Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor de photoconversion van Kaede fluorescent proteïne in endocardial cellen van de levende zebrafish embryo waarmee het volgen van endocardial cellen tijdens de atrioventriculaire kanaal en Atrioventriculaire hart ventiel ontwikkeling .
Abstract
Tijdens de embryogenese, cellen ondergaan dynamische veranderingen in het gedrag van de cel, en ontcijferen van de cellulaire logica achter deze veranderingen is een fundamentele doelstelling op het gebied van de ontwikkelingsbiologie. De ontdekking en ontwikkeling van photoconvertible eiwitten hebben ons begrip van deze dynamische veranderingen sterk geholpen door het verstrekken van een methode om optisch Markeer cellen en weefsels. Terwijl photoconversion, time-lapse microscopie en latere beeldanalyse hebben bewezen als zeer succesvol in het blootleggen cellulaire dynamiek in organen zoals de hersenen of het oog, wordt deze aanpak echter in het algemeen niet gebruikt in de ontwikkelingslanden hart wijten aan uitdagingen van de snelle beweging van het hart tijdens de cardiale cyclus. Dit protocol bestaat uit twee delen. Het eerste deel beschrijft een methode voor photoconverting en vervolgens endocardial cellen (EdCs) bijhouden tijdens zebrafish Atrioventriculaire kanaal (AVC) en Atrioventriculaire hart ventiel ontwikkeling. Bij deze methode wordt tijdelijk stoppen van het hart met een geneesmiddel om nauwkeurige photoconversion plaatsvinden. Harten zijn toegestaan om te hervatten gewonnen na verwijdering van de drug en de embryonale ontwikkeling blijft normaal totdat het hart weer voor hoge resolutie beeldvorming van photoconverted EdCs op een moment later ontwikkelings tijd wordt gestopt. Het tweede deel van het protocol beschrijft een methode van de analyse van het beeld om te kwantificeren van de lengte van een photoconverted of niet-photoconverted gebied in de AVC in jonge embryo's door het toewijzen van het fluorescerende signaal van de driedimensionale structuur naar een tweedimensionale kaart . Samen, de twee delen van het protocol kan men de oorsprong en werking van cellen waaruit de zebravis AVC en Atrioventriculaire hartklep, en potentieel kan worden toegepast voor het bestuderen van mutanten, morphants of embryo's die zijn behandeld met te onderzoeken reagentia die AVC en/of klep ontwikkeling verstoren.
Introduction
De zebravis is momenteel een van de belangrijkste gewervelde modellen om te studeren cellulaire en ontwikkelingsbiologie processen in vivo. Dit is grotendeels te wijten aan de de zebravis optische transparantie en inschikkelijkheid aan genetics, waardoor het een krachtig model voor de toepassing van optische technieken met genetisch photoresponsive eiwit technologieën1gecodeerd. Specifiek voor de studie van hart ontwikkeling, zebravis ontvangen voldoende zuurstof via diffusie zodanig dat zelfs mutanten zonder hartslag kunnen overleven door middel van de eerste week van ontwikkeling, het toelaat van analyses over de gevolgen van ontwikkelingsstoornissen genen en verstoord doorbloeding op hart voedselproductie niet mogelijk is in de meeste gewervelde dieren2.
De zebravis hart buis wordt gevormd door 24 uur bericht bevruchting (hpf). Kort na haar oprichting begint de hart-buis actief te verslaan. Door 36 hpf, een duidelijke vernauwing scheidt het atrium van het ventrikel. Deze regio van de vernauwing wordt aangeroepen op een cuboidal morfologie3de atrioventriculaire kanaal (AVC), en de cellen in deze regio wijziging vanuit een squamous morfologie. Zebravis Atrioventriculaire ventiel morfogenese begint ongeveer 48u post bevruchting. Door 5 dagen na de bevruchting, twee ventiel folders uit te breiden naar de AVC en de terug stroom van bloed vanuit het ventrikel aan het atrium tijdens de cardiale cyclus4voorkomen. Bijhouden van cellen tijdens de vorming van AVC en ventiel is een uitdaging zoals de snelle kloppen van het hart maakt het moeilijk om te volgen van cellen via traditionele time-lapse microscopie5,6. Dit protocol, aangepast van Steed et al., 20167, beschrijft een methode die gebruikmaakt van de GS (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 zebrafish transgene lijn, waarin de photoconvertible proteïne Kaede wordt uitgedrukt in endotheliale cellen, met inbegrip van het endocard. De drug 2,3-butaandion-2-monoxime (DTB) wordt gebruikt om tijdelijk stoppen met het hart gewonnen, waardoor nauwkeurige photoconversion van EdCs tussen 36 en 55 hpf en hoge resolutie beeldvorming van photoconverted EdCs op specifieke tijdstippen voor ontwikkelingsstoornissen. Het is eerder aangetoond dat EdCs photoconverted using zulks werkwijze voor vijf dagen of meer na de tijd van photoconversion7te onderscheiden van hun onbekeerde buren kan blijven. Dit protocol gegevens ook een methode die wordt gebruikt voor beeldanalyse van photoconverted EdCs in embryo's jonger dan 48 hpf, die met succes is gebruikt om het weefsel bewegingen volgen tijdens AVC ontwikkeling (Boselli et al., in druk)9. Wij hopen dat lezers dit protocol nuttig vindt zou voor de studie van AVC en ventiel ontwikkeling in normale embryo's, en mutanten, morphants of drug-behandelde embryo's. Voor een meer algemene protocol betreffende cel bijhouden met behulp van photoconvertible eiwitten tijdens de ontwikkeling van de zebravis, te bekijken gelieve het artikel door Lombardo et al., 201210.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiden van mallen en monteren van agarose
- Maak een mal met de afmetingen weergegeven in Figuur 1 met behulp van een 3D-printer of traditionele mechanische werkplaatsgereedschap.
- Pipetteer ongeveer 1,5 mL gesmolten 1% agarose in een 35-mm kunststof ophangsysteem schotel. Plaats de plastic mal in de vloeibare agarose, verzorgen om te voorkomen dat de lucht van de overlapping tussen de schimmel en de agarose. Zet de schotel bij 4 ° C, wachten tot de agarose verhardt (dit duurt ongeveer 5 minuten) en deze vervolgens verwijdert de plastic mal.
- De montage schotel voor later gebruik opslaan, dekking van de schotel met het deksel, dan wikkel zowel de schaal als het deksel strak met parafilm. De montage schotel kan vervolgens worden opgeslagen deksel kant naar beneden tot maximaal 5 dagen bij 4 ° C.
- Bereiden 1 mL aliquots van 0,7% lage smeltpunt agarose in 1,5 mL Eppendorf buizen te gebruiken op de dag van montage.
Opmerking: De agarose putten van de montage-schotel zal vervormen na verloop van tijd als water verdampt als parafilm niet strak om de gerechten is gewikkeld.
2. het verkrijgen van embryo's voor de Photoconversion
- In de GS (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) lijn en groeien ongeveer 200 embryo's in embryo medium in het donker bij 28,5 ° C. Raadpleeg voor meer informatie over hoe te steken zebrafish lijnen, de JoVE Science Education Database-11.
- Na 5 h maar vóór 24u, behandeling van embryo's met 1-fenyl-2-thioureum (FTU) pigment vorming te voorkomen (0.003% FTU in embryo medium).
- Ongeveer 1 uur vóór het begin van de photoconversion, scherm embryo's onder een fluorescente stereoscoop en selecteer 5 gezonde embryo's die lijken te uiten de helderste groene fluorescentie. Het gebruik van lage-intensiteit licht bij het visualiseren van embryo's wordt aanbevolen om Vermijd blootstelling van de embryo's aan omgevingslicht om te voorkomen dat photoconverting Kaede in niet-specifieke cellen.
3. insluiten
- 10 mL van de montage van de media voor te bereiden: 0.02% tricaïne en 50 mM BDM embryo medium.
- Voeg van 2 mL van montage medium aan de montage schotel en laat 15-30 min. voor de oplossing te verspreiden in de agarose.
- In de tussentijd smelt een hoeveelheid van 1 mL van 0,7% lage smeltpunt (LMP) agarose door het plaatsen van de buis in een blok warmte 70 ° C gedurende ongeveer 5 minuten.
- Wachten op de LMP agarose lichtjes afkoelen, dan 25 µL van tricaïne oplossing van 8 mg/mL en 40 µL van 1M BDM oplossing toevoegen aan de buis van lage smeltpunt agarose. Meng door pipetteren op en neer, breng de buis naar een 38 ° C warmte blok te houden van de LMP agarose in zijn vloeibare toestand.
- In een Petri schotel met embryo medium, zorgvuldig dechorionate de voorgeselecteerde embryo's onder de stereomicroscoop met pincet, verzorgen niet tot schade van de embryo's.
- De embryo's overbrengen in een aparte schotel met 2 mL media te monteren.
- Wanneer de harten van de embryo's worden gestopt (duurt ongeveer 5-10 min), overdracht de embryo's naar de montage schotel en schik embryo's in de putjes met behulp van Tang zodat ze onder een hoek van 25 graden liggen, tails wijst naar het bovenste gedeelte van het goed, de dooier naar boven.
- Wanneer de embryo's zijn ruwweg in plaats, verwijder het medium, de embryo's insluiten in ~ 200 µL van 0,7% LMP agarose met tricaïne en BDM, en passen de embryo's posities, kantelen van de embryo's naar links of naar rechts als nodig.
- Wacht totdat de LMP agarose sets (duurt ongeveer 5 minuten), vervolgens montage medium aan het gerecht toevoegen. De embryo's zijn nu klaar om te worden photoconverted.
Opmerking: De tricaïne en de BDM worden gebruikt om de anesthetize van de embryo's en om te stoppen met de embryo's hart, respectievelijk. Montage media kan worden voorbereid voor de dag voor imaging, maar zorg ervoor dat de media te beschermen tegen licht.
Opmerking: De juiste positionering van de embryo's is belangrijk dat er een duidelijke laser-pad naar de cellen die men te photoconvert wenst. Positie van het hoofd van het embryo dicht bij het begin van de put zodat laserlicht hoeft niet te reizen ver te bereiken van het embryo, en zodat de embryo's kunnen gemakkelijk gemonteerd na photoconversion.
4. Photoconversion
- Op een rechtop confocal microscoop (zoals Leica SP8) uitgerust met een 405 nm, 488 nm en 561 nm laserbron, zoek het embryo is verzonden met behulp van hart wit licht (helderveld) en een objectief (graag Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 doelstelling). Controleren op rode Kaede fluorescentie met behulp van de 561 nm laser (dat wil zeggen, DPSS 561 laser, bij ~ 5% intensiteit, detector vastgesteld op 589-728 nm). Vervolgens visualiseer het endocard met behulp van de 488 nm laser (dat wil zeggen, 30 mW multiline Argon laser bij ~ 5% intensiteit, detector vastgesteld op 502-556 nm).
- "FRAP" modus op de Microscoop verwerving software. Selecteer ~ 1% laser macht voor beide 488 nm en 561 nm lasers.
- Richten zich op het vlak van belang, een regio van belang (ROI), selecteer vervolgens photoconvert cellen met behulp van de 405 nm diode laser op 25% laser kracht, drie keer over de ROI scannen. Onvoldoende Kaede moet worden photoconverted in de ROI, scan de 405 nm laser over het gebied drie keer opnieuw. Herhaal deze stap voor alle ROIs.
- Keren naar de modus "TCS SP8" op de software en het verwerven van een z-stack, met behulp van de 561 nm en 488 nm lasers opeenvolgend. Zorg ervoor dat de optie 'bidirectionele' imaging snelheid te verhogen.
Opmerking: Hoe lang het duurt om photoconvert en beeld die elk embryo varieert. Hartslag is bekend dat belangrijk is voor normaal hart ventiel ontwikkeling, dus vermijden houden het hart gestopt voor meer dan 30 min, zelfs als dat betekent dat u geen tijd om te photoconvert alle 5 embryo's.
Opmerking: Tijdens het photoconversion gebruik bet detectoren, terwijl als photoconversion, wordt het aangeraden om te gebruiken hybride detectoren ingesteld op 'tellen' modus. Dit is omdat de hybride detectoren gevoeliger zijn en geschikt zijn voor het produceren van betere kwaliteitsbeelden, maar zijn gemakkelijk beschadigd door overmatige blootstelling.
5. unmounting photoconverted embryo 's
- Na photoconversion, kunt een glazen pipet ingedrukt licht net boven het hoofd van het embryo te breken de LMP agarose, dan zachtjes zuigen op het embryo.
- Het werpen van het embryo van de glazen pipet in een 35-mm petrischaal met embryo medium met FTU (weg te wassen met middellange BDM).
- De embryo transfer naar een goed in een 6-well plaat met embryo medium met FTU. Tijdens deze stap, zorg ervoor om te houden van nota van welke embryo gaat in die Nou, zoals dit essentieel is voor de positie van photoconverted cellen op later ontwikkelingsstadia correleren.
- Nu dat de embryo's worden verwijderd uit het BDM met medium, beginnen hun hart weer in ongeveer 5 min. terugkeer embryo's het donker bij 28,5 ° C om embryo's te blijven ontwikkelen normaal te verslaan.
6. imaging photoconverted cellen in later embryonale stadia
- De gewenste stadium, het hart stoppen en opnieuw insluiten van de embryo's zoals onder stap 3 van dit protocol, met het belangrijke verschil dat de embryo's moeten worden behandeld met BDM in afzonderlijke, duidelijke gerechten om embryo's bij te houden.
- Voor embryo's tot 62 hpf, verwerven van z-stacks van het endocard met behulp van 561 nm en 488 nm voor rode en groene TL-signalen, respectievelijk. Voor embryo's in stadia ouder dan 62 hpf, gebruik een multiphoton laser ingesteld op 940 nm tot beeld van groene Kaede in plaats van de 488 nm laser.
7. beeldanalyse voor embryo's onder 48 hpf
Opmerking: Weefsel bewegingen van de AVC moeilijk kunnen zijn om te analyseren als gevolg van de complexe driedimensionale structuur. Om te kwantificeren van de lengte van een photoconverted gebied in de AVC tussen twee niet-photoconverted regio's of de lengte van een niet-photoconverted gebied in de AVC tussen twee photoconverted-regio's, het kan wenselijk zijn te weerspiegelen de driedimensionale structuur op een tweedimensionale kaart. Beelden van photoconverted embryo's verkregen vóór 48 hpf kan worden geanalyseerd met behulp van de volgende methode.
- De verworven afbeeldingen in Matlab of soortgelijke software importeren.
- Handmatig de ROI, d.w.z. het endocard, afgebakend en toepassen van een masker om te verwijderen het signaal buiten deze regio.
- De drempel van een intensiteit van toepassing op de afbeelding om de punten op het endocard identificeren en plot ze in drie dimensies. Isoleren van de punten die overeenkomen met het smalste en meest rechte deel van de AVC, door handmatig wissen de punten geen rente over het atrium en het ventrikel met behulp van de opdracht wissen in de software.
- Gebruiken een cilinder past de punten vertegenwoordigen de AVC aldus verkregen.
- Definieer een referentiesysteem om te vergelijken verschillende monsters. Bijvoorbeeld, het aannemen van het massamiddelpunt van de AVC-punten als de oorsprong van het referentiesysteem en de as van de ingerichte cilinder als de z-as.
- Zorg ervoor dat de positieve z-posities altijd correspondeert aan dezelfde kant van het hart (ventriculaire of atriale).
- Project de AVC punten op de x-y vlak en een ellips gebruiken om ze te passen.
- Draai de endocardial punten rond de z-as zo dat de hoofdas van de ovaal en de y-as van het referentiesysteem zijn parallel en positieve y-waarden komen met de interne kant van de AVC ten aanzien van het embryo overeen.
- Om het segment van de AVC, snijd de driedimensionale dataset met sommige vliegtuigen verkregen door het draaien van de halfvlak {y = 0, x > 0} in de z-richting.
- Project van de intensiteit van de aangrenzende pixels op deze vliegtuigen en het endotheel definiëren op een consistente wijze. Bijvoorbeeld handmatig een lijn tekenen van de atriale naar de ventriculaire kant van de AVC bij halve dikte van het endotheel.
- Interpoleren van de punten van de lijnen waarmee het endotheel met een driedimensionale spline met behulp van de werkset spline te vertegenwoordigen de AVC met een oppervlak.
Opmerking: Het aantal de knipvlakken bepaalt zowel de nauwkeurigheid van de segmentatie en het verbruik van de tijd van deze stap. 8 vliegtuigen zijn meestal genoeg om goede resultaten te bereiken.
- De azimutale positie van elk punt op het oppervlak van de AVC met behulp van cilindrische coördinaten bepalen.
- Definieer een parametrische kromme langs het oppervlak van de AVC door het berekenen van de booglengte op de oppervlakte tussen opeenvolgende punten op elke azimutale positie.
- Voor elke parametrische kromme, definieert u het punt op de curve die zich het dichtst bij het midden van de AVC tot nul. De punten van de AVC zijn dus volledig beschreven door hun azimutale positie en hun positie op de parametrische kromme.
- Ontvouwen van de AVC tot een twee-dimensionale afbeelding met behulp van de parametrische positie van de punten.
- De randen van de regio te kwantificeren als de randen van de binaire image drempelmethode de verhouding tussen de intensiteiten van de photoconverted en de niet-photoconverted-kanalen te zoeken. Handmatig het resultaat te corrigeren indien nodig.
- Bereken de booglengte tussen de randen voor het berekenen van de lengte van het weefsel als een functie van de azimutale positie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van een embryo photoconverted op 48 hpf en beeld weer bij 80 hpf wordt weergegeven in Figuur 2, films 1 en 2. Kaede bloot aan licht van 405 nm onherroepelijk bekeerlingen van de eiwitten uit zijn fluorescente groene vorm aan fluorescerende rode vorm, waardoor het gedrag van cellen die zijn gemarkeerd met de groene of de rode vorm moet worden gevolgd met betrekking tot hun differentieel gekleurde buren tijdens de vorming van de klep. Het kan worden gezien dat de paar photoconverted cellen van de 48 hpf AVC later ontwikkeld en later overwegend aan één zijde van het ventiel in de bijsluiter verbleven.
Een voorbeeld van de resultaten die bereikt worden door toepassing van de beschreven methode voor de analyse van afbeelding op een 36 hpf embryo na photoconverting EdCs in het atrium en het ventrikel is afgebeeld in Figuur 3. De segmentatie van de AVC staat de parametrisatie van de driedimensionale structuur, die vervolgens wordt geprojecteerd in twee dimensies voor gemakkelijker visualisatie en analyse. De methode kan men de afstand tussen de twee regio's van de photoconverted te kwantificeren. Door herhaling van dit proces op verschillende ontwikkelings tijden is het mogelijk om te bestuderen van de migratie van de cellen naar de AVC (Boselli et al., in druk)9.
Figuur 1 : Schimmel gebruikt voor het maken van agarose wells. A) vooraanzicht. B) achteraanzicht. C-D) Zijaanzicht. E-F) Schuine uitzichten. Afmetingen zijn weergegeven in millimeter. De. STL-bestand voor de schimmel sjabloon vindt u in de aanvullende materialen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatieve resultaten van een GS (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) photoconverted embryonale hart. A) het embryonale hart net na photoconversion op 48 hpf. Cytoplasmatische Kaede binnen verschillende cellen van de superieure kant van de AVC heeft uit haar groene formulier omgebouwd tot de rode vorm. B) het dezelfde embryo bij 80 hpf. Het kan worden gezien dat de eerder photoconverted cellen zich hebben verspreid en zijn gekomen om te verblijven in de binnenzijde van de superieure Atrioventriculaire klep. Schaal bars: 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Representatieve resultaten van de analyse van het proces van de image op een 36 hpf embryo. A) het resultaat van de drie-dimensionale segmentatie van de AVC in een referentiesysteem dat gebruikelijk is bij de embryo's; het signaal van de photoconverted (magenta) en niet-photoconverted (groen) Kaede wordt geprojecteerd op het oppervlak en de regio's photoconverted en niet-photoconverted worden gemarkeerd. B) de AVC is ongevouwen volgens de parametrische positie van het punt en het signaal wordt geprojecteerd in twee dimensies voor gemakkelijker visualisatie. De randen van de niet-photoconverted regio worden aangeduid in wit. C) de lengte van de niet-photoconverted regio wordt uitgezet als functie van de hoekige positie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Film 1: het embryonale hart net na photoconversion op 48 hpf. Gerelateerd aan figuur 2A. De film gaat door de verworven z-stack van de 48 hpf embryo weergegeven in figuur 2A z segment door z segment. Slechts één z vliegtuig werd gekozen tijdens het photoconversion-proces, maar het kan hier worden gezien dat cellen op verschillende dieptes photoconverted zijn geweest. Z segmenten zijn verdeelde 2 µm uit elkaar. Klik met de rechtermuisknop om te downloaden van deze film.
Movie 2: het hart photoconverted embryonale bij 80 hpf. Gerelateerd aan figuur 2B. De film gaat door de verworven z-stack van de 80 hpf embryo weergegeven in figuur 2B z segment door z segment. Z segmenten zijn verdeelde 2 µm uit elkaar. Klik met de rechtermuisknop om te downloaden van deze film.
Aanvullende bestand: Gerelateerd aan Figuur 1. De. STL-bestand voor de schimmel-sjabloon. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Timing van photoconversion: Hoewel Kaede blijft helder uitgedrukt in EdCs zelfs bij 96 hpf, opgemerkt moet worden dat als het embryo groeit, laserlicht meer diffundeert voordat zij de AVC tot, beperkte photoconversion van Kaede moeilijker te maken. At embryonale stadia later dan 55 hpf, het ballonvaren van het ventrikel en het atrium betekent ook dat de paarse laserstraal gebruikt voor photoconversion AVC cellen zonder eerste doorsnijdt het atrium of de ventrikel niet bereiken. Dit betekent dat voorbij 55 hpf, om photoconvert EdCs van de AVC, moet men ook photoconvert extra EdCs in het atrium en het ventrikel.
DTB en tricaïne: nauwkeurige photoconversion van EdCs vereist het hart van de afstraffing tijdelijk te stoppen. DTB (2,3-butaandion monoxime) is een electro-contractiele uncoupler dat is bekend bij het onderdrukken van de hartspier contractie12. Wij verschillen tussen de morfologie van embryo's die dit protocol hebben ondergaan niet respecteren, en embryo's die normaal zijn gegroeid en hebben niet had hun hart gestopt voor imaging. Het risico blijft echter dat de medicamenteuze behandeling is het wijzigen van normale ontwikkeling13. Geconcentreerd tricaïne kan ook worden gebruikt om tijdelijk stoppen met het hart14. Wij vinden dat wij kunnen effectief stoppen met het hart door het plaatsen van embryo's in embryo medium met 0.32% tricaïne voor 1 min en het hart zijn gestopt blijven handhaven door de overdracht van de embryo's aan embryo medium met 0,16% tricaïne. Vergelijkbaar met de behandeling van BDM, het hart kan gestopt worden deze manier voor 30 min en hartslag kan worden gezien om terug te keren binnen 5 min na zijn terugkeer van embryo's tot normale embryo medium. Hogere concentraties van tricaïne moeten worden vermeden; lage concentraties van tricaïne gedurende langere tijd (h/dagen) heeft aangetoond dat het beïnvloeden van normale embryonale ontwikkeling15,16. Tricaïne oplossing gebruikt voor het stoppen van het hart is best vers bereid. Als bevroren aliquots worden gebruikt, controleert u of de oplossing goed beschermd tegen licht en ontdooiing van de tricaïne zonder verwarming van de oplossing boven 30 ° C. Tot slot heeft blebbistatin gemeld om te stoppen met het hart zonder ernstige bijwerkingen13. Deze laatste methode hebben wij niet in ons lab getest.
Mounting en unmounting: juiste positionering van de embryo's is essentieel tijdens photoconversion. De mal voor het maken van agarose wells vergemakkelijkt de montage van embryo's zodanig dat de anterior-posterior-as van het embryo consequent bij 25° ten opzichte van het oppervlak van de schotel ligt. De schimmel kan worden toegepast op voor photoconversion hebben wij helemaal ontwikkelingsstadia tussen 36 en 55 hpf gevonden. In montage moet de kantelen van het embryo in de links-rechts-richting worden aangepast volgens de embryo's ontwikkelingsstadium en de ruimte die men te photoconvert wenst. Bijvoorbeeld, om photoconvert de AVC op 36 hpf, het embryo moet het gezicht van ongeveer 15° naar links, terwijl bij 55 hpf, het embryo moet het gezicht van ongeveer 10° naar links. Onder de stereomicroscoop, moet u zitten kundig voor zien van de AVC vrije door het ventrikel of het atrium. Als, bijvoorbeeld, het atrium ligt over de AVC, zou het niet mogelijk zijn naar photoconvert net de AVC of gewoon het atrium. Voor imaging-doeleinden, is het dezelfde mal gebruikt voor plaatsing van embryo's tussen 36 en 96 hpf. De schimmel kan worden gemaakt met behulp van een verscheidenheid van materialen met behulp van een 3D-printer of het gebruik van traditionele mechanische werkplaatsgereedschap. Roestvrij staal of chemische stof en hitte bestendig kunststof zijn beide geschikt materiaal. Indien de lezer wenst te maken van de mal met behulp van een 3D-printer, raadpleegt u aanvullende informatie voor de. STL-bestand van de schimmel-sjabloon.
Toevoegen van voldoende LMP wordt agarose ter dekking van het hele embryo geadviseerd om ervoor te zorgen dat de embryo's niet worden verdreven tussen montage en photoconversion/imaging, vooral als de Microscoop niet direct aan het station van montage ligt. In het algemeen, op voorwaarde dat de embryo's zijn goed gemonteerd, doet LMP agarose niet vasthouden aan de embryo's na het ontkoppelen. Echter moet sommige LMP agarose blijven steken op het embryo, de LMP agarose kan verwijderd worden door voorzichtig plagen het embryo van de agarose met pincet.
Embryo's, met name embryo's minder dan 48 hpf, kunnen gemakkelijk beschadigd worden tijdens het koppelen en ontkoppelen. Voor embryo's minder dan 48 hpf, is het raadzaam brand het einde van de glazen pipet om te voorkomen dat schadelijke embryo's tijdens pipetteren polijsten.
Microscoop: dit protocol werd uitgevoerd met behulp van een Microscoop Leica SP8. Echter, photoconversion is een gevestigde proces en dit protocol moet gemakkelijk converteerbare aan andere rechtop microscopen uitgerust met lasers geschikt voor het produceren van 405 nm, 488 nm en licht van 561 nm. Voor embryo's tot 62 hpf, beelden werden verkregen met behulp van een laser argon excitatie en een laser DPSS 561 voor groene en rode Kaede, respectievelijk. Voor embryo's in stadia ouder dan 62 hpf, groene Kaede kan worden opgewekt met behulp van een multiphoton laser ingesteld op 940 nm, die een grotere diepte van de penetratie dan licht van 488 nm heeft. In theorie, rode Kaede moet een twee-foton excitatie spectra vergelijkbaar met die van DsRed, en image op 950 nm17zou kunnen worden gemaakt.
Een objectief met een hoge numerieke lensopening is vereist voor efficiënt photoconvert EdCs en hoge resolutie beelden te verwerven. Aangezien de embryo's worden gehouden in de media, is het belangrijk om te kiezen van een microscoop voorzien van een water-objectief.
Photoconverting de regio van belang: het is raadzaam om de conservatieve worden bij het selecteren van de ROI photoconvert - de 405 nm laser diffundeert als het reizen door weefsel en kan photoconvert cellen in een gebied groter dan die geselecteerd. Als, bijvoorbeeld, u wilt een cel rood label maar wil de cel direct grenzend aan het groen blijven, is het wellicht verstandig om Selecteer alleen het gedeelte van de cel liggen verder uit de buurt van de aangrenzende cel als uw ROI. Aangezien Kaede wordt uitgedrukt in het cytoplasma van EdCs, zal photoconverted eiwit verspreiden naar delen van de cel niet geselecteerd door de ROI.
Photobleaching en fototoxiciteit: The Kaede eiwit, beide zijn groene en rode vormen, is extreem helder en photobleaching is meestal niet een beperkende factor in cel bijhouden van experimenten. Echter laserlicht kan invloed hebben op embryonale ontwikkeling en moet worden geminimaliseerd, vooral tijdens de vroege stadia van ontwikkeling. Tekenen van fototoxiciteit omvatten vertraging in de ontwikkeling en, in meer ernstige gevallen, onjuist hart looping en misvormde kleppen.
De kracht van de violette laser (25%) en het aantal iteraties de violette laser over de ROI scant (3 - 6 keer) gebruikt in dit protocol werden empirisch bepaald. Aan deze instellingen zagen we bijna volledige conversie van Kaede van haar groen naar rode vorm zonder merkbare vertraging in de ontwikkeling. Het bedrag van de macht van de laser vereist in andere opstellingen microscopie zou afhangen van de intensiteit van de laser. Opgemerkt moet worden dat de rode vorm van Kaede kan worden gebleekt door intens 405 nm verlichting, dus langer photoconversion geen noodzakelijkerwijs meer rode fluorescentie oplevert.
Beeldanalyse: de methode voorgesteld voor de beeldanalyse een nieuw ontwikkelde proces is te beschrijven de driedimensionale geometrie van de AVC en het onder de embryo's te vergelijken. Het is bedoeld om te worden toegepast op enkelgelaagde buisvormige structuren, zoals de AVC voordat 48 hpf en potentieel de buis van het hart, de dorsale aorta en anderen. Het is voornamelijk automatische, hoewel de segmentatie op de knipvlakken wordt handmatig uitgevoerd door de gebruiker en andere stappen potentieel handmatige correctie vereisen kon. De handmatige segmentatie vertegenwoordigt het meest kritische deel van het proces, aangezien de kennis van de geometrie van de structuur en de opleiding nodig zijn om goede resultaten te bereiken. Na het oefenen, is de tijd-consumptie van deze stap aanzienlijk kleiner zijn.
Het protocol hier beschreven biedt een effectieve manier om het endocardial weefsel bewegingen tijdens de AVC en Atrioventriculaire hart ventiel ontwikkelen met behulp van de GS (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) zebrafish transgene lijn volgen.
Op dit moment is een van de belangrijkste beperkingen van deze methode dat de Violette laserstraal niet in de axiale dimensie beperkt is. Dit bemoeilijkt de doelgerichtheid van afzonderlijke cellen voor photoconversion, en vandaar klonale analyses en eencellige bijhouden. Twee jaar geleden werd ontdekt dat de photoconvertible proteïne die dendra2 kan gevuld worden omgezet - het eiwit kan worden geconverteerd van de groene vorm naar de rode vorm door eerste het bestralen van het eiwit met blauw licht, en vervolgens met de nabij-infrarood licht18. Microscoop opstellingen die misbruik maken van deze eigenschap kunnen photoconvert Dendra2 waarin cellen in een ruimtelijk beperkte wijze complexe 3D weefsel structuren terwijl het vermijden van veel van de fototoxiciteit problemen in verband met intens in de buurt van-UV-bestraling18 , 19 , 20. met de recente ontdekking van het moleculaire mechanisme achter dit fenomeen, varianten van veel groen-naar-rood photoconvertible fluorescerende eiwitten, met inbegrip van Kaede, hebben ontworpen zodat die ook kan komen van een primer intermediair staat21. Om onze kennis zijn zebravis transgene lijnen waar een promotor zoals fli1a of kdrl drijft de expressie van eiwit Dendra2 of andere primer converteerbare fluorescente proteïnen in de endotheliale cellen nog niet beschikbaar. Echter, lijnen die overal Dendra2 express zijn beschikbaar en kunnen nuttig zijn in bepaalde toepassingen 22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflict verklaard.
Acknowledgments
Wij wil Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli en Basile Gurchenkov bedanken voor het helpen bij het ontwerpen en maken van de mal beschreven in dit protocol. Dit werk werd gesteund door de ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), de EMBO jonge onderzoeker programma, FRM (DEQ20140329553), de EUROPESEGEMEENSCHAP, ERC CoG N ° 682938 Evalve en door de subsidie ANR-10-LABX-0030-INRT, een Franse staat Fonds beheerd door het Agence Nationale de la Recherche onder het frame programma Investissements d'Avenir label ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
