Summary
このプロトコルは楓生活の心内膜細胞の蛍光タンパク質の光変換の方法を記述するゼブラフィッシュ胎児房室管、心臓房室弁開発中心内膜細胞の追跡を有効にします。.
Abstract
胚発生に伴う細胞細胞行動のダイナミックな変化を受けるし、発生生物学の分野の基本的な目標は、これらの変更の背後にある細胞の論理を読み解きます。発見と蛍光タンパク質の開発が格段に動的変更の私達の理解光学的細胞や組織を強調表示する方法を提供します。ただし、光電、微速度顕微鏡観察およびそれに続く画像解析は、脳や目など臓器の細胞動態を暴くで非常に成功する証明が、このアプローチは通常使用されないため心臓の開発で心臓のサイクル中に心臓の急速な動きによってもたらされる課題。このプロトコルは、2 つの部分で構成されています。最初の部分では、photoconverting とその後中ゼブラフィッシュ房室運河 (AVC)、心臓房室弁開発心内膜細胞 (内分泌かく乱化学物質) を追跡する方法について説明します。正確な光電場所を取るために薬で心臓を一時的停止メソッドが含まれます。心は再開できる発達時間後の時点で photoconverted 内分泌かく乱化学物質の高分解能イメージングのため心臓が再び停止するまでに薬物および萌芽期の開発の除去時に鼓動が通常どおり続行されます。プロトコルの 2 番目の部分は、二次元の地図に立体構造から蛍光信号をマッピングすることにより幼胚の胚で AVC の photoconverted または非 photoconverted 領域の長さを定量化する画像解析法をについて説明します.一緒に、プロトコルの 2 つの部分は、起源とゼブラフィッシュ AVC と房室弁をし、変異体、morphants、またはと扱われている胚を研究するため適用できる可能性のある細胞の挙動を検討する 1 つをことができます。AVC および/または弁の開発を妨害する試薬です。
Introduction
ゼブラフィッシュは現在体内細胞および進化のプロセスを勉強する最も重要な脊椎動物モデルの一つです。これがゼブラフィッシュの光透過性の主因と遺伝学は、遺伝子を含む光学的手法を適用するための強力なモデルはそれにこうしてエンコード光応答性タンパク質技術1。心臓の研究に固有のゼブラフィッシュを受け取る拡散を介して十分な酸素ハートビートなしも突然変異体は発達遺伝子および摂動の影響に関する分析を許可、開発の最初の週を生き残ることができるようにほとんどの脊椎動物2で可能ではない心臓の形態形成に関する血流。
ゼブラフィッシュの心臓の管は 24 時間ポスト受精 (hpf) によって形成されます。その形成直後後心臓の管は、積極的に暴行を開始します。36 で hpf、明確な収縮心室から心房を分離します。収縮のこの地域は、立方形態3房室運河 (AVC) とこの地域の変更細胞扁平上皮の形態から呼び出されます。ゼブラフィッシュ房室弁の形態形成開始 48 時間前後は、受精を投稿します。5 日ポスト受精、2 つの弁尖は、AVC に拡張し、4心周期の間に、心室から心房への血液の逆流を防ぐ。AVC と弁形成過程における細胞の追跡を介して伝統的なタイムラプス顕微鏡5,6セルに従うことが困難な心の急速な打撃としては困難です。このプロトコルは、スティードら2016年7から適応で楓の蛍光蛋白質の表現に使用されるなTg (fli1a:gal4FFubsUAS:kaede)8ゼブラフィッシュ遺伝子組換え回線を使用する方法を記述します。血管内皮細胞は、心内膜を含みます。36 55 の hpf と発生時間の特定ポイントで photoconverted 内分泌かく乱化学物質の高分解能イメージングの内分泌かく乱化学物質の正確な光電に暴行、心臓を一時的に停止、薬 2, 3-butanedione-2-ジアセチルモノオキシム (BDM) が使用されます。以前、内分泌かく乱化学物質 photoconverted このメソッドを使用してが変換されていない近所の人たちと区別することができますまま光電7時間後 5 日間以上に示されています。このプロトコル 48 より若い胚における内分泌かく乱化学物質 photoconverted の画像解析に使用するメソッドの詳細も hpf は、AVC 開発 (Boselliらプレスで)9中に組織の動きに従う正常に使用されています。我々 は、読者がこのプロトコルを有用見つける AVC とバルブの開発、正常な胚、変異体、morphants、または薬剤を投与した胚を研究するため願っています。ゼブラフィッシュの開発中に蛍光タンパク質を用いた細胞追跡に関連する一般的なプロトコル、ロンバルドら、2012年10投稿記事をご覧ください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 金型の製作やアガロースをマウント
- 3 D プリンターまたは伝統的な機械的ワーク ショップ ツールを使用して図 1に示す寸法の金型を作成します。
- 35 mm プラスチック製取り付け皿に溶かし 1% アガロースゲルの約 1.5 mL のピペットします。金型と agarose の間の空気を避けるために世話液体の agarose のプラスチック金型を配置します。4 ° C で皿を配置、agarose 硬化 (この所要時間約 5 分) まで待つプラスチック金型を削除します。
- 後で使用できるマウント料理を保存するには、カバー、ふた付き皿を皿とパラフィルムでしっかりと蓋をラップします。取り付け皿を格納、ことができます蓋面 4 ° C で最大 5 日間を下
- 事前に 1.5 mL で 0.7% 低融点アガロースの因数を 1 mL エッペン チューブ取り付けの日に使用準備します。
注: パラフィルムがしっかりと料理の周りラップされていない場合、水が蒸発する、取り付け皿の agarose の井戸が時間の経過とともに変形をします。
2. 光変換の胚を取得
- Tg (fli1a:gal4FFubsUAS:kaede)異なる線し、約 200 胚胚中 28.5 ° C で暗闇の中での成長ゼブラフィッシュのラインを交差させる方法の詳細については、ゼウス科学教育データベース11を参照してください。
- 5 時間後、24 時間前に、1-フェニル-2-チオ尿素 (PTU) 色素形成を防ぐために胚を扱う (0.003% 胚中 PTU)。
- 明るい緑の蛍光性を表現する表示される光電、蛍光万国実体写真下画面胚、選択 5 健康な胚の開始前に約 1 時間。Photoconverting 非特異的細胞で楓を避けるために胚の周囲の光への露出を避けるために胚を視覚化するときの強度の低い光の使用お勧めします。
3. 埋め込み
- メディアのマウントの 10 mL を準備: 0.02 %tricaine と 50 mM BDM 胚中。
- 取り付け皿にメディアをマウントの 2 mL を追加でき、agarose に拡散して解決のための 15-30 分。
- 一方で、約 5 分の 70 ° C の熱ブロックに管を置くことによって 0.7% (LMP) 低融点アガロースの 1 mL の約数を溶かします。
- わずかに冷却する LMP agarose のため待機し、低融点アガロースのチューブに 8 mg/mL tricaine ソリューションを 25 μ l 添加し 1 M BDM 溶液 40 μ L を追加します。上下、ピペッティングによるミックスは、液体状態で LMP アガロースを保つために 38 ° C の熱ブロックにチューブを転送します。
- ペトリネットの胚を損傷しないように注意を取って、鉗子を用いた顕微鏡下で事前に選択された胚を胚中、慎重に dechorionate と料理します。
- メディアのマウントの 2 mL を含む別の皿に胚を転送します。
- 胚の心を停止する時 (約 5-10 分を取る)、取付に胚料理、彼らは 25 度の角度でうそをつくように鉗子を使用して井戸に胚を手配転送ツインテールだけでなく、上向き卵黄の深部に向かって指しています。
- 胚が大体の場所でメディアを削除、tricaine と、BDM を含む 0.7% LMP agarose の 〜 200 μ L に胚を埋め込むし、胚の位置を再調整は、必要に応じて左右に胚を傾斜します。
- LMP agarose セット (所要時間約 5 分) は、メディアをマウントを料理に追加されるまで待ちます。胚は、photoconverted をする準備が整いました。
注: tricaine と、BDM 胚を麻酔してそれぞれ胚の心臓を停止する使用されます。マウント メディア イメージング、前日を準備することができますが、メディアを光から保護してください。
注: は胚の正しい位置 photoconvert たいセルへ明確なレーザーのパスを許可することが重要です。レーザー光は、胚に到達するまで旅行する必要はありません、胚は光電後簡単にマウントされませんすることができます、ので、井戸の開始の近くに胚の頭を位置します。
4. 光電
- 装備されて、405 (ライカ SP8) のような正立型共焦点顕微鏡の 488 nm nm と 561 nm レーザー ソースを見つける胚白色光 (明視野観察) と対物レンズに透過心による (ライカ HCX IRAPO L、25 × 0.95 エヌ ・ エイのような目的)。561 nm レーザー (すなわち、~ 5% 強度、589 728 nm での DPSS 561 レーザー) を用いた赤い楓蛍光性をチェックします。その後、488 nm レーザー (すなわち、~ 5% 強度、502-556 nm に設定器で 30 mW マルチライン アルゴン レーザー) を用いて心内膜を視覚化します。
- 顕微鏡集録ソフトウェアに「縛る」モードを入力します。両方 488 の ~ 1% のレーザー出力を選択して nm と 561 nm のレーザーです。
- 興味の面に焦点を当てる、その後、405 nm のダイオードを用いた photoconvert 細胞レーザー スキャン、投資収益率を 3 倍の 25% レーザー出力で利益率 (ROI) の地域を選択します。不十分な楓は、投資収益率で photoconverted をする必要があります、405 nm レーザー領域の上 3 回再びスキャンします。僅かにこの手順を繰り返します。
- ソフトウェアに「TCS SP8」モード戻るし、、561 を使用して z スタックを取得 nm、488 nm レーザーの順番に。画像処理速度を上げるため 'の双方向' オプションを選択することを確認します。
メモ: どのくらいそれは photoconvert にかかるし、それぞれの胚をイメージが違います。心臓の鼓動が正常な心臓弁の開発にとって重要である、それを意味する必要はありません時間を photoconvert すべて 5 胚場合でも 30 分以上停止して心を維持しないように知られています。
注: 使用 PMT 検出器、光電過程光電後しばらくお勧め 'カウント' モードに設定ハイブリッド検出器を使用します。これは、ハイブリッド検出器より敏感なより良い品質の画像を作り出すことができるが露出オーバーで簡単に破損しているためにです。
5. photoconverted 胚のアンマウント
- 光電後に、、LMP アガロースを破るし、胎児をやさしく吸う胚の頭の上に少しだけ押しにガラス ピペットを使用します。
- ガラス ピペットから胚を胚媒体 (媒体を含んでいる BDM を洗い流す) に PTU を含む 35 mm のペトリ皿に取り出します。
- PTU と胚媒体を含んでいる 6 ウェル プレートには井戸に胚を転送します。このステップの間に胚のノートを保つことを確認は、これは後で発達段階で photoconverted のセルの位置を関連付けるに不可欠なまあに入ります。
- 今では、胚は、BDM 含む媒体から削除されます、彼らの心は戻り胚胚は通常を開発し続けることを許可するように 28.5 ° C で暗闇の中を約 5 分で再び暴行を始めるべきです。
6 その後の胚の段階で photoconverted 細胞のイメージング
- 必要な段階では、心臓を停止させるし、胚が胚を追跡する別のマーク付きの料理で BDM と見なす必要がある重要な違いがこのプロトコルの手順 3 の下のような胚を再埋め込みます。
- 62 までの胚の hpf 561 を使用して心内膜の z スタックを取得 nm、488 nm の赤と緑の蛍光信号をそれぞれ。62 より古い段階で胚の hpf、多光子を使用してレーザー セット 940 nm 488 nm レーザーではなく緑の楓をイメージします。
7. 画像解析による胚下 48 hpf
注: AVC の組織の動きが複雑な三次元構造を分析することは困難にすることができます。2 つの非 photoconverted 領域または 2 つの photoconverted の地域間 avc 非 photoconverted 領域の長さ間の AVC の photoconverted 領域の長さを定量化することができます上に立体の構造をマップするが望ましい、二次元の地図。Photoconverted 胚の画像取得 48 前に hpf は、次の方法を使用して分析できます。
- Matlab または任意の同様のソフトウェアで取得した画像をインポートします。
- 投資収益率、すなわち、心内膜を手動で外縁し、この地域外の信号を削除するマスクを適用します。
- 心内膜上の点を識別し、3 次元にそれらをプロットする画像を輝度しきい値を適用します。アトリウムとソフトウェアの消去コマンドを使用して心室に興味のポイントを手動で消去することによって、AVC の狭いとほとんどストレートの部分に対応する箇所を特定します。
- ように入手された AVC を表す点に合わせてシリンダーを使用します。
- いくつかのサンプルを比較するための参照システムを定義します。たとえば、参照系の原点と z 軸として装着シリンダーの軸として AVC ポイントの重心を採用します。
- 心臓 (心房または心室筋) の同じ側に正の z 位置が常に対応していることを確認します。
- X y 平面上の AVC ポイントのプロジェクトし、それらに合わせて楕円を使用してください。
- 楕円の長軸と参照系の y 軸が平行し、正の y 値は胎児に関して AVC 内部側に対応心内膜ポイント z 軸の周りを回転します。
- 半平面を回転させることにより得られるいくつかの面で三次元データセットをカット、AVC をセグメント化、{y = 0、x > 0} z 方向で。
- これらの平面の隣接ピクセルの強度をプロジェクトし、一貫した方法で、内皮を定義します。たとえば、手動でからラインを描く、心房内皮の半分の厚さで AVC の心室側に。
- 表面と AVC を表すスプライン ツールボックスを使用して 3 次元スプラインと内皮を表すラインのポイントを補間します。
注: 分割の精度とこのステップの時間消費の両方切断面の数を決定します。通常、飛行機 8、良い結果を達成するために十分であります。
- 円筒座標を使用して AVC 表面の各ポイントの方位の位置を定義します。
- 各方位の位置でサーフェス間の連続する点の円弧の長さを計算することによって、AVC の表面に沿ってパラメトリック曲線を定義します。
- 各のパラメトリック曲線曲線ゼロに AVC の中心に最も近いポイントを定義します。AVC のポイントはこうしてパラメトリック曲線上の方位の位置とその位置によって完全に説明しました。
- ポイントのパラメトリック位置を使用して二次元のイメージに、AVC を展開します。
- バイナリ イメージの閾値のエッジとして、photoconverted の強度と非 photoconverted チャンネル間の比率を定量化する領域のエッジを見つけます。必要に応じて、手動で結果を修正します。
- 方位角の位置の関数として組織の長さを計算するためのエッジ間の円弧の長さを計算します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
48 胚 photoconverted の例 hpf 80 でもう一度イメージ化と hpf は図 2映画 1および2で示されています。405 nm の光に楓を公開すると、不可逆的変換蛍光赤フォームにその蛍光緑の形態からの蛋白質、緑または赤いフォームのラベルの付いたセルの動作を有効にする彼らのメランジに尊重します。弁形成の間に近所の人。それは 48 の hpf AVC のいくつかの photoconverted 細胞が後で急増し、弁尖の片側に主に住んでいた後に見ることができます。
Photoconverting 内分泌かく乱化学物質、心房と心室は図 3に示す後 36 hpf 胚の説明画像解析法を適用することによって達成することができます結果の例です。AVC のセグメンテーションでは、簡単に可視化と分析のための 2 次元で投影し、立体構造のパラメトリゼーションをことができます。メソッドでは、2 つの photoconverted 領域の間の距離を定量化することができます。異なる発達時期でこのプロセスを繰り返すことによって AVC (Boselliらプレスで)9への細胞の移行を検討することが可能です。
図 1: 金型 agarose 井戸を作成するために使用します。A)フロント ビュー。B)背面図。C D)サイドビュー。E F)斜めビュー。寸法はミリメートル単位で表示されます。。金型テンプレート用の STL ファイルは、補足資料で提供されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: の代表の結果、 Tg (fli1a:gal4FFubs、UAS:kaede) 胚の心臓原基 photoconverted.A) 48 光電直後後胚の心臓 hpf。AVC の上側のいくつかの細胞内の細胞質の楓は、その赤フォームにその緑のフォームから変換されています。B) 80 で同じ胚 hpf。それを見ることができるが、以前 photoconverted 細胞が増殖しているし、優れた房室弁の内側に存在してきた。スケール バー: 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 36 hpf 胚のイメージ分析プロセスの代表の結果。A) ; 胚の間で共通の参照システムで AVC の三次元領域分割の結果photoconverted (マゼンタ) と非 photoconverted (グリーン) 楓からの信号は、その表面に投影、photoconverted と非 photoconverted の領域をマークします。B) 、AVC はそのポイントのパラメトリック位置に応じて折り返しと信号は、簡単に可視化のための 2 次元で投影されます。非 photoconverted 領域のエッジは白で表示されます。C)非 photoconverted 領域の長さは角度の位置の関数としてプロットされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ムービーの 1: 48 で光電直後後胚の心臓 hpf 。図 2 aに関連します。映画は、z スライスによって図 2 a z スライスに示す 48 hpf 胚の取得した z スタックを通過します。光変換処理中に 1 つだけの z 平面が選ばれたが、それすることができますここで見る様々 な深さで細胞が photoconverted をされています。Z スライスは、間隔の 2 μ m 離れています。この映画をダウンロードするを右クリックします。
映画 2: 80 photoconverted 胚の心臓 hpf。図 2 bに関連しています。映画は、z スライスによって図 2 b z スライスに示す 80 hpf 胚の取得した z スタックを通過します。Z スライスは、間隔の 2 μ m 離れています。この映画をダウンロードするを右クリックします。
の補足ファイル:図 1に関連します。。金型テンプレートの STL ファイルです。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
光電のタイミング: 96 でも内分泌かく乱化学物質の鮮やかな表現が楓のまま hpf、胚が大きくなると、レーザー光を拡散させるより楓の限られた光電をより困難になり、AVC に達する前にそれに注意してください。At 萌芽期段階の 55 以降 hpf、心室と心房のバルーニングもの光電用バイオレット レーザー ビームが心房または心室のどちらかを最初の通過せず AVC 細胞を達することができないということ。これは 55 を超えて、hpf、photoconvert、AVC の内分泌かく乱化学物質を 1 つする必要がありますも photoconvert 心房と心室に追加内分泌かく乱化学物質。
BDM と tricaine: 内分泌かく乱化学物質の正確な光電暴行から心臓を一時的に停止する必要があります。BDM (2, 3-butanedione ジアセチルモノオキシム) は、心筋収縮12を抑制するよく知られている電気収縮ランプです。我々 は、この議定書の対象となっている胚の形態の違いを観察しないと通常成長されているしていない胚心イメージングのために停止があった。ただし、薬物治療は通常開発13を変更が負います。14心臓を一時的に停止する集中 tricaine を使用もできます。我々 は見つけること、効果的に 1 分 0.32 %tricaine で胚の中に胚を置くことによって心臓を停止させるし、0.16 %tricaine で胚の中に胚を転送することによって、停止している状態で心臓を維持します。BDM 治療と同様に、心臓を停止できるこの方法で 30 分間、通常胚の中に胚を帰国後 5 分以内に返すに心臓の鼓動を見ることができます。Tricaine のより高い集中を避ける必要があります。長時間にわたって tricaine の低濃度正常な胚15,16に影響を与える (h/日) を示されています。心臓を停止するために使用 Tricaine 溶液を調製して新鮮な最高。冷凍の因数を使用する場合 30 ° C を超えるソリューションを加熱することがなく、tricaine を解凍して光から十分に保護ソリューションを保持するを確認します。最後に、blebbistatin は、重篤な副作用13なし心臓停止に報告されています。この最後の方法は、ラボでは未テストです。
マウントとアンマウント: 光電中は胚の正しい位置が重要。アガロース井戸を作るための金型その胚の前後軸に一貫して料理の表面を基準にして 25 ° である胚の取付が容易になります。我々 は 36、55 の hpf の間すべての発達段階光電の金型を発見しました。取り付け、左から右の方向で胚の傾きは胚の発育段階と 1 つの photoconvert に願いエリアに応じて調整する必要があります。36 photoconvert、AVC にたとえば、hpf、胚の中で 55 分、左に約 15 ° を直視すべきだ hpf 胚直面すべき約左に 10 °。、実体顕微鏡下で心室または心房で AVC を見ることができます。たとえば、アトリウムの向こう、AVC 場合、photoconvert だけ、AVC またはアトリウムだけにそれはできないでしょう。目的をイメージング、36、96 hpf 間の胚の位置に同じ型が使用されます。3 D プリンターを使用してまたは伝統的な機械的ワーク ショップ ツールを使用して材料の様々 なを使用して金型がでした。ステンレス鋼または化学薬品および熱抵抗力があるプラスチックは、両方の適切な材料です。する必要があります読者の補足情報を参照してください、3 D プリンターを使用して、金型を作成します。金型テンプレートの STL ファイル。
十分な LMP の追加全体の胚をカバーする agarose 取付間外れと光電/イメージング、顕微鏡に直接取付駅に隣接してある場合は特に、胚がなることをお勧めします。一般的には、胚が適切に取り付けられている LMP アガロースに固執していません胚アンマウント後。ただし、必要がありますいくつかの LMP agarose 立ち往生のまま優しくからかう鉗子を使用して agarose から胚、胚の LMP アガロースを削除できます。
特に胚 48 未満の胚は、hpf はマウントおよびアンマウント中に簡単に破損することができます。48 未満の胚の hpf 火ピペッティング中有害な胚を防ぐためにガラス ピペットの最後の研磨をお勧めします。
顕微鏡: このプロトコルは、ライカ SP8 顕微鏡を用いて行われました。しかし、光電は確立されたプロセス、このプロトコルは 405 を作り出すことができるレーザー装備他の正立顕微鏡に簡単に変換する必要があります nm、488 nm と 561 nm の光。62 までの胚の hpf、それぞれ赤と緑の楓の励起レーザーと 561 DPSS レーザーを使用して画像を取得しました。62 より古い段階で胚の hpf、緑の楓を 940 に設定多光子レーザ励起できること nm は、488 nm の光より大きい浸透の深さを持っています。理論的には、赤い楓 2 光子励起スペクトルの類似した DsRed、する必要があります、950 nm17でイメージを作成することができます。
高開口数の対物レンズは効率的に photoconvert 内分泌かく乱化学物質と高解像度の画像を取得する必要です。メディアで、胚は維持されますので、水の対物レンズを搭載した顕微鏡を選択することが重要です。
Photoconverting 関心領域: それは photoconvert に ROI を選択するときに保守することをお勧め - 405 nm レーザー拡散 photoconvert の細胞組織とすることができます選択より大きい領域を通過するようです。たとえば、セルを赤にラベルを貼りたいが、緑のままに直接隣接するセルと思います場合、あなたの ROI として隣接するセルからさらに横になっているセルの一部だけを選択するが賢明かもしれません。楓は、内分泌かく乱化学物質の細胞質で表される、ので photoconverted 蛋白質に投資収益率で選択されていないセルの部分に拡散します。
退色、光毒性:、楓蛋白質、の両方の緑と赤形態は非常に明るいと退色は一般的に追跡実験セルの制限要因ではないです。ただし、レーザー光は萌芽期の開発に影響を与えることができます、特に開発の初期段階中に、最小化する必要があります。光毒性の兆候は発育遅延を含めるより深刻な場合、不適切な心ループと不正な形式のバルブ。
バイオレット レーザー (25%) と投資収益率 (3-6 回) と、このプロトコル上のバイオレット レーザー スキャン回数の力は経験的に決定されました。これらの設定では、顕著な発達遅滞なく赤フォームにその緑から楓のほぼ完全な転換を見た。他の顕微鏡のセットアップに必要なレーザー電力量は、レーザーの強度によって異なります。それは、長い光電が必ずしも赤い蛍光をもたらさないので、楓の赤いフォームことができます強烈な 405 nm 照明によって漂白すること注意してください。
画像解析: 画像解析が新しく開発したプロセス、AVC の 3次元のジオメトリを記述し、胚の間で比較する方法を提案します。48 前に AVC などの単分子膜管状の構造物に適用するもので hpf と潜在的心臓の管、背側大動脈。にもかかわらず、切断面の分割は、ユーザーが手動で実行、他の手順は、手動補正を要する可能性があります、主に自動です。手動のセグメンテーションは、構造幾何学とトレーニングの知識は、良い結果を達成するために必要ですので、プロセスの最も重要な部分を表します。練習の後は、このステップの時間消費は大きく減少します。
ここで説明したプロトコルでは、AVC とTg (fli1a:gal4FFubsUAS:kaede)ゼブラフィッシュ遺伝子組換えラインを使用して心臓の房室弁開発中心内膜組織の動きを追跡するための効果的な方法を提供します。
現在、このメソッドの主な制限事項の 1 つはバイオレット レーザー ビームの軸ディメンションに限定されていないことです。これは光電したがってクローン解析の単一細胞および追跡、1 つのセルのターゲットと難しくなります。2 年前、Dendra2 をプライミングすることができる蛍光タンパク質の変換 - タンパク質に変換できる緑の形態からその赤フォームに青色の光と近赤外光18タンパク質を最初に照射することにより発見されました。このプロパティを利用する顕微鏡のセットアップが強烈な近紫外線照射18に関連する毒性問題の多くを回避しながら複雑な 3次元組織構造の空間的に限られた方法で photoconvert Dendra2 発現細胞をことができます。,19,20しますこの現象の背後にある分子メカニズムの最近の発見、楓、を含む多くの緑、赤の蛍光蛍光蛋白質の亜種は、下塗りの中間に入ることができるでもあるので設計されて。状態21。私たちの知る限り、ゼブラフィッシュ形質転換線、プロモーターなどのfli1aまたはkdrlドライブ Dendra2 の発現または他は内皮細胞の蛍光タンパク質転換を準備万端まだご利用いただけません。ただし、普遍的 Dendra2 を表現するラインがあり、特定アプリケーション22,23で役に立つかもしれないです。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
我々 はこのプロトコルで記述されている金型を助けるためバジーレ Gurchenkov ナタリー Faggianelli、デニス · Duchemin アン ロール Duchemin を感謝したいです。この作品は FRM (DEQ20140329553)、(ANR-15-CE13-0015-01、ANR-12-ISV2-0001-01) ANR、エンボ若い調査官プログラム ERC CoG N ° 682938 欧州共同体によってサポートされない Evalve ・ グラント ANR-10-LABX-0030-INRT、フランスの州の資金管理ANR-10-アイデックス-0002-02 というラベルの付いたフレーム プログラム Investissements d'Avenir の下のアジャンス ナシオナル デ ラ凝った。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
