Summary
이 프로토콜에가 생활의 endocardial 세포에서 형광 단백질의 photoconversion에 대 한 방법을 설명 합니다 zebrafish 태아 것 운하 및 것 심장 밸브 개발 하는 동안 endocardial 셀의 추적을 가능 하 게 .
Abstract
Embryogenesis, 동안 셀 셀 행동의 동적 변화를 받아야 하 고 개발 생물학의 분야에서 근본적인 목표는 이러한 변화 뒤에 세포 논리를 해독 합니다. Photoconvertible 단백질의 개발과 발견은 크게 주 었 이러한 동적 변화에 대 한 우리의 이해 광학 세포와 조직을 강조 하는 방법을 제공 하 여. 그러나, 동안 photoconversion, 시간 경과 현미경 및 후속 이미지 분석 뇌 또는 눈 등 장기 잠복 세포 역학에 매우 성공적인 것으로 입증 되었습니다,이 방법은 일반적으로 사용 하지 않습니다로 인해 개발에 심장 주기 동안 심장의 빠른 움직임으로 인 한 과제. 이 프로토콜은 두 부분으로 구성 됩니다. 첫 번째 부분에서는 photoconverting 및 이후 zebrafish 것 운하 (AVC)와 것 심장 밸브 개발 하는 동안 endocardial 셀 (EdCs)를 추적 하는 방법을 설명 합니다. 방법은 일시적으로 마음 자리를 정확 하 게 photoconversion에서 마약을 중지 포함 한다. 마음 다시 시작할 수 있습니다 약물 및 배아 개발의 제거에 따라 박동 EdCs 발달 시간 나중에 photoconverted의 고해상도 이미징 마음 다시 중지 될 때까지 정상적으로 계속. 프로토콜의 두 번째 부분에 2 차원 지도 3 차원 구조에서 형광 신호를 매핑하여 젊은 배아에서 AVC에서 photoconverted 또는 비 photoconverted 영역의 길이 계량 하는 이미지 분석 방법을 설명 합니다. . 함께, 프로토콜의 두 부분 기원 그리고 zebrafish AVC 및 것 심장 밸브, 구성 하 고 돌연변이, morphants, 또는으로 치료 배아 연구에 대 한 잠재적으로 적용할 수 있습니다. 있는 셀의 동작을 수 AVC 및 밸브 개발을 방해 하는 시 약
Introduction
Zebrafish는 현재 셀룰러 및 발달 과정에 vivo에서공부 하는 가장 중요 한 척추 모델 중 하나입니다. 이것은 크게 zebrafish의 광학 투명도 그리고 유전학, 그것에 게 유전으로 관련 된 광학 기술을 적용 하기 위한 강력한 모델을 순종 인코딩된 photoresponsive 단백질 기술1. 특정 심장 개발의 연구, zebrafish 받을 충분 한 산소 보급을 통해 하트 비트 없이 돌연변이 분석을 허용 하는 발달 유전자 교란된 효과에 개발의 첫 번째 주까지 살아남을 수 있는 그런 심장 morphogenesis 대부분 척추 동물2가능 하지에 혈액 흐름.
Zebrafish 심장 관 24 시간 게시물 수정 (hpf)에 의해 형성 된다. 그것의 대형 조금 후에 심장 튜브 적극적으로 치고 시작 합니다. 36에 의해 hpf, 분명 수축 분리는 심 실에서 심. 수축의이 지역에서에서 호출 됩니다 것 운하 (AVC), 그리고이 지역의 변화에 셀 편평 형태학 cuboidal 형태3. Zebrafish 것 밸브 morphogenesis 시작 약 48 h 수정 게시. 5 일에 의해 게시물 수정, 두 개의 밸브 전단지는 AVC로 확장 하 고 심장 주기4안마당에는 심 실에서 혈액의 역류를 방지. AVC 및 밸브 형성 동안 셀 추적으로 심장의 빠른 박동 어려운 전통적인 시간 경과 현미경5,6을 통해 셀을 따라 도전적 이다. 말 외., 20167에서 적응이 프로토콜 Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 zebrafish 유전자 변형 라인, photoconvertible 단백질이 표시 됩니다를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 내 피 세포는 endocardium입니다. 약 2, 3-butanedione-2-monoxime (BDM)는 심장 박동, hpf, photoconverted EdCs 특정 발달 시간 점에서 고해상도 영상 36와 55 사이 EdCs의 정확한 photoconversion 수 있도록 일시적으로 중지 하는 데 사용 됩니다. 그것은 이전 보였다 EdCs photoconverted이이 메서드를 사용 하 여 photoconversion7시간 후에 5 일 이상 그들의 비전향된 이웃에서 구별할 수 유지 수 있습니다. 이 프로토콜은 photoconverted EdCs 48 보다 어린 배아에서의 이미지 분석에 사용 되는 방법 내용을 hpf, 성공적으로 AVC 개발 (Boselli 외., 언론에서)9동안 조직의 움직임을 수행 하는 데 사용 되었습니다. 우리는 독자 것입니다 찾을 바랍니다이 프로토콜 유용한 AVC 및 밸브 개발 정상적인 배아, 그리고 돌연변이, morphants, 또는 약물 치료 배아 연구. Zebrafish 개발 하는 동안 photoconvertible 단백질을 사용 하 여 셀 추적에 관련 된 보다 일반적인 프로토콜 롬 바르도 외., 201210에 의해 문서를 참조 하십시오.
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Protocol
1. 금형을 준비 하 고 장착 agarose
- 3D 프린터 또는 전통적인 기계 워크숍 도구를 사용 하 여 그림 1 에 표시 된 치수와 금형을 만듭니다.
- 35 m m 플라스틱 마운트 그릇에 녹 인된 1 %agarose 약 1.5 mL를 플라스틱. 형과 agarose 사이 트랩 공기를 피하기 위해 돌보는 액체 agarose에서 플라스틱 금형을 놓습니다. 4 ° C에서 접시를 놓고는 agarose 견고 (약 5 분이이 소요) 때까지 기다려 다음 플라스틱 몰드를 제거 합니다.
- 나중에 사용에 대 한 장착 접시를 저장 하는 뚜껑 접시 커버 다음 접시와 뚜껑 parafilm으로 단단히 포장. 장착 요리를 저장할 수 있습니다 다음 뚜껑 면이 아래로 최대 5 일 동안에 4 ° c.
- 1.5 mL에 0.7% 낮은 융 점 agarose의 1 mL aliquots Eppendorf 관 장착 당일 사용을 사전에 준비 합니다.
참고: 장착 접시의 agarose 우물 것 이다 변형 시간이 지남에으로 물 증발 parafilm 래핑되지 않은 요리 주위 밀접 하 게 하는 경우.
2.는 Photoconversion에 대 한 배아를 얻기
- Incross Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) 라인과 28.5 ° c.에 어둠 속에서 배아 중간에 약 200 배아를 성장 제 브라 라인을 교차 하는 방법에 자세한 내용은 정돈 과학 교육 데이터베이스11를 참조 하십시오.
- 5 h 후만 24 시간 전에 치료 1-페 닐-2-thiourea 색소 형성을 방지 (PTU)와 태아 (0.003% 배아 중간에 통해).
- 약 1 h photoconversion, 형광 stereoscope 아래 화면 배아 및 선택 5 건강 한 배아의 시작 하기 전에 나타나는 밝은 녹색 형광을 표현 하. 낮은-강도 빛 머릿속 배아 때의 사용은 photoconverting가 아닌 특정 셀에 피하기 위하여 주변광을 배아의 노출을 피하기 위해 권장 됩니다.
3. 포함
- 설치 미디어의 10 mL를 준비: 0.02 %tricaine 및 50 mM BDM 배아 매체에.
- 장착 접시를 장착 중간의 2 개 mL를 추가 하 고 솔루션은 agarose로 확산을 위한 15-30 분을 허용.
- 한편, 약 5 분 동안 70 ° C 열 블록에 튜브를 삽입 하 여 0.7% 낮은 녹는점 (LMP) agarose의 약 1 mL 수를 녹여.
- 약간, 냉각 LMP agarose 기다립니다 다음 낮은 융 점 agarose의 튜브에 8mg/mL tricaine 솔루션의 25 µ L와 1m BDM 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다. 아래로, pipetting으로 혼합 튜브 LMP agarose 액체 상태로 유지 하는 38 ° C 열 블록에 다음 전송.
- 페 트리에서 배아 매체, 신중 하 게 dechorionate와 접시는 배아를 손상 하지 않도록 주의 복용 집게를 사용 하 여 stereomicroscope에서 미리 선택 된 배아.
- 미디어를 마운트의 2 개 mL를 포함 하는 별도 접시에는 배아를 전송 합니다.
- 배아의 마음은 중지 하는 경우 (약 5-10 분 소요), 장착에 태아 요리 하 고 그들은 25도 각도로 거짓말 집게를 사용 하 우물에 배아 전송 잘 향하도록 노른자위의 더 깊은 부분 쪽으로 향하고 꼬리.
- 배아 약 미디어를 제거 하는 장소에, tricaine 및 BDM, 0.7% LMP agarose의 ~ 200 µ L에 배아를 포함 하 고, 태아의 위치를 재조정 왼쪽 이나 오른쪽 필요에 따라 배아를 기울이기.
- LMP agarose 세트 (약 5 분 소요)까지 기다려 접시에 장착 매체를 추가 합니다. 배아는 이제 photoconverted 될 준비가.
참고:는 tricaine와는 BDM 사용 됩니다 anesthetize 배아와 태아의 심장, 각각 중지. 설치 미디어 영상, 전날 준비 될 수 있다 그러나 빛에서 미디어를 보호 하기 위해 확인 한다.
참고: 태아의 정확한 위치는 하나 photoconvert을 하고자 하는 셀에 대 한 명확한 레이저 경로 허용 해야 합니다. 레이저 광은 태아를 도달 하는 멀리 여행 하지 않아도 고 배아 수 쉽게 탑재 photoconversion 후 태아의 머리 우물의 시작 가까이 위치.
4입니다. Photoconversion
- 직 립 confocal 현미경 (Leica SP8) 같은 장비는 405에 nm, 488 nm 및 561 nm 레이저 소스를 찾아 태아의 백색 광 (명시)와 목표 렌즈 전송 심장 사용 하 여 (같은 Leica HCX IRAPO L, 25 × 없음 0.95 목표). 빨간 데 형광 561 nm 레이저 (즉, 561 DPSS 레이저, ~ 5% 강도로, 검출기 589-728 nm에서 설정)를 사용 하 여 확인 합니다. 그런 다음, 488 nm 레이저 (즉, 30 mW 여러 줄 아르곤 레이저 ~ 5% 강도로, 검출기 502-556 nm에서 설정)를 사용 하 여는 endocardium 시각화.
- 현미경 수집 소프트웨어에 "FRAP" 모드를 입력 합니다. 선택 ~ 1% 레이저 전원 모두 488 nm 및 561 nm 레이저.
- 관심의 비행기에 초점을, 관심 (ROI)의 영역을 선택 하는 다음 25% 레이저 전력, 투자 수익을 통해 세 번 검사에서 405 nm 다이오드를 사용 하 여 photoconvert 셀 레이저. 부족 한 데는 투자 수익에서 photoconverted 해야, 스캔 405 nm 레이저 지역 세 번 다시. 모든 ROIs에 대해이 단계를 반복 합니다.
- 소프트웨어에 "TCS SP8" 모드를 반환 하 고 인수는 561를 사용 하 여 z-스택, nm, 488 nm 레이저 순차적으로. 이미지 속도 높이기 위해 '양방향' 옵션을 선택 해야 합니다.
참고: 얼마나 오래 걸리는 photoconvert 및 이미지 각 배아 다릅니다. 심장 박동은 정상적인 심장 밸브 개발에 대 한 중요 한, 그래서 하지 않은 시간 photoconvert 모든 5 배아 의미 하는 경우에 30 분 이상 중단 마음을 유지 하지 마십시오으로 알려져 있다.
참고: photoconversion 과정, 사용 PMT 검출기, photoconversion, 후 그것 것이 좋습니다 '계산' 모드를 설정 하는 하이브리드 감지기를 사용 하 여. 이 때문에 하이브리드 감지기 더 민감합니다와 더 나은 품질의 이미지를 생산 할 수 있다 하지만 노출 과도 의해 쉽게 손상 됩니다.
5. photoconverted 배아를 마운트 해제
- Photoconversion, 후 유리 피 펫을 사용 하 여 약간 LMP agarose 휴식 후 부드럽게 빨 아 태아 태아의 머리 위에 눌러.
- PTU (를 포함 하는 중간은 BDM 씻어)와 배아 매체를 포함 하는 35 mm 페 트리 접시에 유리 피 펫에서 배아를 꺼냅니다.
- PTU와 배아 매체를 포함 하는 6-잘 접시에 잘에 배아를 전송. 이 단계는 배아의 메모를 계속 확인이 필수적인 나중 발달 단계에서 photoconverted 셀의 위치를 연결 하는 잘로 들어간다.
- 이제는 배아 BDM 포함 매체에서 제거 됩니다, 그들의 마음 반환 배아 배아 정상적으로 개발을 계속 있도록 28.5 ° C에서 어둠 속에 약 5 분에서 다시 치고 시작 해야 한다.
6. 배아 단계 나중에 photoconverted 세포 이미징
- 원하는 단계에서 마음을 중지 하 고 다시이 프로토콜의 3 단계 같은 배아 배아 배아를 추적 하려면 별도, 표시 된 요리에서 BDM으로 대우 되어야 하는 중요 한 차이점으로 포함 합니다.
- 62까지 배아에 대 한 hpf, z-스택 endocardium 561를 사용 하 여의 획득 nm, 488 nm 빨강 및 녹색 형광을 위한 신호를, 각각. 62 보다 오래 된 단계에서 태아에 대 한 hpf, 다 사용 하 여 레이저 세트 940 nm 녹색가 488 nm 레이저 대신 이미지.
7. 이미지 분석 배아 미만 48 hpf
참고:는 AVC의 조직 움직임 때문에 그것의 복잡 한 3 차원 구조 분석 하기 어려울 수 있습니다. 두 비 photoconverted 지역 또는 비 photoconverted 지역 두 photoconverted 지역 간의 AVC에의 길이 사이 AVC에서 photoconverted 영역의 길이 계량 수에 3 차원 구조를 지도 하는 2 차원 지도입니다. Photoconverted 배아의 이미지 48 전에 얻은 hpf는 다음 메서드를 사용 하 여 분석 될 수 있다.
- Matlab 또는 유사한 소프트웨어에 인수 이미지를 가져옵니다.
- 투자 수익, 즉 endocardium, 수동으로 delimitate 고이 지역 밖에 서 신호를 제거 하는 마스크를 적용 합니다.
- 이미지는 endocardium에 포인트를 확인 하 고 3 차원에서 플롯를 강도 임계값을 적용 합니다. 안마당에는 소프트웨어에서 지우기 명령을 사용 하 여 심 실 관심의 포인트를 수동으로 지우기 여는 AVC의 좁은 하 고 가장 직선 부분에 해당 하는 포인트를 격리 합니다.
- 그래서 얻은 AVC를 나타내는 포인트에 맞게 실린더를 사용 합니다.
- 여러 샘플을 비교 하는 참조 시스템을 정의 합니다. 예를 들어 참조 시스템의 기원과 z 축으로 장착 되어 실린더의 축으로 AVC 포인트의 질량 중심을 채택 한다.
- 긍정적인 z-위치 (심 실 또는 atrial) 심장의 같은 쪽에 항상 해당 하는 다는 것을 확인 하십시오.
- X-y 평면에서 AVC 포인트 프로젝트 고 그들을 맞는 타원을 사용 합니다.
- 타원의 주요 축과 레퍼런스 시스템의 y는 병렬 하 고 태아에 관하여 AVC의 내부 측면에 해당 하는 긍정적인 y-값 endocardial 포인트 z 축 주위를 회전 합니다.
- 세그먼트는 AVC, 3 차원 데이터 집합 반 비행기를 회전 하 여 얻은 몇 가지 평면 컷 {y = 0, x > 0} z-방향에서.
- 이 비행기에 인접 픽셀의 농도 프로젝트 하 고 일관 된 방식에서 endothelium을 정의 합니다. 예를 들어 수동으로 선을 그립니다는 심에서 endothelium의 절반 두께에서 AVC의 심 실 쪽으로.
- 보간 스플라인 도구 상자를 사용 하 여 표면으로 AVC를 대표 하는 3 차원 스플라인 endothelium을 대표 하는 라인의 포인트.
참고: 절단 평면 수 세그먼트화의 정확도이 단계 시간 소비를 모두 결정합니다. 일반적으로, 8 비행기 좋은 결과 달성 하기에 충분 하다.
- 원통형 좌표를 사용 하 여 AVC 표면에 각 점의 방위 위치를 정의 합니다.
- 각 방위 위치에 연속 점 사이의 표면에 아크 길이 계산 하 여는 AVC의 표면 따라 파라메트릭 커브를 정의 합니다.
- 각 매개 변수 곡선 지점을 정의 합니다 0 AVC의 센터에 가장 가까운 곡선에. AVC의 포인트는 따라서 완전히 기술 그들의 방위 위치 및 그들의 위치에 의해 파라메트릭 커브에.
- 포인트의 파라메트릭 위치를 사용 하 여 2 차원 이미지에는 AVC를 전개.
- 바이너리 이미지 임계 처리의 모서리는 photoconverted 농도 비 photoconverted 채널 사이의 비율 척도를 영역의 가장자리를 찾아. 필요한 경우 수동으로 결과 수정.
- 방위 위치의 기능으로 직물의 길이 계산 하기 위해 가장자리 사이의 아크 길이 계산 합니다.
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Representative Results
48에서 태아 photoconverted의 예로 hpf 80에서 다시 몇 군데와 hpf 영화 1 , 2, 그림 2에 표시 됩니다. 그들의 차동 색깔을 녹색 또는 그들의 빨간 양식으로 따라야 하는 셀의 동작을 사용 하면 형광등 빨간 형태, 그것의 형광 녹색 양식에서 단백질에서 변환 존중 레스터가 405 nm 빛에 노출 밸브 형성 동안 이웃입니다. 그것은 48 hpf AVC의 몇 photoconverted 셀 나중 확산 및 밸브 전단의 1 개의 측에 나중에 주로 살고 볼 수 있습니다.
그림 3에서 볼 수 photoconverting EdCs 안마당에는 심 실에서 후 36 hpf 배아에 설명 하는 이미지 분석 방법을 적용 하 여 얻을 수 있는 결과의 예입니다. 세분화는 AVC의 3 차원 구조를 쉽게 시각화 및 분석을 위한 2 차원 투영 다음의 parametrization 수 있습니다. 메서드를 두 photoconverted 지역 간의 거리를 정할 수 있습니다. 다른 발달 시간에이 프로세스를 반복 하 여 공부 셀 AVC (Boselli 외., 언론에서)9쪽으로 마이그레이션 가능 하다.
그림 1 : 금형 agarose 웰 스를 만드는 데 사용. A) 앞면 모습. B) 다시 보기. C D) 사이드 뷰입니다. E-F) 비스듬한 전망입니다. 치수는 밀리미터 단위로 표시 됩니다. . STL 파일 형 서식 파일에 대 한 보충 자료 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 :의 대표적인 결과 Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) photoconverted 배아 심장. A) photoconversion 48에 후 배아 심장 hpf. 세포질 단풍나무는 AVC의 우수한 측면의 여러 셀 내에서 녹색 양식에서 빨간 형태로 변환 되었습니다. B) 80에서 동일한 배아 hpf. 그것을 볼 수 있다 그는 이전 photoconverted 세포 확산 그리고 우수한 것 밸브의 안쪽에 왔습니다. 스케일 바: 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 36 hpf 배아에 이미지 분석 프로세스의 대표적인 결과. A) 배아; 중 공통 되는 참조 시스템에서 AVC의 3 차원 세분화의 결과 photoconverted (마젠타색) 및 비-photoconverted (녹색)가 신호 그것의 표면에 투영 하 고 photoconverted 및 photoconverted 비 지역을 표시 합니다. B) 는 AVC의 포인트의 파라메트릭 위치에 따라 접힌 고 신호 쉽게 시각화를 위한 2 차원에서 예상 된다. 비 photoconverted 영역의 가장자리는 흰색에서 레이블이 지정 됩니다. C) 비 photoconverted 영역의 길이 각도 위치의 기능으로 그려집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1: 48에 photoconversion 후 배아 심장 hpf. 그림 2A와 관련이 있습니다. 영화 에서처럼 z 조각으로 그림 2A z 슬라이스 48 hpf 배아의 인수 z 스택을 통해 간다. 하나의 z 비행기 photoconversion 과정 선정 되었다 그러나 그것 여기 볼 수 있습니다 다양 한 깊이에 셀 photoconverted 되었습니다. Z 슬라이스 간격된 2 µ m 떨어져 있습니다. 마우스 오른쪽 클릭 하 여 다운로드이 영화.
영화 2: 80 photoconverted 배아 심장 hpf. 그림 2B와 관련이 있습니다. 영화 에서처럼 z 조각으로 그림 2B z 슬라이스 80 hpf 배아의 인수 z 스택을 통해 간다. Z 슬라이스 간격된 2 µ m 떨어져 있습니다. 마우스 오른쪽 클릭 하 여 다운로드이 영화.
보조 파일: 그림 1에 관련 된. . 곰 팡이 서식 파일에 대 한 STL 파일입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Photoconversion의 타이밍: 비록가 남아 96 에서도 EdCs에 밝게 표현 hpf, 그 태아 성장 함에 따라 레이저 광 확산 더 장난의 한정 된 photoconversion를 더 어렵게 만드는 AVC에 도달 하기 전에 주목 해야 한다. At 배아 단계 55 보다 나중 hpf, 열기구는 심 실 및 아 트리 움의 의미 photoconversion 용 바이올렛 레이저 빔 AVC 셀 심 방 또는 심 실 첫 번째 통과 없이 연결할 수 없습니다. 55 이상 즉 hpf, photoconvert는 AVC의 EdCs 순서로 하나 해야 합니다 또한 photoconvert 추가 EdCs 심 방 및 심 실.
BDM과 tricaine: EdCs의 정확한 photoconversion 심장 박동에서 일시적으로 중지 해야 합니다. BDM (2, 3 butanedione monoxime)는 잘 알려진 심장 근육 수축12를 억제 하는 전기 수축 성 uncoupler. 우리는이 프로토콜에 따라 되었습니다 배아의 형태 사이의 차이점을 준수 하지 않는 그리고 배아는 정상적으로 성장 하지 않은 그들의 마음을 영상에 대 한 중지 했다. 그러나, 위험 약물 치료 정상 개발13변경는 남아 있다. 집중된 tricaine 심장14를 일시적으로 중지 하려면 사용할 수 있습니다. 우리는 우리가 효과적으로 1 분 동안 0.32 %tricaine 배아 중간에 배아를 배치 하 여 마음을 중지 하 고 태아 보통 0.16 %tricaine 배아를 전송 하 여 중지 된 상태에서 마음을 유지 찾으십시오. BDM 치료와 마찬가지로 심장 멈출 수 30 분이 이런식으로 하 고 심장 박동 정상 배아 중간에 배아를 반환 후 5 분 이내에 반환을 볼 수 있습니다. Tricaine의 높은 농도 피해 야 한다; 연장된 기간에 대 한 tricaine의 낮은 농도 (h/일) 정상 배아 발달15,16영향을 보여줘 왔다. 마음을 중지에 사용 되는 Tricaine 솔루션은 최고의 신선한 준비 됩니다. 냉동된 aliquots 사용 하는 경우 잘 빛에서 보호 하는 솔루션을 유지 하 고는 tricaine 30 ° c.의 위 솔루션을가 열 하지 않고 녹을 있는지 확인 마지막으로, blebbistatin 심각한 부작용13없이 마음을 막으려고 보고 되었습니다. 우리 실험실에서이 마지막 메서드를 테스트 하지 했습니다.
장착 및 분리: 중요 한 photoconversion는 태아의 정확한 위치. Agarose 우물을 만들기 위한 금형 태아의 앞쪽 후부 축 지속적으로 접시의 표면에 상대적으로 25 °에서 거짓말을 배아의 장착을 지원 합니다. 우리 photoconversion에 대 한 적용할 수 형 36 55 hpf 사이 모든 발달 단계를 발견 했다. 장착, 왼쪽-오른쪽 방향에서 태아의 기울기가 태아의 발달 단계와 하나 photoconvert을 하고자 하는 지역에 따라 조정 될 필요가 있다. 예를 들어 photoconvert는 AVC 36 hpf, 태아 55에서 왼쪽에 약 15 °를 직면 한다 hpf, 태아 해야 얼굴 약 10 ° 왼쪽으로. Stereomicroscope, 아래는 심 실 또는 안마당에 의해 가려지지 않은 AVC 볼 수 한다. 경우, 예를 들어 안마당은 AVC에 속 인 다, 그것은 photoconvert 그냥 AVC 또는 그냥 아 트리 움 수 않을 것 이다. 목적, 이미징에 대 한 동일한 형 36 96 hpf 사이의 배아를 사용 됩니다. 다양 한 3 차원 프린터를 사용 하 여 또는 전통적인 기계 워크숍 도구를 사용 하 여 재료를 사용 하 여 금형을 할 수 있었다. 스테인리스 스틸 또는 화학 및 열 저항력이 플라스틱은 모두 적합 한 자료입니다. 독자 하고자 한다 3 차원 프린터를 사용 하 여 몰드를 만들에 대 한 추가 정보를 참조 하십시오는. 곰 팡이 서식 파일의 STL 파일입니다.
충분 한 LMP 추가 전체 태아를 충당 하기 위해 agarose 장착 사이 빠질과 photoconversion 영상, 특히 현미경 없는 경우 직접 장착 역에 인접 한 배아가 되지 않습니다 보장 하기 위해 조언 된다. 일반적으로 배아는 제대로 탑재는 LMP agarose 충실 하지 않습니다 배아를 언마운트 후. 그러나, 일부 LMP agarose 있어야 붙어 태아에 LMP agarose 부드럽게 agarose 집게를 사용 하 여에서 배아를 괴 롭 히 고에 의해 제거 될 수 있다.
배아, 특히 배아 48 미만 hpf, 마운트 및 마운트 해제 하는 동안 쉽게 손상 될 수 있습니다. 48 보다 작은 태아에 대 한 hpf, 좋습니다 pipetting 동안 손상 배아를 방지 하기 위해 유리 피 펫의 끝을 연마 하는 화재.
현미경:이 프로토콜 Leica SP8 현미경을 사용 하 여 수행 되었다. 그러나, photoconversion는 잘 설립 과정 이며이 프로토콜 되어야 레이저 405 생산 능력을 갖춘 다른 직 립 현미경으로 쉽게 변환 nm, 488 nm 및 561 nm 빛. 62까지 배아에 대 한 hpf, 이미지 사용 하 여 아르곤 여기 레이저와 561 DPSS 레이저 녹색 및 빨강 단풍나무, 각각 인수 했다. 62 보다 오래 된 단계에서 태아에 대 한 hpf, 녹색 단풍나무 940으로 설정 multiphoton 레이저를 사용 하 여 흥분 수 nm, 488 nm 빛 보다 더 큰 침투 깊이. 이론에서는, 빨간 단풍나무 2 광자 여기 스펙트럼 DsRed의 저것과 유사한 고 950 nm17군데 수 있습니다.
높은 숫자 조리개와 렌즈를 효율적으로 photoconvert EdCs 하 고 고해상도 이미지 필요 하다. 때문에 배아 미디어에 보관 됩니다, 그것은 물 대물 렌즈를 장착 하는 현미경을 선택 하는 것이 중요입니다.
Photoconverting 관심 영역: 그것은 photoconvert에 투자 수익을 선택할 때 보수 하는 것이 좋습니다-405 nm 레이저 확산 조직 및 수 photoconvert 셀 선택 보다 큰 영역을 통해 여행. 경우, 예를 들어 셀 레드 라벨을 셀 직접 인접 한 녹색을 유지 하 고 싶습니다, 그것은 귀하의 투자 수익으로 인접 한 셀에서 더 거짓말 셀의 일부만 선택 하 수 있습니다. 이후가 EdCs의 세포질에 표현 된다, photoconverted 단백질 투자 수익에서 선택 하지 않은 셀의 부분을 무마 것 이다.
Photobleaching 및 phototoxicity:는 데 단백질, 녹색 및 빨강의 형태 모두 매우 밝은 이며 photobleaching은 일반적으로 실험을 추적 하는 셀에 제한 요인이 아니다. 그러나, 레이저 빛 배아 발달에 영향을 미칠 수 및 개발의 초기 단계 동안 특히 최소화 한다. Phototoxicity의 발달 지연 포함 하 고, 더 심각한 경우, 부적절 한 심장 반복 및 잘못 된 형식의 밸브에.
바이올렛 레이저 (25%)와 바이올렛 레이저 (3-6 회)이이 프로토콜에서 사용 하는 투자 수익을 통해 검색 하는 반복의 힘은 실험적으로 결정 되었다. 이러한 설정에서 우리는 거의 완전 한 변환이 녹색에서 눈에 띄는 발달 지연 없이 붉은 형태를 보았다. 다른 현미경 설정에 필요한 레이저 전력의 양을 레이저의 강도에 따라 것입니다. 그것은 더 이상 photoconversion는 반드시 더 많은 빨간 형광을 생성 하지 않습니다 그래서 단풍나무의 빨간 형태 강렬한 405 nm 조명에 의해 표백 될 수 있다 주목 해야한다.
이미지 분석: 이미지 분석은 새로 개발된 된 프로세스를 설명 하는 AVC의 3 차원 형상을 고 배아 중 비교 방법 제안. 그것은 48 전에 AVC 같은 단층 관 구조에 적용할 것입니다 hpf와 잠재적으로 심장 관, 등 쪽 대동맥 및 다른 사람. 그것은 주로 자동도 절단 평면에 세분화를 수동으로 수행 하는 사용자와 다른 단계 수동 수정 필요할 수 있습니다. 수동 분할 이후 지식 구조 형상 및 훈련의 좋은 결과 달성 하는 데 필요한 프로세스의 가장 중요 한 부분을 나타냅니다. 연습 후에,이 단계에 대 한 시간 소비는 상당히 감소 된다.
여기에 설명 된 프로토콜 AVC 및 것 심장 밸브 개발 안내 (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) zebrafish 유전자 변형 라인을 사용 하 여 endocardial 조직 움직임을 추적 하는 효과적인 방법을 제공 합니다.
현재이 방법의 주요 한계 중 하나는 보라색 레이저 광선 축 차원에 국한 되지 않습니다. 이 어려운 photoconversion, 및 그러므로 클론 분석에 대 한 단일 셀 및 추적, 단일 셀의 대상으로 합니다. 2 년 전, Dendra2 준비 될 수 있다 photoconvertible 단백질 변환-단백질 변환할 수 형태로 녹색에서 빨간색 형태로 첫 해 파란 빛, 그리고 근처-적외선 빛18단백질에 의해 발견 되었다. 이 속성을 악용 하는 현미경 설정 많은 강렬한 근처 UV 방사선18 과 관련 된 phototoxicity 문제를 피하고 있는 동안 복잡 한 3 차원 조직 구조에서 공간적으로 제한 된 방식으로 photoconvert Dendra2 표현 셀 수 , 19 , 20.이 현상 뒤에 분자 메커니즘의 최근 발견, 장난를 포함 하 여 많은 그린-레드 photoconvertible 형광 단백질의 이체는 설계 되었습니다 그래서 끝났다 중급을 입력 할 수 있습니다 주21. 우리의 지식, zebrafish 유전자 변형 라인 fli1a 또는 kdrl 와 같은 발기인 단백질 Dendra2의 표현을 드라이브 또는 다른 준비 하는 내 피 세포에서 형광 단백질을 전환 하지 아직 사용할 수 있습니다. 그러나, 라인 편 Dendra2을 표현 하는 사용할 수 있으며 특정 응용 프로그램 22,23에 유용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언.
Acknowledgments
우리 앤 Laure Duchemin, 데니스 Duchemin, 나탈리 Faggianelli 및 바 실 Gurchenkov 디자인 하 고 만들어서 형이이 프로토콜에서 설명 하는 데 도움 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 유럽 공동체, ERC 장부 N ° 682938, EMBO 젊은 조사 프로그램, ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), FRM (DEQ20140329553)에 의해 지원 되었다 Evalve 그랜트 ANR-10-LABX-0030-INRT에 의해 프랑스 국가 기금에 의해 관리 ANR-10-IDEX-0002-02 프레임 프로그램 Investissements d'Avenir에서 직원 회 드 라 검색 표시.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
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