Summary
Ce protocole décrit une analyse inversée invasion verticale qui pourrait être utilisée pour quantifier les capacités de migration et invasion des cellules dans un décor en trois dimensions tout en préservant le microenvironnement cellulaire. Ce dosage est adapté aux cellules rares et/ou sensibles.
Abstract
Bien que les analyses d’invasion 3D ont été développés, le défi demeure pour étudier les cellules sans affecter l’intégrité de leur microenvironnement. Des analyses de 3D traditionnelles telles que la chambre de Boyden exigent que les cellules sont déplacées de l’emplacement original de la culture et déplacés à un nouvel environnement. Non seulement cela perturbe les processus cellulaires qui sont intrinsèques au microenvironnement, mais il se traduit souvent par une perte de cellules. Ces problèmes sont particulièrement difficiles lorsqu’il s’agit des cellules qui sont soit rares, soit extrêmement sensible de leur microenvironnement. Nous décrivons ici le développement d’un test 3D invasion qui évite les deux préoccupations. Dans ce test, les cellules sont bien plaquées au sein d’un petit et une matrice de ECM contenant un facteur chimiotactique est dressée au sommet des cellules. Cela ne nécessite aucun déplacement de la cellule et permet aux cellules d’envahir le haut dans la matrice. Dans cet essai, invasion des cellules ainsi que la morphologie des cellules peut être évaluée dans le gel de collagène. À l’aide de ce test, nous caractérisons les capacités invasives des cellules rares et sensibles ; les cellules hybrides résultant de la fusion entre les cellules de cancer du sein MCF7 et mésenchymateuses/multipotentes tige/stroma cells (MSCs).
Introduction
Motilité cellulaire est un processus normal de développement et physiologique des cellules. Cependant, des changements dans le modèle et la capacité des cellules de migrer et d’envahir sont associées à certaines pathologies incluant les maladies inflammatoires et métastases de cancer1,2,3. Métastase est sans doute l’aspect le plus mal compris dans le cancer. Pour métastases, les cellules cancéreuses doivent dégrader la matrice extracellulaire (ECM), envahissent le tissu local et intravasate. Une fois en circulation, les cellules cancéreuses diffusera sur le site distant, extravasate et forment des tumeurs secondaires. Par conséquent, la capacité des cellules à dégrader l’ECM, à migrer et à envahir sont lié à leur potentiel métastatique. Différentes approches ont été développées pour analyser et quantifier les capacités de migration et d’invasion des cellules. Les approches les plus utilisées incluent la cicatrisation de dosage, Time-lapse microscopie et le dosage de chambre de Boyden. La plaie guérison dosage4 temps déchéance microscopie et sont simples et pratiques des dosages qui donneraient un aperçu préliminaire de la migration cellulaire. Cependant, les deux sont les tests 2D qui ne reflètent pas l’environnement 3D dans lequel les cellules existent en vivo. Des études ont montré que les cellules réagissent différemment à un environnement en 3D par rapport à une 2D5,6. De plus, essais guérison de la plaie sont difficiles à reproduire et à produire des résultats quantitatifs7,8,9. L’analyse de la Zone d’Exclusion de cellule, qui est une modification 3D du dosage de la cicatrisation, est un dosage plus physiologiquement pertinent, mais il n’est pas adapté pour les piles faibles en nombre comme les cellules hybrides résultant de cellule fusion événements10,11 .
Le dosage de chambre de Boyden est un dosage 3-dimensional prévoyant des micro-environnements pertinentes études cellulaires. Cependant, elle nécessite des cellules à déposer dans la chambre supérieure du système de dosage Boyden de migrer et d’envahir le bas vers le milieu contenant du facteur chimiotactique et être retirés de leur microenvironnement original. Cette approche 3D n’est pas appropriée dans l’analyse de la capacité de migration et invasion des cellules, susceptibles de leur microenvironnement et/ou limitée en numéro10,11,12. Une nouvelle approche pour analyser l’invasion et la migration cellulaire est la microfluidique chambre dégradé dosage13. Bien qu’adapté et fiable dans les études de migration et d’invasion, ce dosage est plus cher et pourrait être techniquement difficile pour un laboratoire typique. Nous décrivons ici un essai simple invasion verticale inversée qui est compatible avec plusieurs types de cellules dont les cellules sensibles à leur microenvironnement et/ou restreints en nombre. Ce test est une adaptation du protocole proposé par Hooper et al. 14. dans ce test, les cellules demeurent dans leur migration et leur microenvironnement original et invasion est surveillée comme ils se déplacent vers le haut dans le gel de collagène contenant un facteur chimiotactique11. Ce dosage est reproductible et a été optimisé et validé dans la boîte de Petri de 35 mm. Il pourrait être adapté aux conditions de dosage différents y compris les tailles de culture de cellules différentes, différentes matrices ou force d’adhérence et chimioattractants différents. Ce test pourrait constituer une plateforme in vitro pour la présélection dans le processus de découverte de médicaments.
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Protocol
Remarque : Ce protocole est décrit dans McArdle et al. 11. une chronologie est fournie à la Figure 1.
1. préparation de la plaque de culture
- Laver le 35 mm boîte de Petri contenant un fond en verre 10 mm avec 1 mL de 1 M d’acide chlorhydrique (HCl) pendant 15 min abaisser l’hydrophobicité du verre-fond.
- Laver la plaque de culture deux fois avec 1 mL de solution saline tampon phosphate (PBS) de se débarrasser de tous le HCl.
- Laver la plaque de culture deux fois avec 1 mL d’éthanol à 70 %.
- Rincez la plaque de culture avec 1 mL de milieu de culture cellulaire spécifique (ici, utilisation α-MEM additionné de 10 % de chaleur inactivé SVF et 1 % des acides aminés non essentiels).
Remarque : La plaque de culture traitée contenant le milieu de culture peut être stockée dans un incubateur à CO2 avec un humidificateur d’air à 37 ° C jusqu’au lendemain. - Cultiver les cellules (MSCs et co-culture de MCF-7) dans le fond en verre traité bien de la boîte de Petri de 35mm à la confluence de 100 %. Co-culture 35 000 cellules MSC et 75 000 des cellules MCF7 pendant 24 h.
2. préparation du gel collagène
- Stocker les pointes de micropipette utilisés pour le pipetage le gel de collagène dans le congélateur pour empêcher la polymérisation du collagène au contact.
Remarque : C’est l’étape la plus critique. - Déterminer un volume de collagène de queue de rat j’ai à utiliser selon la concentration de l’encours de collagène. Préparer 100 µL de gel de collagène avec ce test.
Remarque : Forte concentration de collagène de queue de rat que je stock fonctionne mieux. Déterminer le volume de 10 x moyen de l’aigle de la modification de Dulbecco à utiliser pour diluer le collagène en conséquence. - Combiner le collagène de glace rat queue j’ai (3,8 µg/mL de bouillon), de l’aigle de la modification de 10 x Dulbecco moyen et 1 milieu de culture cellulaire x additionné de sérum de veau fœtal 2 % et le chimioattractant approprié à une concentration finale de collagène de 2,4 mg/mL.
- Ajouter au mélange 4.5 % de solution de bicarbonate de sodium pour neutraliser le gel de collagène.
Remarque : Le volume de solution de bicarbonate de soude ajoutée peut varier en fonction du pH exact des autres réactifs. Il est préférable de tester le mélange avec des bandelettes de pH pour assurer une solution neutre, ou utiliser un indicateur de pH dans le milieu de culture. - Déposez 80 µL du mélange collagène sur des cellules dans le fond en verre bien de la boîte de Pétri.
- Permettre le gel de collagène à polymériser pendant 30 min dans un incubateur à CO2 avec un humidificateur d’air à 37 ° C.
- Recouvrir le gel de collagène avec 2 mL de milieu cellulaire avec sérum réduit (2 %) et incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 avec un humidificateur pour 24, 48 ou 72 h.
Mise en garde : La plaque doit être manipulée avec soin pour empêcher le gel de collagène de détacher le fond de verre.
3. exemple de préparation de collagène gel à l’aide d’un stock de collagène de queue de rat de 3,8 µg/ml
- Sur la glace, mélanger 114,5 µL de collagène de queue de rat, 16,6 µL de 10 x DMEM et 33,1 µL de milieu de culture contenant le facteur chimiotactique.
- Neutraliser le mélange collagène avec 14,0 µL de bicarbonate de sodium.
- Continuer comme au point 2.5.
4. imagerie des cellules
- Retirez doucement le support du plat.
- Rincer doucement le gel avec 1 mL de PBS.
- Fixer les cellules avec 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min.
- Laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS.
- Colorer les cellules avec solution DAPI (100 ng/mL) pendant 20 min à température ambiante.
- Les cellules à l’aide d’un microscope confocal à différents endroits et prenant 400 µm z-empiler les images de chaque emplacement de 16 µm de l’image. Le microscope utilisé possède un disque unité qui permet l’imagerie confocale utilisant une lumière blanche, source d’excitation arc de numérisation. Utiliser une lentille X 20 utilisé avec une ouverture numérique de 0,75.
- Reconstituer les images.
- Ouvrez les images pour un gel donné (environ 25 images) et créer une pile d’image en cliquant sur image → piles → des images à empiler. La première image correspond à la partie inférieure du gel (z = 0 µm), la deuxième image correspond à la première étape dans la direction z (z = 16 µm), la troisième image correspond à la deuxième étape dans la direction z (z = 32 µm). Évaluer chaque noyau à chaque profondeur de l’image et désigner la profondeur à laquelle le noyau a été mise au point plus forte comme la profondeur de l’invasion de cette cellule particulière.
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Representative Results
Nous avons utilisé une boîte de Petri de 35 mm avec un verre bas et rat queue collagène I à développer et optimiser une invasion 3D in vitro d’analyse protocole. À l’aide de ce test, nous avons montré ce sein cancéreux MCF7 et CSM cellules pourraient envahir dans le gel de collagène pour une distance moyenne de 0,04 ± 1,8 µm et 41,3 ± 76,0 µm respectivement après 48 h lorsque IGF1 (18,6 ng/mL) a été utilisé comme facteur chimiotactique (Figure 2). Plus important encore, nous avons montré que les produits de fusion des cellules MCF7 et SMC, qui sont des cellules rares, pourraient envahir dans le gel de collagène ainsi. Leur distance moyenne d’invasion en 48 h a été de 10,7 µm ± 12,4 lorsque l’IGF I 18,6 ng/ml a été utilisé comme facteur chimiotactique (Figure 2). La différence dans la capacité d’invasion entre MCF7 et MSCs était statistiquement significative (P < 0,01)11. La différence entre la capacité d’invasion des produits fusion et celui de MCF7 ou MSSC n’était pas statistiquement significative. Cependant, cet essai a montré constamment que les produits de fusion de cellule de cancer avaient une plus grande capacité migratoire et envahissante que les cellules cancéreuses parental MCF7.
Cellules demeurent en bonne santé au cours des expériences, comme en témoigne leur morphologie et la quantité 48 h post gel de polymérisation (Figure 3a). Avec la conception de dosage invasion verticale inversée, la cinétique de la migration cellulaire et l’invasion peut être analysée (Figure 3b, 4) et de la morphologie cellulaire peut être évaluée (Figure 4).
Figure 1 : Chronologie de la conception de dosage inversé invasion verticale S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Capacité d’invasion des produits de fusion des cellules du cancer. La capacité d’invasion des produits de fusion des cellules du cancer peut être déterminée en utilisant l’analyse d’invasion verticale inversée. Les chiffres représentent la capacité moyenne d’invasion de quatre produits de fusion indépendante de trois cultures co séparées et leurs lignées parentales analysées de huit différents domaines au sein de chaque série de tests. Cette expérience a été réalisée en trois exemplaires. Analyse de la variance avec test post-hoc de HSD de Tukey. ** P < 0,01. Barres d’erreur représentent déviation standard (SD). Ce chiffre a été adapté du 11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Cellules viabilité et série Z du dosage invasion verticale inversée.
un) 20 X images de champ lumineux montrant la morphologie des cellules sous le gel de collagène après deux jours. De gauche à droite MCF7 et MSC co-culture MCF7 et MSC ; b) représentation de série z, montrant les deux lieux (i et ii) dans un plat du bas vers le haut. Images successives sont apart 16 µm. 3,8 % FBS a été utilisé comme un facteur chimiotactique. Vert cercles sur les deux panneaux indiquent envahissent les cellules ; Remarque, floue au bas du gel et mise au point dans le haut du gel, envahissant dans le gel. Les cercles rouges sur les deux panneaux indiquent les cellules restantes à la couche inférieure de la série z (non-invasion des cellules). Barre d’échelle (a) : 15 µm ; L’échelle bar (b) : 10 µm. Ce chiffre a été adapté du 11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Cellule morphologie dans le test d’invasion verticale inversée. Morphologie de MSCs dans le gel de collagène à un endroit du bas (Z = 0 µm) le z = 20 µm. 3,8 % FBS a été utilisé comme un facteur chimiotactique. La longue flèche indique l’appendice d’une invasion de MSC dans le gel. La flèche indique une maîtrise ès sciences, qui est alignée le long du bas du gel et pas envahissant. Le bleu montre la tache DAPI nucléaire tandis que le rouge indique les filaments d’actine phalloïdine colorée. Ce chiffre a été adapté du 11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous décrivons ici un essai simple invasion verticale inversée qui est commode pour divers types de cellules dont les cellules qui sont rares et dépendent de leur microenvironnement. Dans ce test 3D invasion, les cellules restent dans leur microenvironnement original et sont couverts par le gel de collagène contenant un facteur chimiotactique. Ensuite, les cellules migrent et envahissent dans le collagène. Dans ce test, les cellules peuvent être teintés et facilement surveiller le gel. La simplicité et la reproductibilité de ce dosage en fait un outil commode pour l’étude de la migration des cellules du cancer et invasion dans un système 3D. Cependant, forts chimioattractants semblent être nécessaires pour briser l’affinité de la cellule vers le bas de la boîte de Pétri.
Nous avons optimisé le dosage d’invasion verticale inversée dans la boîte de Petri de 35 mm. Cette boîte de Petri a un fond en verre 10 mm bien qui est bien équipé pour l’imagerie. Une des limites de cette boîte de Petri sont le gel de collagène requis pour effectuer un test considérable. Conclusion plus petits récipients de culture avec un design compatible avec l’imagerie serait plus économiques. La couche de gel appropriée pour la conception de plat de 35 mm est très délicate en raison de sa force et peut facilement se détacher du fond de la plaque si elle n’est pas manipulé avec soin. Une conception de la culture de cellule différente peut améliorer la stabilité de la couche de gel de collagène, mais la compatibilité entre la viabilité de force et de la cellule de gel de collagène doit être optimisée.
Malgré ces limites, le dosage d’invasion verticale inversée présente de nombreux avantages par rapport aux autres formats de test 3D invasion. Le principal avantage est que les cellules restent dans leur milieu de culture original, qui n’est pas le cas dans le dosage de chambre de Boyden. Ce protocole préserve le microenvironnement cellulaire qui est avantageux pour les cellules rigoureusement contrôlées par leur microenvironnement tels que les cellules souches,15. Ce dosage empêche également les dommages cellulaires ou la perte de cellules en particulier pour les cellules qui sont délicates ou rare10,11. En outre, avec ce test, la morphologie des cellules et la cinétique associée à peuvent être évalués dans le gel, ce qui n’est pas possible avec le test de chambre de Boyden. En outre, le non physiologique en polycarbonate ou polypropylène filtre du système de dosage Boyden chambre n’est pas utilisé dans le test d’invasion verticale inversée. L’essai d’invasion verticale inversée est une conception statique, il n’imite pas l’in vivo environnement dynamique qui offre la conception de dosage microfluidique invasion mais il fournit une plus simple, moins l’environnement 3D provocant et rentable pour quantifier migration et invasion d’une variété de types de cellules dans un micro-environnement préservé et contrôlé.
Le dosage d’invasion verticale inversée a de nombreuses applications potentielles dans les études physiopathologiques. Cette approche pourrait servir comme une plate-forme in vitro pour l’étude de la motilité cellulaire durant le développement embryonnaire, plaie guérison et/ou réponses inflammatoires3. Interaction de cellule avec l’ECM et autres types de cellules au cours de la migration et invasion pourrait également être étudiée en utilisant ce protocole. Ce test pourrait également représenter un outil utile pour le dépistage des drogues initiale des médicaments anti-métastatiques. Un système modèle de métastases cancéreuses de certains organes pourrait être développé en utilisant le test inversé invasion verticale aussi bien.
Le test inversé invasion verticale a été développé afin de contourner le défi que le déplacement de certaines cellules de leur microenvironnement originale présente dans le système de dosage de chambre de Boyden. Ce test est simple, fiable et reproductible ; Il est flexible et peut être utilisé pour quantifier le potentiel invasif d’une grande variété de types de cellules, y compris les types de cellules sensibles et rare. Ce dosage peut être appliqué pour détecter l’activité migrateur liée à la dégradation de la matrice et peut s’adapter pour étudier l’activité dégradante sélective sur des substrats de matrice différente.
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Disclosures
Les auteurs ont déclaré qu’aucun intérêt concurrent n’existe.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) par l’intermédiaire de la Royal Canadian Military Institute-Centre hygiène Jackson State University et l’US Department of Defense, Idea Award 11-1-0205.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
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