)。
- 当缓冲区已完全排入该列时, 将另一3毫升冰寒的人加到柱子上。
- 重复步骤 2.13, 再进行3毫升洗涤。
- 从磁铁中取出柱, 并在15毫升锥形收集管上放置。
- 把5毫升冰冷的 SB 放在柱子顶部, 然后用柱塞将电池从柱上冲出。重复此步骤一次。
- 离心收集的细胞 (丰富相关的聚丙烯阳性细胞分数) 在 460 x g 5 分钟, 并进行额外的抗体染色。
注: 池收集的细胞从所有管, 如果合适的。
3. Ag 特定人 B 细胞的染色和细胞分类
- 重的细胞颗粒与抗人抗体鸡尾酒对 CD3 (最后稀释: 1:20), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50), 和 7AAD (1:1000) 在最后的容量100µL PBS 与 2% FBS。孵育30分钟, 在4° c。
- 在细胞中加入10毫升的 PBS, 在 460 x g 处离心5分钟, 消除上清液。重复此步骤一次。重200µL PBS 中的细胞颗粒, 过滤到70µm 尼龙网。
- 在单元格浏览细胞仪上继续对100µm 喷嘴和 20 psi 压力不超过1000事件/秒9的单个单元格级别上的特定 B 单元格进行排序。
注意: 使用的浇口策略显示在图 1.单元格首先在 CD14-CD16-7AAD 单元格中进行封闭, 以排除单核细胞、NK 和死单元 (未在 图 1中显示)。然后, 通过 PE 和 APC 相关的 Ag-体, 在双染色细胞上进行门控之前, 选择了 CD19+ B 细胞。非特异性 B 细胞被排除在 BV421 阴性细胞 (不由不相关的 Ag-聚丙烯) 的门。 - 将单个 B 细胞收集到8条 PCR 管中, 之前填充有10µL 1x PBS 和10单位的核糖核酸抑制剂, 放在96管内的架子上。立即将 PCR 管冷冻在-80 ° c。
注: 在细胞仪仪器上选择的分类掩模为: 0、纯度面膜:32、相掩膜: 0. 如果需要, 这种单细胞沉积物可以调整为 96-或 384-好的 PCR 板。单 B 细胞必须尽快冷冻, 如果需要, 可以在-80 ° c 下留几个星期。
4. 单细胞 rt-pcr
- 溶解细胞通过直接加热冷冻样品在70° c 的 PCR 带在干燥浴5分钟。
- 传输带到冰和进行反向转录 (RT) 通过增加10µL 每管2x 主混合缓冲区包含1毫米 dNTP, 25 µg/毫升 oligod (T) 底漆, 5 µM 随机 hexamers, 20 单位核糖核酸抑制剂, 和400单位的反转录酶。
注意: 细胞解冻后, 必须迅速进行 RT, 以避免 RNA 降解。 - 孵育在25° c 为5分钟, 允许随机 hexamers 到杂交, 然后孵育1小时在50° c, 并完成与孵化在95° c 为3分钟停止反应。
- 为可变重 (vH) 和卡伯 (vLκ) 或λ光链 (vLλ) 的每个区域编码进行两轮嵌套 PCR 扩增。
注: 另外, RT 样品可在-20 ° c 冷冻并保存一周。- 在第一轮 PCR, 增加3µL 的 cDNA 为40µL 最后的体积, 包含1.5 毫米氯化镁2, 0.25 毫米 dNTPs, 2.5 单位的 DNA 聚合酶, 和 200 nM 的外部底漆 (见图 2和材料表的入门序列)。
注: 外底漆组合物的组成。对于重链放大: 4 前引物 (5 ' 肥厚的混合) 和2反向底漆 (3 ' CµCγ混合)。为轻卡伯链放大, 3 前引物 (5 ' LV | 混合) 和1反向底漆 (3 ' Cκ543-566)。对于光λ链放大, 7 前引物 (5 ' LVl 混合) 和1反向底漆 (3 ' Cl)。
注: 引物是由分蘖et al.设计的, 用于放大所有重和轻链家族基因5。 - 应用以下循环条件:94 ° c 为 4 min, 跟随40周期三十年代在94° c, 三十年代在58° c 为 VH 和 VLκ (60 ° c 为 VLλ), 和五十五年代在72° c, 以最后的伸长步在72° c 为 7 min。
- 对于第二轮 PCR, 使用3µL 的第一个放大产品的最后体积40µL 含有1.5 毫米氯化镁2, 0.25 毫米 dNTPs, 2.5 单位的 DNA 聚合酶, 和 200 nM 内引物含有限制酶点的克隆成表达向量 (请参见图 2和材料表中的入门序列)。
注: 内底漆组合物。对于重链放大: 9 前引物 (5 ' AgeIVH 混合) 和3反向底漆 (3 ' SalIJH 混合)。对于轻卡伯链放大, 9 前引物 (5 ' AgeIV | 混合) 和3反向底漆 (3 ' BsiWIJκ混合)。对于光λ链放大, 6 前引物 (5 ' AgeIVl 混合) 和1反向底漆 (3 ' XhoICl)。
注: 引物是由分蘖et al.设计的, 用于放大所有的重和轻链家族基因5。 - 应用以下循环条件:94 ° c 为 4 min, 跟随40周期三十年代在 94, 三十年代在58° c 为 VH 和 LCκ (60 ° c 为 LCλ) 和四十五年代在72° c 以最后的伸长步在72° c 为 7 min。
- 在第一轮 PCR, 增加3µL 的 cDNA 为40µL 最后的体积, 包含1.5 毫米氯化镁2, 0.25 毫米 dNTPs, 2.5 单位的 DNA 聚合酶, 和 200 nM 的外部底漆 (见图 2和材料表的入门序列)。
- 通过在1.5% 琼脂糖凝胶上迁移5μ l vH、vLκ和 vLλ的 PCR 产物 (500 bp 产品用于可变重链编码段和 350 bp 产品用于可变光链编码段), 确定正井。
- 利用超滤膜提纯 pcr 产物, 纯化剩余的35µL pcr 产物。
- 洗 PCR 产品与60µL 的 H2O。
5. 表达式克隆
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准备插入
注: 在含有适当限制酶缓冲剂的100µL 的最后一卷中, 对每个纯化的 PCR 产物进行消化60µL。- 对于 vH PCR 产品, 增加50单位的 AgeI 和50单位的贝里沙, 并孵化1小时37° c。
- 对于 vLλ PCR 产品, 增加50单位的 AgeI 和50单位的 XhoI, 并孵化1小时37° c。
- 对于 vLκ PCR 产品, 增加50单位的 AgeI 和孵化1小时在37° c。用 96 PCR 膜和洗60µL 的µL 洗在µL 限制酶缓冲的 100 BsiWI 的最后一卷中, 消化了 60 BsiWI, 并在50° c 下孵育 1 h.
- 在80° c 加热15分钟, 使酶钝化。
-
表达载体的制备
注: vH PCR 产物在一个表达载体 (HCγ1) 被克隆包含恒定的重链 Cγ1 IgG1。vLκ PCR 产物在含有恒光链 Cκ的表达载体 (LCκ) 中被克隆。vLλ PCR 产物在含有恒光链 Cλ的表达载体 (LCλ) 中被克隆。- 执行以下消解:
- 混合1µg 的表达载体 HCγ1与10单位的 AgeI 和10单位的贝里沙酶的总容量20µL 的限制缓冲区的制造商建议, 并孵化 1 h 在37° c。
- 混合1µg 的表达载体 LCκ与10单位的 AgeI 限制酶在总容量20µL 的限制缓冲区的制造商建议, 并孵化 1 h 在37° c。添加10单位的 BsiWI 限制酶, 并孵育1小时在55° c。
- 混合1µg 的表达载体 LCλ与10单位的 AgeI 和10单位的 XhoI 酶的总容量20µL 的限制缓冲区的制造商建议, 并孵化 1 h 在37° c
- 将每个消化混合物在65° c 下加热10分钟, 使限制酶钝化。
- 用2µL (100 ng) 的相应线性化表达载体, 在20µL 1x dna 连接缓冲器的总容积中, 在1° c 的夜间孵育, 用4单位 T4 dna 连接, 进行结扎5µL 的 PCR 产物。
注: 另外, 结扎是在4° c 下进行3小时。
- 执行以下消解:
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克隆
- Electroporate 1 µL 20 µL 结扎合剂成45µL 自制 electrocompetent TOP10大肠杆菌(目前的分子生物学协议, 1.8. 4-1. 8.8)。立即在37° c 的水浴中加入500µL 2X 的培养基, 孵育30分钟。在37° c 的夜间孵育。
- 对于每一个转换, 筛选八殖民地的 PCR。
- 在冰上设置反应预混料如下:45 µL 5x PCR 缓冲, 12 µL 氯化镁2 (25 毫米), 4 µL dNTPs (从每股包含10毫米), 10 µL 前引物 (股票10µM) 杂交到向量序列 (底漆 Ab-vec-感觉)和10µL 的反向底漆 (股票10µM) 的目标是恒定的重或轻链区域 (参见材料表的底漆序列)。用 H2O 组成200µL 的最终卷。然后加入4µL 的 DNA 聚合酶 (5 U/µL)。
- 在冰上分布25µL 反应预混料每8条带 PCR 管。
- 用一根无菌牙签来提取单个的菌落。将牙签贴在2x 的 TY 氨苄西林板上, 形成一个复制板, 然后将其浸入 PCR 反应管中。
- 在以下循环条件下执行筛选 PCR:94 ° c 为 10 min, 跟随25周期三十年代在94° c, 三十年代在55° c 和五十年代在72° c。
- 通过在1.5% 琼脂糖凝胶上迁移5µL 的 PCR 产物来鉴别阳性菌。
注意: 阳性菌落为重链向量和 600 bp 为轻链向量提供了一个 PCR 产品大约 850 bp。
- 接种四阳性菌落从复制板到2毫升的 LB 培养基和孵化过夜在37° c 与晃动 200 rpm。
- 使用质粒纯化试剂盒从液体培养基中提取粒, 如制造商所示。
- 通过 vec 感引物的桑格测序, 验证变量域的正确插入。
注: 质粒与正确的插入 (编码 HC 和相应的 LC) 是 cotransfected 到293A 细胞的分泌。用 ELISA 法测定小规模生产抗体的特异性。然后, 在适用的情况下进行大规模生产。
6. 抗体的生产
-
小规模生产专用检测
- 在转染前的前一天, 种子1.5万人胚胎肾脏 293A (HEK 293A) 细胞在200µL Dulbecco 氏改良鹰培养基 (DMEM) 补充 10% FBS 每井 96-井板。在 co2孵化器 (5% co2) 中, 在37° c 的夜间孵育。
- 用线性亚衍生物作为转染试剂, 在含有 10% FBS 的 DMEM 培养基中 Cotransfect 293A 细胞。
注: 在 triplicates 中进行转染。下面的协议是一个平底96井板的一个井。- 将0.5 µL 的 DNA 转染试剂稀释为150毫米氯化钠10µL。稀释0.125 µg 的 vH 和0.125 µg 表达载体为10µL 150 毫米氯化钠。漩涡每稀释十年代。
- 在10µL dna 溶液中加入10µL 稀释的 dna 转染试剂。十五年代涡旋, 室温孵育15分钟。加入20µL 混合滴明智的293A 细胞, 并通过轻轻旋转的板块混合。
- 在无血清培养基中, 在转染和培养细胞5天后更换培养基16小时。
注: 使用无血清的培养基, 以避免血清中的抗体污染的产生。 - 通过离心 460 x g 去除细胞和碎片5分钟。
- 收获清通过吸入多通道吸管和转移到一个 V 底96井板。
- 在4° c 的情况下, 每晚在100µL, 重组 elisa/ELISPOT 涂层缓冲 1x, 在 96-井 elisa 版中最终浓度为2µg/毫升。请参见9中的示例。
- 10% FBS DMEM 介质2小时37° c 的块井
- 添加50µL 清转染的293A 细胞从步骤 6.1.5, 并孵化2小时 RT。
- 添加100µL 的抗人 IgG Ab 共轭的辣根过氧化物酶 (HRP) 酵素在1µg/毫升和孵化1小时室温。添加50µL 显色基底 (TMB), 孵育20分钟。
- 在分光光度计上读取 450 nm 的光学密度。
注: ELISA 法显示的特异抗体可在大范围内进一步制备, 并在蛋白 A 柱上纯化, 对人类 IgG 具有亲和力。
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特抗体的规模化生产与提纯
- 在转染前的前一天, 种子 6 x 106人胚肾 293A (HEK 293A) 细胞进入175厘米2烧瓶, 含25毫升 DMEM 补充 10% FBS。在 co2孵化器 (5% co2) 中, 在37° c 的夜间孵育。
注: 转染时细胞应为70% 汇合。 - 用线性亚衍生物作为转染试剂, 在含有 10% FBS 的 DMEM 培养基中 Cotransfect 293A 细胞。
- 将50µL 的 DNA 转染试剂稀释为150毫米氯化钠450µL。稀释10µg 的 vH 和10µg 表达载体为500µL 150 毫米氯化钠。漩涡十年代每稀释。
- 在 dna 溶液中加入稀释的 dna 转染试剂。十五年代涡旋, 室温孵育15分钟。加入1毫升混合滴明智的细胞, 并通过轻轻旋转的烧瓶混合。
- 在无血清培养基中, 在转染和培养细胞5天后更换培养基16小时。
- 用25毫升吸管抽吸培养基。
- 通过离心 460 x g 去除细胞和碎片5分钟。
- 在4° c 的快速蛋白液相色谱 (FPLC) 系统中, 用1毫升的蛋白 a 涂上一层蛋白质纯化抗体。
- 平衡蛋白质 A 琼脂专栏与20毫米磷酸盐缓冲 (pH 值 7)。
- 使用1.22 µm 过滤器从6.2.5 过滤细胞培养基, 然后是0.45 µm 过滤器。
- 将筛选的介质加载到列上。
- 用20毫米磷酸盐缓冲液 (ph 7) 和洗0.1 米的柠檬酸盐缓冲液 (ph 3.5) 洗涤。
- 在吸收分光光度计上读取 280 nm 的光学密度, 并立即中和含有 1 M 三缓冲器 (pH 9) 的含蛋白质分数。
- 透析纯化 Ab 在4° c 一夜的磁带与3.5K 分子量的防 PBS 缓冲 (pH 7.4)。
- 由0.2 µm 过滤和控制纯度的大小-排除色谱, 如制造商所示。
- 在转染前的前一天, 种子 6 x 106人胚肾 293A (HEK 293A) 细胞进入175厘米2烧瓶, 含25毫升 DMEM 补充 10% FBS。在 co2孵化器 (5% co2) 中, 在37° c 的夜间孵育。
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Representative Results
从 PBMC 从健康捐赠者开始, 这个项目提出了人类抗体的世代, 它认可肽 Pp65495 (Pp65, 从人巨细胞病毒) 提出由主要的组织相容性复合 i 类 (MHC i) 分子 HLA-A*0201 (HLA-A2)。这些抗体可以区分这一复杂和代表其他肽加载到同一 MHC I 分子的络合物。
PBMC 被 HLA-A2/Pp65-PE、HLA-A2/Pp65-APC 和 HLA-A2/MelA2-BV421 体染色, 如上述协议所述。聚丙烯阳性细胞免疫细胞富集后, 洗细胞被附加抗体染色。在流式细胞仪细胞分选机上, 磁富集细胞首先在可行的 CD14 上封闭-CD16-CD3 CD19+汗衫 (B 单元格)。图 1显示了用于隔离 B 细胞的门控策略, 表达 BCRs 能够区分 HLA-A2/Pp65 和其他相关的 HLA-A2/peptide 复合物。在 HLA-A2/Pp65 pe+和 HLA-A2/Pp65 apc+双阳性后, 对 b 单元进行了感兴趣的选择, 以排除单独着色 pe+或 apc+的荧光特定 b 单元格。最后, 通过对 HLA-A2/MelA2-BV421 负细胞进行门控, 确定高特异 B 细胞。这允许识别 b 细胞表达 BCRs 能够绑定 HLA-A2/Pp65, 以肽和 HLA-A2-dependent 方式, 区分这些 b 细胞和那些针对β球蛋白, 生物素, HLA-A2, 或那些不歧视在 MHC 结合槽中的多肽之间。所有这些后细胞将 BV421 阳性细胞。如前所示, 并进一步记录与其他类型的 ag, 这种排除策略是更重要的, 因为 B 细胞的区分能力的增加, 为 ag9。
对单特异性 B 细胞进行分类后, 采用 rt-pcr 方法对重、轻 Ig 链的基因编码进行了放大。对重和轻链编码段获得了约50% 的单一 B 细胞测试 (表 1)。然后将变域序列克隆成包含相应恒定域序列的表达载体 (重常数1和光常数κ或λ)。人胚肾细胞 (HEK, 293A 细胞) cotransfected 重和轻链载体。IgG1 同种的分泌抗体在转染后5天从培养清中得到了293A 细胞 (见图 3 , 用于全面人类抗体生产的全球战略)。这成功地产生了一个 HLA-A2/Pp65 特异性抗体从3个单一的 B 淋巴细胞细胞生成对重和轻链编码段 (表 1)。ELISA 测定表明, 这种单克隆抗体是 MHC 和多肽依赖于其绑定到 HLA-A2/Pp65 配合物 (图 4A), 和几毫克的抗体容易产生进一步的分析 (例如, 亲和性分析,功能化验)。它的结合亲和力, 由表面等离子体共振 (SPR), 是约 7 x 10-6 M (图 4B)。
因此, 本文描述了一个敏感和有效的方法, 允许 i) 检测相关的 Ag 特定 B 细胞, 即使在非常低频率在健康的献血者的血液和 ii) 产生高度歧视的人类抗体。
图 1: 从人类 PBMC 中检测 HLA-A2/Pp65 特异性 B 细胞。
3 x 108 PBMC 被 HLA-A2/Pp65-PE、HLA-A2/Pp65-APC 和 HLA-A2/MelA2-BV421 体染色。聚丙烯阳性细胞免疫细胞富集后, 洗细胞被附加抗体染色。在流式细胞仪细胞分选机上, 细胞首先在可行的单线 CD14-CD16-淋巴细胞 (未显示), 然后在 CD19+CD3-细胞上进行封闭。然后, HLA-A2/Pp65-PE 和 HLA-A2/Pp65-APC 体染色的 B 细胞被门控。HLA-A2/MelA-BV421 聚丙烯是用来排除 B 细胞不承认 HLA-A2/Pp65, 在多肽和 MHC 依赖性的方式。
图 2: Ig 基因的放大和克隆策略.采用巢式 rt-pcr 技术对轻、重的 Ig 链编码基因进行了放大。第一 PCRs 进行了混合前引物杂交的领导区域和反向引物特定的恒定区域适当的重, 轻的卡帕, 或轻的 lambda 链。第二 PCRs 是用含有限制点的底漆进行的, 正向和反向引物分别针对 V 段的开始和 J 段的末端。PCR 产物被测序, 用限制性酶消化, 并在含有适当常数域的表达载体中进行克隆。CMV: 巨细胞病毒启动子;AmpR: 氨苄西林耐药基因。
图 3: 重组人抗体重建的总体策略。
基于聚丙烯的排序策略允许检测感兴趣的 B 细胞。高度特定的 B 细胞是单细胞排序。利用 rt-pcr 技术, 对轻、重的 Ig 链编码段进行了放大。将变域序列克隆成独立的真核表达载体, 并对恒定光和重区的基因片段进行编码。相应的完全人抗体是用瞬时转染的 HEK 293A 细胞表达的, 并从培养上清液中纯化。此图是从 Ouisse et al.中修改的(2017)9。
图 4: 对人外周血循环 B 细胞产生的 HLA-A2/Pp65 有代表性的高度歧视性抗体的表征。
A)单克隆抗体 PC1.02 对 HLA-A2/Pp65 检测的特异性。板上涂有相关的 (HLA-A2/Pp65) 或不相关的 HLA-A2 复合物含有 HLA-A2-restricted 肽: 节, NS3 (HCV-1), GagP17 (HIV-1) 在2µg/毫升, 添加了单克隆抗体 PC1.02, 和一个抗人 IgG-HRP Ab 被用于检测。光学密度 (OD) 被读了在450毫微米。B)利用表面等离子体共振 (SPR) 在 CM5 片结合的单克隆体上流动各种浓度的 HLA-A2/Pp65 配合物来测定 PC1.02 的亲和性。此图是从 Ouisse et al.中修改的(2017)9。
| PBMC 数量 | 富集后的 PE + APC + 细胞数 | 排除的 (BV421+) 单元格数 | 排序的单个单元格数 | 分析井数 | 与 HC 和 LC 相关的井数 (% 恢复) | 生产的抗体数量 | 特定抗体的数量 | |
| HLA-A2/Pp65 单克隆 (PC1.02) | 3 x 108 | 818 | 117 | 161 | 7 | 3 (43%) | 3 | 1 |
表 1: HLA-A2/Pp65 特异性 B 细胞的分析。
对不 b 细胞排斥策略的影响、Ig 基因扩增的结果以及分离的 HLA-A2/Pp65 特异 b 细胞的单克隆产物进行了评价/测量。
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Discussion
所提出的协议是一种强有力的方法, 产生的人抗体直接从 Ag 特定的 B 细胞循环血液。它结合了三重要的方面: (i) 使用聚丙烯相关的磁性富集, 它允许对甚至稀有的银结合 B 细胞的ex 体内隔离;(二) 采用三 ag 体 (两个相关的和一个不相关的) 的门控策略, 用三种不同的荧光来隔离, 用流式细胞仪, 只对所需的 ag 表达一个 BCR 特异的 B 细胞;(iii) 用 rt-pcr 技术在单细胞水平上重建相应的重组单克隆人基因, 并在细胞中表达基因。
先前的研究建议使用一个或两个荧光相关抗原来标记人类 b 细胞, 然后再从分离的 b 细胞6,7,8中分类和随后生产抗体。一项分析的类风湿性关节炎患者, 和一个在自身免疫性小鼠模型, 已经关联了一个不相关的荧光抗原, 以表征性 B 细胞和确定其频率10,11。据我们所知, 使用两个荧光相关抗原体和一个不相干的抗原聚丙烯的组合, 以前没有被描述为丰富的特定 B 细胞之前, 其使用, 以生产完全人类抗体。这种优化的方法可以在一个月内获得完全的人的歧视抗体, 并且可以成功地执行, 即使从一个天真的 B 细胞剧目开始。因此, 它没有一个主要的缺点, 噬菌体显示, 人 B 细胞永生, 或其他先前所描述的分子生物学的生物抗体重建程序。
这种细胞分选策略的结果是高收益率的 Ag 特定的人抗体。对来自单个孤立 B 细胞的重、轻链段进行放大, 成功率约为50%。轻链段几乎总是被放大, 但这不是重链段的情况。rt-pcr 的效率在很大程度上取决于以下几点: i) 排序的单一 B 细胞必须尽快冻结;2) 增加30单位的核糖核酸抑制剂, 尽量减少从冰箱取出 B 细胞和启动 RT 反应的时间;三) 解冻所有冰上底漆;四、不冻/解冻底漆超过三次;五) 放养底漆最多一年。
关于相应的重组抗体的生产效率与所需的特异性, 它是约 30-40% 的情况下, 公司具体抗体。这些特殊的抗体必须承认肽和 MHC 分子, 这是相当苛刻的, 我们以前已经表明, 总的恢复率的特定抗体针对更多的常规抗原是优越的, 高达100% 的β-乳糖抗原9。必须强调的是, 为不相关的聚丙烯选择适当的 Ag, 对于增加抗体产生的特异性是很重要的。
本文描述的 anti-HLA-A2/Pp65 单克隆人 (PC1.02) 的亲和力相对较低, 约 7 x 10-6 M, 类似于 TCR 的亲和力。这一结果是意料之中的, 因为 B 细胞分离是由天真的捐献者进行的。大多数聚丙烯+ B 细胞是 IgM+IgG-, 这降低了获得良好 Ag 粘合剂的几率。然而, 因为个体的免疫学过去12, 这个方法也可能使对一个渴望的 Ag 的交叉反应记忆 B 细胞分类从天真捐赠者。此外, 这种方法很容易适用于接种疫苗或感染病人或免疫的人性化动物, 如9所述, 其中体内亲和成熟可以提高结果抗体的亲和力, 使其与大约 1 x 10-9 m. 各种程序也被描述来改善抗体体外的亲和性, 特别是通过在表达抗体的细胞中复制体细胞变异 (在13中被审查)。
最后, 我们提出了一个多用途战略的高度歧视性的抗体生产, 可用于各种类型的情况, 从一个天真的个人, 以接种疫苗的捐助者或病人患有自身免疫性疾病。以这种方式产生的完全人类抗体对所需的表位可能是有用的基础研究和免疫治疗。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢细胞仪设备 "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, 南特) 的专家技术援助。我们还感谢所有的重组蛋白生产 (P2R) 和冲击平台 (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, 南特) 的工作人员的技术支持。我们感谢伊曼纽尔 Scotet 和理查德 Breathnach 对手稿的建设性评论。这项工作的财政支持 IHU-Cesti 项目资助的« Investissements 艾文莉»法国政府计划, 由法国国家研究机构 (ANR-10-IBHU-005) 管理。IHU-Cesti 项目也得到了南特 Métropole 和 Région 支付 de la 卢瓦尔的支持。这项工作是在国家研究机构通过对未来项目 ANR-11-LABX-0016-01 的投资支持的 LabEX 总检办方案的背景下实现的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK 293A cell line | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine |
| RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | PAA | K45-001 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
| PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
| Fetal Bovine serum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
| Ficoll - lymphocytes separation medium | EuroBio | CMSMSL01-01 | density 1,0777+/-0,001 |
| streptavidin R-phycoerythrin conjugate | Invitrogen by Life Technologies | S21388 | premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide |
| Streptavidin, allophycocyanin conjugate | Invitrogen by thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azide premium grade |
| Brilliant violet 421 streptavidin | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
| Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| MidiMACs or QuadroMACS separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Used dilution 1:20 |
| CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Used dilution 1:20 |
| CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Used dilution 1:50 |
| CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Used dilution 1:50 |
| 7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Used dilution 1:1000 |
| FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer | BD Biosciences | ||
| 8-strip PCR tubes | Axygen | 321-10-061 | |
| Racks for 96 microtubes | Dominique Dutscher | 45476 | |
| RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) | Invitrogen by thermoFisher scientific | 10777-019 | qty:5000U (40U/ul) |
| Distilled Water Dnase/Rnase Free | Gibco | 10977-035 | |
| Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
| Random hexamers | Invitrogen by thermoFisher scientific | N8080127 | qty : 50uM, 5nmoles |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 18080-044 | qty : 10000U (200U/ul) |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| dNTP Set, Molecular biology grade | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
| 5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers |
| 5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers |
| 5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers |
| 5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers |
| 3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening |
| 3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA |
First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig |
| 5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers |
| 3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG |
Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers |
| 5'LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG |
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG |
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers |
| 3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA |
First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening |
| 5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1_9_1–13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC |
Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers |
| 5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG |
First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers |
| 5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers |
| 3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG |
Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening |
| Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC |
Bacteria PCR screening |
| QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade | MP Bio | AGAH0500 | |
| NucleoFast 96 PCR Plate | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
| Enzyme Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
| Enzyme SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
| Enzyme Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
| Enzyme BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
| HCg1 (Genbank accession number FJ475055) | |||
| LCk (Genbank accession number FJ475056 ) | |||
| LCl (Genbank accession number FJ517647) | |||
| T4 DNA ligase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
| 2X YT medium | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
| LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
| Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification | Macherey Nagel | 740588.250 | |
| Jet PEI DNA transfection reagent | PolyPlus | 101-40 | |
| Flat bottom96-well plate | Falcon | 353072 | |
| V-bottom 96-well plate | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
| Nunc easy 175 cm2 flasks | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
| ELISA/ELISPOT coating buffer | eBiosciences | 00-0044-59 | |
| Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | high protein binding |
| Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
| TMB substrate | BD Biosciences | 555214 | |
| Streptavidin | Sigma | S0677 | |
| 1 mL-HiTrap protein A HP column | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517501 | |
| NGC Quest 10 Plus Chromatography System | BioRad | 7880003 |
References
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- Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C.
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- Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3 (2017).
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免疫学 问题 132 免疫学 细胞生物学 人抗体 B 细胞 聚丙烯 流式细胞仪 单细胞 抗原特异 磁性充实Erratum
Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.
The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes, Nantes, France
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France
