Summary
Questo protocollo descrive un metodo per fotoconversione di Kaede proteina fluorescente in cellule endocardial del vivente degli embrioni di zebrafish che consente il tracciamento delle cellule endocardial durante lo sviluppo di valvola atrioventricolare del cuore e del canale atrioventricolare .
Abstract
Durante l'embriogenesi, le cellule subiscono cambiamenti dinamici nel comportamento delle cellule e decifrare la logica cellulare dietro a questi cambiamenti è un obiettivo fondamentale nel campo della biologia dello sviluppo. La scoperta e lo sviluppo di proteine di fotoconvertibile hanno aiutato la nostra comprensione di questi cambiamenti dinamici fornendo un metodo per evidenziare otticamente cellule e tessuti. Tuttavia, mentre fotoconversione, time-lapse microscopia e analisi delle immagini successive hanno dimostrato di essere molto successo nel scoprire dinamica cellulare in organi come il cervello o l'occhio, questo approccio è generalmente non utilizzato nel cuore in via di sviluppo a causa sfide posate dal movimento rapido del cuore durante il ciclo cardiaco. Questo protocollo è costituito da due parti. La prima parte descrive un metodo per photoconverting e successivamente tracking endocardial cellule (EdCs) durante lo sviluppo di valvola atrioventricolare del cuore e zebrafish canale atrioventricolare (AVC). Il metodo prevede di fermare temporaneamente il cuore con un farmaco in ordine per fotoconversione accurata a prendere posto. I cuori sono permesso di riprendere pestaggio dopo l'estrazione della droga e lo sviluppo embrionale prosegue normalmente fino a quando il cuore è fermato di nuovo per l'imaging ad alta risoluzione di photoconverted CDE in un momento dello sviluppo più tardi. La seconda parte del protocollo descrive un metodo di analisi di immagine per quantificare la lunghezza di una regione photoconverted o non photoconverted in AVC in giovani embrioni mappando il segnale fluorescente dalla struttura tridimensionale su una mappa bidimensionale . Insieme, le due parti del protocollo permette di esaminare l'origine e il comportamento delle cellule che compongono il zebrafish AVC e valvola cardiaca atrioventricolare e potenzialmente può essere applicato per lo studio di mutanti, morphants o embrioni che sono stati trattati con reagenti che interrompono lo sviluppo AVC e/o la valvola.
Introduction
Zebrafish è attualmente uno dei più importanti modelli vertebrati per studiare i processi cellulari e dello sviluppo in vivo. Ciò è in gran parte dovuto trasparenza ottica di zebrafish e disponibilità allo studio della genetica, che lo rende un potente modello per l'applicazione di tecniche ottiche che coinvolgono geneticamente codificato fotoresponsivi proteina tecnologie1. Specifico per lo studio dello sviluppo del cuore, zebrafish ricevere sufficiente ossigeno tramite diffusione tale che persino mutanti senza battito cardiaco possono sopravvivere attraverso la prima settimana di sviluppo, permettendo analisi sugli effetti dei geni dello sviluppo e perturbato flusso sanguigno sulla morfogenesi del cuore non è possibile nella maggior parte dei vertebrati2.
Il tubo di cuore di zebrafish è formato da 24 ore post fertilizzazione (hpf). Poco dopo la sua formazione, il tubo di cuore inizia a battere attivamente. Da 36 hpf, una costrizione chiara separa l'atrio dal ventricolo. Questa regione di costrizione è chiamata il canale atrioventricolare (AVC) e cellule in questo cambiamento di regione da una morfologia squamosa a morfologia cuboidali3. Inizia di zebrafish valvola atrioventricolare morfogenesi circa 48 h post fertilizzazione. Da 5 giorni post fecondazione, due opuscoli della valvola estendono l'AVC e impediscono il riflusso del sangue dal ventricolo all'atrio durante il ciclo cardiaco4. Rilevamento delle cellule durante la formazione AVC e valvola è impegnativo come il rapido battito del cuore, rende difficile seguire le cellule tramite microscopia time-lapse tradizionale5,6. Questo protocollo, adattato da Steed et al., 20167, descrive un metodo che utilizza la linea transgenica Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 zebrafish, in cui la proteina fotoconvertibile Kaede è espressa in cellule endoteliali, tra cui l'endocardio. La droga 2,3-butanedione-2-monoxime (BDM) viene utilizzato per interrompere temporaneamente il cuore battere, permettendo fotoconversione accurata di EdCs tra 36 e 55 hpf e imaging ad alta risoluzione di photoconverted EdCs intervalli di tempo inerente allo sviluppo specifico. Precedentemente è stato indicato che photoconverted di EdCs utilizzando questo metodo può rimanere distinguibili dai loro vicini non convertiti per cinque giorni o più dopo il tempo di fotoconversione7. Questo protocollo anche i dettagli di un metodo utilizzato per l'analisi di immagine di photoconverted CDE in embrioni più giovani di 48 hpf, che è stato usato con successo per seguire i movimenti dei tessuti durante lo sviluppo AVC (Boselli et al., in stampa)9. Speriamo che i lettori sarebbero trovare questo protocollo utile per lo studio di sviluppo AVC e valvola in embrioni normali e mutanti, morphants o embrioni droga trattato. Per un protocollo più generale relative al rilevamento delle cellule mediante fotoconvertibile proteine durante lo sviluppo di zebrafish, vedere l'articolo di Lombardo et al., 201210.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparazione di stampi e montaggio dell'agarosi
- Creare uno stampo con le dimensioni riportate in Figura 1 utilizzando una stampante 3D o strumenti di officina meccanica tradizionale.
- Pipettare circa 1,5 mL di agarosio all'1% fuso in un piatto di montaggio in plastica 35 mm. Posizionare lo stampo plastica in agarosio liquido, avendo cura di evitare di inglobare aria tra lo stampo e l'agarosio. Posizionare il piatto a 4 ° C, aspetta che indurisce l'agarosio (l'operazione dura circa 5 minuti), quindi rimuovere la muffa di plastica.
- Per memorizzare il piatto di montaggio per un uso successivo, coprire il piatto con il suo coperchio, quindi avvolgere il piatto sia il coperchio ermeticamente con parafilm. Il piatto di montaggio possa quindi essere archiviato lato coperchio rivolto verso il basso fino a 5 giorni a 4 ° C.
- Preparare in anticipo le aliquote di 1ml di 0,7% basso punto di fusione dell'agarosi in 1,5 mL provette Eppendorf da utilizzare il giorno del montaggio.
Nota: I pozzi dell'agarosi del piatto montaggio si deformano nel tempo come acqua evapora se parafilm non si avvolge strettamente attorno i piatti.
2. ottenimento di embrioni per la fotoconversione
- Zione il Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) linea e crescere di circa 200 embrioni nel mezzo di embrione al buio a 28,5 ° C. Per maggiori dettagli su come attraversare linee di zebrafish, consultare il Giove Science Education Database11.
- Dopo 5 h ma prima 24h, trattare gli embrioni con 1-fenil-2-tiourea (PTU) per prevenire la formazione di pigmento (0,003% PTU nel mezzo di embrione).
- Circa 1 h prima dell'inizio di fotoconversione, embrioni di schermo sotto uno stereoscopio fluorescente e selezionare 5 embrioni sani che sembrano esprimere la fluorescenza verde più brillante. Luce a bassa intensità quando visualizzare gli embrioni si consiglia di evitare l'esposizione degli embrioni alla luce ambientale al fine di evitare photoconverting Kaede in cellule aspecifiche.
3. incorporare
- Preparare 10 mL di supporti di montaggio: 0,02% tricaina e 50mm BDM nel mezzo di embrione.
- Aggiungere 2 mL di mezzo di montaggio al montaggio piatto e consentire 15-30 min per la soluzione di diffondere in agarosio.
- Nel frattempo, sciogliere un'aliquota di 1 mL di 0,7% basso punto di fusione (LMP) agarosio inserendo il tubo in un blocco di calore 70 ° C per circa 5 min.
- Attendere l'agarosio LMP raffreddare leggermente, quindi aggiungere 25 µ l di soluzione di tricaina 8 mg/mL e 40 µ l di soluzione 1M BDM al tubo del basso punto di fusione dell'agarosi. Mix pipettando su e giù, quindi trasferire il filmato a un blocco di calore di 38 ° C per mantenere l'agarosio LMP allo stato liquido.
- In un Petri dish con il mezzo di embrione, attentamente dechorionate gli embrioni pre-selezionati sotto lo stereomicroscopio usando il forcipe, avendo cura di non per danneggiare gli embrioni.
- Trasferire gli embrioni per un piatto separato contenente 2 mL di supporti di montaggio.
- Quando vengono interrotti i cuori degli embrioni (dura circa 5-10 min), trasferimento degli embrioni per il montaggio piatto e organizzare gli embrioni nei pozzetti utilizzando pinze, in modo che essi si trovano ad un angolo di 25 gradi, coda rivolta verso la parte più profonda del pozzo, tuorlo rivolto verso l'alto.
- Quando gli embrioni sono all'incirca in luogo, rimuovere il supporto, incorporare gli embrioni in ~ 200 µ l del 0,7% LMP agarosio contenente tricaina e BDM e riadattare le posizioni degli embrioni, inclinando gli embrioni a sinistra o a destra se necessario.
- Attendere fino a quando i set di agarosio LMP (dura circa 5 minuti), quindi aggiungere mezzo di montaggio al piatto. Gli embrioni sono ora pronti per essere photoconverted.
Nota: La tricaina e BDM sono usati per anestetizzare gli embrioni e per fermare il cuore degli embrioni, rispettivamente. Mezzi di montaggio possono essere preparata il giorno prima di formazione immagine, ma assicuratevi di proteggere il supporto dalla luce.
Nota: Il corretto posizionamento degli embrioni è importante per consentire un percorso chiaro laser alle cellule si vuole fotoconvertita. Posizionare la testa dell'embrione vicino all'inizio del pozzo in modo che la luce laser non è necessario andare lontano per raggiungere l'embrione, e affinché gli embrioni possono essere facilmente smontati dopo fotoconversione.
4. fotoconversione
- Un microscopio confocale in posizione verticale (come Leica SP8) equipaggiato con un 405 nm, 488 nm e sorgente 561 nm, individuare l'embrione di cuore utilizzando trasmesso luce bianca (campo chiaro) e una lente obiettiva (come Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 obiettivo). Verifica per fluorescenza rossa di Kaede utilizzando il 561 nm laser (cioè, laser DPSS 561, al ~ 5% di intensità, rivelatore a 589-728 nm). Quindi, è possibile visualizzare l'endocardio utilizzando laser 488 nm (cioè, 30 mW laser di Argon su più righe a ~ 5% intensità, rivelatore a 502-556 nm).
- Entrare in modalità "FRAP" del software di acquisizione di microscopio. Selezionare la potenza del laser ~ 1% per entrambi 488 nm e 561 nm laser.
- Concentrarsi sul piano di interesse, selezionare una regione di interesse (ROI), poi fotoconvertita cellule usando il diodo 405 nm laser a potenza laser 25%, tre tempi di scansione sopra il ROI. Kaede insufficiente va photoconverted nel ROI, scansione laser 405 nm sopra la zona tre volte ancora. Ripetere questo passaggio per tutti i ROIs.
- Tornare alla modalità "TCS SP8" sul software e acquisire un z-stack, utilizzando il 561 nm e 488 nm laser in sequenza. Assicurarsi di selezionare l'opzione 'bidirectional' per aumentare la velocità di formazione immagine.
Nota: Quanto tempo ci vuole per fotoconvertita e immagine che ogni embrione varia. Battito cardiaco è conosciuto per essere importante per lo sviluppo di valvola del cuore normale, quindi evitare di tenere il cuore si è fermato per più di 30 min, anche se questo significa che non hai tempo per fotoconvertita 5 tutti gli embrioni.
Nota: Durante il processo di fotoconversione, uso PMT rivelatori, mentre dopo fotoconversione, si consiglia di utilizzare rilevatori di ibrido impostati su modalità di conteggio. Infatti, i rivelatori di ibridi sono più sensibili e sono in grado di produrre immagini di qualità migliore, ma possono essere facilmente danneggiati da sovresposizione.
5. Smontare gli embrioni photoconverted
- Dopo fotoconversione, utilizzare una pipetta di vetro premere verso il basso leggermente appena sopra la testa dell'embrione per rompere l'agarosio LMP, quindi aspirare delicatamente l'embrione.
- Espellere l'embrione dalla pipetta di vetro in una capsula Petri 35 mm contenente mezzo di embrione con PTU (per lavare via BDM contenente mezzo).
- Trasferimento dell'embrione in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti contenenti embrioni mezzo con PTU. Durante questo passaggio, assicurarsi di tenere nota di quali embrione entra in che bene, come questo è essenziale per correlare la posizione delle cellule photoconverted alle versioni successive fasi di sviluppo.
- Ora che gli embrioni vengono rimossi dal mezzo contenente BDM, loro cuori dovrebbero iniziare a battere nuovamente in circa 5 min ritorno embrioni al buio a 28,5 ° C per permettere embrioni continuare a svilupparsi normalmente.
6. imaging photoconverted cellule al più tardi stadi embrionali
- Nella fase desiderata, fermare il cuore e ri-incorporare gli embrioni come sotto punto 3 del presente protocollo, con l'importante differenza che gli embrioni devono essere trattati con BDM in piatti separati, contrassegnati per tenere traccia di embrioni.
- Per gli embrioni fino a 62 hpf, acquisire z-stack dell'endocardio utilizzando 561 nm e 488 nm per rosso e verde fluorescente segnali, rispettivamente. Per embrioni a livelli oltre 62 anni hpf, utilizzare un multifotonica laser insieme a 940 nm all'immagine verde Kaede invece il laser 488 nm.
7. image analysis per embrioni sotto il 48 hpf
Nota: I movimenti del tessuto dell'AVC possono essere difficili da analizzare grazie alla sua struttura tridimensionale complessa. Per quantificare la lunghezza di una regione di photoconverted in AVC tra due regioni di non-photoconverted o la lunghezza di una regione di non-photoconverted in AVC tra due regioni di photoconverted, può essere desiderabile per mappare la struttura tridimensionale su un mappa bidimensionale. Immagini di photoconverted embrioni ottenuti prima del 48 hpf possono essere analizzati usando il seguente metodo.
- Importare le immagini acquisite in Matlab o software simili.
- Delimitare manualmente il ROI, cioè l'endocardio e applicare una maschera per rimuovere il segnale fuori di questa regione.
- Applicare una soglia di intensità sull'immagine per individuare i punti sull'endocardio e tracciarle in tre dimensioni. Isolare i punti corrispondenti alla parte più stretta e più dritta di AVC, cancellando manualmente i punti di nessun interesse sull'atrio ed il ventricolo utilizzando il comando Cancella nel software.
- Utilizzare un cilindro per adattare i punti che rappresentano l'AVC così ottenuto.
- Definire un sistema di riferimento per confrontare diversi campioni. Ad esempio, è possibile adottare il centro di massa dei punti AVC come l'origine del sistema di riferimento e l'asse del cilindro montato come l'asse z.
- Assicurarsi che il positivi z-posizioni corrispondono sempre sullo stesso lato del cuore (ventricolare o atriale).
- Proiettare i punti AVC sul piano x-y e utilizzare un'ellisse per farli stare.
- Ruotare i punti endocardial intorno all'asse z in modo che l'asse maggiore dell'ellisse e l'asse y del sistema di riferimento sono paralleli e y-valori positivi corrispondono al lato interno dell'AVC per quanto riguarda l'embrione.
- Per segmentare l'AVC, tagliare il dataset tridimensionale con alcuni aerei ottenuti ruotando il semipiano {y = 0, x > 0} in direzione z.
- L'intensità dei pixel adiacenti del progetto su questi aerei e definire l'endotelio in modo coerente. Ad esempio, disegnare manualmente una linea da atriale al lato ventricolare dell'AVC a metà dello spessore dell'endotelio.
- Interpola i punti delle linee che rappresentano l'endotelio con una spline tridimensionale utilizzando la casella degli strumenti spline per rappresentare l'AVC con una superficie.
Nota: Il numero dei piani di taglio determina sia l'accuratezza della segmentazione e il consumo di tempo di questo passaggio. Di solito, 8 aerei sono sufficienti per ottenere buoni risultati.
- Definire la posizione azimutale di ogni punto sulla superficie AVC utilizzando coordinate cilindriche.
- Ad ogni posizione azimutale è possibile definire una curva parametrica lungo la superficie dell'AVC calcolando la lunghezza dell'arco sulla superficie tra punti consecutivi.
- Per ogni curva parametrica, definire il punto sulla curva più vicina al centro di AVC a zero. I punti dell'AVC sono così completamente descritto dalla loro posizione azimutale e loro posizione sulla curva parametrica.
- Spiegare l'AVC in un'immagine bidimensionale utilizzando la posizione parametrica dei punti.
- Trovare i bordi dell'area da quantificare come i bordi della soglia di immagine binaria il rapporto tra le intensità dei photoconverted e i canali non-photoconverted. Se necessario, correggere manualmente il risultato.
- Calcolare la lunghezza dell'arco tra i bordi per calcolare la lunghezza del tessuto in funzione della posizione azimutale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un esempio di un embrione photoconverted 48 hpf e ripreso nuovamente a 80 hpf è illustrato nella Figura 2, film 1 e 2. Esponendo Kaede a 405 nm luce irreversibilmente converte dalla proteina dalla sua forma verde fluorescente fluorescente rosso forma, consentendo il comportamento delle cellule identificate con il verde o loro forma rosso da seguire con rispettano alla loro differenzialmente colorata vicini di casa durante la formazione di valvola. Si vede che poche cellule photoconverted dell'AVC hpf 48 più tardi hanno proliferato e più tardi risiedevano principalmente su un lato del foglio illustrativo valvola.
Un esempio dei risultati che si possono ottenere applicando il metodo di analisi di immagine descritto su un embrione di hpf 36 dopo photoconverting EdCs nell'atrio e nel ventricolo è illustrato nella Figura 3. La segmentazione dell'AVC permette la parametrizzazione della struttura tridimensionale che è poi proiettata in due dimensioni per più facile visualizzazione e analisi. Il metodo permette di quantificare la distanza tra le due regioni photoconverted. Ripetendo questo processo inerente allo sviluppo in momenti diversi è possibile studiare la migrazione delle cellule verso l'AVC (Boselli et al., in stampa)9.
Figura 1 : Stampo usato per creare pozzi dell'agarosi. A) vista frontale. B) punto di vista posteriore. C-D) Viste laterali. E-F) Viste oblique. Dimensioni sono espresse in millimetri. I. STL file per il modello di stampo viene fornito nei materiali supplementari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Risultati rappresentativi di un Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) cuore embrionale photoconverted. A) il cuore embrionale solo dopo fotoconversione 48 hpf. Kaede citoplasmiche all'interno di diverse cellule del lato superiore dell'AVC è stato convertito dalla sua forma verde alla sua forma rosso. B) l'embrione stesso a 80 hpf. Si vede che il precedentemente photoconverted le cellule si sono moltiplicate e sono venuti a trovarsi sul lato interno della valvola atrioventricolare superiore. Scala bar: 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Risultati rappresentativi del processo di analisi di immagine su un embrione di hpf 36. A) il risultato della segmentazione tridimensionale di AVC in un sistema di riferimento che è comune tra gli embrioni; il segnale dal photoconverted (magenta) e non-photoconverted (verde) Kaede viene proiettato sulla sua superficie e segna le regioni photoconverted e non photoconverted. B) The AVC è spiegato in base alla posizione parametrica del suo punto e il segnale è proiettato in due dimensioni per più facile visualizzazione. I bordi della regione non-photoconverted sono etichettati in bianco. C) la lunghezza della regione non-photoconverted è rappresentato graficamente in funzione della posizione angolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Movie 1: cuore embrionale solo dopo fotoconversione 48 hpf. Legate alla Figura 2A. Il film passa attraverso lo stack z acquisita dell'embrione hpf 48 mostrato nella Figura 2A fetta di z dalla fetta di z. Piano un solo z è stato scelto durante il processo di fotoconversione, ma può essere visto qui che le cellule a varie profondità sono stati photoconverted. Fette di Z sono distanziati 2 µm a pezzi. Fare clic destro per scaricare questo film.
Movie 2: il cuore embrionale di photoconverted a 80 hpf. Legate alla Figura 2B. Il film passa attraverso lo stack z acquisita dell'embrione hpf 80 illustrato nella Figura 2B fetta di z dalla fetta di z. Fette di Z sono distanziati 2 µm a pezzi. Fare clic destro per scaricare questo film.
File complementari: Legate alla Figura 1. I. File STL per il modello di stampo. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Temporizzazione di fotoconversione: Kaede anche se rimane brillantemente espressa in EdCs anche a 96 hpf, va notato che l'embrione cresce, luce laser diffonde più prima che raggiunga l'AVC, rendendo più difficile la fotoconversione ristretti di Kaede. At embrionale fasi oltre 55 hpf, la mongolfiera del ventricolo e l'atrio significa anche che il raggio laser viola utilizzato per fotoconversione non può raggiungere le cellule AVC senza passare per l'atrio o ventricolo. Ciò significa che oltre 55 hpf, al fine di fotoconvertita EdCs di AVC, uno deve anche fotoconvertita ulteriori EdCs nell'atrio e ventricolo.
BDM e tricaina: fotoconversione Accurate di EdCs richiede temporaneamente fermare il cuore dal pestaggio. BDM (2,3-butanedione monoxime) è un disaccoppiante electro-contrattile che è ben noto per sopprimere di contrazione del muscolo cardiaco12. Non osserviamo le differenze tra la morfologia degli embrioni che sono stati oggetto di questo protocollo, e gli embrioni che crescono normalmente e non hanno avevano loro cuori fermato per l'imaging. Tuttavia, rimane il rischio che il trattamento farmacologico è alterando il normale sviluppo13. Concentrato di tricaina è utilizzabile anche per fermare temporaneamente il cuore14. Troviamo che possiamo efficacemente fermare il cuore posizionando gli embrioni in un mezzo di embrione con tricaina 0,32% per 1 min e mantenere il cuore nel suo stato arrestato dal trasferimento degli embrioni a mezzo di embrione con tricaina 0,16%. Simile al trattamento BDM, il cuore può essere interrotto in questo modo per 30 min e battito cardiaco può essere visto da restituire entro 5 min dopo il ritorno di embrioni nel mezzo di embrione normale. Concentrazioni più elevate di tricaina dovrebbero essere evitati; le concentrazioni basse di tricaina per periodi prolungati (ore/giorni) ha dimostrato di influenzare il normale sviluppo embrionale15,16. Soluzione di tricaina usato per fermare il cuore è meglio preparato fresco. Se vengono utilizzate aliquote congelate, assicurarsi che per mantenere la soluzione ben protetta dalla luce e per scongelare la tricaina senza riscaldare la soluzione sopra 30 ° C. Infine, blebbistatin è stato segnalato per fermare il cuore senza gravi effetti collaterali13. Quest'ultimo metodo non è stato testato nel nostro laboratorio.
Montaggio e smontaggio: corretto posizionamento degli embrioni è critica durante fotoconversione. Lo stampo per la fabbricazione dell'agarosi pozzi facilita il montaggio di embrioni tale che l'asse antero-posteriore dell'embrione si trova costantemente a 25° rispetto alla superficie del piatto. Abbiamo trovato questo stampo per essere applicabile per fotoconversione affatto stadi tra 36 e 55 hpf. Nel montaggio, l'inclinazione dell'embrione nella direzione sinistra-destra deve essere regolata in base alla fase dello sviluppo dell'embrione e la zona che si vuole fotoconvertita. Ad esempio, per fotoconvertita l'AVC 36 hpf, l'embrione deve essere rivolto all'incirca 15° a sinistra, mentre al 55 hpf, l'embrione deve essere rivolto all'incirca 10° a sinistra. Sotto lo stereomicroscopio, si dovrebbe essere in grado di vedere l'AVC unobscured dal ventricolo o l'atrio. Se, ad esempio, l'atrio si trova sopra l'AVC, non sarebbe possibile fotoconvertita solo l'AVC o solo l'atrio. Per scopi di formazione immagine, lo stesso stampo utilizzato per posizionare gli embrioni tra 36 e 96 hpf. La muffa potrebbe essere fatta usando una varietà di materiali usando una stampante 3D o utilizzando strumenti di officina meccanica tradizionale. Plastica resistente in acciaio inox o sostanze chimiche e calore sono entrambi materiali adatti. Se il lettore desidera creare lo stampo utilizzando una stampante 3D, vedere informazioni supplementari per il. File STL del modello stampo.
Aggiunta di LMP sufficiente dell'agarosi per coprire l'intero embrione sono consigliato per garantire che gli embrioni non diventare sloggiato tra montaggio e fotoconversione/imaging, soprattutto se il microscopio non si trova direttamente accanto alla stazione di montaggio. In generale, condizione che gli embrioni sono montati correttamente, LMP agarosio non si attacca agli embrioni dopo lo smontaggio. Tuttavia, alcuni agarosio LMP dovrebbe rimanere bloccato sull'embrione, l'agarosio LMP possa essere rimossi delicatamente prendere in giro l'embrione dall'agarosi usando il forcipe.
Embrioni, soprattutto embrioni in meno di 48 hpf, possono essere facilmente danneggiati durante il montaggio e smontaggio. Per gli embrioni meno di 48 hpf, si consiglia di fuoco lucidatura fine la pipetta di vetro per evitare dannosi embrioni durante il pipettaggio.
Microscopio: questo protocollo è stato effettuato usando un microscopio Leica SP8. Tuttavia, fotoconversione è un processo ben stabilito e questo protocollo deve essere facilmente convertibile in altri microscopi dotati di laser in grado di produrre 405 nm, 488 nm e 561 nm luce. Per gli embrioni fino a 62 hpf, immagini sono state acquisite utilizzando un laser di eccitazione ad argon e un laser di DPSS 561 per Kaede verde e rosso, rispettivamente. Per gli embrioni in fasi oltre 62 hpf, verde Kaede possa essere eccitati utilizzando un laser di multiphoton impostato a 940 nm, che ha una maggiore profondità di penetrazione della luce di 488 nm. In teoria, Kaede rosso dovrebbe avere un spettri di eccitazione del due-fotone simile a quella di DsRed e potrebbe essere imaged a 950 nm17.
Un obiettivo con un'apertura numerica elevata è necessario in modo efficiente fotoconvertita interferenti endocrini e di acquisire immagini ad alta risoluzione. Dal momento che gli embrioni sono tenuti nei media, è importante scegliere un microscopio equipaggiato con un obiettivo di acqua.
Photoconverting la regione di interesse: si consiglia di essere prudenti quando si seleziona il ROI a fotoconvertita - il laser di 405 nm diffonde mentre viaggia attraverso il tessuto e può fotoconvertita cellule in un'area superiore a quella selezionata. Se, ad esempio, voler etichettare una cella rossa ma vorrei la cella direttamente adiacente a rimanere verde, può essere prudente selezionare solo la parte della cella che si trova ulteriore distanza dalla cella adiacente come il ROI. Poiché Kaede è espresso nel citoplasma di EdCs, photoconverted proteina diffonderà a parti della cellula non selezionata per il ROI.
Photobleaching e fototossicità: Kaede la proteina, entrambe le sue forme verde e rosse, è estremamente luminosa e photobleaching non è generalmente un fattore limitante nella cella esperimenti di rilevamento. Tuttavia, la luce laser possa influenzare lo sviluppo embrionale e dovrebbe essere minimizzata, soprattutto durante le prime fasi di sviluppo. Segni di fototossicità comprendono ritardo inerente allo sviluppo e, in casi più gravi, cuore improprio looping e valvole non validi.
La potenza del laser viola (25%) e il numero di iterazioni scansioni laser viola sopra il ROI (3 - 6 volte) utilizzato in questo protocollo sono stati determinati empiricamente. A queste impostazioni, abbiamo visto quasi completa conversione di Kaede dal suo verde rosso forma senza evidente ritardo inerente allo sviluppo. La quantità di potenza laser richiesto in altre configurazioni di microscopia sarebbe dipendono dall'intensità del laser. Si noti che il modulo rosso di Kaede può essere candeggiato di illuminazione intensa nm 405, modo fotoconversione più lungo non produce necessariamente più fluorescenza rossa.
Analisi dell'immagine: il metodo proposto per l'analisi di immagine è un processo di recente sviluppato per descrivere la geometria tridimensionale dell'AVC e confrontarlo tra embrioni. È destinato a essere applicato a strutture tubolari monostrato, ad esempio l'AVC prima 48 hpf e potenzialmente il tubo del cuore, l'aorta dorsale e altri. È principalmente automatico, anche se la segmentazione sui piani di taglio viene eseguita manualmente dall'utente e altri passaggi potenzialmente potrebbero richiedere correzione manuale. La segmentazione manuale rappresenta la parte più critica del processo, dal momento che la conoscenza della geometria della struttura e formazione sono necessari per ottenere buoni risultati. Dopo aver praticato, il consumo di tempo di questo passaggio è ridotto considerevolmente.
Il protocollo descritto qui fornisce un modo efficace per monitorare i movimenti del tessuto endocardial durante AVC e sviluppo valvola atrioventricolare del cuore usando la linea transgenica di zebrafish Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) .
Attualmente, uno dei principali limiti di questo metodo è che il raggio laser viola non è limitato nella dimensione assiale. Questo rende mirata delle singole cellule per fotoconversione e quindi clonale analisi e singola cella di rilevamento, difficile. Due anni fa, è stato scoperto che la proteina fotoconvertibile che dendra2 può essere innescato convertito - la proteina può essere convertita dalla sua forma verde alla sua forma rosso primo irradiando la proteina con luce blu e quindi con luce vicina all'infrarosso18. Configurazioni di microscopio che sfruttano questa proprietà possono fotoconvertita Dendra2 cellule esprimenti in modo spazialmente confinato in strutture complesse 3D del tessuto, evitando molti dei problemi fototossicità associati con intensa irradiazione vicino-UV18 , 19 , 20. con la recente scoperta del meccanismo molecolare dietro questo fenomeno, varianti di molte proteine fluorescente verde-rosso fotoconvertibile, tra cui Kaede, sono stati progettati in modo che sono anche in grado di entrare in un intermedio innescato stato21. A nostra conoscenza, non sono ancora disponibili linee transgeniche di zebrafish dove un promotore come fli1a o kdrl spinge l'espressione della proteina Dendra2 o altro innescato le proteine fluorescenti convertibile in cellule endoteliali. Tuttavia, linee che esprimono Dendra2 ubiquistmente sono disponibili e possono risultare utile in determinate applicazioni 22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli e Basile Gurchenkov per aiutare a progettare e realizzare lo stampo descritto nel presente protocollo. Questo lavoro è stato supportato da FRM (DEQ20140329553), l'ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), il programma di EMBO Young Investigator, la Comunità europea, ERC CoG N ° 682938 Evalve e dalla concessione ANR-10-LABX-0030-INRT, un fondo di stato francese gestito da Agence Nationale de la Recherche sotto il telaio programma Investissements d'Avenir etichettato ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
