Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Published: February 6, 2018 doi: 10.3791/56508
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

ERRATUM NOTICE

Summary

אנו מתארים שיטה לייצור נוגדנים אנושי ספציפי אנטיגן של עניין, מתחיל מתאי B נדיר במחזור דם אנושי. דור של נוגדנים טבעיים אלה הוא יעיל ומהיר, הנוגדנים שהושג יכול להפלות בין אנטיגנים מאוד קשורות.

Abstract

נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) הינם כלים רבי-עוצמה שימושי עבור שניהם מחקר בסיסי ב וההתערבות. ירידה לפרטים גבוהה שלהם היא הכרחית כאשר הנוגדן צריך להבחין בין מבנים הקשורים במידה רבה (למשל, חלבון רגיל, גרסה מוטציה הימנו). הדרך הנוכחית של יצירת mAbs שמסווגת כזה כרוך ההקרנה נרחב של תאים מייצרי Ab B מרובים, וזה גם יקר וגם זמן רב. אנו מציעים כאן שיטה מהירה וחסכונית לדור של שמסווגת, mAbs אנושית לחלוטין, החל מדם אנושי במחזור B לימפוציטים. מקוריות אסטרטגיה זו נובעת בחירת התאים איגוד B אנטיגן ספציפי בשילוב עם מבחר הנגד של כל התאים האחרים, שימוש זמינים היקפיים דם תאי תאים (PBMC). ברגע מסוים B תאים מבודדים, רצפים cDNA (חומצה deoxyribonucleic משלימים) קידוד mAb המתאימים מתקבלים תא בודד הפוך תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית (RT-PCR) בטכנולוגיית והביע לאחר מכן-אנוש תאים. בתוך מעט ככל 1 חודש, זה אפשרי לייצר מיליגרם של mAbs אנושי מאוד שמסווגת נגד כמעט כל אנטיגן הרצוי באופן טבעי שזיהה את הרפרטואר תא B.

Introduction

השיטה המתוארת כאן מאפשרת ייצור מהיר ופסיביות של נוגדנים חד-שבטיים אנושית לחלוטין (mAbs) נגד אנטיגן הרצוי (Ag). mAbs הם כלים חיוניים רבים מחקר בסיסי יישומים בתוך חוץ גופית ו ויוו: flow cytometry, היסטולוגיה, ניסויים סופג המערבי, ואת החסימה לדוגמה. יתר על כן, mAbs נמצאים בשימוש יותר תרופות לטיפול במחלות אוטואימוניות, סרטן, וכדי לשלוט דחייה השתלת1. לדוגמה, mAbs אנטי-CTLA-4 ו- anti-PD-1 (או אנטי-PD-L1) לאחרונה שימשו מעכבי המערכת החיסונית מחסום טיפולי סרטן2.

MAbs הראשונה יוצרו על ידי אימונוגלובולין (Ig)-מפריש hybridomas המתקבל תאי הטחול של חיסון עכברים או חולדות. עם זאת, התגובה החיסונית חזקה נגד mAbs מאתר או עכברוש הסלים שלהם לשימוש טיפולית בבני אדם, בשל הסיווג שלהם מהירה של אינדוקציה סביר של רגישות יתר תגובות3. כדי להתמודד עם בעיה זו, פרוטאין מהחי רצפים של mAbs הוחלפו חלקית על-ידי אלה האדם לייצר נוגדנים העכבר-אנושי או humanized chimeric כביכול. עם זאת, אסטרטגיה זו פוחתת באופן חלקי בלבד immunogenicity, תוך הגדלת באופן משמעותי הן את העלות והן ציר-הזמן של ייצור. פתרון טוב יותר היא לייצר mAbs האנושי ישירות מתאי B האנושית, מספר אסטרטגיות זה הינם זמינים. אחד מהם הוא השימוש של תצוגת phage או שמרים. זה כולל הצגת תחומים משתנים מספרייה קומבינטורית של Ig אדם אקראי כבד, אור שרשראות phages או שמרים, ולא בביצוע שלב הבחירה באמצעות אנטיגן ספציפי של עניין. חיסרון גדול של אסטרטגיה זו היא שרשראות קלות וכבדות מקושרים באקראיות, שמוביל עלייה גדולה מאוד הרב-גוניות של נוגדנים שנוצרו. נוגדנים שהושג סביר להניח תואמים לאלה הנובעים מן תגובה חיסונית טבעית נגד Ag מסוים. יתר על כן, קיפול חלבונים האנושית והשינויים post-translational לא באופן שיטתי משוחזרות אאוקריוטים או אפילו בכל שמרים. שיטת הייצור mAb האדם השני הוא immortalization של תאים B אנושי טבעי, על ידי וירוס אפשטיין בר זיהום או ביטוי של גורמים אנטי-מוות BCL-6 ו- BCL-XL4. אולם, שיטה זו ישימה רק לתאי זיכרון B, הוא יעיל, הדורשים הקרנת רבים mAb immortalized B והתאים המייצרים לזהות שיבוטים mAb כמה (אם בכלל) עם יחודיות antigenic הרצוי. השיטה זו וכך גם יקר וגם זמן רב.

פרוטוקול חדש לאחרונה תואר לייצור mAbs אנושית מבודדת אחת B תאים5. זה מסתמך על אופטימיזציה בתא יחיד הפוך תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית (RT-PCR) עבור הגברה של שני כבדים - ו אור-שרשרת קידוד מקטעי מתא B ממוינת יחידה. זה מלווה את שיבוט וביטוי של מקטעים אלה במערכת הביטוי האיקריוטים, ובכך לאפשר שחזור של mAb אנושית לחלוטין. פרוטוקול זה שימש בהצלחה מתחיל מתאי B מתורמים שחוסנו. תאים נבצרו מספר שבועות לאחר החיסון כדי להשיג תדרים גבוהים יותר של תאי B נגד היועץ המשפטי לממשלה הרצוי, ואת ובכך להגביל את משך הזמן הדרוש לסינון6. אחרים mAbs אנושית לחלוטין גם הופקו נשאי איידס+ (וירוס הכשל החיסוני האנושי) חולים7 ו מלנומה מטופלים8. למרות ההתפתחויות הללו, יש עדיין אין הליך זמין המאפשר את הבידוד של תאים ספציפיים Ag B עצמאית של פנוטיפ זיכרון או התדירות שלהם.

ההליך שמתואר כאן מוביל בידוד יעיל ex-vivo של תאי B במחזור אדם המבוסס על ירידה לפרטים BCR שלהם, ואחריו את הייצור של mAbs אנטיגן ספציפי אנושית לחלוטין תשואה גבוהה ועם זמן הקרנה נמוכה. השיטה אינה מוגבלת זיכרון B תאים או מפריש נוגדן תאי B המושרה לאחר תגובה חיסונית, אך ניתן להחיל גם על הרפרטואר תא B נאיבי האדם. זה עובד אפילו מתחיל מתאי B הספציפיים Ag, נוכח תדרים נמוכים מאוד היא אינדיקציה טובה של היעילות שלה. העקרון של השיטה הוא כדלקמן: היקפי דם תאי תאים (PBMC) מוכתמים tetramers שני מציג אנטיגן של עניין, כל אחת המסומנת fluorochrome שונים (למשל, Phycoerythrin (PE), Allophycocyanin (APC)), tetramer השלישי מציג אנטיגן הקשורים קשר הדוק מצומדת עם fluorochrome השלישי (למשל, 421 ויולט Brillant (BV421)). להעשיר עבור תאים אנטיגן מחייב, תאים מודגרת ואז עם חרוזים מצופים אנטי-PE ו- Abs אנטי-APC, וממוינות תא ההפרדה עמודות. השבר תא APC PE+ + נבחר, ויטראז'ים עם מגוון רחב של mAbs ספציפיות עבור סוגים שונים של תאים PBMC לאפשר זיהוי של תאי B, ומתן וכפופים לזרום cytometry מיון תא. בתאי B שהן PE+ , APC+, אבל-, ויולט מבריק מבודדים. שלב זה נגד בוחר תאים אשר אינם תאים B או אפשרות לאגד אנטיגן tetramerized, אך לאגד PE או APC (תאים אלו יהיו PE+ APC– או PE– APC+) או לחלק הלא-אנטיגן של tetramers בשימוש (אלה התאים יהיה BV421+). בתאי B לא ספציפי מאוד עבור epitope עניין גם נבחרו נגד בשלב זה (תאים אלה יהיה גם BV421+). לכן, בשיטה זו ניתן לטהר ספציפי מאוד B תאים המבטאים קולטנים B-cell (BCRs) יכול להפלות בין שני אנטיגנים מאוד קרובים. תאים B ספציפיים בודדים נאספים צינורות, שלהם cDNAs Ig מוגבר-PCR (חומצות deoxyribonucleic משלימים) שיכפל והביע על-ידי קו תאים אנושיים כמו המופרש mAbs IgG.

מהווה הוכחה של המושג, מחקר זה מתאר הדור יעיל של mAbs האנושי, אשר מזהה פפטיד שהוצגו על-ידי מחלקה מורכבים histocompatibility הגדולות (MHC-אני) מולקולה, יכול להפלות בין פפטיד זה אחרים פפטידים טעון על אותו MHC-אני אלל. רמת המורכבות של Ag זה אמנם חשוב, שיטה זו מאפשרת (i) תשואה גבוהה שחזור של mAbs Ag ספציפיים; (ii) ייצור mAbs מסוגל להפלות בין שתי Ags קרובים מבחינה מבנית. גישה זו ניתן להרחיב את חוסנו או נגועים המטופלים ללא כל שינוי פרוטוקול, גם כבר בהצלחה הוכרז ב מערכת humanized החולדה9. לפיכך, מחקר זה מתאר בגישה רב תכליתי ויעיל להפקת mAbs אנושית לחלוטין שניתן להשתמש בהם מחקר בסיסי, חיסוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל דגימות דם היקפיים אדם התקבלו מתורמים אנונימיים למבוגרים לאחר הסכמה מדעת, על פי ועדת האתיקה המקומית (Etablissement פרנקאיס du שרו, EFS, נאנט, הליך PLER NTS-2016-08).

1. בידוד תאי תאי דם היקפיים אנושי

הערה: החל חומר ניתן הכולל דם היקפיים אנושי או דגימות cytapheresis. לא צריך להיות מבוגר יותר 8 שעות ודוגמאות בתוספת תרופות נגד קרישת דם (למשל, הפארין).

  1. לדלל דם עם 2 כרכים (דם היקפיים אנושי) או 5 כרכים (לדוגמה cytapheresis) של RPMI (רוזוול, מכון ממוריאל פארק) בינוני.
  2. בזהירות שכבה 35 מ של השעיה תא מדולל על 15 מ"ל של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור חרוטי 50-mL. להפוך צינורות רבים לפי הצורך כדי להפיץ את כל הדם מדולל. צנטריפוגה-1,290 g x עבור 25 דקות בטמפרטורת החדר רוטור דלי מתנדנד עם בלם את.
  3. בזהירות וארוקן את שכבת תאים תאי-הממשק בין המדיום הדרגתיות צפיפות השכבה פלזמה, ולהעביר את התאים צינור חרוטי 50 מ.
  4. ממלאים את הצינור עם RPMI בינוני, לערבב, צנטריפוגה-1,290 g x 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את תגובת שיקוע.
  5. Resuspend בגדר תא ב- 20 מ של RPMI בינונית, צנטריפוגה-200 גרם x 10 דקות להסיר את טסיות הדם. הסר בזהירות את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעם אחת.
  6. Resuspend בגדר תא RPMI בינוני עם 10% סרום שור עוברית (FBS).
    הערה: להמשיך ישירות אל tetramer תיוג או לשמור תאים ב 4 ° C בלילה-ריכוז של 107 תאים למ"ל.

2. tetramer-הקשורים העשרה מגנטי של תאים ספציפיים Ag B

  1. להכין Ag-tetramers על-ידי הוספת או PE או התווית על-ידי APC פרימיום כיתה streptavidin או התווית על-ידי BV421 streptavidin ב שן טוחנת יחס של 1:4 על biotinylated אנטיגן מונומרים. להוסיף את הכמות המתאימה של streptavidin-המספר המשלים בשלושה חלקים נפרדים, הוספת אחד aliquot בכל 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. להפיץ תאים (עד 3 x 108 למחזור) צינורות חרוט 15 מ"ל, צנטריפוגה ב g x 460 במשך 5 דקות.
    הערה: פרוטוקול הבאות היא שפופרת אחת.
  3. Resuspend בגדר תא ב- µL 200 ל- PBS (פוספט Buffered מלוחים) עם 2% FBS. הוסף PE - APC-, BV421 מצומדת tetramers, אחד כדי ריכוז סופי של 10 µg/mL. מערבבים היטב, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הכנת מאגר ההפרדה תא קר כקרח (SB) באמצעות PBS עם 0.5% BSA (שור אלבומין) EDTA (חומצה Ethylenediaminetetraacetic) 2 מ מ.
  5. להוסיף 10 מ של תאים SB. צנפה באמצעות צנטריפוגה ב g x 460 במשך 5 דקות.
  6. Resuspend התאים ב- 500 µL של µL SB. להוסיף 50 קר כקרח של אנטי-PE ו- 50 µL של גרגרי מגנטיים אנטי-APC.
  7. מערבבים היטב, תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 º C.
  8. חזור על שלב 2.5 פעמיים.
  9. לחסל את תגובת שיקוע בקפידה andresuspend בגדר תא-ריכוז של 2 x 108 תאים/מ ל SB קר קרח.
  10. Equilibrate עמודה מגנטי גדול ממוקם על מגנט עם 3 מ"ל של SB.
  11. להעביר תא השעיה מ- 2.9 על החלק העליון של העמודה equilibrated ולאפשר לרוקן לגמרי. שלב קריטי: כדי להימנע הצליעה של העמודה, התאים עוברים דרך רשת ניילון מיקרומטר 70.
  12. לשטוף את הצינור שהכיל תאי עם 3 מ"ל של SB קר קרח ולהעביר את המאגר ישירות על העמודה (במקרה של סינון, יש לשטוף 70 רשת ניילון מיקרומטר).
  13. כאשר המאגר יש מרוקנת לגמרי לתוך העמודה, להוסיף עוד 3 מ"ל של SB קר קרח לעמודה.
  14. חזור על צעד 2.13 עוד 3 מ"ל לשטוף.
  15. הסר את העמודה מגנט ומקום על צינור איסוף חרוט 15-mL.
  16. הוסף 5 מ של SB קר קרח על החלק העליון של העמודה ' לשטוף מיד את התאים מחוץ העמודה באמצעות הבוכנה. חזור על שלב זה פעם אחת.
  17. Centrifuge התאים שנאספו (מועשר tetramer רלוונטי תא חיובי שבר) ב- g 460 x עבור 5 דקות והמשך נוגדן נוסף מכתים.
    הערה: בריכת שנאסף תאים לכל הצינורות, במידת הצורך.

3. צביעת תאים B אנושי ספציפי Ag, מיון תא

  1. Resuspend בגדר תא עם קוקטייל של נוגדנים נגד CD3 (דילול הסופי: 1:20), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50), ו- 7AAD (1:1000) באמצעי אחסון הסופי של µL 100 ל- PBS עם 2% FBS. תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 º C.
  2. להוסיף 10 מ של PBS לתאים, צנטריפוגה ב 460 x g במשך 5 דקות, ולמחוק את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעם אחת. Resuspend בגדר תא ב- µL 200 ל- PBS, מסנן על גבי רשת ניילון מיקרומטר 70.
  3. להמשיך למיין תאים ספציפיים B ברמת תא בודד על cytometer סדרן התא עם זרבובית 100 מיקרומטר, בלחץ של 20 psi מבלי לחרוג אירועים/s 10009.
    הערה: האסטרטגיה המגביל המשמש מוצג באיור 1. התאים היו קודם מגודרת על CD14–CD16 7AAD–– תאים כדי לא לכלול ומונוציטים NK, תאים מתים (לא מוצג באיור1). ואז CD19+ B תאים שנבחרו לפני gating בתאי מוכתם כפול על ידי PE ו- APC הרלוונטיים Ag-tetramers. בתאי B שאינם ספציפיים היו לא נכלל בשל gating בתאי שלילי BV421 (מוכתם על ידי לא רלוונטי Ag-tetramer).
  4. איסוף תאים B בודדים לתוך חשפנות-8 המבחנות בעבר מלאים µL 10 ל- 1 x PBS ו 10 יחידות של מעכב RNAse והניח על מתלה עבור 96 microtubes. מיד להקפיא את המבחנות ב-80 מעלות צלזיוס.
    הערה: המסכות המיון שבחרת על הכלי cytometer הם המסיכה התשואה: 0, טוהר המסכה: 32, ומסכה שלב: 0. הפיקדון בתא יחיד יכולה להיות מכוונת אל צלחת PCR 96 - או 384-ובכן אם יש צורך. בתאי B בודדת בוודאי קופא מהר ככל האפשר, ניתן יהיה להשאיר ב-80 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות, במידת הצורך.

4. תא ותא RT-PCR

  1. Lyse תאים על ידי חימום ישירות את הדגימות קפוא ברצועות ה-PCR-70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות באמבט יבש.
  2. להעביר רצועות קרח ולהמשיך להיפוך שעתוק (RT) על-ידי הוספת µL 10 למחזור של 2 x מיקס מאסטר מאגר המכיל 1 מ מ dNTP 25 תחל oligod(T) µg/mL, 5 מיקרומטר hexamers אקראיים, 20 יחידות של RNAse מעכב, 400 יחידות של רוורס טרנסקריפטאז.
    הערה: לאחר תא מפשיר, RT חייב להתבצע במהירות כדי למנוע השפלה RNA.
  3. דגירה 25 ° c עבור 5 דקות כדי לאפשר hexamers אקראיים hybridize, ואז תקופת דגירה של h 1 ב 50 מעלות צלזיוס, ולסיים עם דגירה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות לעצור את התגובה.
  4. להמשיך עם שני סיבובים של הגברה מקוננים PCR לכל אחד האזורים קידוד עבור המשתנה כבד (vH) ואת קאפה (vLκ) או שרשראות אור למבדה (vLλ).
    הערה: לחלופין, RT יכול להיות קפוא ב-20 ° C ודוגמאות שמרה במשך שבוע אחד.
    1. בסיבוב הראשון של ה-PCR, להוסיף 3 µL של cDNA עבור אמצעי אחסון 40 µL הסופי המכיל 1.5 mM MgCl2, dNTPs 0.25 mM, 2.5 יחידות של ה-DNA פולימראז ו 200 ננומטר של תחל החיצוני (ראה איור 2 ו לטבלה של חומרים עבור רצפי פריימר).
      הערה: ההרכב של מיקס תחל החיצוני. עבור הגברה שרשרת כבדה: 4 קדימה תחל (5' LVH mix) ולהפוך 2 תחל (3' CµCγ mix). עבור הגברה שרשרת בהיר kappa, 3 להעביר תחל (5' LV | לערבב) 1 הפוכה פריימר (3' Cκ543-566). עבור הגברה שרשרת אור למדא, 7 קדימה תחל (5' מיקס LVl), 1 להפוך פריימר (3' Cl).
      הערה: תחל עוצבו על ידי ההגה ואח . עבור הגברה של כל שרשרת כבד וקל גנים משפחה5.
    2. חלים התנאים אופניים הבאים: 94 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 30 s ב 94 ° C, 30 s-58 ° C עבור VH VLκ (60 ° C עבור VLλ), ואת 55 s ב 72 ° C, עם התארכות הסופי צעד ב-72 מעלות למשך 7 דקות.
    3. PCR בסיבוב השני, להשתמש µL 3 של המוצר הראשון הגברה עבור אמצעי אחסון הסופי של 40 µL המכיל 1.5 mM MgCl2, dNTPs 0.25 mM, 2.5 יחידות של ה-DNA פולימראז ו 200 ננומטר של תחל פנימי המכיל אנזים הגבלה אתרים עבור שכפול לידי ביטוי וקטורים (ראה איור 2 ו לטבלה של חומרים עבור רצפי פריימר).
      הערה: ההרכב של מיקס תחל פנימי. עבור הגברה שרשרת כבדה: 9 קדימה תחל (5' AgeIVH מיקס) ולהפוך 3 תחל (3' SalIJH מיקס). עבור הגברה שרשרת בהיר kappa, 9 קדימה תחל (5' AgeIV | לערבב) 3 הפוכה תחל (3' BsiWIJκ מיקס). עבור הגברה שרשרת אור למדא, 6 קדימה תחל (5' מיקס AgeIVl), 1 להפוך פריימר (3' XhoICl).
      הערה: תחל עוצבו על ידי ההגה. et al., עבור הגברה של כל שרשרת כבד וקל גנים משפחה5.
    4. חלים התנאים אופניים הבאים: 94 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 30 s ב 94° C, 30 s-58 ° C עבור VH LCκ (60 ° C עבור LCλ), ואת 45 s ב-72 מעלות עם התארכות הסופי צעד ב-72 מעלות למשך 7 דקות.
  5. לזהות בארות חיובי על-ידי העברת 5 μL של מוצרי ה-PCR של vH, vLκ, vLλ-ג'ל agarose 1.5% (500 מוצרים bp עבור פלחי קידוד שרשרת כבדה משתנה) ומוצר bp 350 עבור שרשרת אור משתנה קידוד מקטעי.
  6. לטהר הנותרים 35 µL PCR המוצרים שנותרו מבארות חיובי באמצעות ממברנות אולטראפילטרציה מתקני טיהור של מוצרי ה-PCR.
  7. Elute מוצרים PCR עם 60 µL של H2O.

5. ביטוי שיבוט

  1. להכין מוסיף
    הערה: לעכל 60 µL של כל ה-PCR מטוהרים המוצר באמצעי אחסון הסופי של 100 µL המכיל מאגר אנזים הגבלה המתאים.
    1. למוצרי PCR vH, להוסיף 50 יחידות של AgeI ו- 50 יחידות של סאלי, ולאחר תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
    2. למוצרי PCR vLλ, להוסיף 50 יחידות של AgeI ו- 50 יחידות של XhoI, ולאחר תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
    3. למוצרי PCR vLκ, להוסיף 50 יחידות של AgeI ולאחר תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס. לטהר מעכל באמצעות ממברנות PCR 96 ו elute עם µL 60 H2O. לעכל את eluate µL 60 באמצעי אחסון הסופי של µL 100 BsiWI אנזים הגבלה המאגר, להוסיף 50 יחידות של BsiWI ולאחר תקופת דגירה של h 1-55 מעלות צלזיוס.
    4. בטל האנזימים על ידי חימום ב 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  2. הכנת לבטא וקטורים
    הערה: מוצרי ה-PCR vH משוכפלות ב וקטור ביטוי (HCγ1) המכילה את שרשרת כבדה קבועה Cγ1 של IgG1. מוצרי ה-PCR vLκ משוכפלות ב וקטור ביטוי (LCκ) המכילה את שרשרת אור קבוע Cκ. מוצרי ה-PCR vLλ משוכפלות ב וקטור ביטוי (LCλ) המכילה את שרשרת אור קבוע Cλ.
    1. לבצע את digestions הבאות:
      1. לערבב 1 µg של הביטוי וקטור HCγ1 עם 10 יחידות של AgeI ו 10 יחידות של סאלי endonucleases ב הנפח הכולל של 20 µL מאגר ההגבלה המומלצת על ידי היצרן ולאחר תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
      2. לערבב 1 µg של הביטוי וקטור LCκ עם 10 יחידות אנזים הגבלה AgeI ב הנפח הכולל של µL 20 הגבלת מאגר מומלצים על ידי היצרן ולאחר תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס. להוסיף 10 יחידות אנזים הגבלה BsiWI, ולאחר תקופת דגירה של h 1-55 מעלות צלזיוס.
      3. לערבב 1 µg של הביטוי וקטור LCλ עם 10 יחידות של AgeI, של XhoI endonucleases ב הנפח הכולל של µL 20 הגבלת מאגר 10 יחידות המומלץ על ידי היצרן ולאחר תקופת דגירה של h 1 ב 37 ° C
    2. מחממים את כל התערובת עיכול-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להשבית את אנזימי הגבלה.
    3. לבצע מצדו של 5 µL של מוצר ה-PCR מתעכל עם 2 µL (100 ng) של וקטור ביטוי ליניארית המתאימה בהנפח הכולל של 20 µL 1 x DNA ליגאז מאגר עם 1 יחידה של T4 DNA ליגאז על ידי דגירה בין לילה ב 4 º C.
      הערה: לחלופין, מצדו שבוצעו עבור h 3-4 מעלות צלזיוס.
  3. שיבוט
    1. Electroporate 1 µL של תערובת מצדו 20 µL לתוך µL 45 של תוצרת בית electrocompetent TOP10 e. coli (הנוכחי פרוטוקולים בביולוגיה מולקולרית, סעיף 1.8.4-1.8.8). מיד להוסיף 500 µL 2 X יט בינוני, דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות התפשטות טרנספורמציה חיידקים על 2 x יט אמפיצילין צלחות. דגירה בין לילה ב 37 º C.
    2. עבור כל שינוי, מסך שמונה מושבות על ידי ה-PCR.
      1. להגדיר premix התגובה כמפורט על הקרח: 45 µL של 5 x PCR מאגר µL 12 MgCl2 (25 מ מ), 4 µL של dNTPs (מ מניות המכילה 10 מ מ של כל אחד), µL 10 של פריימר לפנים (המניות 10 מיקרומטר) hybridizing רצף וקטור (פריימר Ab-vec-סנס) , ו- µL 10 של פריימר הפוכה (המניות 10 מיקרומטר) פילוח האזור שרשרת כבד או קל מתמיד (ראו טבלה של חומרים פריימר רצפים). לפצות נפח סופי של 200 µL עם H2O. לאחר מכן להוסיף 4 µL של האנזים DNA פולימראז (U 5/µL).
      2. להפיץ 25 µL של התגובה premix למחזור PCR חשפנות-8 על קרח.
      3. השתמש קיסם סטרילי כדי להרים את מושבות בודדות. צובעות את קיסם השיניים על גבי צלחת אמפיצילין x TY 2 כדי להוות צלחת שכפל וטובל ואז לתוך צינור תגובת ה-PCR.
      4. לבצע ההקרנה PCR אופניים בתנאים הבאים: 94 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 25 מחזורים של 30 s ב 94 ° C, 30 s-55 ° C, ו-50 s ב- 72 מעלות צלזיוס.
      5. לזהות חיידקים חיוביים על-ידי העברת µL 5 המוצרים PCR ג'ל 1.5% agarose.
        הערה: תוצאות חיוביות המושבות לתת מוצר ה-PCR בסביבות 850 bp הווקטור שרשרת כבדה, 600 bp הווקטור שרשרת אור.
    3. לחסן ארבע המושבות חיובי מהצלחת שכפל לתוך 2 מ ל LB בינוני, דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד.
    4. תמצית פלסמידים מתרבויות נוזלי באמצעות ערכת טיהור פלסמיד, כמצוין על-ידי היצרן.
    5. ודא הכניסה הנכון של תחומים משתנה על ידי סנגר רצף של פלסמידים עם מן המפתח Ab-vec-סנס.
      הערה: פלסמידים עם תותב הנכון (קידוד ל- HC ו- LC התואם את) הן להיות cotransfected לתוך תאים 293A על הפרשה. ייחודה של mAbs המיוצר בקנה מידה קטן לבדיקה על ידי אליסה. לאחר מכן, ייצור בקנה מידה גדול מתבצע אם ישים.

6. ייצור של mAbs

  1. ייצור בקנה מידה קטן לבדיקת ירידה לפרטים
    1. שלשום תרביות תאים, זרע 15,000 כליות עובריים אנושיים 293A (HEK 293A) תאי 200 µL של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% FBS לכל טוב ב 96-ובכן צלחות. דגירה בין לילה בחממה2 CO (5% CO2) ב- 37 מעלות צלזיוס.
    2. Cotransfect 293A תאים DMEM בינוני המכיל 10% FBS באמצעות נגזרת polyethylenimine ליניארית כמו ריאגנט תרביות תאים.
      הערה: לבצע תרביות של תאים triplicates. להלן כללי התנהגות הוא אחד טוב של צלחת 96-ובכן בתחתית שטוח.
      1. לדלל 0.5 µL של ה-DNA תרביות תאים ריאגנט לתוך µL 10 מ מ 150 NaCl. לדלל 0.125 µg של vH ו 0.125 µg של וקטורים לביטוי vL לתוך µL 10 מ מ 150 NaCl. מערבולת כל דילול 10 s.
      2. להוסיף 10 µL מדולל DNA תרביות תאים ריאגנט הפתרון DNA µL 10. מערבולת 15 s דגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להוסיף את תערובת 20 µL drop-wise על תאים 293A ומערבבים על ידי מתערבל בעדינות את הצלחת.
    3. החלף את ה 16 בינוני לאחר תרביות תאים ותאים תרבות במשך 5 ימים ללא סרום בינוני.
      הערה: השתמש בינונית ללא סרום כדי להימנע סרום Igs שמזהם את הנוגדנים המיוצרים.
    4. לחסל תאים ופסולת על ידי צנטריפוגה ב g x 460 במשך 5 דקות.
    5. קציר supernatants על ידי השאיפה עם ערוץ מרובה פיפטה, להעביר אותם לתוך צלחת V-התחתון 96-ובכן.
    6. המעיל Ag רלוונטיים בין לילה ב 4 ° C ב- µL 100 לכל טוב של ציפוי אליסה/ELISPOT משוקם מאגר 1 x-ריכוז הסופי של µg/mL 2 ב 96-ובכן חומרי ניקוי. ראה דוגמאות ב 9.
    7. וולס בלוק 10% FBS DMEM בינונית עבור 2 h ב 37 ° C
    8. להוסיף 50 µL של supernatants של תאים transfected 293A מהשלב 6.1.5 ולאחר תקופת דגירה של 2 h-RT.
    9. להוסיף 100 µL של אנטי-אדם Ab אג מצומדת חזרת אנזים peroxidase (HRP) ב 1 µg/mL, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר. הוסף µL 50 הדפסות כסף המצע (שוייץ) ולאחר תקופת דגירה של 20 דקות.
    10. לקרוא את צפיפות אופטית-450 nm ב ספקטרופוטומטרים.
      הערה: mAbs ספציפית על ידי אליסה assay יכול להיות מיוצר עוד ב בקנה מידה גדול, מטוהרת על חלבונים עמודה בהצגת חיבה אנושית IgG.
  2. ייצור בקנה מידה גדול, טיהור של mAbs ספציפיים
    1. שלשום תרביות תאים, זרע 6 x 106 האדם מתחלקים כליות 293A (HEK 293A) תאים לתוך 175 ס' ' מ2 בקבוקונים המכילים 25 מ ל DMEM בתוספת 10% FBS. דגירה בין לילה בחממה2 CO (5% CO2) ב- 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: תאים צריך להיות 70% confluent כאשר transfected.
    2. Cotransfect 293A תאים DMEM בינוני המכיל 10% FBS באמצעות נגזרת polyethylenimine ליניארית כמו ריאגנט תרביות תאים.
      1. לדלל 50 µL של ה-DNA תרביות תאים ריאגנט לתוך µL 450 של 150 מ מ NaCl. לדלל 10 µg של vH ו 10 µg של וקטורים לביטוי vL לתוך µL 500 של 150 מ מ NaCl. מערבולת 10 s לכל דילול.
      2. להוסיף ריאגנט מדוללת של תרביות תאים DNA פתרון ה-DNA. מערבולת 15 s דגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להוסיף את תערובת 1 מ"ל drop-wise לתאים ומערבבים על ידי מתערבל בעדינות את הבקבוק.
    3. החלף את ה 16 בינוני לאחר תרביות תאים ותאים תרבות במשך 5 ימים ללא סרום בינוני.
    4. קציר בינוני על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה 25-mL.
    5. לחסל תאים ופסולת על ידי צנטריפוגה ב g x 460 במשך 5 דקות.
    6. לטהר את הנוגדנים משתמש בעמודה 1 מ"ל מצופה עם חלבון א' במערכת כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) חלבון מהיר ב 4 º C.
      1. Equilibrate החלבון עמודה sepharose עם 20 מ מ פוספט מאגר (pH 7).
      2. לסנן התרבות התא האמצעי 6.2.5 באמצעות מיקרומטר 1.22 מסנן ולאחר מכן מסנן 0.45 מיקרומטר.
      3. לטעון את המדיום המסונן אל העמודה.
      4. לשטוף עם מאגר פוספט 20 מ מ (pH 7), elute עם מאגר ציטראט 0.1 M (pH 3.5).
      5. לקרוא את צפיפות אופטית-280 ננומטר על ספקטרופוטומטרים הקליטה ומיד לנטרל המכילים חלבון שברים עם טריס מ' 1 מאגר (pH 9).
    7. Dialyze אלב מטוהרים בין לילה ב 4 ° C בקסטה עם משקל מולקולרי 3.5K הקיצוץ נגד המאגר PBS (pH 7.4).
    8. לחטא על ידי 0.2 µm סינון ובקרה טוהר על ידי גודל-הדרה כרומטוגרפיה, כפי שצוין על ידי היצרן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

החל מ- PBMC מתורמים מאוד בריאים, זה פרויקט המתנות הדור של האדם mAbs, אשר מזהה את פפטיד Pp65495 (Pp65, מן האדם cytomegalovirus) שהוצגו על-ידי המחלקה מורכבת histocompatibility הגדולות אני (MHC-אני) מולקולה (הלע - A * 0201 HLA-A2). MAbs אלה יכול להפלות בין מתחם, מתחמי המייצג אחרים פפטידים מועמסים על MHC אותו זה-אני מולקולה.

PBMC היו מוכתמים הלע-A2/Pp65-PE הלע-A2/Pp65-APC, הלע-A2/MelA2-BV421 tetramers כמפורט בפרוטוקול לעיל. לאחר immunomagnetic תא העשרה של תאים חיוביים PE - ו APC-tetramer, התאים eluted היו מוכתמים mAbs נוספים. ב סדרן התא cytometry זרימה, דיסקות מועשר התאים היו מגודרת קודם על CD14 קיימא–CD16–CD3–CD19+ ללבישה (ב תאים). איור 1 מציג האסטרטגיה המגביל המשמש בידוד תאי B לבטא BCRs להפלות בין הלע-A2/Pp65 ושאר מסוגל הקשורים מתחמי הלע-A2/פפטיד. הבחירה של תאים B עניין בוצעה לאחר gating הלע-A2/Pp65 PE+ , הלע-A2/Pp65 APC+ כפול-חיוביים, כדי לא לכלול תאים B ספציפיים fluorochrome זה היו מוכתמים ביחידים PE+ או APC+. לבסוף, בתאי B ספציפי מאוד זוהו על ידי gating בתאי שלילי הלע-A2/MelA2-BV421. פעולה זו מאפשרת זיהוי תאים B לבטא BCRs מסוגל לקשור הלע-A2/Pp65, פפטיד, באופן תלוי-A2-הלע, להפלות בין תאים B אלה מאלה המבוימים נגד β2 microglobulin, ביוטין, הלע-A2 או אלה אשר לא מפלים. בין פפטידים החריץ איגוד MHC. כל התאים האחרונים האלה יהיו תאים חיובי BV421. כפי שמוצג בעבר תיעד נוסף עם סוגים אחרים של Ag, אסטרטגיה הדרה זו חשובה יותר עקב עליות ויכולת שמסווגת של תאי B עבור Ag9.

ברגע תאים B ספציפיים בודדים היו ממוין, cDNAs קידוד עבור כבד ואור Ig-שרשראות היו מוגבר על ידי RT-PCR. זוגות של שרשרת כבד וקל קידוד מקטעי התקבלו אצל כ-50% B תאים בודדים נבדקו (טבלה 1). תחום משתנה רצפים היו אז משובטים לתוך ביטוי המומנט המכיל רצפי מתמדת בתחום המתאים (כבד מתמיד 1 וקל מתמיד κ או λ). תאי הכליה עובריים אנושיים (HEK, תאים 293A) היו cotransfected עם שרשרת כבד וקל וקטורים. MAbs מופרשים של IgG1 isotype היו שנקטפו supernatants התרבות של תאים 293A 5 ימים לאחר תרביות תאים (ראה איור 3 אסטרטגיה גלובלית של ייצור mAbs אנושית לחלוטין). זה בהצלחה מיוצר אחד הלע-A2/Pp65 ספציפי נוגדן החל מ- 3 תאים לימפוציטים B אחד מניב זוגות של שרשרת כבד וקל קידוד מקטעים (טבלה 1). אליסה מבחני הראו בבירור כי mAb הזה היתה לשני MHC-פפטיד ותלוי עבור שלה מחייב מתחמי הלע-A2/Pp65 (איור 4A), מספר מיליגרם mAb הופקו בקלות לניתוח נוסף (למשל, זיקה ניתוחים, מבחני תפקודית). שלו זיקה מחייבת, נקבע על ידי תהודה פלזמון משטח (SPR), היה לגבי 7 x 10-6 מ' (איור 4B).

לכן, מאמר זה מתאר שילוב של שיטות רגיש ויעיל המאפשר זיהוי i) של תאים ספציפיים Ag B הרלוונטיים, אפילו כאשר הן בתדרים נמוכים מאוד הדם של תורמים בריא, ii) הדור של mAbs האנושי שמסווגת מאוד.

Figure 1
איור 1: הזיהוי של תאים B ספציפיים הלע-A2/Pp65 מן האדם PBMC.
3 x 108 PBMC היו מוכתמים הלע-A2/Pp65-PE הלע-A2/Pp65-APC, הלע-A2/MelA2-BV421 tetramers. לאחר immunomagnetic תא העשרה של תאים חיוביים PE - ו APC-tetramer, התאים eluted היו מוכתמים mAbs נוספים. ב סדרן התא cytometry זרימה, התאים היו מגודרת קודם על גופיה קיימא CD14–CD16– לימפוציטים (לא מוצג), ואז על CD19+CD3 תאים– . לאחר מכן, היו פיקוח בתאי B מוכתם tetramers הלע-A2/Pp65-PE והן הלע-A2/Pp65-APC. Tetramer הלע-A2/מלה-BV421 שימש כדי לא לכלול תאים B לא זיהה הלע-A2/Pp65, פפטיד, באופן תלוי-MHC.

Figure 2
איור 2: אסטרטגיה הגברה, שיבוט של גנים איג. קל וכבד Ig-שרשרת קידוד הגנים היו מוגבר על ידי מקוננים RT-PCR. מותני הראשונה בוצעו עם שילוב של צבעי בסיס קדמי hybridizing ספציפיים עבור אזורים מתמדת של קאפה כבד, האור המתאימה, או שרשראות אור למדא הפוכה תחל והאזור מנהיג. מותני השני בוצעו עם תחל המכיל באתרים מגבלת, תחל ואחורה בהתאמה ספציפית עבור תחילת V מקטעים, סוף J מקטעים. מוצרי ה-PCR היו רציף, מתעכל עם אנזימי הגבלה, משוכפל בוקטורים ביטוי המכיל המתאים תחומים מתמדת. CMV: cytomegalovirus מקדם; AmpR:. ג'ין עבור אמפיצילין התנגדות.

Figure 3
איור 3: האסטרטגיה הכוללת של שחזור של recombinant mAbs האנושי.
אסטרטגיה מיון המבוסס על tetramer מאפשר זיהוי של תאים B עניין. בתאי B ספציפי מאוד היו החד-תאיים ממוינים. קל וכבד Ig-שרשרת קידוד קטעים היו מוגבר באמצעות RT-PCR. תחום משתנה רצפים היו משובטים לתוך וקטורים ביטוי האיקריוטים נפרד במסגרת הגן מקטעים קידוד קבוע אזורים קל וכבד. MAbs אנושית לחלוטין המתאימים היו לידי transiently transfected תאים 293A HEK וטיהרו מתרבות supernatant. איור זה היה שונה. Ouisse et al. (2017) 9.

Figure 4

איור 4: אפיון mAb שמסווגת מאוד ייצוגית נגד הלע-A2/Pp65 המופקים דם היקפיים אנושי במחזור בתאי B.
A) יחודיות של mAb PC1.02 נגד הלע-A2/Pp65 נבדק על ידי אליסה. הצלחות היו מצופים הרלוונטיים (הלע-A2/Pp65) או לא רלוונטי מתחמי הלע-A2 המכיל פפטידים הלע-A2-מוגבלת: מלה, NS3 (בזכות-1), ו- GagP17 (HIV-1) 2 µg/mL, mAb PC1.02 נוספה, ועל אדם אנטי איג-HRP Ab שימש לצורך זיהוי. צפיפות אופטית (OD) היו בסדום 450 ננומטר. B) קביעת זיקה mAb PC1.02 באמצעות תהודה פלזמון השטח (SPR) הזורם ריכוזים שונים של מתחמי הלע-A2/Pp65 על mAb שבב מכורך CM5. איור זה היה שונה. Ouisse et al. (2017) 9.

מספר PBMC מספר התאים PE + APC + לאחר העשרה מספר התאים נשלל (BV421 +) מספר תאים בודדים ממוינים מספר בארות שנותחה מספר בארות עם HC ו- LC הקשורים (% התאוששות) מספר mAbs המיוצר מספר של מסוים mAbs
הלע-A2/Pp65 mAb (PC1.02) 3 x 108 818 117 161 7 3 (43%) 3 1

טבלה 1: ניתוח של תאים ספציפיים הלע-A2/Pp65 B.
ההשפעה של האסטרטגיה אי-הכללה של תאי B לא ספציפי, התשואות של Ig ג'ין הגברה וייצור mAb מתאי מבודד הלע-A2/Pp65 ספציפי B היו מוערכים/נמדד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המוצע היא שיטה חזקה לדור של mAbs האנושי ישירות מתאי B הספציפיים Ag במחזור הדם. היא משלבת שלושה היבטים חשובים: (i) שימוש tetramer-הקשורים מגנטי העשרה, המאפשרת בידוד שמחוץ תאי B Ag מחייב אפילו נדיר; (ii) אסטרטגיה המגביל המשתמשת שלושה Ag tetramers (שני רלבנטיות, אחד לא רלוונטי) מתויג עם שלושה fluorochromes שונים כדי לבודד, מאת cytometry זרימה, רק בתאי B ביטוי מסוים BCR עבור התובע הכללי הרצוי; (iii) מחדש של רקומביננטי התואם mAb cDNAs מאת RT-PCR-הסינגל התא רמת ביטוי cDNAs בתאים אנושיים.

מחקרים קודמים הציע באמצעות אחד או שניים אנטיגנים הרלוונטיים פלורסנט לסמן תאים אנושיים B לפני המיון ובעקבות הייצור של mAbs מבודדת B תאים6,7,8. אחת ניתוח בחולים עם דלקת מפרקים שגרונית, ואחד במודל עכבר אוטואימונית, משויכות אנטיגן פלורסנט לא רלוונטי לאפיין בתאי B autoreactive ולקבוע שלהם תדירות10,11. עד כמה שידוע לנו, להשתמש בשילוב של שני פלורסנט אנטיגן רלוונטי tetramers, אחד tetramer אנטיגן לא רלוונטי לא תואר בעבר העשרה של תאים ספציפיים B לפני השימוש בהם לייצור mAbs אנושית לחלוטין. שיטה זו ממוטבת מאפשר mAbs שמסווגת אנושית לחלוטין ואפשר להשיג מעט ככל בחודש, וכן ניתן לבצע בהצלחה גם כאשר החל מרפרטואר תא B נאיבי. כך, שאין לו תשובה החסרונות העיקריים של phage תצוגה, immortalization תא B האנושי, או השני שתואר קודם לכן הליכי שיקום mAb מבוססי ביולוגיה מולקולרית.

תא זה מיון אסטרטגיה תוצאות החלמה תשואה גבוהה של mAbs אנושי ספציפי Ag. זוגות של מקטעי רשת קל מתאי B יחידה מבודדת הם מוגבר עם שיעור הצלחה של-50%. שרשרת אור מקטעים הם כמעט תמיד מוגבר, אבל זה לא המקרה עבור פלחי שרשרת כבדה. יעילות RT-PCR תלוי בכבדות לכבד את הנקודות הבאות: אני) ממוינת יחידה B תאים בוודאי קופא מהר ככל האפשר; ii) הוספת 30 יחידות של מעכב RNase וצמצום הזמן בין נטילת בתאי B מהמקפיא משיקה את התגובה RT; iii) מפשיר תחל כל על הקרח; iv) לא הקפאה \ הפשרה תחל יותר משלוש פעמים; v) גרב תחל לכל היותר שנה אחת.

לגבי יעילות הייצור mAbs רקומביננטי המתאים עם יחודיות הרצויה, זה כ- 30-40% מן pMHC mAbs ספציפיים. אלה mAbs מסוים יש לזהות את פפטיד והן מולקולת MHC, אשר די תובעניים, לנו בעבר הראו כי התשואה הכוללת של התאוששות של mAbs ספציפי נגד אנטיגנים קונבנציונליים יותר עליון, עד ל- 100% עבור Β-galactosidase אנטיגן9. זה חייב להיות הדגיש מבחר Ag המתאים עבור tetramer לא רלוונטי מה שחשוב להגדיל את ייחודה של mAbs מיוצר.

זיקתו של mAb אנטי-הלע-A2/Pp65 (PC1.02) המתוארת במאמר הנוכחי הוא נמוך יחסית, על 7 x 10-6 מ', הדומה בזיקה של TCR. תוצאה זו היה צפוי, כמו תא B הבידוד בוצע מתורמים תמימים. רוב התאים B tetramer+ היו IgM+IgG-, אשר מקטין את ההסתברות להשגת ממוצע טוב Ag-קלסרים. יחד עם זאת, שיטה זו באפשרותך גם להפוך אפשרי המיון cross-reactive זיכרון B תאים נגד Ag הרצוי מתורמים תמימים, בגלל העבר אימונולוגי של יחידים12. יתר על כן, שיטה זו ישימה בקלות לחסן או נגועים המטופלים או לחסן חיות humanized, כמתואר ב- 9, איפה ויוו זיקה ההבשלה יכול להגדיל את זיקתו של mAbs שנוצר כדי 1 x 10 כ-9 מ' שונים נהלים תוארו גם לשפר את זיקתו של mAbs במבחנה, במיוחד דרך להתרבות היפרמוטציה בתאים המבטאים הנוגדן (נבדקה 13).

לסיכום, אנו מציעים אסטרטגיה רב תכליתי עבור ייצור mAbs מאוד שמסווגת שיכול לשמש בסוגים שונים של המצב, נאיבי הפרט תורם לחסן או מטופל סובל מחלה אוטואימונית. MAbs אנושית לחלוטין שנוצר באופן זה נגד epitope הרצויה יכול להיות שימושי גם מחקר בסיסי וגם חיסוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים המתקן Cytometry "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, נאנט) לקבלת סיוע טכני מומחה. אנו מודים גם כל הצוות של ייצור חלבון רקומביננטי (P2R) ושל ההשפעה פלטפורמות (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, נאנט) לתמיכה טכנית שלהם. אנו מודים עמנואל Scotet, ריצ'רד Breathnach להערות בונה על כתב היד. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי הפרויקט IHU-צ'סטי במימון התכנית ממשלת צרפת «Investissements d'Avenir», מנוהל על ידי הצרפתי הלאומי מחקר סוכנות (ANR) (ANR-10-IBHU-005). פרויקט IHU-צ'סטי נתמך גם על ידי נאנט Métropole Région פיי דה לה לואר. עבודה זו מומש בהקשר של התוכנית LabEX IGO הנתמך על-ידי הסוכנות מחקר לאומי באמצעות ההשקעה של התוכנית בעתיד ANR-11-LABX-0016-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK 293A cell line Thermo Fisher scientific R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by life technologies 21969-035 (+) 4,5g/L D-Glucose
0,11g/L Sodium Pyruvate
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X) Gibco by life technologies 31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA) PAA K45-001
Nutridoma-SP Roche 11011375001 100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 Ambion AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 Invitrogen by Life Technologies 15575-020
Fetal Bovine serum (FBS) Dominique Dutscher S1810-500
Ficoll - lymphocytes separation medium EuroBio CMSMSL01-01 density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate Invitrogen by Life Technologies S21388 premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate Invitrogen by thermoFisher scientific S32362 1mg/ml
2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin Biolegend 405225 conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor Miltenyi Biotec 130-042-302/130-090-976
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
CD3 BV510 BD horizon BD Pharmingen / BD Biosciences 563109 Used dilution 1:20
CD19 FITC BD Pharmingen / BD Biosciences 345788 Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 561116 Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 338440 Used dilution 1:50
7AAD BD Pharmingen / BD Biosciences 51-68981E (559925) Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer BD Biosciences
8-strip PCR tubes Axygen 321-10-061
Racks for 96 microtubes Dominique Dutscher 45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) Invitrogen by thermoFisher scientific 10777-019 qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free Gibco 10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer New England BioLabs S1316S 5.0 A260unit
Random hexamers Invitrogen by thermoFisher scientific N8080127 qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen by thermoFisher scientific 18080-044 qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase Promega M7805
dNTP Set, Molecular biology grade Thermo Scientific R0182 4*100umol
5LVH1 Eurofins ACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH3 Eurofins AAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVL4_6 Eurofins CCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH5 Eurofins CAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
3HuIgG_const_anti Eurofins TCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1 Eurofins GGGAATTCTCACA
GGAGACGA		 First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG		 Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2 Eurofins ATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk3 Eurofins CTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk4 Eurofins ATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566 Eurofins GTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		 First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5 Eurofins GCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC		 Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'LVl1 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl2 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl3 Eurofins GCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5 Eurofins GGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl6 Eurofins GTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl7 Eurofins GGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5LVl8 Eurofins GAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
3'Cl Eurofins CACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		 First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3 Eurofins CTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5 Eurofins CTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6 Eurofins CTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8 Eurofins CTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
3'XhoICl Eurofins CTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		 Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense Eurofins GCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		 Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade MP Bio AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate Macherey Nagel 743.100.100
Enzyme Age I HF New England Biolabs R3552L 20000U/ml
Enzyme SalI HF New England Biolabs R3138L 20000U/ml
Enzyme Xho I New England Biolabs R0146L 20000U/ml
Enzyme BSIWI New England Biolabs R0553L 10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase Invitrogen by thermoFisher scientific 15224.017 100U (1U/ul)
2X YT medium Sigma Aldrich Y1003-500ML
Ampicillin Sigma Aldrich 10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification Macherey Nagel 740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent PolyPlus 101-40
Flat bottom96-well plate Falcon 353072
V-bottom 96-well plate Nunc/Thermofisher 055142
Nunc easy 175 cm2 flasks Nunc/Thermofisher 12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer eBiosciences 00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates Nunc/Thermofisher 44-2404-21 high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) BD Pharmingen / BD Biosciences 55788
TMB substrate BD Biosciences 555214
Streptavidin Sigma S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column GE Healthcare 17-0402-01
ÄKTA FPLC GE Healthcare 18190026
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System BioRad 7880003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
  7. Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532 (2011).
  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
  9. Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3 (2017).
  10. Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
  11. Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
  12. Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
  13. Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).

Tags

אימונולוגיה גיליון 132 אימונולוגיה ביולוגיה תאית נוגדנים אנושיים תא B tetramer cytometry זרימה תא בודד העשרה אנטיגן ספציפי מגנטי

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes, Nantes, France

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devilder, M. C., Moyon, M.,… More

Devilder, M. C., Moyon, M., Saulquin, X., Gautreau-Rolland, L. Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood. J. Vis. Exp. (132), e56508, doi:10.3791/56508 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter