Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה photoconversion של חלבון פלואורסצנטי קאךה בתאים endocardial של החיים העובר דג זברה המאפשרת המעקב של תאים endocardial במהלך תעלת atrioventricular ופיתוח שסתום הלב atrioventricular .
Abstract
במהלך מופרה, התאים עוברים שינויים דינמיים בהתנהגות התא, פיענוח הסלולר ההיגיון מאחורי שינויים אלה היא מטרה היסוד בתחום ביולוגיה התפתחותית. בגילוי ופיתוח של חלבונים photoconvertible במידה רבה כאילו סייע ההבנה שלנו של שינויים דינמיים אלה על-ידי מתן שיטה לסימון שטיחות תאים ורקמות. עם זאת, בעוד photoconversion, מיקרוסקופיה זמן לשגות, ניתוח תמונות עוקבות הוכיחו להיות מאוד מוצלח שיגורי דינמיקה סלולר באיברים כמו המוח או את העין, גישה זו משמשת בדרך כלל לא בלב המתפתח עקב לאתגרים שמציב את התנועה המהירה של הלב במהלך מחזור הלב. פרוטוקול זה מורכב משני חלקים. החלק הראשון מתאר שיטה photoconverting ומעקב לאחר מכן תאים endocardial (והריון) במהלך דג זברה תעלת atrioventricular (AVC) ופיתוח שסתום הלב atrioventricular. השיטה כוללת חנותם עוצר את הלב עם סמים על מנת photoconversion מדויק להתקיים. לבבות מותר לחדש את המכות על הסרת התרופה ואת התפתחות נמשכת בדרך כלל עד הלב הוא נעצר שוב עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של photoconverted והריון בשלב מאוחר יותר זמן התפתחותית. החלק השני של הפרוטוקול מתאר שיטת ניתוח התמונה כדי לכמת את האורך של אזור photoconverted או אי-photoconverted AVC ב צעירים העוברים על-ידי מיפוי האות פלורסנט מתוך מבנה תלת-ממדי על גבי מפה דו-ממדית . יחד, שני חלקי הפרוטוקול מאפשר לבחון את מקור וההתנהגות של תאים המרכיבים את דג זברה AVC ואת מסתמי הלב atrioventricular ולאחר פוטנציאלי יכול להיות מיושם עבור לומד מוטציות, morphants או עוברי שטופלו עם ריאגנטים לשבש את התפתחות AVC ו/או שסתום.
Introduction
דג זברה נחשב כיום לאחד הדגמים חוליות החשוב ביותר ללמוד הסלולר תהליכים התפתחותיים ויוו. זה נובע במידה רבה שקיפות אופטית של דג זברה ולקודדו amenability על גנטיקה, מה שהופך אותו במודל רב עוצמה על יישום טכניקות אופטי מעורבים גנטית photoresponsive חלבון טכנולוגיות1. ספציפיים בחקר התפתחות הלב, דג זברה מקבלים מספיק חמצן באמצעות דיפוזיה כזה כי מוטציות אפילו ללא דופק יכולים לשרוד עד השבוע הראשון של פיתוח, התרת ניתוחים על ההשפעות של גנים התפתחותית, מודאג זרימת הדם על הלב מורפוגנזה לא אפשרי חולייתנים רוב2.
הצינור הלב דג זברה נוצר על ידי הפריה פוסט 24 שעות (hpf). זמן קצר לאחר הקמתו, הצינור הלב מתחיל לפעום באופן פעיל. על ידי 36 hpf, כיווץ ברור שמפריד האטריום מן החדר. אזור זה של הכיווץ נקראת התעלה atrioventricular (AVC), ועל תאים שינוי אזור זה של מורפולוגיה קשקשיים מורפולוגיה cuboidal3. דג זברה שסתום atrioventricular מורפוגנזה מתחיל בסביבות 48 שעות פוסט הפריה. על ידי 5 ימים פוסט הפריה, משני עלעלים שסתום להרחיב AVC, למנוע את זרימת הדם מן הנוזלים לאטריום גב במהלך מחזור לב4. מעקב אחר תאים במהלך היווצרות AVC שסתום הוא מאתגר כמו המכות מהיר של הלב ומקשה לעקוב אחר תאים באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות המסורתית5,6. פרוטוקול זה, משנת סטיד. et al., 20167, מתאר שיטה המשתמשת Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 דג זברה מהונדס הקו, שבו מתבטאת החלבון photoconvertible קאךה תאי אנדותל, כולל את endocardium. התרופה 2, 3-butanedione-2-monoxime (BDM) משמש כדי לעצור באופן זמני את פעימות לבי ומאפשר photoconversion מדויק של והריון בין 36 ל 55 hpf, דימות ברזולוציה של photoconverted והריון בנקודות זמן התפתחותית מסוימת. בעבר הוכח כי photoconverted והריון בשיטה זו יכול להישאר להבדיל מהשכנים אשר במשך חמישה ימים או יותר אחרי שעת photoconversion7. פרוטוקול זה מפרט גם שיטה לניתוח תמונה של photoconverted והריון ב עוברי צעיר יותר 48 hpf, אשר שימש בהצלחה כדי לעקוב אחר תנועות רקמות במהלך AVC פיתוח (בוזלי. et al., בעיתונות)9. אנו מקווים כי הקוראים שימושיות פרוטוקול זה ללמוד AVC ופיתוח שסתום עוברי רגילה, וכן מוטציות, morphants או עוברי שטופלו בסמים. עבור פרוטוקול כלליים יותר הקשורים תא מעקב באמצעות חלבונים photoconvertible במהלך הפיתוח דג זברה, בבקשה להציג את המאמר על ידי לומברדו. et al., 201210.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תבניות והרכבה agarose
- צור תבנית עם מידות איור 1 באמצעות מדפסת תלת-ממד או כלים מסורתיים וטכני.
- פיפטה בערך 1.5 מ של agarose 1% מומסת לתוך תבשיל הרכבה פלסטיק 35 מ מ. מקום כייר פלסטיק agarose נוזלי, מקפיד להימנע השמנה אוויר בין כייר את agarose. מקם את המנה ב 4 ° C, חכה עד agarose מתקשה (זה לוקח בערך 5 דקות) ולאחר מכן להסיר את כייר פלסטיק.
- כדי לאחסן את המנה הרכבה לשימוש מאוחר יותר, מכסים את המכסה שלה, ואז לעטוף את המנה וגם את המכסה בצורה הדוקה עם מצלמות-מיקרוסקופים. לאחר מכן ניתן לאחסן את המנה הרכבה המכסה פונה כלפי מטה עד 5 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס.
- להכין מראש 1 מ"ל aliquots כ- 0.7% agarose נקודת התכה נמוכה ב- 1.5 mL גלאים צינורות לשימוש ביום של הרכבה.
הערה: הבארות agarose של המנה הרכבה עיוות לאורך זמן כמו המים מתאדה אם מצלמות-מיקרוסקופים הוא לא מסובבת את הכלים בחוזקה.
2. קבלת את העוברים על Photoconversion
- Incross Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) קו ולגדול כ 200 עוברי במדיום העובר בחושך-28.5 ° C. לפרטים נוספים על איך לחצות קווים דג זברה, נא עיין יופיטר מדעי החינוך מסד נתונים11.
- לאחר 5 שעות אך לפני 24 שעות, מתייחסים העוברים עם 1-phenyl-2-thiourea (פרופילתיואוראציל) כדי למנוע היווצרות פיגמנט (0.003% פרופילתיואוראציל במדיום העובר).
- בערך 1 h לפני תחילת photoconversion, מסך העוברים תחת סטריאוסקופ פלורסנט, בחר 5 העוברים בריאים זה מופיעים לבטא את קרינה פלואורסצנטית ירוקים בהירים. השימוש של אור בעוצמה נמוכה כשמתכננים העוברים מומלץ להימנע מחשיפה של העוברים תאורת כדי להימנע photoconverting קאךה בתאים שאינם ספציפיים.
3. הטמעה
- הכינו 10 מ"ל של הרכבה מדיה: 0.02% tricaine ו-50 מ"מ BDM במדיום העובר.
- להוסיף 2 מ של הרכבה בינוני למנה גובר ולאפשר 15-30 דקות עבור הפתרון לנטרל את agarose.
- בינתיים, ממיסים את aliquot 1 מ"ל של 0.7% נקודת התכה נמוכה (LMP) agarose על-ידי הצבת את הצינורית בתוך גוש חום 70 מעלות צלזיוס למשך כ- 5 דקות.
- מחכה agarose LMP להתקרר מעט, ואז להוסיף הצינורית של נקודת התכה נמוכה agarose 25 µL של פתרון tricaine 8 מ"ג/מ"ל, µL 40 של 1 מ' BDM פתרון. מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה, ואז להעביר את הצינור גוש חום 38 ° C כדי לשמור את agarose LMP במצב נוזלי.
- ב פטרי צלחת עם העובר בינוני, בזהירות dechorionate העוברים שנבחרו מראש תחת stereomicroscope באמצעות מלקחיים, דואגת שלא יגרמו נזק העוברים.
- העברת העוברים תבשיל נפרד המכיל 2 מ של הרכבה מדיה.
- מתי עצרו את ליבם של העוברים (לוקח בערך 5-10 דקות), העברת העוברים על הרכבה צלחת ומסדרים העוברים בתוך הבארות באמצעות מלקחיים, כך הם משקרים בזווית של 25 מעלות, זנבות והצביע לעבר החלק עמוק יותר של הבאר, חלמון פונה כלפי מעלה.
- כאשר עוברי הן בערך במקום, להסיר את המדיה, להטביע את העוברים ~ 200 µL כ- 0.7% LMP agarose המכיל tricaine BDM, להסתגל העמדות של העוברים, הטיית העוברים שמאלה או ימינה בהתאם לצורך.
- לחכות עד ערכות agarose LMP (לוקח בערך 5 דקות), ולאחר מכן הוספת התגברות בינוני למנה. העוברים מוכנים עכשיו להיות photoconverted.
הערה: את tricaine של BDM משמשים עזים ומתנגד העוברים וכדי לעצור את הלב של העוברים, בהתאמה. הרכבה מדיה ניתן להכין יום לפני הדמיה, אך הקפד על התקשורת מפני אור.
הערה: המיקום הנכון של העוברים חשוב לאפשר נתיב לייזר נקה התאים אחד ורוצה photoconvert. מקם את הראש של העובר קרוב ההתחלה של הבאר כך אור לייזר לא צריך לנסוע רחוק כדי להגיע אל העובר, העוברים שניתן יהיה בקלות שטעינתו בוטלה לאחר photoconversion.
4. Photoconversion
- על מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף (כמו Leica SP8) מצוידים עם 405 ננומטר, 488 ננומטר ומקור 561 ננומטר לייזר, לאתר את העובר של הלב באמצעות ששודרו אור לבן (brightfield), המטרה של העדשה (כמו לייקה HCX IRAPO L, 25 ×, נ. א. 0.95 המטרה). בדוק פלואורסצנטי אדום קאךה באמצעות הלייזר nm 561 (קרי, לייזר DPSS 561, בעוצמה ~ 5%, גלאי שוכן בגובה 589-728 ננומטר). אז דמיינו את endocardium באמצעות 488 ננומטר לייזר (קרי, 30 mW מרובת שורות ללייזר בעוצמה ~ 5%, גלאי להגדיר ב- 502-556 ננומטר).
- להיכנס למצב "FRAP" על התוכנה רכישת מיקרוסקופ. בחר ~ 1% עוצמת הלייזר עבור שניהם 488 ננומטר, 561 ננומטר לייזר.
- להתמקד המטוס עניין, בחר אזור בעל עניין (ROI), ולאחר מכן photoconvert תאים באמצעות את 405 ננומטר דיודת לייזר בעוצמה לייזר 25%, סריקה על רועי שלוש פעמים. קאךה לא מספיק צריך להיות photoconverted של רועי, לסרוק את 405 ננומטר לייזר מעל האזור שלוש פעמים שוב. חזור על שלב זה עבור כל ROIs.
- להחזיר מצב "TCS SP8" על התוכנה ולרכוש z-מחסנית, שימוש של 561 nm ו 488 ננומטר לייזרים ברצף. הקפד לבחור באפשרות 'דו-כיווני' כדי להגדיל את מהירות הדמיה.
הערה: כמה זמן לוקח photoconvert, התמונה שמשתנה כל העובר. לבי הלם ידוע להיות חשוב להתפתחות שסתום הלב רגיל, כדי להימנע שמירה על הלב הפסיק במשך יותר מ 30 דקות, אפילו אם זה אומר שאין לך זמן photoconvert כל העוברים 5.
הערה: במהלך תהליך photoconversion, שימוש PMT גלאי, לאחר photoconversion, מומלץ להשתמש גלאי היברידית מוגדר 'ספירה' מצב. זה כי גלאי היברידית רגישים יותר, הם מסוגלים לייצר תמונות באיכות טובה יותר, אבל נפגמים בקלות חשיפת יתר.
5. ביטול הטעינה photoconverted עוברי
- לאחר photoconversion, להשתמש פיפטה מזכוכית כדי לחץ כלפי מטה מעט מעל ראשו של העובר כדי לשבור את agarose LMP ולאחר מכן למצוץ בעדינות את העובר.
- הוצא את העובר מן פיפטה מזכוכית לתוך צלחת פטרי 35 מ מ המכיל העובר בינוני עם פרופילתיואוראציל (לשטוף BDM המכילות בינוני).
- להעביר את העובר באר צלחת 6-ובכן המכיל העובר בינוני עם פרופילתיואוראציל. במהלך שלב זה, הקפד לשמור על הערה של העובר אשר נכנס בו טוב, כמו זה חיוני כדי להתאים את המיקום של תאים photoconverted בשלבים התפתחותיים מאוחר יותר.
- שעכשיו העוברים יוסרו מן המדיום המכיל BDM, ליבם כדאי שנתחיל להכות שוב בבערך 5 דק העוברים המוחזר בחשיכה-28.5 ° C כדי לאפשר עוברי להמשיך לפתח בדרך כלל.
6. בהדמיית photoconverted התאים העובריים מאוחר יותר
- בשלב הרצוי, לעצור את הלב ולהכניס מחדש את העוברים כמו תחת שלב 3 של פרוטוקול זה, עם הבדל חשוב כי חייבים להיות מטופלים העוברים עם BDM במנות נפרדים, מסומן, כדי לעקוב אחר עוברי.
- עבור עוברי עד 62 hpf, לרכוש z-ערימות endocardium באמצעות 561 nm ו 488 ננומטר עבור פלורסנט אדום וירוק אותות, בהתאמה. עבור עוברי בשלבים שגילן עולה על 62 hpf, להשתמש multiphoton לייזר מוגדר כ- 940 nm לשיקוף קאךה ירוק במקום 488 ננומטר לייזר.
7. תמונה ןועברל העוברים מתחת לגיל 48 hpf
הערה: תנועות רקמת AVC יכול להיות קשה לנתח עקב המבנה תלת מימדי המורכב שלו. כדי לכמת את האורך של אזור photoconverted AVC בין שני אזורים שאינם photoconverted או האורך של אזור אי-photoconverted AVC בין שני אזורים photoconverted, זה יכול להיות רצוי למפות את מבנה תלת-ממדי על גבי מפה דו-ממדית. תמונות של photoconverted עוברי שהושגו לפני 48 hpf ניתן לנתח באמצעות השיטה שלהלן.
- ייבוא תמונות שנרכשו ב- Matlab או כל תוכנה דומה.
- Delimitate באופן ידני את רועי, כלומר endocardium, ולהחיל מסכה כדי להסיר את האות מחוץ לאזור זה.
- להחיל על הסף בעוצמה על התמונה כדי לזהות את הנקודות על endocardium ותכין אותם 3-ממדים. לבודד את הנקודות התואם לחלק הצר וישר ביותר AVC, על ידי מחיקת באופן ידני את הנקודות של עניין האטריום ואת הנוזלים באמצעות הפקודה מחק בתוכנה.
- להשתמש גליל כדי להתאים את הנקודות המייצג את AVC השיג.
- הגדרת מערכת הפניה כדי להשוות בין מספר דגימות. לדוגמה, לאמץ אל מרכז המסה של AVC נקודות המקור של מערכת הייחוס, הציר של הגליל מצויד כמו ציר z.
- ודא כי z חיובי-תנוחות מתאימות תמיד באותו הצד של הלב (חדרית או פרפור).
- פרויקט הנקודות AVC במישור x-y ולהשתמש אליפסה שתתאים להם.
- לסובב את הנקודות endocardial סביב ציר z כך את ציר מרכזי של האליפסה ואת ציר y של מערכת הייחוס מקבילים ותואמים ערכי-y חיובי בצד הפנימי AVC ביחס העובר.
- כדי לחלק את AVC, לחתוך את ערכת הנתונים תלת מימדי עם מטוסים מתקבל על ידי סיבוב המישור החצי {y = 0, x > 0} z-כיוון.
- פרויקט האינטנסיביות של הפיקסלים הסמוכים במטוסים אלה ולהגדיר את אנדותל באופן עקבי. לדוגמה, צייר באופן ידני קו מ פרפור לצד חדרית AVC-חצי עובי אנדותל.
- אינטרפולציה הנקודות של הקווים המייצג את אנדותל עם בליטת חיבור תלת ממדי באמצעות הכלים בליטת חיבור כדי לייצג את AVC עם משטח.
הערה: מספר המטוסים חיתוך קובע גם את הדיוק של פילוח וגם צריכת זמן שלב זה. בדרך כלל, שמונה מטוסים הם מספיק כדי להשיג תוצאות טובות.
- להגדיר את המיקום azimuthal של כל נקודה על פני השטח AVC באמצעות קואורדינטות גליליות.
- במיקום azimuthal כל להגדיר עקומה פרמטרית לאורך פני השטח של AVC על-ידי חישוב אורך הקשת על פני השטח בין נקודות רצופות.
- עבור כל עקומה פרמטרית, מגדירים את הנקודה בעקומה הקרוב ביותר למרכז AVC לאפס. הנקודות של AVC ובכך באופן מלא מתוארים על ידי העמדה azimuthal שלהם ומיקומם על העקומה פרמטרית.
- לגולל את AVC לתמונה דו-ממדית באמצעות המיקום פרמטרית של הנקודות.
- למצוא את הקצוות של האזור לכמת כמו הקצוות של סף תמונה בינארי היחס בין עוצמות photoconverted הערוצים הלא-photoconverted. ידנית לתקן את התוצאה במידת הצורך.
- לחשב את אורך הקשת בין הקצוות כדי לחשב את האורך של הרקמה כפונקציה של העמדה azimuthal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמא photoconverted העובר ב 48 hpf, עם תמונה שוב 80 hpf מוצג באיור 2, סרטים 1 ו- 2. חשיפת קאךה 405 ננומטר לאור בלתי הפיך ממיר מ החלבון שלו בטופס ירוק ניאון לטופס אדום פלואורסצנטי, המאפשר את אופן הפעולה של תאים עם הירוק או את הטופס אדום שלהם להיות בעקבות עם תוויות הכבוד שלהם באופן שונה בצבע השכנים במהלך היווצרות שסתום. ניתן לראות כי מספר תאי photoconverted AVC hpf 48 התרבו מאוחר יותר, לאחר מכן התגורר בעיקר בצד אחד של העלעל שסתום.
דוגמה של התוצאות יכולה להיות מושגת על-ידי החלת שיטת הניתוח התמונה המתוארת על העובר hpf 36 אחרי photoconverting והריון באטריום ובתוך החדר מוצג באיור3. חלוקת AVC מאפשר את parametrization של מבנה תלת-ממדי המועבר ואז שני-ממדים עבור הדמיה וניתוח קל יותר. השיטה מאפשרת לכמת את המרחק בין שני האיזורים photoconverted. על ידי חזרה על תהליך זה בזמנים שונים, התפתחותי זה אפשר ללמוד את ההעברה של התאים לכיוון AVC (בוזלי. et al., בעיתונות)9.
איור 1 : עובש המשמשים ליצירת agarose בארות. A) מבט חזיתי. B) מבט מאחור. C-D) נופים צדדיים. E-F) תצוגות עקיפה. מידות מוצגות במילימטרים. . STL קובץ עבור תבנית עובש מסופק את החומרים המשלימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תוצאות נציג Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) הלב העוברי photoconverted. A) הלב העוברי רק לאחר photoconversion-48 hpf. קאךה cytoplasmic בתוך תאים אחדים של הצד הנעלה של AVC המומר שלו בטופס הירוק בצורתו אדום. B) העובר אותו 80 hpf. ניתן לראות כי בעבר photoconverted תאים יש התרבו ולא לבוא להתגורר בצד הפנימי של השסתום atrioventricular מעולה. גודל ברים: 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : התוצאות נציג של תהליך ניתוח תמונה על העובר hpf 36. A) התוצאה של פילוח תלת מימדי של AVC במערכת ייחוס נפוצה בקרב העוברים; האות photoconverted (מגנטה), אי-photoconverted (ירוק) קאךה מוקרן על גבי המשטח וסימון photoconverted ואזורים שאינם photoconverted. B) AVC הוא פרש בהתאם למיקום פרמטרית של נקודת שלה, האות מוקרן דו-מימדים להמחשת קל יותר. קצות האזור הלא-photoconverted מסומנות בלבן. C) האורך של האזור הלא-photoconverted מותווים כפונקציה של העמדה זוויתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
סרט 1: הלב העוברי רק לאחר photoconversion-48 hpf. קשור איור 2A. הסרט עובר הערימה רכשה z של העובר hpf 48 שמוצג באיור 2A פרוסה z על ידי z פרוסה. Z אחד בלבד המטוס נבחר במהלך תהליך photoconversion, אך זה ניתן לראות כאן כי תאים בעומקים שונים היה photoconverted. פרוסות Z הם במרווחים של 2 מיקרומטר לגזרים. קליק ימני כדי להוריד את הסרט הזה.
סרט 2: הלב העוברי photoconverted 80 hpf. קשור איור 2B. הסרט עובר הערימה רכשה z של העובר hpf 80 שמוצג באיור 2B פרוסה z על ידי z פרוסה. פרוסות Z הם במרווחים של 2 מיקרומטר לגזרים. קליק ימני כדי להוריד את הסרט הזה.
הקבצים המשלימים: קשור איור 1. . STL קובץ עבור תבנית עובש. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
העיתוי של photoconversion: קאךה למרות נשאר במאור פנים מתבטאות והריון אפילו ב 96 hpf, יצוין כי ככל שהעובר גדל, אור לייזר מפזרת עוד לפני שהוא מגיע את AVC, יצירת photoconversion מוגבלת של קאךה קשה יותר. At עובריים שלבים מאוחר יותר 55 hpf, שהתנפח של הנוזלים, האטריום גם אומר כי קרן לייזר סגול משמש photoconversion לא יכול להגיע AVC תאים ללא הראשון העוברים דרך אטריום או החדר. משמעות הדבר מעבר 55 hpf, על מנת photoconvert והריון של AVC, אדם חייב גם photoconvert והריון נוסף אטריום, החדר.
BDM, tricaine: photoconversion מדויק של והריון דורש לעצור באופן זמני את הלב הפועם. BDM (2, 3-butanedione monoxime) הוא uncoupler אלקטרו-כויץ המוכרת לדכא את התכווצות שריר הלב12. לנו אסור לצפות ההבדלים בין המורפולוגיה של עוברי שהיו כפופים פרוטוקול זה, והיה עוברי יש גדלים בדרך כלל, לא את ליבם עצר עבור הדמיה. עם זאת, הסיכון נשאר כי הטיפול בסמים משנה להתפתחות התקינה13. Tricaine מרוכז יכול לשמש גם כדי לעצור באופן זמני את הלב14. אנו מוצאים כי אנחנו יכולים לעצור את הלב על-ידי הצבת עוברי העובר בינוני עם tricaine % 0.32 נקודות עבור 1 דקות, ביעילות לשמור על הלב במצבו נעצר על ידי העברת העוברים העובר בינוני עם tricaine 0.16%. בדומה לטיפול BDM, הלב ניתן לעצור בדרך זו במשך 30 דקות, ניתן לראות לחזור תוך 5 דקות לאחר החזרת העוברים אל העובר רגיל בינוני לבה. ריכוז גבוה של tricaine להימנע; ריכוזים נמוכים של tricaine לתקופות ממושכות (h/ימים) הוכח להשפיע על התפתחות נורמלי15,16. פתרון Tricaine המשמש עבור עצירת פעולת הלב הכי מוכן טרי. אם משמשים aliquots קפואים, הקפד לשמור את הפתרון מוגן היטב מפני אור להפשיר את tricaine ללא חימום הפתרון מעל 30 ° C. לבסוף, blebbistatin דווח כדי לעצור את הלב בלי תופעות לוואי חמורות13. לא בדקנו שיטה זו במעבדה שלנו.
הרכבה וביטול טעינתה: למקם נכון את העוברים הוא קריטי במהלך photoconversion. העובש להכנת agarose בארות מקלה את ההרכבה של העוברים כך הציר הקדמי-את ישבנה של העובר באופן עקבי נמצא 25° ביחס השטח של המנה. מצאנו התבנית כדי להיות ישימים עבור photoconversion שלבים התפתחותיים בכלל בין hpf 36, 55. על הרכבה, הטה של העובר לכיוון משמאל צריך להיות מותאם על פי שלב התפתחותי של העובר לבין אזור אחד ורוצה photoconvert. לדוגמה, כדי photoconvert AVC-36 hpf, העובר צריך להתמודד בערך 15° שמאלה, בעוד בגיל 55 hpf, העובר צריך להתמודד בערך 10° שמאלה. תחת stereomicroscope, תוכל לראות את AVC unobscured החדר או החצר. אם, לדוגמה, האטריום נמצא מעל את AVC, זה לא יהיה אפשרי photoconvert רק AVC או רק האטריום. הדמיה למטרות, ההקבלה משמש כדי למקם העוברים בין 36 ל 96 hpf. העובש יכול להתבצע באמצעות מגוון רחב של חומרים באמצעות מדפסת תלת-ממד או בכלים מסורתיים וטכני. פלסטיק עמיד פלדת אל-חלד או כימית, חום הם שני חומרים מתאימים. צריך הקורא רוצה ליצור את התבנית באמצעות מדפסת תלת-ממד, אנא ראה מידע משלים. STL קובץ של תבנית עובש.
הוספת LMP מספיק agarose כדי לכסות את העובר כל מומלץ כדי להבטיח כי העוברים לא יהפכו ונדרש בין הרכבה ו photoconversion/הדמיה, במיוחד אם המיקרוסקופ לא שוכן סמוך ישירות לתחנה הרכבה. באופן כללי, ובלבד העוברים כראוי תיטען, LMP agarose לא מקל על העוברים לאחר ביטול הטעינה. עם זאת, כמה agarose LMP תישאר תקוע על העובר, ניתן להסיר את agarose LMP באמצעות בעדינות להקניט את העובר מן agarose באמצעות מלקחיים.
עוברי, במיוחד העוברים פחות מ- 48 hpf, יכול להיפגע בקלות במהלך טעינה וביטול טעינתה. עבור עוברי פחות מ- 48 hpf, אנו ממליצים על האש ליטוש בסוף פיפטה מזכוכית כדי למנוע נזק עוברי במהלך pipetting.
מיקרוסקופ: פרוטוקול זה התבצע בעזרת מיקרוסקופ לייקה SP8. עם זאת, photoconversion היא תהליך ומבוססת, פרוטוקול זה צריך להיות להמרה בקלות כדי אחרים מיקרוסקופים זקוף מצויד עם לייזרים מסוגל לייצר 405 ננומטר, 488 ננומטר, 561 אור ננומטר. עבור עוברי עד 62 hpf, תמונות נרכשו באמצעות לייזר עירור של הארגון, לייזר DPSS 561 עבור קאךה ירוק ואדום, בהתאמה. עבור עוברי בשלבים שגילן עולה על 62 hpf, ירוק קאךה יכול להתרגש באמצעות לייזר multiphoton מוגדר כ- 940 nm, אשר יש עומק חדירה גדולה יותר מאשר אור 488 ננומטר. בתיאוריה, קאךה אדום צריך שני הפוטונים עירור של ספקטרה דומה לזו של DsRed, ולכן יכול לדימות ב 950 nm17.
עדשת המטרה עם צוהר מספרי גבוה יש צורך ביעילות photoconvert והריון וכדי לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה. מאז העוברים נשמרים בכלי התקשורת, חשוב לבחור מיקרוסקופ מצוידים עדשה המטרה מים.
Photoconverting האזור עניין: מומלץ להיות זהירים בבחירת רועי כדי photoconvert - 405 ננומטר לייזר מפזרת כפי שהוא נוסע דרך רקמות ותאי photoconvert יכול באזור גדול מזה שנבחר. אם, לדוגמה, אתה רוצה לסמן תא אדום אך רוצה את התא ישירות הסמוכים להישאר ירוק, זה עשוי להיות זהיר לבחור רק את החלק של התא משקר יותר מן בתא הסמוך כמו החזר ההשקעה שלך. מאז קאךה מתבטאת בציטופלסמה של והריון, photoconverted חלבון מפוזר לחלקים של התא לא נבחר על-ידי רועי.
Photobleaching, phototoxicity: קאךה חלבון, בשתי צורותיה ירוק ואדום, מואר מאוד, photobleaching בדרך כלל לא גורם מגביל בתא מעקב ניסויים. עם זאת, אור לייזר יכול להשפיע על התפתחות, צריך להיות ממוזער, במיוחד במהלך בשלבים המוקדמים של פיתוח. סימנים של phototoxicity כוללים עיכוב התפתחותי, במקרים חמורים יותר, הלב לא תקין לולאה ושסתומים בעלת מבנה פגום.
עוצמת הלייזר ויולט (25%) ואת מספר איטראציות סורק לייזר סגול על רועי (3 - 6 פעמים) בשימוש פרוטוקול זה היו נחושים מדעית. אלה בהגדרות, ראינו המרה כמעט מוחלטת של קאךה מירוק שלה לטופס אדום ללא עיכוב התפתחותי ניכר. הכמות של עוצמת הלייזר הנדרשים setups מיקרוסקופ אחרים תלוי בעוצמה של הלייזר. יודגש כי צורת קאךה אדום יכול להיות מולבן מאת אינטנסיבי 405 ננומטר תאורה, אז photoconversion עוד לא בהכרח תשואות פלואורסצנטי אדום יותר.
ניתוח תמונות: השיטה המוצעת עבור ניתוח התמונה הוא תהליך פיתח כדי לתאר בגיאומטריה תלת מימדי של AVC ולהשוות אותם בין העוברים. הדבר נועד לחול על מבנים צינורי טפט, כגון AVC לפני 48 hpf ואת פוטנציאל הצינור הלב, העורקים הגבי ואחרים. זה בעיקר אוטומטי, למרות פילוח במישורים חיתוך מתבצע באופן ידני על-ידי המשתמש צעדים אחרים שעלולים ידרוש תיקון ידני. פילוח ידנית מייצגת את החלק הקריטי ביותר של התהליך, מאז ידע על מבנה הגיאומטריה ואת האימונים הדרושים כדי להשיג תוצאות טובות. לאחר תרגול, הזמן-הצריכה של שלב זה הוא מופחת במידה ניכרת.
פרוטוקול המתוארים כאן מספק דרך יעילה כדי לעקוב אחר תנועות רקמת endocardial במהלך AVC ופיתוח שסתום הלב atrioventricular באמצעות קו הטרנסגניים של דג זברה Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) .
כיום, אחת המגבלות מפתח של שיטה זו הוא כי קרן לייזר סגול אינו מוגבל רק בממד צירית. זה הופך למטרה של תאים בודדים עבור photoconversion, וניתוחים ומכאן המשובטים, תא בודד, מעקב אחר קשה. לפני שנתיים התגלה כי החלבון photoconvertible ש-dendra2 יכול להיות בשלה המרה - החלבון ניתן להמיר שלו בטופס הירוק בצורתו אדום על ידי הראשון בין החלבון עם אור כחול, ולאחר מכן עם אור אינפרא אדום18. כיוונוני מיקרוסקופ לנצל מאפיין זה יכול photoconvert Dendra2 התאים מבטאים באופן מוגבל במרחב במבנים מורכבים רקמות 3D תוך הימנעות רבות מהבעיות phototoxicity הקשורים עם הקרנה ליד-UV אינטנסיבי18 , 19 , 20. עם גילוי האחרונות המנגנון המולקולרי מאחורי תופעה זו, גרסאות רבות חלבונים פלורסנט גרין-כדי-אדום photoconvertible, כולל קאךה, יש מהונדס כך כי הם גם מסוגלים להיכנס ביניים כאשר הבחינה המדינה21. לידע שלנו, דג זברה מהונדס קווים שבהם מקדם מכירות כגון fli1a או kdrl כוננים הביטוי של חלבונים Dendra2 או השני בשלה להמרה פלורסנט חלבונים בתאי האנדותל עדיין אינם זמינים. עם זאת, קווי אקספרס Dendra2 ubiquitously הינם זמינים, עשוי להיות מועיל יישומים מסוימים, 22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
ברצוננו להודות Duchemin הולץ, דניס Duchemin, נטלי Faggianelli, באזיל Gurchenkov שעזרת לתכנן ולבצע כייר שמתואר פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי עקרות (DEQ20140329553), את ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), התוכנית של חוקר צעיר EMBO, הקהילה האירופית, ERC קוג N ° 682938 Evalve ומנוהל על ידי המענק ANR-10-LABX-0030-INRT, קרן צרפתית המדינה על ידי סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש תחת d'Avenir Investissements תוכנית מסגרת בתווית ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
