Summary
Det här protokollet beskriver en metod för photoconversion av Kaede fluorescerande protein i endokardiella celler levande zebrafiskar embryo som möjliggör spårning av endokardiella celler under atrioventrikulär kanal och atrioventrikulärt hjärtat ventil utveckling .
Abstract
Under embryogenes, celler genomgår dynamiska förändringar i cell beteende och dechiffrera cellulära logiken bakom dessa förändringar är ett grundläggande mål i fältet i utvecklingsbiologi. Upptäckten och utvecklingen av photoconvertible proteiner har kraftigt hjälpt vår förståelse av dessa dynamiska förändringar genom att tillhandahålla en metod för att optiskt markera celler och vävnader. Dock även photoconversion, time-lapse mikroskopi och efterföljande bildanalys har visat sig vara mycket framgångsrik i avslöjande cellulära dynamik i organ såsom hjärnan eller ögat, används detta tillvägagångssätt inte i allmänhet i utvecklingsländer hjärtat beror på utmaningar som den snabba rörelsen av hjärtat under hjärt cykeln. Detta protokoll består av två delar. Den första delen beskriver en metod för photoconverting och därefter spårning endokardiella celler (hormonstörande ämnen) under zebrafiskar atrioventrikulär kanal (AVC) och atrioventrikulärt hjärtat ventil utveckling. Metoden innebär att temporally stoppa hjärtat med en drog för korrekt photoconversion att äga rum. Hjärtan är tillåtna att återuppta stryk vid avlägsnande av drogen och embryonal utveckling fortsätter normalt tills hjärtat stoppas igen för högupplöst avbildning av photoconverted hormonstörande ämnen vid en senare tidpunkt utvecklingstoxicitet. Den andra delen av protokollet beskriver en bild analysmetod för att mäta längden på en photoconverted eller icke-photoconverted region i AVC i unga embryon genom att mappa fluorescerande signalen från den tredimensionella strukturen på en tvådimensionell karta . Tillsammans, de två delarna av protokollen som gör att man kan undersöka ursprung och beteende av celler som utgör zebrafiskar AVC och atrioventrikulärt hjärtklaff och potentiellt kan användas för att studera mutanter, morphants eller embryon som har behandlats med reagenser som stör AVC och/eller ventilen utveckling.
Introduction
Zebrafiskar är för närvarande en av de viktigaste ryggradsdjur modellerna att studera cellulära och utvecklande processer i vivo. Detta beror till stor del den zebrafiskar optisk transparens och föredragandens till genetik, vilket gör det en kraftfull modell för att tillämpa optiska tekniker som innefattar genetiskt kodade photoresponsive protein teknik1. Specifika för studiet av hjärtat utveckling, zebrafiskar får tillräckligt med syre via diffusion sådan att även mutanter utan hjärtslag kan överleva genom den första veckan av utveckling, tillåter analyser på effekterna av utvecklingstoxicitet gener och perturbed blodflöde på hjärtat morfogenes inte möjligt i de flesta ryggradsdjur2.
Zebrafiskar hjärtat röret bildas av 24 timmar efter befruktning (hpf). Kort efter dess bildande startar hjärtat röret aktivt slog. Av 36 hpf, en tydlig sammandragning separerar atrium från ventrikeln. Denna region av sammandragning kallas atrioventrikulärt kanalen (AVC), och celler i den här regionen förändringen från en skivepitelcancer morfologi till ett kubiskt morfologi3. Zebrafiskar atrioventrikulärt ventil morfogenes inleds runt 48 h lägga befruktning. Med 5 dagar efter befruktning, två ventilen broschyrer sträcker sig in AVC och förhindra tillbaka flödet av blod från kammare till förmak under hjärt cykel4. Spåra celler under AVC och ventil bildandet är utmanande eftersom den snabba hjärtslag gör det svårt att följa celler via traditionella time-lapse mikroskopi5,6. Detta protokoll, anpassad från springare et al., 20167, beskriver en metod som använder Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 zebrafiskar transgena raden, där det photoconvertible proteinet Kaede är uttryckt i endotelceller, inklusive endocardium. Den drog 2,3-butandion-2-monoxime (BDM) används för att tillfälligt stoppa hjärtat slå, så att korrekt photoconversion av hormonstörande ämnen mellan 36 och 55 hpf och högupplöst avbildning av photoconverted hormonstörande ämnen vid särskilda utvecklingsmässiga tidpunkter. Det har tidigare visat att hormonstörande ämnen photoconverted med den här metoden kan förbli skiljas från sina oomvända grannar för fem dagar eller mer efter tidpunkten för photoconversion7. Detta protokoll också detaljerna en metod som används för bildanalys av photoconverted hormonstörande ämnen i embryon yngre än 48 hpf, som framgångsrikt har använts för att följa vävnad rörelser under AVC utveckling (Boselli et al., i pressen)9. Vi hoppas att läsarna skulle finna detta protokoll användbar för att studera AVC och ventil utveckling i normala embryon, och mutanter, morphants eller drog-behandlade embryon. För en mer allmän protokollet till cell tracking med hjälp av photoconvertible proteiner under zebrafiskar utveckling, vänligen se artikeln av Lombardo et al., 201210.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förbereda formar och montering agaros
- Skapa en mögel med de dimensioner som visas i figur 1 med en 3D-skrivare eller traditionell mekanisk verkstad verktyg.
- Pipettera ca 1,5 mL 1% agaros som smält i en 35 mm plast montering maträtt. Placera plast mögel i den flytande agaros, för att undvika svällning luft mellan mögel och Agarens. Placera skålen vid 4 ° C, vänta tills Agarens hårdnar (detta tar ca 5 min) och sedan ta bort den plast mögel.
- Att lagra montering skålen för senare användning, täck skålen med lock, sedan Linda både skålen och locket tätt med parafilm. Montera skålen kan förvaras sedan locket med datasidan nedåt i upp till 5 dagar vid 4 ° C.
- Förbered i förväg 1 mL portioner av 0,7% låg smältpunkt agaros i 1,5 mL Eppendorf-rör att använda på dagen för montering.
Obs: Agaros brunnarna av montering skålen kommer att deformeras med tiden när vattnet dunstar om parafilm inte radbryts runt rätterna tätt.
2. att erhålla embryon för Photoconversion
- Direktivetgäller Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) linje och växa cirka 200 embryon i embryo medium i mörkret på 28,5 ° C. För mer information om hur du korsa zebrafiskar linjerna, hänvisas till JoVE Science Education Database11.
- Efter 5 h men före 24 h, behandla embryon med 1-fenyl-2-tiourea (PTU) för att förhindra bildning av pigment (0,003% PTU i embryo medium).
- Ca 1 h innan starten av photoconversion, under en fluorescerande stereoskop embryon på skärmen och välj 5 friska embryon som visas att uttrycka den ljusaste gröna fluorescensen. Användning av låg intensitet ljus när visualisera embryon rekommenderas att undvika exponering av embryon för omgivande ljus för att undvika photoconverting Kaede i icke-specifika celler.
3. bädda in
- Förbereda 10 mL montering media: 0,02% tricaine och 50 mM BDM i embryo medium.
- Tillsätt 2 mL av monteringsmedium till montering skålen och låt 15-30 min för att lösningen skall diffunderar in Agarens.
- Smält under tiden en 1 mL alikvot av 0,7% agaros som låg smältpunkt (LMP) genom att placera röret i ett 70 ° C värme i ca 5 min.
- Vänta på LMP Agarens svalna något, sedan lägga 25 µL av 8 mg/mL tricaine lösning och 40 µL 1M BDM lösning till röret av låg smältpunkt agaros. Mix av pipettering upp och ner, sedan överföra röret till en 38 ° C värme block att hålla LMP Agarens i dess flytande form.
- I en Petri maträtt med embryo medium, noggrant dechorionate förväg utvalda embryon under stereomikroskopet med pincett, noga med att inte skada embryon.
- Överföra embryon till en separat skål innehållande 2 mL montering media.
- När hjärtan av embryon stoppas (tar ca 5-10 min), överföring embryon för montering skålen och ordna embryon i brunnarna med pincett så att de ligger i 25 graders vinkel, svansar pekar mot den djupa delen av brunnen, äggula uppåt.
- När embryon är ungefär på plats, ta bort materialet, bädda in embryon i ~ 200 µL 0,7% LMP agaros som innehåller tricaine och BDM och justera embryon positioner, luta embryon för vänster eller höger efter behov.
- Vänta tills LMP agaros uppsättningar (tar ca 5 min), sedan lägga monteringsmedium i skålen. Embryona är nu redo att vara photoconverted.
Obs: Tricaine och BDM används att söva embryona och sluta embryon hjärta, respektive. Montering media kan förberedas dagen innan imaging, men se till att skydda mediet från ljus.
Obs: Den korrekta positioneringen av embryon är viktigt att möjliggöra en tydlig laser sökväg till de celler som man vill efter photoconvert. Placera huvudet av embryot nära starten av brunnen så att laserljus inte behöver resa långt för att nå embryot, och så att embryon kan enkelt omonterade efter photoconversion.
4. Photoconversion
- På en upprätt confocal Mikroskop (som Leica SP8) utrustad med en 405 nm, 488 nm och 561 nm laserkälla, leta upp embryot är hjärtat använder överförbara vitt ljus (brightfield) och en objektiv (som Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0,95 mål). Kontrollera om röd Kaede fluorescens med 561 nm laser (dvs, 561 DPSS laser, på ~ 5% intensitet, detektorn inställd på 589-728 nm). Sedan, visualisera endocardium med 488 nm laser (dvs, 30 mW multiline Argon laser på ~ 5% intensitet, detektorn inställd på 502-556 nm).
- Ange ”FRAP”-läge på mikroskopet förvärv programvara. Välj ~ 1% lasereffekt för båda 488 nm och 561 nm lasrar.
- Fokusera på planet av intresse, Välj en region av intresse (ROI), photoconvert celler med hjälp av de 405 nm dioden laser på 25% lasereffekt, scanning över ROI tre gånger. Bör otillräcklig Kaede photoconverted i ROI, skanna 405 nm laser över området tre gånger igen. Upprepa detta för alla ROIs.
- Återgå till ”TCS SP8” läget på programvara och förvärva en z-stack, använder 561 nm och 488 nm lasrar sekventiellt. Se till att markera alternativet 'dubbelriktad' att öka imaging hastighet.
Obs: Hur lång tid det tar att photoconvert och bild varje embryo varierar. Hjärtslag är känt för att vara viktiga för normala hjärtat ventil utveckling, så undvik att hålla hjärtat stannade för mer än 30 min, även om det innebär att du inte har tid att photoconvert alla 5 embryon.
Obs: Under photoconversion, använda PMT detektorer, medan efter photoconversion, det är rekommenderat att använda hybrid detektorer inställd på 'räknar' läge. Detta beror på att hybrid detektorerna är känsligare och kan producera bilder med bättre kvalitet, men kan lätt skadas av överexponering.
5. Demontera photoconverted embryon
- Efter photoconversion, Använd glas pipett för att trycka ner något precis ovanför huvudet av embryot att bryta LMP Agarens, sedan försiktigt suga upp embryot.
- Mata ut embryot från glas pipetten i en 35 mm petriskål som innehåller embryot medium med PTU (att tvätta bort BDM innehållande medium).
- Överföra embryot till en brunn i en 6-well platta som innehåller embryot medium med PTU. Under detta steg, se till att hålla Obs som embryo går in som Tja, eftersom detta är viktigt att korrelera placera av photoconverted celler i senare utvecklingsstadier.
- Nu när embryon tas bort från BDM innehållande medlet, bör deras hjärtan börja slå igen i ca 5 min. tillbaka embryon till mörka på 28,5 ° C att embryon som fortsätter att utvecklas normalt.
6. imaging photoconverted celler i senare embryonala stadier
- När de önskade, stoppa hjärtat och åter bädda embryona som under steg 3 i detta protokoll, med den viktiga skillnaden att embryon måste behandlas med BDM i separata, märkt rätter att hålla reda på embryon.
- För embryon upp till 62 hpf, förvärva z-högar av endocardium använder 561 nm och 488 nm för röd och grön fluorescerande respektive röd komponentsignal. För embryon skeden äldre än 62 hpf, Använd en multiphoton laser set till 940 nm till bild gröna Kaede istället för 488 nm laser.
7. bildanalys för embryon under 48 hpf
Obs: Vävnad förflyttningar av AVC kan vara svåra att analysera på grund av dess komplexa tredimensionella struktur. För att kvantifiera längden på en photoconverted region i AVC mellan två icke-photoconverted regioner eller längden på en icke-photoconverted region i AVC mellan två photoconverted regioner, kan det vara önskvärt att mappa den tredimensionella strukturen på en tvådimensionell karta. Bilder av photoconverted embryon erhållits före 48 hpf kan analyseras med hjälp av följande metod.
- Importera de förvärvade bilderna i Matlab eller liknande programvara.
- Avgränsa manuellt ROI, dvs endocardium, och tillämpa en mask för att ta bort signalen utanför denna region.
- Tillämpa en intensitet tröskelvärde på bilden för att identifiera punkterna på endocardium och rita dem i tre dimensioner. Isolera de punkter som motsvarar den smalaste och mest raka delen av AVC, genom att radera manuellt inga sevärdheter på atrium och ventrikeln med kommandot Radera i programvaran.
- Använd en cylinder för att passa de punkter som representerar AVC så erhålls.
- Definiera ett referenssystem för att jämföra flera prover. Till exempel, anta centrum av massan av punkterna som AVC som beskärningen av referenssystemet och axel monteras cylindern som z-axeln.
- Se till att positiva z-positioner alltid motsvarar på samma sida av hjärtat (ventrikulära arytmier).
- Projicera AVC punkter på x-y-planet och använda en ellips för att passa dem.
- Rotera de endokardiella punkterna runt z-axeln så att huvudaxeln av ellipsen och y-axeln av referenssystemet är parallella och positiv y-värdena motsvarar den inre sidan av AVC med avseende på embryot.
- Om du vill segmentera AVC, skära tredimensionella datamängden med vissa flygplan som erhållits genom roterande halv-planet {y = 0, x > 0} i z-riktningen.
- Projicera intensiteten i de intilliggande pixlarna på dessa plan och definiera endotelet på ett konsekvent sätt. Exempelvis manuellt rita en linje från den förmaksflimmer till ventrikulär sida av AVC på halva tjockleken på endotelet.
- Interpolera pekar av de linjer som representerar endotel med en tredimensionell spline använder verktygslådan spline för att representera AVC med en yta.
Anmärkning: Antalet skärande plan bestämmer både riktigheten av segmentering och tidsförbrukningen för detta steg. 8 plan är vanligtvis tillräckligt för att uppnå goda resultat.
- Definiera den azimuthal positionen för varje punkt på AVC ytan med cylindriska koordinater.
- Definiera en parametrisk kurva längs ytan av AVC genom beräkning av arc längden på ytan mellan på varandra följande punkter på varje azimuthal position.
- För varje parametriska kurva, definiera punkten på kurvan närmast centrum av AVC till noll. Pekar av AVC är således fullt beskrivs av deras azimuthal samt deras position på parametriska kurvan.
- Veckla upp AVC till en tvådimensionell bild genom att använda parametriska ställning av punkter.
- Hitta kanterna på regionen att kvantifiera som kanterna på den binär bild tröskelvärde förhållandet mellan stödnivåerna photoconverted och de icke-photoconverted kanalerna. Manuellt korrigera resultatet om det behövs.
- Beräkna arc längden mellan kanterna för att beräkna längden av vävnad som en funktion av den azimuthal ståndpunkten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel på ett embryo photoconverted på 48 hpf och avbildas igen på 80 hpf visas i figur 2, filmer 1 och 2. Utsätta Kaede för 405 nm ljus irreversibelt konverterar från proteinet från dess fluorescerande grön form till fluorescerande röd form, möjliggör uppförandet av celler märkta med antingen grön eller deras röda form följas med avseende på deras differentially färgade grannar under ventilen bildandet. Det kan ses att några photoconverted cellerna i 48 hpf AVC senare frodats och senare bodde huvudsakligen på ena ventilen bipacksedel.
Ett exempel på de resultat som kan uppnås genom att tillämpa den metod för analys av bild som beskrivs på ett 36 hpf embryo efter photoconverting hormonstörande ämnen i atrium och i ventrikeln visas i figur 3. Segmentering av AVC tillåter parametrization tredimensionella struktur som projiceras sedan i två dimensioner för enklare visualisering och analys. Metoden gör att man kan mäta avståndet mellan de två photoconverted-regionerna. Genom att upprepa denna process på olika utvecklings gånger är det möjligt att studera migration av celler mot AVC (Boselli et al., i pressen)9.
Figur 1 : Mögel används för att skapa agaros brunnar. (A) framifrån. B) bakifrån. C-D) Sidoutsikt över. E-F) Sneda visningar. Mått visas i millimeter. Den. STL-fil för mallen mögel finns i den kompletterande material. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa resultat av en Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) photoconverted embryonala hjärtat. A) embryonala hjärtat precis efter photoconversion på 48 hpf. Cytoplasmiska Kaede inom flera celler av överlägsen sida av AVC har konverterats från dess gröna form till dess röda form. B) 80 samma embryo hpf. Det kan ses som den tidigare photoconverted celler har frodats och har kommit att bosätta sig i insidan av överlägsen atrioventrikulärt ventilen. Skala barer: 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativa resultat av bild analysprocessen på ett 36 hpf embryo. (A) resultatet av tredimensionella segmentering av AVC i ett referenssystem som är vanligt bland embryona; signalen från photoconverted (magenta) och icke-photoconverted (grön) Kaede är projiceras på dess yta och markerar regionerna photoconverted och icke-photoconverted. B) The AVC är Övik enligt dess punkt parametriska ställning och signalen beräknas i två dimensioner för enklare visualisering. Kanterna på icke-photoconverted regionen är märkta i vitt. C) längden på icke-photoconverted regionen ritas som en funktion av kantiga position. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: embryonala hjärtat precis efter photoconversion på 48 hpf. Relaterade till figur 2A. Filmen går igenom förvärvade z stacken 48 hpf embryots visas i figur 2A z segment av z slice. Endast en z planet valdes under photoconversion, men det kan ses här att celler på olika djup har varit photoconverted. Z segment är fördelade 2 µm isär. Högerklicka för att ladda ner denna film.
Movie 2: photoconverted embryonala hjärtat vid 80 hpf. Relaterade till figur 2B. Filmen går igenom förvärvade z stacken 80 hpf embryots visas i figur 2B z segment av z slice. Z segment är fördelade 2 µm isär. Högerklicka för att ladda ner denna film.
Kompletterande fil: Relaterade till figur 1. Den. STL-fil för mallen mögel. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidpunkten för photoconversion: även om Kaede är fortfarande ljust uttryckt i hormonstörande ämnen även vid 96 hpf, det bör noteras att när embryot växer, laserljus sprider mer innan det når AVC, försvårar trånga photoconversion av Kaede. At embryonala stadier senare än 55 hpf, ballooning av ventrikeln och atrium innebär också att Violetta laserstrålen används för photoconversion inte kan nå AVC celler utan första passerar genom antingen atrium eller ventrikeln. Detta innebär att utöver 55 hpf, för att photoconvert hormonstörande ämnen av AVC, man måste också photoconvert ytterligare hormonstörande ämnen i förmak och kammare.
BDM och tricaine: exakt photoconversion av hormonstörande ämnen kräver tillfälligt stoppa hjärtat från misshandeln. BDM (2,3-butandion monoxime) är en electro-kontraktila uncoupler som är väl känt att undertrycka hjärtmuskulatur kontraktion12. Vi beaktar inte skillnaderna mellan morfologi av embryon som har varit föremål för detta protokoll och embryon som har växt normalt och har inte haft sina hjärtan stannade för imaging. Risken är dock fortfarande att läkemedelsbehandlingen är att förändra normala utveckling13. Koncentrerad tricaine kan också användas för att tillfälligt stoppa hjärtat14. Vi finner att vi effektivt kan stoppa hjärtat genom att placera embryon i embryo medium med 0,32% tricaine för 1 min och behålla hjärtat i dess stoppat tillstånd genom att överföra embryon till embryo medium med 0,16% tricaine. Liknar BDM behandling, kan personer som hjärtat stoppas detta sätt i 30 min och hjärtslag kan ses att återvända inom 5 min efter återkomsten embryon till normala embryo medium. Högre koncentrationer av tricaine bör undvikas. låga koncentrationer av tricaine under längre perioder (h/dagar) har visat sig påverka normal embryonal utveckling15,16. Tricaine-lösning som används för att stoppa hjärtat är bäst förberedda färska. Om frysta alikvoter används, se till att hålla lösningen väl skyddade från ljus och att Tina tricaine utan värme lösningen över 30 ° C. Slutligen har blebbistatin rapporterats att stoppa hjärtat utan allvarliga biverkningar13. Vi har inte testat denna sista metod i vårt labb.
Montera och demontera: korrekt positionering av embryon är kritisk under photoconversion. Formen för att göra agaros brunnar underlättar montering av embryon så att främre-bakre axeln av embryot konsekvent ligger vid 25° i förhållande till ytan av skålen. Vi har funnit mögel ska vara tillämplig för photoconversion på alla utvecklingsstadier mellan 36 och 55 hpf. Montering behöver lutningen på embryot i vänster-höger-riktning justeras enligt embryots utvecklingsstadier och området man vill efter photoconvert. Till exempel till photoconvert AVC på 36 hpf, embryot ska möta ungefär 15° till vänster, medan vid 55 hpf, embryot ska möta ungefär 10° till vänster. Under stereomikroskopet bör du kunna se AVC distriktet av ventrikeln eller atrium. Om, till exempel atrium ligger över AVC, vore inte möjligt att photoconvert bara AVC eller bara atrium. För imaging ändamål, används samma mögel att placera embryon mellan 36 och 96 hpf. Mögel kan göras med hjälp av olika material med hjälp av en 3D-skrivare eller traditionell mekanisk verkstad verktyg. Rostfritt stål eller kemiska och värme resistent plast är båda lämpliga material. Om läsaren vill skapa mögel med en 3D-skrivare, se Tilläggsinformation för den. STL-fil av mallen för mögel.
Lägga tillräcklig LMP är agaros att täcka hela embryot klokt att se till att embryon inte blir rubbas mellan montering och photoconversion/imaging, särskilt om mikroskopet inte ligger i direkt anslutning till montering station. I allmänhet, förutsatt att embryona är korrekt monterade, fastnar LMP agaros inte embryon efter avmontera. Dock bör vissa LMP agaros fastnar på embryot, LMP Agarens kan avlägsnas genom att försiktigt retas embryot från Agarens använda pincett.
Embryon, särskilt embryon mindre än 48 hpf, lätt kan skadas under montera och demontera. För embryon mindre än 48 hpf, rekommenderar vi eld polering slutet av glas pipetten att förhindra skadliga embryon under pipettering.
Mikroskop: detta protokoll utfördes med hjälp av Leica SP8 Mikroskop. Men photoconversion är en väletablerad process och detta protokoll bör kunna enkelt konverteras till annan upprätt Mikroskop utrustat med lasrar kan producera 405 nm, 488 nm och 561 nm ljus. För embryon upp till 62 hpf, bilder förvärvades med en argon excitation laser och en DPSS 561 laser för gröna och röda Kaede, respektive. För embryon skeden äldre än 62 hpf, grön Kaede kan vara upphetsad med hjälp av en multiphoton laser inställd på 940 nm, som har en större genomträngningsdjupet än 488 nm ljus. I teorin, röda Kaede bör ha en två-photon excitation spectra liknar DsRed, och kunde avbildas 950 nm17.
Ett objektiv med en hög numeriska bländaröppningen är nödvändigt att effektivt photoconvert hormonstörande ämnen och förvärva högupplösta bilder. Eftersom embryon hålls i media, är det viktigt att välja ett mikroskop som är utrustat med en vatten-objektiv.
Photoconverting regionen av intresse: det är klokt att vara försiktig när du väljer ROI till photoconvert - 405 nm laser diffunderar när den färdas genom vävnad och kan photoconvert celler i ett område som är större än den som valts. Om till exempel du vill märka en cell röd men vill cellen i direkt anslutning till förblir grön, kan det vara klokt att välja endast delen av cellen ligga ytterligare från den intilliggande cellen som avkastningen på din investering. Eftersom Kaede uttrycks i cytoplasman av hormonstörande ämnen, kommer photoconverted protein diffusa till delar av cellen inte valt av ROI.
Fotoblekning och fototoxicitet: The Kaede protein, både gröna och röda former, är extremt ljusa och fotoblekning är i allmänhet inte en begränsande faktor i cell tracking experiment. Dock laserljus kan påverka embryonal utveckling och bör minimeras, särskilt under tidiga stadier av utveckling. Tecken på fototoxicitet inkluderar utvecklingsförsening och, i allvarligare fall, felaktig hjärtat looping och missbildade ventiler.
Kraften i den violett lasern (25%) och antalet iterationer violett laser File över ROI (3 - 6 gånger) används i detta protokoll fastställdes empiriskt. På dessa inställningar såg vi nästan fullständig omvandling av Kaede från sin gröna till röda form utan märkbar utvecklingsförsening. Mängden lasereffekt som krävs i andra mikroskopi uppställningar skulle bero på laserns intensitet. Det bör noteras att röd form av Kaede kan blekas av intensiv 405 nm belysning, så längre photoconversion inte ger nödvändigtvis mer röd fluorescens.
Bildanalys: metoden som föreslås för bildanalys är en nyutvecklad process att beskriva AVC tredimensionell geometri och jämföra bland embryon. Det är avsett att tillämpas på enskiktslager tubulära strukturer, såsom AVC innan 48 hpf och potentiellt hjärtat röret, dorsala aorta m.fl. Det är huvudsakligen automatiska, även om segmentering på de skärande plan utförs manuellt av användaren och andra stegen kunde potentiellt kräver manuell korrigering. Den manuella segmenteringen utgör den mest kritiska delen av processen, eftersom kunskap om struktur geometri och utbildning behövs för att uppnå goda resultat. Efter öva, minskas avsevärt tid-konsumtion av detta steg.
Protokollet beskrivs här ger ett effektivt sätt att spåra endokardiella vävnad rörelser under AVC och atrioventrikulärt hjärtat ventil utveckling med Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) zebrafiskar transgena linjen.
För närvarande är en av de viktigaste begränsningarna med denna metod att Violetta laserstrålen inte är begränsad i den axiella dimensionen. Detta gör inriktning av enstaka celler för photoconversion, och därmed klonal analyser och enda cell tracking, svårt. För två år sedan upptäcktes det att det photoconvertible proteinet Dendra2 kan vara grundmålade konverteras - proteinet kan omvandlas från dess gröna form till dess röda form av första bestråla proteinet med blått ljus, och sedan med infrarött ljus18. Mikroskopet uppställningar som utnyttjar detta boende kan photoconvert Dendra2 uttrycker cellerna i ett rumsligt begränsade sätt i komplexa 3D vävnad strukturer samtidigt undvika många av fototoxicitet problemen i samband med intensiv nära-UV bestrålning18 , 19 , 20. med den senaste upptäckten av den molekylära mekanismen bakom detta fenomen, varianter av många grön-till-röd photoconvertible fluorescerande proteiner, inklusive Kaede, har konstruerats så att också kan komma en primade mellanliggande statliga21. Till vår kunskap är zebrafiskar transgena linjerna där en promotor såsom fli1a eller kdrl driver uttrycket av protein Dendra2 eller andra primas konvertibla fluorescerande proteiner i endotelceller ännu inte tillgängliga. Men rader som uttrycker Dendra2 ubiquitously finns tillgängliga och kan vara användbar i vissa program 22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Någon intressekonflikt förklarade.
Acknowledgments
Vi vill tacka Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli och Basile Gurchenkov för att hjälpa till att designa och tillverka den mögel som beskrivs i detta protokoll. Detta arbete stöds av FRM (DEQ20140329553), ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), EMBO Young Investigator programmet, gemenskapens ERC CoG N ° 682938 Evalve och av bidraget ANR-10-LABX-0030-INRT, en franska statens fond förvaltas av den Agence Nationale de la Recherche under den ram program Investissements pris märkt ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
