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Developmental Biology

Zebrafish भ्रूण में सेल Photoconversion के द्वारा निंनलिखित Endocardial ऊतक आंदोलनों

Published: February 20, 2018 doi: 10.3791/57290
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2UMR7104, Centre National de la Recherche Scientifique, 3U964, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 4Université de Strasbourg
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल endocardial कोशिकाओं के रहने वाले zebrafish भ्रूण है कि endocardial नहर और अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक दिल वाल्व विकास के दौरान अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक कोशिकाओं की ट्रैकिंग में सक्षम बनाता है की Kaede फ्लोरोसेंट प्रोटीन की photoconversion के लिए एक विधि का वर्णन .

Abstract

embryogenesis के दौरान, कक्ष व्यवहार में गतिशील परिवर्तन से गुजरते हैं, और इन परिवर्तनों के पीछे सेलुलर तर्क का गूढ़ विकास जीवविज्ञान के क्षेत्र में एक मौलिक लक्ष्य है । खोज और photoconvertible प्रोटीन के विकास के काफी एक विधि प्रदान करने के लिए ऑप्टिकली कोशिकाओं और ऊतकों को उजागर द्वारा इन गतिशील परिवर्तन की हमारी समझ सहायता प्राप्त है । हालांकि, जबकि photoconversion, समय चूक माइक्रोस्कोपी, और बाद में छवि विश्लेषण इस तरह के मस्तिष्क या आंख के रूप में अंगों में सेलुलर गतिशीलता को उजागर करने में बहुत सफल साबित कर दिया है, इस दृष्टिकोण के कारण विकासशील दिल में आम तौर पर इस्तेमाल नहीं किया जाता है हृदय चक्र के दौरान दिल की तेजी से आंदोलन से उत्पंन चुनौतियां । इस प्रोटोकॉल में दो भाग होते हैं । पहला भाग photoconverting के लिए एक विधि का वर्णन करता है और बाद में zebrafish अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक नहर (AVC) और अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक हार्ट वाल्व विकास के दौरान endocardial कोशिकाओं (EdCs) पर नज़र रखने । विधि अस्थायी सही photoconversion के लिए जगह लेने के लिए एक दवा के साथ दिल रोक शामिल है. दिल को दवा और भ्रूण के विकास को हटाने पर धड़कन फिर से शुरू की अनुमति है सामांय रूप से जारी है जब तक दिल फिर से photoconverted EdCs के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक बाद में विकास के समय बिंदु पर बंद कर दिया है । प्रोटोकॉल का दूसरा भाग एक छवि विश्लेषण विधि का वर्णन करने के लिए एक photoconverted या गैर photoconverted क्षेत्र के युवा भ्रूण में AVC में तीन आयामी संरचना एक दो आयामी नक्शे पर से फ्लोरोसेंट संकेत मानचित्रण द्वारा की लंबाई यों तो . एक साथ, प्रोटोकॉल के दो भागों एक मूल और कोशिकाओं है कि zebrafish AVC और अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक दिल वाल्व बनाने के व्यवहार की जांच करने के लिए अनुमति देता है, और संभावित म्यूटेंट, morphants, या भ्रूण है कि इलाज किया गया है के साथ अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है AVC और/या वाल्व विकास को बाधित करने वाले एजेंट ।

Introduction

zebrafish वर्तमान में vivo मेंसेलुलर और विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण हड्डीवाला मॉडल में से एक है । यह काफी हद तक आनुवंशिकी के लिए है zebrafish ऑप्टिकल पारदर्शिता और सुविधा के कारण है, जो यह ऑप्टिकल आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग photoresponsive प्रोटीन प्रौद्योगिकियों1शामिल लागू करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल बनाता है । हृदय विकास के अध्ययन के लिए विशिष्ट, zebrafish प्रसार के माध्यम से पर्याप्त ऑक्सीजन प्राप्त ऐसी है कि दिल की धड़कन के बिना भी म्यूटेंट विकास के पहले सप्ताह के माध्यम से जीवित रह सकते हैं, विकासात्मक जीन और परेशान के प्रभाव पर अनुमति विश्लेषण सबसे रीढ़2में हृदय morphogenesis पर रक्त का प्रवाह संभव नहीं ।

zebrafish हार्ट ट्यूब 24 घंटे के बाद निषेचन (hpf) द्वारा बनाई गई है । शीघ्र ही इसके गठन के बाद, दिल ट्यूब सक्रिय रूप से धड़कन शुरू होता है । द्वारा ३६ hpf, एक स्पष्ट कसना निलय से atrium अलग करती है । कसना के इस क्षेत्र अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक नहर (AVC) कहा जाता है, और इस क्षेत्र में कोशिकाओं को एक स्क्वैमस आकृति विज्ञान से एक cuboidal आकृतिविज्ञान3 के लिए बदल जाते हैं । ४८ ज पद निषेचन के आसपास Zebrafish अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक वाल्व morphogenesis शुरू होता है । द्वारा 5 दिनों के बाद निषेचन, दो वाल्व पत्रक AVC में विस्तार और निलय से रक्त की पीठ के प्रवाह को रोकने के लिए हृदय चक्र4के दौरान atrium । AVC और वाल्व गठन के दौरान ट्रैकिंग कोशिकाओं को दिल की तेजी से धड़कन के रूप में चुनौतीपूर्ण है यह मुश्किल पारंपरिक समय चूक माइक्रोस्कोपी5,6के माध्यम से कोशिकाओं का पालन करने के लिए बनाता है । इस प्रोटोकॉल, घोड़ा एट अल, २०१६7से अनुकूलित, एक तरीका है कि टीजी (fli1a: gal4FFयूबीएस, यूएएस: kaede)8 zebrafish ट्रांसजेनिक लाइन, जिसमें photoconvertible प्रोटीन kaede में व्यक्त किया जाता है का उपयोग करता है का वर्णन endocardium सहित endothelial कक्ष । दवा 2, 3-butanedione-2-monoxime (BDM) दिल की धड़कन को अस्थायी रूप से बंद करने के लिए प्रयोग किया जाता है, ३६ और ५५ EdCs के बीच hpf के सटीक photoconversion, और विशिष्ट विकासात्मक समय बिंदुओं पर photoconverted EdCs के उच्च संकल्प इमेजिंग की अनुमति. यह पहले से दिखाया गया है कि EdCs photoconverted इस विधि का उपयोग कर पांच दिन या उससे अधिक के लिए photoconversion7के समय के बाद अपने को अनकनवर्ट पड़ोसियों से अलग रह सकते हैं । इस प्रोटोकॉल भी एक photoconverted EdCs के ४८ hpf, जो सफलतापूर्वक AVC विकास के दौरान ऊतक आंदोलनों (Boselli एट अल., प्रेस में)9का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है से छोटे भ्रूण में छवि विश्लेषण के लिए इस्तेमाल विधि विवरण । हमें उंमीद है कि पाठकों को इस प्रोटोकॉल सामांय भ्रूण में AVC और वाल्व विकास के अध्ययन के लिए उपयोगी मिल जाए, और म्यूटेंट में, morphants, या दवा का इलाज भ्रूण । zebrafish विकास के दौरान सेल ट्रैकिंग photoconvertible प्रोटीन का उपयोग करने से संबंधित एक और अधिक सामांय प्रोटोकॉल के लिए, कृपया Lombardo एट अल, २०१२10द्वारा लेख देखें ।

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Protocol

1. मोल्ड और बढ़ते agarose की तैयारी

  1. या तो एक 3 डी प्रिंटर या पारंपरिक यांत्रिक कार्यशाला उपकरण का उपयोग कर चित्रा 1 में दिखाए गए आयामों के साथ एक मोल्ड बनाएँ ।
  2. एक ३५ मिमी प्लास्टिक बढ़ते पकवान में पिघला 1% agarose के बारे में १.५ मिलीलीटर पिपेट । तरल agarose में प्लास्टिक मोल्ड प्लेस, ध्यान लेने के लिए मोल्ड और agarose के बीच हवा फँसाने से बचने के लिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर पकवान प्लेस, agarose सख्त तक इंतजार (इस बारे में 5 मिनट लगते हैं), तो प्लास्टिक मोल्ड हटा दें ।
  3. बाद में उपयोग के लिए बढ़ते पकवान की दुकान, इसके ढक्कन के साथ पकवान कवर, तो दोनों पकवान लपेटो और parafilm के साथ कसकर ढक्कन । बढ़ते पकवान तो ढक्कन पक्ष नीचे 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए नीचे का सामना कर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  4. अग्रिम में तैयार ०.७% कम पिघलने बिंदु agarose में १.५ मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों के बढ़ते के दिन पर उपयोग करने के लिए 1 मिलीलीटर aliquots ।
    नोट: बढ़ते पकवान के agarose कुओं को समय पर ख़राब के रूप में यदि parafilm व्यंजन के चारों ओर कसकर लपेटा नहीं जाता तो पानी वाष्पित हो जाएगा.

2. Photoconversion के लिए भ्रूण प्राप्त करना

  1. टीजी (fli1a: gal4FFयूबीएस, यूएएस: kaede) रेखा को पार और २८.५ डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में भ्रूण माध्यम में लगभग २०० भ्रूण हो जाना । कैसे zebrafish लाइनों को पार करने के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया जौव विज्ञान शिक्षा डाटाबेस को देखें11।
  2. 5 घंटे के बाद लेकिन 24 घंटे से पहले, 1 के साथ भ्रूण का इलाज-फिनाइल-2-thiourea (PTU) वर्णक गठन को रोकने के लिए (०.००३% भ्रूण माध्यम में PTU).
  3. photoconversion के शुरू होने से पहले के बारे में 1 ज, एक फ्लोरोसेंट stereoscope के तहत स्क्रीन भ्रूण और चुनें 5 स्वस्थ भ्रूण है कि चमकदार हरी प्रतिदीप्ति व्यक्त प्रकट होते हैं । कम तीव्रता प्रकाश का उपयोग करें जब भ्रूण visualizing को परिवेश प्रकाश में भ्रूण के जोखिम से बचने के क्रम में गैर विशिष्ट कोशिकाओं में photoconverting Kaede से बचने के लिए सिफारिश की है ।

3. एंबेडिंग

  1. बढ़ते मीडिया के 10 मिलीलीटर तैयार: ०.०२% tricaine और ५० mM भ्रूण माध्यम में BDM ।
  2. बढ़ते डिश के लिए बढ़ते मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें और agarose में फैलाना समाधान के लिए 15-30 मिनट की अनुमति दें ।
  3. इस बीच में, पिघलने ०.७% कम पिघल बिंदु (LMP) agarose के बारे में 5 मिनट के लिए एक ७० डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में ट्यूब रखने के द्वारा एक 1 मिलीलीटर aliquot ।
    1. थोड़ा ठंडा करने के लिए LMP agarose के लिए प्रतीक्षा करें, फिर कम पिघलने बिंदु µ की ट्यूब के लिए 8 मिलीग्राम/एमएल tricaine समाधान और ४० BDM एल के 25 µ एल जोड़ें । pipetting ऊपर और नीचे से मिश्रण है, तो एक ३८ डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक करने के लिए अपनी तरल अवस्था में LMP agarose रखने के लिए ट्यूब हस्तांतरण ।
  4. भ्रूण के माध्यम से एक पेट्री डिश में, ध्यान से dechorionate stereomicroscope के तहत पूर्व चयनित भ्रूण संदंश का उपयोग कर, देखभाल के लिए भ्रूण को नुकसान नहीं ले ।
  5. बढ़ते मीडिया के 2 मिलीलीटर युक्त एक अलग डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण ।
    1. जब भ्रूण के दिलों को बंद कर दिया जाता है (के बारे में 5-10 मिनट लेता है), बढ़ते पकवान के लिए भ्रूण हस्तांतरण और संदंश का उपयोग कर कुओं में भ्रूण की व्यवस्था इतना है कि वे एक 25 डिग्री के कोण पर झूठ, पूंछ अच्छी तरह से गहरे भाग की ओर इशारा करते हुए, जर्दी का सामना करना पड़ ।
    2. जब भ्रूण जगह में मोटे तौर पर कर रहे हैं, मीडिया को हटाने, ०.७% tricaine और BDM युक्त agarose के ~ २०० µ एल में भ्रूण एंबेड, और ' भ्रूण पदों को समायोजित, छोड़ दिया है या आवश्यक के रूप में सही करने के लिए भ्रूण झुकाव ।
  6. LMP agarose सेट तक रुको (के बारे में 5 मिनट लेता है), तो पकवान को बढ़ते माध्यम जोड़ें । भ्रूण अब photoconverted बनकर तैयार हो गया है ।
    नोट: tricaine और BDM भ्रूण को anesthetize करने के लिए और भ्रूण के दिल को रोकने के लिए, क्रमशः किया जाता है । बढ़ते मीडिया इमेजिंग से पहले दिन तैयार किया जा सकता है, लेकिन प्रकाश से मीडिया की रक्षा के लिए सुनिश्चित करें ।
    नोट: भ्रूण की सही स्थिति एक photoconvert के लिए इच्छाओं को कोशिकाओं को एक स्पष्ट लेजर पथ की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण है । अच्छी तरह से शुरू करने के लिए बंद भ्रूण के सिर की स्थिति इतनी है कि लेजर प्रकाश के लिए दूर यात्रा भ्रूण तक पहुंचने के लिए नहीं है, और इतना है कि भ्रूण आसानी से photoconversion के बाद अनमाउंट किया जा सकता है ।

4. Photoconversion

  1. एक ४०५ एनएम, ४८८ एनएम और ५६१ एनएम लेजर स्रोत के साथ सुसज्जित (Leica SP8 की तरह) एक ईमानदार फोकल माइक्रोस्कोप पर, भ्रूण के दिल का पता लगाने के लिए संचारित सफेद प्रकाश (brightfield) और एक उद्देश्य लेंस का उपयोग (जैसे Leica HCX IRAPO एल, 25 ×, एनए ०.९५ उद्देश्य). लाल Kaede ५६१ एनएम लेजर का उपयोग कर प्रतिदीप्ति के लिए जांच करें (यानी, DPSS ५६१ लेजर, पर ~ 5% तीव्रता, 589-728 एनएम पर सेट डिटेक्टर) । फिर, ४८८ एनएम लेजर का उपयोग करके endocardium कल्पना (यानी, 30 मेगावाट बहुरेखीय आर्गन लेजर पर ~ 5% तीव्रता, 502-556 एनएम पर सेट डिटेक्टर) ।
  2. माइक्रोस्कोप अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर "frap है" मोड दर्ज करें । चुनें ~ 1% लेजर पावर दोनों के लिए ४८८ एनएम और ५६१ एनएम पराबैंगनीकिरण ।
  3. ब्याज के विमान पर ध्यान केंद्रित, ब्याज की एक क्षेत्र (रॉय) का चयन करें, तो photoconvert 25% लेजर पावर में ४०५ एनएम डायोड लेजर का उपयोग कर कोशिकाओं, रॉय तीन बार से अधिक स्कैनिंग । अपर्याप्त Kaede रॉय में photoconverted होना चाहिए, क्षेत्र पर तीन बार फिर से ४०५ एनएम लेजर स्कैन । सभी ROIs के लिए इस चरण को दोहराएँ ।
  4. सॉफ़्टवेयर पर "TCS SP8" मोड पर लौटें और एक z-स्टैक प्राप्त करें, ५६१ एनएम और ४८८ एनएम पराबैंगनीकिरण का उपयोग कर क्रमिक रूप से । इमेजिंग गति बढ़ाने के लिए ' द्वि-दिशा ' विकल्प का चयन करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    नोट: कितनी देर तक यह photoconvert और छवि प्रत्येक भ्रूण बदलता रहता है । दिल की धड़कन सामांय हृदय वाल्व विकास के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है, तो रखने से बचने के दिल से अधिक 30 मिनट के लिए बंद कर दिया, भले ही इसका मतलब है आप समय के लिए सभी 5 भ्रूण photoconvert नहीं है ।
    नोट: photoconversion प्रक्रिया के दौरान, PMT डिटेक्टरों का उपयोग करें, जबकि photoconversion के बाद, यह ' गिनती ' मोड के लिए सेट हाइब्रिड डिटेक्टरों का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. यह है क्योंकि संकर डिटेक्टरों और अधिक संवेदनशील है और बेहतर गुणवत्ता छवियों का उत्पादन करने में सक्षम हैं, लेकिन आसानी से अधिक जोखिम से क्षतिग्रस्त कर रहे हैं ।

5. अनमाउंट photoconverted भ्रूण

  1. photoconversion के बाद, एक गिलास पिपेट का उपयोग करने के लिए नीचे थोड़ा बस भ्रूण के सिर के ऊपर प्रेस करने के लिए LMP agarose तोड़, तो धीरे भ्रूण ऊपर चूसना ।
    1. एक ३५ मिमी पेट्री PTU के साथ भ्रूण माध्यम युक्त पकवान में गिलास पिपेट से भ्रूण बेदखल (दूर BDM युक्त मध्यम) धोने के लिए ।
    2. PTU के साथ भ्रूण माध्यम युक्त 6-वेल प्लेट में एक कुआं में भ्रूण का स्थानांतरण करें । इस चरण के दौरान, ध्यान रखें कि भ्रूण जो में अच्छी तरह से चला जाता है, के रूप में इस के बाद विकास चरणों में photoconverted कोशिकाओं की स्थिति सहसंबंधी बनाना आवश्यक है रखने के लिए सुनिश्चित करें ।
  2. अब जब कि भ्रूण के माध्यम से युक्त BDM से हटा रहे हैं, उनके दिल के बारे में 5 मिनट में फिर से धड़कना शुरू कर देना चाहिए । २८.५ डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे के लिए भ्रूण वापस लौटने के लिए भ्रूण सामान्य रूप से विकसित करने के लिए जारी रखने के लिए अनुमति दें ।

6. इमेजिंग बाद भ्रूण चरणों में photoconverted कोशिकाओं

  1. वांछित चरण में, दिल बंद करो और फिर से इस प्रोटोकॉल के चरण 3 के तहत की तरह भ्रूण एंबेड महत्वपूर्ण अंतर है कि भ्रूण अलग, चिह्नित व्यंजन में BDM के साथ इलाज किया जाना चाहिए भ्रूण का ट्रैक रखने के साथ ।
  2. ६२ hpf अप करने के लिए भ्रूण के लिए, क्रमशः लाल और हरे फ्लोरोसेंट संकेतों के लिए ५६१ एनएम और ४८८ एनएम का उपयोग कर endocardium के z-पोट प्राप्त करते हैं । ६२ hpf से अधिक उम्र के चरणों में भ्रूण के लिए, एक multiphoton लेजर के बजाय ४८८ एनएम लेजर की छवि हरी Kaede के लिए ९४० एनएम के लिए सेट का उपयोग करें ।

7. ४८ hpf के तहत भ्रूण के लिए छवि विश्लेषण

नोट: AVC के ऊतक आंदोलनों अपने जटिल तीन आयामी संरचना के कारण का विश्लेषण करने के लिए मुश्किल हो सकता है । दो गैर-photoconverted क्षेत्रों या दो AVC क्षेत्रों के बीच photoconverted में एक गैर-photoconverted क्षेत्र की लंबाई के बीच AVC में एक photoconverted क्षेत्र की लंबाई यों तो, यह एक पर तीन आयामी संरचना नक्शा वांछनीय किया जा सकता है दो आयामी नक्शा । photoconverted भ्रूण ४८ hpf से पहले प्राप्त की छवियां निंनलिखित विधि का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है ।

  1. Matlab या किसी भी इसी तरह के सॉफ्टवेयर में अधिग्रहीत छवियों को आयात करें ।
  2. Delimitate मैंयुअल रूप से रॉय, अर्थात् endocardium, और एक मुखौटा लागू करने के लिए इस क्षेत्र के बाहर संकेत हटा दें ।
  3. endocardium पर बिंदुओं को पहचानने और उंहें तीन-आयामों में प्लॉट करने के लिए छवि पर तीव्रता थ्रेशोल्ड लागू करें । AVC के संकीर्ण और सबसे सीधे भाग के लिए इसी अंक को अलग, मैन्युअल रूप से atrium और निलय पर कोई ब्याज की अंक मिटा द्वारा सॉफ्टवेयर में मिटा आदेश का उपयोग कर.
  4. एक सिलेंडर का उपयोग करने के लिए इतनी प्राप्त AVC का प्रतिनिधित्व अंक फिट ।
  5. कई नमूनों की तुलना करने के लिए एक संदर्भ प्रणाली निर्धारित करें । उदाहरण के लिए, संदर्भ प्रणाली के मूल और जेड के रूप में सज्जित सिलेंडर की धुरी अक्ष के रूप में AVC अंक के द्रव्यमान के केंद्र को अपनाने ।
    1. सुनिश्चित करें कि सकारात्मक z-स्थितियां हमेशा हृदय के समान पक्ष (वेंट्रिकुलर या अलिंद) से मेल खाती हैं ।
    2. एक्स-वाई विमान पर AVC अंक परियोजना और उंहें फिट करने के लिए एक दीर्घवृत्त का उपयोग करें ।
    3. z-अक्ष के चारों ओर endocardial बिंदुओं को घुमाएं ताकि दीर्घवृत्त के प्रमुख अक्ष और संदर्भ प्रणाली के y-अक्ष समानांतर और सकारात्मक y-मान भ्रूण के संबंध में AVC के आंतरिक पक्ष के अनुरूप हों ।
  6. AVC को खंड करने के लिए, z-दिशा में आधा-विमान {y = 0, x > 0} घुमाकर प्राप्त किए गए कुछ विमानों के साथ त्रि-आयामी डेटासेट काटें ।
    1. परियोजना इन विमानों पर पड़ोसी पिक्सल की तीव्रता और एक सुसंगत तरीके से endothelium परिभाषित । उदाहरण के लिए, अलिंद से endothelium की आधी मोटाई पर AVC के वेंट्रिकुलर पक्ष के लिए मैंयुअल रूप से एक पंक्ति आरेखित करें ।
    2. लगाना एक तीन आयामी पट्टी के साथ endothelium का प्रतिनिधित्व लाइनों के अंक पट्टी toolbox का उपयोग करने के लिए एक सतह के साथ AVC प्रतिनिधित्व करते हैं ।
      नोट: काटने वाले विमानों की संख्या और इस कदम के समय खपत दोनों के विभाजन की सटीकता निर्धारित करता है । आमतौर पर अच्छे नतीजे हासिल करने के लिए 8 विमान ही काफी हैं ।
  7. बेलनाकार निर्देशांक का उपयोग कर AVC सतह पर प्रत्येक बिंदु की azimuthal स्थिति को परिभाषित करें ।
    1. प्रत्येक azimuthal स्थिति में लगातार अंक के बीच सतह पर चाप की लंबाई की गणना करके AVC की सतह के साथ एक पैरामीट्रिक वक्र को परिभाषित ।
    2. प्रत्येक पैरामीट्रिक वक्र के लिए, AVC के केंद्र को शूंय से निकटतम वक्र पर बिंदु को परिभाषित करें । AVC के अंक इस प्रकार पूरी तरह से अपने azimuthal स्थिति और पैरामीट्रिक वक्र पर अपनी स्थिति से वर्णित हैं ।
  8. अंक की पैरामीट्रिक स्थिति का उपयोग करके एक दो आयामी छवि में AVC प्रकट करना ।
  9. photoconverted और गैर-photoconverted चैनलों की तीव्रता के बीच अनुपात को थ्रेशोल्ड करने वाले बाइनरी छवि के किनारों के रूप में होने वाले क्षेत्र के किनारों का पता लगाएं । मैंयुअल रूप से यदि आवश्यक हो तो परिणाम सुधारें ।
  10. azimuthal स्थिति के एक समारोह के रूप में ऊतक की लंबाई की गणना करने के लिए किनारों के बीच चाप लंबाई की गणना ।

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Representative Results

४८ hpf पर एक भ्रूण photoconverted का एक उदाहरण है और ८० hpf पर फिर से imaged चित्रा 2, सिनेमा 1 और 2में दिखाया गया है । Kaede को उजागर करने के लिए ४०५ एनएम प्रकाश अचल अपनी फ्लोरोसेंट हरी रूप से प्रोटीन से फ्लोरोसेंट लाल रूप में धर्मांतरित, या तो हरी या उनके लाल रूप के साथ लेबल कोशिकाओं के व्यवहार को सक्षम करने के लिए उनके अंतर रंग के संबंध में पीछा किया वाल्व गठन के दौरान पड़ोसियों । यह देखा जा सकता है कि ४८ hpf के कुछ photoconverted कोशिकाओं बाद में proliferated AVC और बाद में वाल्व पत्रक के एक तरफ मुख्य रूप से रहते ।

atrium में और निलय में photoconverting EdCs के बाद एक ३६ hpf भ्रूण पर वर्णित छवि विश्लेषण पद्धति लागू करने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है कि परिणामों का एक उदाहरण चित्रा 3में दिखाया गया है । AVC के विभाजन तीन आयामी संरचना है कि फिर दो में पेश है के parametrization-आयाम आसान दृश्य और विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । विधि एक दो photoconverted क्षेत्रों के बीच की दूरी को बढ़ाता है । विभिंन विकास के समय इस प्रक्रिया को दोहराने से यह AVC (Boselli एट अल., प्रेस में) की ओर कोशिकाओं के प्रवास का अध्ययन करने के लिए संभव है9।

Figure 1
चित्र 1 : agarose कुओं बनाने के लिए इस्तेमाल किया मोल्ड । क) सामने देखें । B) वापस देखें । C-D) पक्ष विचार । ई-F) परोक्ष विचार । आयाम मिलीमीटर में दिखाए जाते हैं । को. STL मोल्ड टेम्पलेट के लिए फ़ाइल अनुपूरक सामग्री में प्रदान की जाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : एक के प्रतिनिधि परिणाम टीजी (fli1a: gal4FFयूबीएस, यूएएस: kaede) photoconverted भ्रूण हृदय. क) ४८ hpf पर photoconversion के बाद भ्रूण दिल बस । AVC के श्रेष्ठ पक्ष की कई कोशिकाओं के भीतर Cytoplasmic Kaede अपने हरे रंग के रूप से अपने लाल रूप में परिवर्तित किया गया है । ख) ८० hpf पर एक ही भ्रूण । यह देखा जा सकता है कि पहले से photoconverted कोशिकाओं proliferated है और बेहतर अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक वाल्व के भीतरी दिशा में रहने के लिए आए हैं । स्केल बार्स: 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : एक ३६ hpf भ्रूण पर छवि विश्लेषण प्रक्रिया के प्रतिनिधि परिणाम । क) एक संदर्भ प्रणाली में AVC के तीन आयामी विभाजन का परिणाम है कि भ्रूण के बीच आम है; photoconverted (रानी) और गैर photoconverted (हरी) Kaede से संकेत अपनी सतह पर पेश है और photoconverted और गैर photoconverted क्षेत्रों के निशान । B) AVC को इसके पॉइंट की पैरामीट्रिक स्थिति के अनुसार सामने किया जाता है और सिग्नल को आसान विज़ुअलाइज़ेशन के लिए दो आयामों में पेश किया जाता है । गैर-photoconverted क्षेत्र के किनारों को सफ़ेद में लेबल कर रहे हैं । ग) गैर photoconverted क्षेत्र की लंबाई कोणीय स्थिति के एक समारोह के रूप में साजिश रची है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Movie 1
फिल्म 1: भ्रूण दिल बस ४८ hpf पर photoconversion के बाद । चित्र 2aसे संबंधित । फिल्म ४८ hpf जेड टुकड़ा द्वारा चित्रा 2a जेड टुकड़ा में दिखाया गया भ्रूण का अधिग्रहण जेड स्टैक के माध्यम से चला जाता है । photoconversion प्रक्रिया के दौरान केवल एक ही जेड विमान को चुना गया था, लेकिन यह यहां देखा जा सकता है कि विभिन्न गहराई पर कोशिकाओं को photoconverted गया है । Z स्लाइस 2 µm अलग जगह हैं । इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए दायां क्लिक करें.

Movie 2
फिल्म 2:८० hpf पर photoconverted भ्रूण दिल। चित्र bसे संबंधित । फिल्म का अधिग्रहण जेड के ढेर के माध्यम से चला जाता है ८० hpf जेड स्लाइस द्वारा चित्रा बी जेड टुकड़ा में दिखाया भ्रूण । Z स्लाइस 2 µm अलग जगह हैं । इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए दायां क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल: चित्र 1से संबंधित । को. STL फ़ाइल मोल्ड टेम्पलेट के लिए है । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

photoconversion के समय: हालांकि Kaede चमकीले ९६ hpf में भी EdCs में व्यक्त रहता है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि के रूप में भ्रूण बढ़ता है, लेजर प्रकाश अधिक फैलाना से पहले यह AVC तक पहुंचता है, photoconversion के सीमित Kaede अधिक कठिन बना । भ्रूण के चरणों से बाद में ५५ hpf, निलय के गुब्बारों और atrium का भी मतलब है कि वायलेट लेजर बीम photoconversion के लिए इस्तेमाल किया पहले या तो atrium या निलय से गुजर बिना AVC कोशिकाओं तक नहीं पहुंच सकता । इसका मतलब यह है कि परे ५५ hpf, क्रम में AVC के EdCs photoconvert करने के लिए, एक भी photoconvert और निलय में अतिरिक्त EdCs atrium चाहिए.

BDM और tricaine: EdCs के सटीक photoconversion को अस्थाई रूप से धड़कन से दिल को रोकने की आवश्यकता है । BDM (2, 3-butanedione monoxime) एक इलेक्ट्रो-सिकुड़ा युग्मक है कि अच्छी तरह से हृदय की मांसपेशी संकुचन12को दबाने के लिए जाना जाता है । हम भ्रूण है कि इस प्रोटोकॉल के अधीन किया गया है की आकृति विज्ञान के बीच मतभेद का पालन नहीं करते हैं, और भ्रूण है कि सामांय रूप से बढ़ गया है और उनके दिल नहीं था इमेजिंग के लिए बंद कर दिया । हालांकि, जोखिम यह है कि दवा उपचार सामांय विकास13फेरबदल कर रहा है । केंद्रित tricaine भी अस्थाई रूप से दिल को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है14। हम पाते है कि हम प्रभावी रूप से 1 मिनट के लिए ०.३२% tricaine के साथ भ्रूण माध्यम में भ्रूण रखने से दिल बंद कर सकते हैं, और ०.१६% tricaine के साथ भ्रूण माध्यम को भ्रूण स्थानांतरित द्वारा अपने बंद राज्य में दिल को बनाए रखने । BDM उपचार के समान, दिल 30 मिनट और दिल की धड़कन के लिए इस तरह से रोका जा सकता है सामांय भ्रूण माध्यम में भ्रूण लौटने के बाद 5 मिनट के भीतर वापस देखा जा सकता है । tricaine की उच् च सांद्रता से बचना चाहिए; लंबी अवधि के लिए tricaine के कम सांद्रता (एच/दिन) सामांय भ्रूण विकास को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है15,16। दिल को रोकने के लिए इस्तेमाल Tricaine समाधान सबसे अच्छा ताजा तैयार है । जमे हुए aliquots उपयोग किया जाता है, तो समाधान अच्छी तरह से प्रकाश से सुरक्षित रखने के लिए और 30 डिग्री सेल्सियस से ऊपर समाधान हीटिंग के बिना tricaine को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें । अंत में, blebbistatin गंभीर साइड इफेक्ट्स के बिना दिल को रोकने के लिए सूचित किया गया है13. हम अपनी प्रयोगशाला में इस अंतिम विधि का परीक्षण नहीं किया है ।

बढ़ते और अनमाउंट: भ्रूण की सही स्थिति photoconversion के दौरान महत्वपूर्ण है । agarose वेल्स बनाने के लिए मोल्ड की सुविधा भ्रूण के बढ़ते ऐसे कि पूर्वकाल-भ्रूण के पीछे अक्ष लगातार 25 डिग्री पकवान की सतह के सापेक्ष में निहित है । हम मोल्ड के लिए ३६ और ५५ hpf के बीच सभी विकासात्मक चरणों में photoconversion के लिए लागू हो पाया है । बढ़ते में, बाईं ओर सही दिशा में भ्रूण के झुकाव को भ्रूण के विकास के चरण के अनुसार समायोजित करने की जरूरत है और क्षेत्र एक photoconvert के लिए इच्छाओं । उदाहरण के लिए, ३६ hpf पर AVC photoconvert करने के लिए, भ्रूण लगभग 15 डिग्री के बाईं ओर का सामना करना चाहिए, जबकि ५५ hpf पर, भ्रूण लगभग 10 ° से बाईं ओर का सामना करना चाहिए । stereomicroscope के तहत, आप निलय या atrium द्वारा अस्पष्ट AVC देखने के लिए सक्षम होना चाहिए. यदि, उदाहरण के लिए, atrium AVC पर झूठ, यह सिर्फ AVC या सिर्फ atrium photoconvert संभव नहीं होगा । इमेजिंग प्रयोजनों के लिए, एक ही सांचे में ढालना ३६ और ९६ hpf के बीच भ्रूण की स्थिति के लिए प्रयोग किया जाता है । मोल्ड एक 3 डी प्रिंटर का उपयोग कर या पारंपरिक यांत्रिक कार्यशाला उपकरण का उपयोग सामग्री की एक किस्म का उपयोग किया जा सकता है । स्टेनलेस स्टील या रासायनिक और गर्मी प्रतिरोधी प्लास्टिक दोनों उपयुक्त सामग्री हैं । पाठक एक 3 डी प्रिंटर का उपयोग कर मोल्ड बनाने के लिए इच्छा चाहिए, कृपया के लिए अनुपूरक जानकारी देखें । STL मोल्ड टेम्पलेट की फ़ाइल.

पर्याप्त LMP agarose जोड़ने के लिए पूरे भ्रूण को कवर करने के लिए सुनिश्चित करें कि भ्रूण बढ़ते और photoconversion के बीच दर्ज नहीं हो जाते है सलाह दी जाती है/इमेजिंग, खासकर यदि माइक्रोस्कोप स्थित नहीं है सीधे बढ़ते स्टेशन से सटे । सामांय में, बशर्ते कि भ्रूण ठीक से बढ़ रहे हैं, LMP agarose अनमाउंट के बाद भ्रूण के लिए छड़ी नहीं है । हालांकि, कुछ LMP agarose भ्रूण पर अटक रहना चाहिए, LMP agarose धीरे agarose का उपयोग संदंश से भ्रूण को चिढ़ा द्वारा हटाया जा सकता है ।

भ्रूण, विशेष रूप से भ्रूण से कम ४८ hpf, बढ़ते और अनमाउंटिंग के दौरान आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है । ४८ hpf से कम भ्रूण के लिए, हम अनुशंसा करते हैं आग चमकाने कांच पिपेट के अंत pipetting के दौरान हानिकारक भ्रूण को रोकने के लिए.

माइक्रोस्कोप: यह प्रोटोकॉल एक Leica SP8 माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया गया था । हालांकि, photoconversion एक अच्छी तरह से स्थापित की प्रक्रिया है और इस प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य ईमानदार ४०५ एनएम, ४८८ एनएम और ५६१ एनएम प्रकाश उत्पादन करने में सक्षम पराबैंगनीकिरण के साथ सुसज्जित सूक्ष्मदर्शी के लिए परिवर्तनीय होना चाहिए । ६२ hpf तक भ्रूण के लिए, छवियों को क्रमशः एक आर्गन उत्तेजना लेजर और हरे और लाल Kaede के लिए एक DPSS ५६१ लेजर का उपयोग कर प्राप्त किया गया । ६२ hpf से अधिक पुराने चरणों में भ्रूण के लिए, हरे Kaede एक multiphoton लेजर ९४० एनएम है, जो ४८८ एनएम प्रकाश की तुलना में अधिक पैठ गहराई है करने के लिए सेट का उपयोग कर उत्तेजित किया जा सकता है । सिद्धांत रूप में, लाल Kaede एक दो फोटॉन उत्तेजना स्पेक्ट्रा DsRed के समान होना चाहिए, और ९५० एनएम17पर imaged किया जा सकता है ।

एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक उद्देश्य लेंस कुशलतापूर्वक photoconvert EdCs और उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । के बाद से भ्रूण मीडिया में रखा जाता है, यह एक पानी उद्देश्य लेंस से सुसज्जित एक खुर्दबीन का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

Photoconverting ब्याज के क्षेत्र: यह रूढ़िवादी होना उचित है जब photoconvert के लिए रॉय का चयन-४०५ एनएम लेजर फैलाना के रूप में यह ऊतक के माध्यम से यात्रा और एक से अधिक है कि चयनित क्षेत्र में कोशिकाओं photoconvert कर सकते हैं । यदि, उदाहरण के लिए, आप एक सेल लाल लेबल चाहते हैं, लेकिन सेल सीधे आसंन हरे रंग की तरह होता है, यह समझदारी के लिए अपने रॉय के रूप में आसंन सेल से आगे दूर झूठ सेल के केवल भाग का चयन कर सकते हैं । चूंकि Kaede EdCs के कोशिका द्रव्य में व्यक्त किया जाता है, photoconverted प्रोटीन रॉय द्वारा चयनित नहीं सेल के कुछ हिस्सों को फैलाना होगा ।

Photobleaching और phototoxicity: Kaede प्रोटीन, दोनों अपने हरे और लाल रूपों, अत्यंत उज्ज्वल है और Photobleaching सेल ट्रैकिंग प्रयोगों में आम तौर पर एक सीमित कारक नहीं है । हालांकि, लेजर प्रकाश भ्रूण के विकास को प्रभावित कर सकते है और कम किया जाना चाहिए, विशेष रूप से विकास के प्रारंभिक दौर के दौरान । phototoxicity के लक्षण विकासात्मक देरी और अधिक गंभीर मामलों में शामिल हैं, अनुचित दिल looping और विकृत वाल्व ।

वायलेट लेजर की शक्ति (25%) और पुनरावृत्तियों की संख्या में इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त रॉय (3-6 बार) पर वायलेट लेजर स्कैन empirically निर्धारित किया गया । इन सेटिंग्स में, हम अपनी हरी से Kaede के लगभग पूरा रूपांतरण नजर विकासात्मक देरी के बिना लाल रूप को देखा । लेजर बिजली की मात्रा अंय सूक्ष्म setups में आवश्यक है लेजर तीव्रता पर निर्भर करेगा । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि Kaede के लाल रूप तीव्र ४०५ एनएम रोशनी द्वारा ब्लीच किया जा सकता है, तो अब photoconversion जरूरी अधिक लाल प्रतिदीप्ति उपज नहीं है ।

छवि विश्लेषण: छवि विश्लेषण के लिए प्रस्तावित विधि एक नव विकसित करने के लिए तीन AVC के आयामी ज्यामिति वर्णन और यह भ्रूण के बीच की तुलना प्रक्रिया है । यह monolayer ट्यूबलर संरचनाओं के लिए लागू किया जा करने के लिए करना है, इस तरह के AVC से पहले ४८ hpf और संभावित दिल ट्यूब, पृष्ठीय महाधमनी और दूसरों. यह मुख्य रूप से स्वचालित है, भले ही काटने विमानों पर विभाजन उपयोगकर्ता द्वारा मैंयुअल रूप से किया जाता है और अंय कदम संभावित मैनुअल सुधार की आवश्यकता हो सकती है । मैनुअल विभाजन प्रक्रिया के सबसे महत्वपूर्ण भाग का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि संरचना ज्यामिति और प्रशिक्षण के ज्ञान के लिए अच्छे परिणाम प्राप्त करने की जरूरत है । अभ्यास के बाद इस कदम का समय-उपभोग काफी कम हो जाता है ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक प्रभावी तरीका AVC और अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक हार्ट वाल्व के दौरान endocardial ऊतक आंदोलनों का उपयोग कर विकास प्रदान करता है टीजी (fli1a:gal4FFयूबीएस, यूएएस: kaede) zebrafish ट्रांसजेनिक लाइन ।

वर्तमान में, इस विधि की प्रमुख सीमाओं में से एक यह है कि वायलेट लेजर बीम अक्षीय आयाम में सीमित नहीं है । यह photoconversion के लिए एकल कोशिकाओं को लक्षित करता है, और इसलिए क्लोनल विश्लेषण और एकल सेल ट्रैकिंग, मुश्किल है । दो साल पहले, यह पता चला था कि photoconvertible प्रोटीन Dendra2 परिवर्तित किया जा सकता है-प्रोटीन अपने हरे रंग के रूप से अपने लाल रूप में परिवर्तित किया जा सकता है पहले नीले प्रकाश के साथ प्रोटीन irradiating, और फिर पास के साथ अवरक्त प्रकाश18। माइक्रोस्कोप setups कि इस संपत्ति का दोहन जटिल 3 डी ऊतक संरचनाओं में एक विशेष रूप से सीमित तरीके से कोशिकाओं को व्यक्त Dendra2 photoconvert कर सकते हैं, जबकि तीव्र निकट-यूवी विकिरण के साथ जुड़े phototoxicity समस्याओं के कई से परहेज18 , 19 , 20. इस घटना के पीछे आणविक तंत्र की हाल की खोज के साथ, Kaede सहित कई हरे-से-लाल photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन के वेरिएंट, इंजीनियर इतना है कि एक प्रमुख मध्यवर्ती दर्ज करने में सक्षम भी हैं राज्य21. हमारे ज्ञान के लिए, zebrafish ट्रांसजेनिक लाइनों जहां एक प्रमोटर जैसे fli1a या kdrl ड्राइव प्रोटीन Dendra2 या अंय endothelial कोशिकाओं में परिवर्तनीय फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के रूप में उपलब्ध नहीं है अभी तक । हालांकि, लाइनों कि एक्सप्रेस Dendra2 बैरे उपलब्ध है और कुछ अनुप्रयोगों में उपयोगी साबित हो सकता है 22,23।

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Disclosures

ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।

Acknowledgments

हम डिजाइन और मोल्ड इस प्रोटोकॉल में वर्णित करने में मदद करने के लिए ऐनी-लौरे Duchemin, डेनिस Duchemin, Nathalie Faggianelli और तुलसी Gurchenkov शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस कार्य को FRM (DEQ20140329553), ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), EMBO युवा अन्वेषक कार्यक्रम, यूरोपीय समुदाय, ईआरसी दांता N ° 682938 Evalve और अनुदान ANR द्वारा-10-LABX-0030-INRT, एक फ्रांसीसी राज्य निधि द्वारा प्रबंधित द Agence नॅशनल डे ला सभ्य फ्रेम प्रोग्राम अंतर्गत Investissements d'Avenir त्यसपछि ANR-१०-IDEX-0002-02.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details).
Stereomicroscope
Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) Leica Leica SP8
Heat block ThermoScientific 88870001
35 mm x 10 mm tissue culture dish Falcon 353001
6 well plate Falcon 353046
Petri dish
Forceps
Glass pipette
Mold
Reagents
8 mg/mL Tricaine stock solution 
1 M BDM stock solution
UltraPure low melting point agarose Invitrogen 16520-050
Agarose Lonza 50004
PTU (1-phenyl-2-thiourea) Sigma Aldrich P7629
Embryo medium: 30x stock solution
Software
Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes MathWorks
8 mg/mL Tricaine stock solution
200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) Sigma-Aldrich E10521
25 mL Danieau
Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C 
1 M BDM stock solution
1 g BDM Sigma-Aldrich 112135
10 mL ddH2O
Aliquot and store at -20 °C
Embryo medium: 30x stock solution
50.7 g NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
0.78 g KCl Sigma-Aldrich 7447-40-7
1.47 g Magnesium sulfate Sigma-Aldrich  7487-88-9
2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate Sigma-Aldrich 13477-34-4
19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) Sigma-Aldrich 7365-45-9
Adjust to pH 7.2 and store at room temperature
Mold
PlasCLEAR resin Asiga
Plus 39 Freeform Pico 3D printer Asiga

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References

  1. Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
  2. Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
  3. Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
  4. Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
  5. Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
  6. Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
  7. Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
  8. Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
  9. Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
  10. Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
  11. JoVE Science Education Database. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).
  12. Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
  13. Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
  14. Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
  15. Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
  16. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  17. Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
  18. Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
  19. Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
  20. Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
  21. Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
  22. Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
  23. Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).

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विकास जीवविज्ञान अंक १३२ विकास जीवविज्ञान हृदय विकास सेल ट्रैकिंग vivo इमेजिंग में photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन,ढाणियो rerio zebrafish भ्रूण
Zebrafish भ्रूण में सेल Photoconversion के द्वारा निंनलिखित Endocardial ऊतक आंदोलनों
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Chow, R. W. Y., Lamperti, P., Steed, … More

Chow, R. W. Y., Lamperti, P., Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (132), e57290, doi:10.3791/57290 (2018).

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