Summary
该协议描述了在活斑马鱼胚胎的心内膜细胞中 photoconversion 枫荧光蛋白的方法, 能够在房室管和房室心脏瓣膜发育过程中跟踪心内膜细胞。.
Abstract
在胚胎发生过程中, 细胞在细胞行为中发生动态变化, 破译这些变化背后的细胞逻辑是发育生物学领域的一个基本目标。photoconvertible 蛋白的发现和发展极大地帮助我们理解这些动态变化, 提供了一种光学突出细胞和组织的方法。然而, 虽然 photoconversion, 时间推移显微镜, 和随后的图像分析已经证明是非常成功的揭露细胞动力学的器官, 如大脑或眼睛, 这种方法一般不使用在发展中的心脏由于心脏循环过程中心的快速运动所带来的挑战。该协议由两部分组成。第一部分介绍了在斑马鱼房室管 (photoconverting) 和房室心脏瓣膜发育过程中, 对心内膜细胞 (EdCs) 进行追踪和跟踪的方法。该方法包括用药物暂时停止心脏, 以便准确 photoconversion 发生。心脏被允许恢复跳动后, 药物的清除和胚胎发育继续正常, 直到心脏再次停止的高分辨率成像 photoconverted EdCs 在以后的发展时间点。该协议的第二部分描述了一种图像分析方法, 通过将三维结构中的荧光信号映射到二维地图上来量化 photoconverted 或非 photoconverted 区域在幼胚中的长度.同时, 该协议的两个部分允许一个人检查组成斑马鱼和房室心脏瓣膜的细胞的起源和行为, 并有可能被应用于研究突变体, morphants, 或胚胎, 已治疗破坏 AVC 和/或阀门发展的试剂。
Introduction
斑马鱼目前是最重要的脊椎动物模型之一, 研究细胞和发育过程的在体内。这主要是由于斑马鱼的光学透明度和顺从遗传学, 这使得它成为一个强大的模型应用光学技术涉及基因编码 photoresponsive 蛋白技术1。针对心脏发育的研究, 斑马鱼通过扩散获得足够的氧气, 即使没有心跳的突变体也能在发育的第一周存活下来, 允许分析发育基因的影响和扰动在大多数脊椎动物中, 血流在心脏形态发生是不可能的2。
斑马鱼心脏管由24小时后受精 (hpf) 形成。形成后不久, 心脏管开始积极跳动。由 36 hpf, 清晰的收缩将心房与心室隔开。这一收缩区称为房室道 (AVC), 该区域的细胞从鳞状形态学转变为立方形态学3。斑马鱼房室瓣膜形态发生开始约48小时后受精。5天后受精, 两个瓣膜小叶延伸到 AVC 和防止血液从心室的背部流到心房在心脏周期的4。当心脏的快速跳动使得通过传统的时间失效显微镜5,6时, 跟踪细胞变得困难。此协议从骏马et., 20167, 描述使用 Tg 的方法(fli1a: gal4FF瑞银, 无人参与: 枫)8斑马鱼转基因线, 其中 photoconvertible 蛋白枫表示在内皮细胞, 包括心内膜。药物 23-butanedione 2-肟 (BDM) 用于暂时停止心脏跳动, 允许在36和 55 EdCs 之间精确 photoconversion hpf, 以及在特定发育时间点的 photoconverted EdCs 的高分辨率成像。以前已显示, 使用此方法的 EdCs photoconverted 在 photoconversion7之后的五天或更远的时间内可以与未转换的邻居保持可区分性。该协议还详细介绍了一种用于在 48 hpf 的胚胎中 photoconverted EdCs 的图像分析方法, 它已成功地用于在 AVC 开发过程中的组织运动 (路易吉·博塞利et), 按下)9。我们希望读者能发现这项议定书对于研究正常胚胎中的 AVC 和瓣膜发育, 以及突变体、morphants 或药物治疗的胚胎都是有用的。有关在斑马鱼开发过程中使用 photoconvertible 蛋白进行细胞跟踪的更通用的协议, 请查看由伦巴多et, 201210的文章。
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Protocol
1. 制备模具和安装琼脂糖
- 使用3D 打印机或传统的机械车间工具, 创建具有图 1所示尺寸的模具。
- 吸管约1.5 毫升熔化1% 琼脂糖成35毫米塑料安装盘。将塑料模具放在液体琼脂糖中, 注意避免在霉菌和琼脂糖之间捕获空气。把盘子放在4摄氏度, 等到琼脂糖变硬 (这大约需要5分钟), 然后取出塑料模具。
- 要储存安装盘供以后使用, 用盖子盖上盘子, 然后用 parafilm 把盘子和盖子包起来。安装盘然后可以被存放盖子边面对下来5天在4°c。
- 提前准备1毫升整除数0.7% 低熔点琼脂糖在1.5 毫升离心管使用在安装日。
注: 安装盘的琼脂糖井会随着时间的推移而变形, 因为如果 parafilm 不紧紧缠绕在盘子里, 水就会蒸发。
2. 获得 Photoconversion 的胚胎
- Incross Tg (fli1a: gal4FF瑞银, 无人参与: 枫)线, 在28.5 摄氏度的黑暗中生长大约200胚胎。有关如何跨越斑马鱼线的详细信息, 请参阅朱庇特科学教育数据库11。
- 5小时后, 但在24小时之前, 治疗胚胎与1苯基 2-硫脲 (PTU), 以防止色素形成 (0.003% PTU 在胚胎培养基)。
- 在 photoconversion 开始前约1小时, 在荧光立体镜下筛选胚胎, 并选择5个健康的胚胎来表达最亮的绿色荧光。建议在胚胎可视化时使用低强度光, 以避免胚胎暴露于环境光中, 以避免非特异细胞 photoconverting 枫。
3. 嵌入
- 准备10毫升的安装介质: 0.02% tricaine 和50毫米 BDM 胚培养基。
- 添加2毫升的安装介质到安装盘, 并允许15-30 分钟的溶液扩散到琼脂糖。
- 同时, 将管置于70°c 热块中, 熔化1毫升整除0.7% 低熔点 (LMP) 琼脂糖, 约5分钟。
- 等待 LMP 琼脂糖稍凉, 然后添加25µL 8 毫克/毫升 tricaine 溶液和40µL 1M BDM 溶液到低熔点琼脂糖管。吹打上下混合, 然后将管子转移到38摄氏度的热块中, 以保持 LMP 琼脂糖在其液态状态。
- 在具有胚胎培养基的培养皿中, 用镊子仔细 dechorionate 显微镜下的预选胚胎, 注意不要损伤胚胎。
- 将胚胎移植到含有2毫升安装介质的单独盘子中。
- 当胚胎的心脏停止 (大约5-10 分钟), 转移胚胎到安装盘和安排胚胎在井使用钳, 因此他们说谎在25度角度, 尾巴指向井的更深部分, 蛋黄面对。
- 当胚胎大致到位时, 取出培养基, 将胚胎植入200µL 0.7% LMP 琼脂糖中, 其中含有 tricaine 和 BDM, 并调整胚胎的位置, 必要时将胚胎倾斜到左侧或右侧。
- 等到 LMP 琼脂糖集 (大约5分钟), 然后添加安装培养基的菜肴。胚胎现在已经准备好 photoconverted 了。
注意: tricaine 和 BDM 是用来麻醉胚胎和停止胚胎的心脏, 分别。安装介质可以在成像前一天准备就绪, 但要确保介质不受光线的保护。
注意: 正确的胚胎定位是重要的, 让一个明确的激光路径的细胞你希望 photoconvert。把胚胎的头部靠近井的开始, 这样激光就不必远距离到达胚胎, 这样胚胎就可以很容易地在 photoconversion 后被卸载。
4. Photoconversion
- 在直立共焦显微镜 (如莱卡 SP8) 配备了405毫微米, 488 毫微米和 561 nm 激光源, 找到胚胎的心脏使用透射白光 (brightfield) 和物镜 (如莱卡 HCX IRAPO L, 25 x, 符合0.95 目标)。检查红色枫荧光使用561毫微米激光 (即, DPSS 561 激光, 在5% 强度, 探测器设置在 589-728 nm)。然后, 通过使用 488 nm 激光 (即, 30 兆瓦多行氩激光器在5% 的强度, 探测器设置在 502-556 nm) 可视化心内膜。
- 在显微镜采集软件上输入 "酶" 模式。选择1% 激光功率为488毫微米和 561 nm 激光。
- 关注平面的兴趣, 选择一个感兴趣的区域 (ROI), 然后 photoconvert 细胞使用405纳米二极管激光器在25% 激光功率, 扫描 ROI 三倍。如果不充分枫 photoconverted 在 ROI, 扫描405毫微米激光在区域三次。对所有 ROIs 重复此步骤。
- 返回到软件上的 "TCS SP8" 模式, 并获得一个 z 栈, 使用 561 nm 和 488 nm 激光器顺序。请确保选择 "双向" 选项以提高成像速度。
注意: photoconvert 和图像需要多长时间, 每个胚胎都有变化。心脏跳动是已知的重要的正常心脏瓣膜发展, 所以避免保持心脏停止超过30分钟, 即使它意味着你没有时间 photoconvert 所有5胚胎。
注: 在 photoconversion 过程中, 使用 PMT 探测器, 而在 photoconversion 后, 建议使用混合探测器设置为 "计数" 模式。这是因为混合探测器更敏感, 能够产生更好的质量图像, 但容易受到过度曝光的破坏。
5. 卸载 photoconverted 胚胎
- photoconversion 后, 用玻璃吸管轻轻按压胚头上方, 打破 LMP 琼脂糖, 然后轻轻吮吸胚胎。
- 将胚胎从玻璃吸管中喷射到含有 PTU 胚培养基的35毫米培养皿中 (洗去含有 BDM 的培养基)。
- 将胚胎移植到一个含有胚介质的6井板中, 并 PTU。在这一步, 一定要注意到哪个胚胎进入哪个好, 因为这是必要的, 以关联的位置 photoconverted 细胞在后期发育阶段。
- 现在胚胎从含有培养基的 BDM 中取出, 他们的心脏应该在5分钟内重新开始跳动. 将胚胎恢复到28.5 摄氏度的黑暗中, 让胚胎继续正常发育。
6. 后期胚胎阶段的成像 photoconverted 细胞
- 在理想的阶段, 停止心脏和重新嵌入的胚胎像在这个协议的步骤 3, 具有重要的区别, 胚胎必须处理与 BDM 在单独的, 标记的菜肴, 以保持跟踪的胚胎。
- 对于多达 62 hpf 的胚胎, 分别使用 561 nm 和488纳米的红色和绿色荧光信号获取心内膜的 z 栈。对于 62 hpf 以上阶段的胚胎, 使用多光子激光设置为 940 nm, 以图象绿色枫而不是 488 nm 激光。
7. 48 hpf 下胚胎的图像分析
注: 由于其复杂的三维结构, 该组织的运动可能难以分析。为了量化在两个非 photoconverted 区域之间的 photoconverted 区域的长度, 或在两个 photoconverted 区域之间的非 photoconverted 区域的长度, 可以将三维结构映射到二维地图。在 48 hpf 之前获得的 photoconverted 胚胎的图像可以用以下方法进行分析。
- 导入 Matlab 或任何类似软件中获取的图像。
- 界定手动执行 ROI,即心内膜, 并应用掩码来删除此区域以外的信号。
- 在图像上应用强度阈值来识别心内膜上的点并在三维中绘制它们。通过在软件中使用 "擦除" 命令, 在心房和心室上手动抹去不感兴趣的点, 将对应于 AVC 最窄和最直部分的点隔开。
- 使用气缸来满足代表的 AVC, 所以得到的点。
- 定义一个参考系统来比较几个样本。例如, 作为参考系统的原点和拟合圆柱的轴线作为 z 轴, 采用了该方法的质量中心。
- 确保阳性 z 位置始终对应于心脏的同一侧 (心室或心房)。
- 将在 x-y 平面上的 AVC 点投射出来, 并使用一个椭圆来适应它们。
- 旋转在 z 轴周围的心内膜点, 以便椭圆的主轴和参照系统的 y 轴是平行的, 正 y 值对应于与该胚胎有关的 AVC 的内部一侧。
- 要对 AVC 进行分段, 请通过在 z 方向旋转半平面 {y=0、x > 0} 获得一些平面来剪切三维数据集。
- 投射这些平面上相邻像素的强度, 并以一致的方式定义内皮。例如, 手动绘制一条线, 从心房到心室一侧的 AVC, 在半厚度的内皮。
- 用三维样条来插值表示内皮的线的点, 使用样条工具箱表示与曲面的 AVC。
注: 切割平面的数量决定了分割的准确性和此步骤的时间消耗。通常, 8 架飞机足以达到良好的效果。
- 用圆柱坐标系定义了 AVC 表面上每个点的方位位置。
- 在每个方位位置上, 通过计算连续点之间的弧长来定义一个沿其表面的参数曲线。
- 对于每个参数曲线, 在曲线上定义最接近 AVC 中心的点为零。因此, 在参数曲线上, 对其方位位置和位置进行了充分描述。
- 利用点的参数位置将 AVC 展开为二维图像。
- 找出该区域的边缘以量化为二进制图像的边缘, 以分割 photoconverted 和非 photoconverted 通道的强度比值。如有必要, 手动更正结果。
- 计算边缘之间的弧长, 以计算组织的长度作为方位位置的函数。
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Representative Results
图 2、影片 1和2中显示了一个 48 hpf 的胚胎 photoconverted 的示例, 并在 80 hpf 中再次映像。暴露枫到405毫微米光不可逆转地转换从从它的荧光绿色形式的蛋白质到荧光红色形式, 使标记以绿色或他们的红色形式的细胞的行为将跟随关于他们的差异色邻居在阀门形成期间。可以看出, 48 hpf 的几个 photoconverted 细胞后来激增, 后来主要居住在阀门单张的一侧。
图 3显示了在中庭和脑室 photoconverting EdCs 后应用 36 hpf 胚上描述的图像分析方法可以实现的结果示例。该算法的分割允许三维结构的参数化, 然后在两个维度中投影, 以便于可视化和分析。该方法允许一个量化两个 photoconverted 区域之间的距离。通过在不同的发展时期重复这个过程, 就有可能研究细胞向 AVC (路易吉·博塞利et) 的迁移, 在按下)9。
图 1: 用于创建琼脂糖井的模具。A)前视图。B)后退视图。C D)侧面视图。E F)斜视图。尺寸以毫米显示。的.模具模板的 STL 文件是在辅助材料中提供的。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 具有代表性的结果 Tg (fli1a: gal4FF瑞银, 无人操作: 枫) photoconverted 胚心.A)在 photoconversion 48 hpf 后的胚胎心脏。在枫的高级侧的几个细胞内细胞质中的胞质, 已从其绿色形态转化为红色形态。B) 80 hpf 的同一胚胎。可见, 先前的 photoconverted 细胞已经增殖, 并已进入高级房室瓣膜的内侧。刻度条:20 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3:36 hpf 胚胎的图像分析过程的代表性结果。a)在胚胎中常见的参考系统中对 AVC 进行三维分割的结果;photoconverted (洋红) 和非 photoconverted (绿色) 枫的信号投射到其表面上, 并标记 photoconverted 和非 photoconverted 区域。B)根据其点的参数位置展开 AVC, 并将信号投影到二维, 以便于可视化。非 photoconverted 区域的边缘用白色标记。C)非 photoconverted 区域的长度绘制为角位置的函数。请单击此处查看此图的较大版本.
影片 1: 刚 photoconversion 48 hpf 后的胚胎心脏.与图 2A相关。影片通过 z 切片在图 2A z 切片中显示的 48 hpf 胚的获取 z 堆栈。在 photoconversion 过程中, 只有一个 z 平面被选择, 但在这里可以看到在不同深度的细胞被 photoconverted。Z 切片间距为2µm 分开。右键单击可下载此影片.
影片 2: photoconverted 胚胎心脏在 80 hpf。与图 2B相关。影片通过 z 切片在图 2B z 切片中显示的 80 hpf 胚的获取 z 堆栈。Z 切片间距为2µm 分开。右键单击可下载此影片.
补充文件:与图 1相关。的.用于模具模板的 STL 文件。请单击此处下载此文件.
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Discussion
photoconversion 的定时: 尽管枫在 EdCs 中仍然保持明亮的表达, 即使在 96 hpf, 也应该注意到, 随着胚胎的生长, 激光在到达 AVC 之前扩散得更多, 使得 photoconversion 的限制枫更加困难。在胚胎阶段比 55 hpf, 心室和心房的膨胀也意味着, 用于 photoconversion 的紫激光束不能到达 AVC 细胞, 而不首先穿过心房或心室。这意味着, 在 55 hpf 以后, 为了 photoconvert EdCs, 你必须也 photoconvert 另外的 EdCs 在心房和脑室。
BDM 和 tricaine: 精确 photoconversion EdCs 需要暂时停止心跳。BDM (23-butanedione 肟) 是一种电收缩 uncoupler, 是众所周知的抑制心肌收缩12。我们不观察受本议定书所规限的胚胎形态与正常生长且没有心脏停止成像的胚胎之间的差异。然而, 药物治疗正在改变正常发展的风险仍然是13。浓缩 tricaine 也可用于临时停止心脏14。我们发现, 我们可以有效地阻止心脏通过放置胚胎培养基与 0.32% tricaine 1 分钟, 并保持心脏在其停止状态通过转移胚胎培养基与 0.16% tricaine。类似于 BDM 治疗, 心脏可以停止这种方式为30分钟, 心跳可以看到返回后5分钟内恢复胚胎进入正常胚胎培养基。应避免更高浓度的 tricaine;长期低浓度的 tricaine (h/天) 已被证明影响正常胚胎发育15,16。Tricaine 解决方案, 用于停止心脏是最好的准备新鲜。如果使用冻结整除数, 请确保解决方案保持良好的保护, 免受光照, 并解冻 tricaine, 而不加热溶液超过30摄氏度。最后, blebbistatin 已被报告为停止心脏没有严重的副作用13。我们没有在实验室中测试最后的方法。
安装和卸载: 在 photoconversion 期间, 胚胎的正确定位至关重要。制作琼脂糖的霉菌促进了胚胎的安装, 使胚胎的前后轴始终位于25°相对于盘子的表面。我们发现该模具适用于 photoconversion 在所有发育阶段之间的36和 55 hpf。在安装过程中, 需要根据胚胎的发育阶段和希望 photoconvert 的区域来调整胚胎在左向右方向的倾斜。例如, 要 photoconvert 36 hpf 的 AVC, 胚胎应该在左边大致上是一只, 而在 55 hpf, 胚胎应该在左边大致10°。在显微镜下, 你应该能够看到视野开阔的心室或心房的 AVC。例如, 如果中庭位于 avc 之上, 就不可能只 photoconvert 或只是中庭。对于成像目的, 同一模具用于定位36和 96 hpf 的胚胎。该模具可以使用各种材料使用3D 打印机或使用传统的机械车间工具。不锈钢或化学和耐热塑料都是合适的材料。如果读者希望使用3D 打印机创建模具, 请参阅的补充信息。STL 文件的模具模板。
建议添加足够的 LMP 琼脂糖覆盖整个胚胎, 以确保胚胎不会成为在安装和 photoconversion/成像之间脱落, 特别是如果显微镜没有直接靠近安装站。一般而言, 只要胚胎正确安装, LMP 琼脂糖在卸载后不会粘在胚胎上。然而, 如果一些 LMP 琼脂糖仍然停留在胚胎, LMP 琼脂糖可以通过轻轻地戏弄从琼脂糖使用镊子的胚胎。
胚胎, 特别是小于 48 hpf 的胚胎, 在安装和卸载过程中容易损坏。对于小于 48 hpf 的胚胎, 我们建议对玻璃吸管的末端进行火焰抛光, 以防止吹打中的胚胎受损。
显微镜: 此协议是使用莱卡 SP8 显微镜进行的。然而, photoconversion 是一个完善的过程, 该协议应易于转换为其他直立显微镜配备激光能够产生 405 nm, 488 nm 和 561 nm 光。对于多达 62 hpf 的胚胎, 分别使用氩激发激光器和 DPSS 561 激光进行绿色和红色枫获取图像。对于 62 hpf 以上阶段的胚胎, 绿色枫可以用多光子激光设置为940纳米, 它的穿透深度比 488 nm 的光强。理论上, 红色枫应该有一个类似于 DsRed 的双光子激发光谱, 并且可以在 950 nm17上进行成像。
为了有效地 photoconvert EdCs 和获取高分辨率图像, 需要一个具有高数值孔径的物镜。由于胚胎被保存在介质中, 所以选择一个装有水物镜的显微镜是很重要的。
Photoconverting 感兴趣的区域: 在选择 ROI 时, 最好是保守 photoconvert--405 nm 激光在组织中传播时扩散, 并且可以 photoconvert 比所选区域大的细胞。例如, 如果您希望将单元格标记为红色, 但希望直接相邻的单元格保持绿色, 则仅选择位于相邻单元格中的部分作为 ROI, 可能较为谨慎。由于枫在 EdCs 胞浆中表达, photoconverted 蛋白会扩散到未由 ROI 选择的部分细胞。
漂白和毒性: 枫蛋白 (其绿色和红色) 非常明亮, 漂白通常不是细胞追踪实验的限制因素。然而, 激光照射会影响胚胎发育, 应尽量减少, 特别是在发育的早期阶段。毒性的症状包括发育迟缓, 在更严重的情况下, 不正确的心脏循环和畸形的瓣膜。
紫激光的功率 (25%) 和迭代次数紫激光扫描在 ROI (3-6 倍) 在这个协议中使用了经验主义地被确定了。在这些设置, 我们看到几乎完全转换的枫从它的绿色到红色的形式, 没有明显的发展滞后。其他显微装置所需的激光功率量取决于激光的强度。应该注意的是, 红色的枫可以通过强烈的405纳米光照漂白, 所以更长的 photoconversion 不一定产生更多的红色荧光。
图像分析: 为图像分析提出的方法是一个新开发的过程, 描述了该模型的三维几何形状, 并将其与胚胎进行了比较。它的目的是用于单层管状结构, 如 48 hpf 前的 AVC 和潜在的心脏管, 背主动脉和其他。它主要是自动的, 即使切割平面上的分割是由用户手动执行的, 并且其他步骤可能需要手动更正。手工分割是过程中最关键的部分, 因为需要了解结构几何和训练才能取得良好的效果。练习后, 这个步骤的时间消耗大大减少。
这里描述的协议提供了一个有效的方法来跟踪心内膜组织运动期间, 使用Tg (fli1a: gal4FF瑞银, 无人枫)斑马鱼转基因线在 AVC 和房室心脏瓣膜发展。
目前, 该方法的主要局限性之一是紫激光束不受轴向尺寸的限制。这使单细胞靶向 photoconversion, 因此克隆分析和单细胞跟踪, 困难。两年前, 它被发现 photoconvertible 蛋白质 Dendra2 可以被引导转换-蛋白质可以从它的绿色形式转换成它的红色形式通过首先辐照蛋白质以蓝光, 然后以近红外线光18。利用这种特性的显微镜设置可以 photoconvert Dendra2 在复杂的3D 组织结构中以空间限制的方式表达细胞, 同时避免了与强近紫外照射相关的许多毒性问题18,19,20. 随着最近发现这种现象背后的分子机制, 许多绿色到红色的 photoconvertible 荧光蛋白 (包括枫) 的变种已经被设计出来, 以便也能够进入一个底漆中间体状态21。根据我们的知识, 斑马鱼的转基因线, 如fli1a或kdrl驱动蛋白 Dendra2 或其他可转换的可转化荧光蛋白在内皮细胞中的表达尚未可用。但是, 表示 Dendra2 无所不在的行是可用的, 在某些应用程序22、23中可能会有用。
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Disclosures
没有宣布利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢安妮-玛丽·韦尔坎贝里弗朗辛·杜舍芒, 丹尼斯弗朗辛·杜舍芒, 纳塔莉 Faggianelli 和巴西莱 Gurchenkov 帮助设计和制作本协议中描述的模具。这项工作得到了 FRM (DEQ20140329553)、国家情报局 (ANR-15-CE13-0015-01、ANR-12-ISV2-0001-01)、EMBO 青年调查员计划、欧洲共同体、紧急救济机构 N°682938 Evalve 和赠款 ANR-10-LABX-0030-INRT 的支助, 由一个法国国有基金管理, 由研究所的框架计划 Investissements 艾文莉标记 ANR-10-IDEX-0002-02。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
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