Summary
Bu iletişim kuralı Kaede yaşayan endocardial hücreleri floresan proteinin photoconversion için bir yöntemi açıklar endocardial hücreleri izleme Atriyoventriküler kanal ve Atriyoventriküler kalp kapak geliştirme sırasında sağlar Zebra balığı embriyo .
Abstract
Embriyo sırasında hücre hücre davranış dinamik değişiklikleri meydana ve bu değişiklikleri arkasındaki hücresel mantık deşifre gelişim biyolojisi alanında temel bir hedeftir. Büyük ölçüde bulma ve geliştirme photoconvertible proteinlerin anlayışımız bu dinamik değişiklikleri optik hücre ve dokulara vurgulamak için bir yöntemi sağlayarak destekli. Photoconversion, hızlandırılmış mikroskobu ve sonraki görüntü analizi beyin veya göz gibi organlarda ortaya çıkarılması hücre dinamiği içinde çok başarılı olduğu kanıtlanmıştır iken, ancak, bu yaklaşım genellikle nedeniyle gelişen kalp kullanılmaz Kalbin hızlı hareket tarafından kalp döngüsü sırasında yarattığı sorunlar. Bu protokol iki bölümden oluşur. İlk bölümü photoconverting ve endocardial hücreleri (EdCs) Zebra balığı Atriyoventriküler kanal (AVC) ve Atriyoventriküler kalp kapak geliştirme sırasında daha sonra izlemek için bir yöntem açıklanır. Yöntem kalp sırayla gerçekleşmesi doğru photoconversion için bir ilaç ile geçici durdurma içerir. Kalpler devam etmek için izin verilen dayak kaldırmadan ilaç ve embriyonik gelişim devam ediyor normal kalp tekrar photoconverted EdCs daha sonra gelişimsel zamanda noktada yüksek çözünürlükte görüntüleme için durduruluncaya kadar. İkinci protokolünün bir parçası olarak bir iki boyutlu harita üç boyutlu yapısını floresan sinyalini eşleyerek genç embriyo AVC photoconverted veya photoconverted olmayan bir bölgede uzunluğunu ölçmek için bir görüntü analiz yöntemi açıklar . Birlikte, protokol iki bölümden bir Zebra balığı AVC ve Atriyoventriküler kalp kapakçığı oluşturan ve potansiyel olarak mutantlar, morphants veya ile tedavi edilmiş embriyoların eğitimi için uygulanan olabilir hücreleri davranışını ve kökeni incelemek izin verir reaktifler AVC ve/veya Vana geliştirme bozabilir.
Introduction
Zebra balığı şu anda hücresel ve gelişim süreçleri vivo içindeçalışmak için en önemli omurgalı modellerinden biri. Bu büyük ölçüde nedeniyle Zebra balığı'nın optik şeffaflık ve amenability genetik olarak içeren optik teknikleri uygulamak için güçlü bir model yapar genetik photoresponsive protein teknolojileri1kodlanmış. Kalp Geliştirme çalışma özgü, Zebra balığı almak yeterli oksijen Difüzyon yolu ile kalp atışı olmadan hatta mutantlar analizleri gelişimsel genlerin ve perişan etkisi izin geliştirme, ilk hafta boyunca yaşayamaz öyle ki kan akımı üzerinde kalp morfogenez çoğu omurgalılar2' mümkün değil.
Zebra balığı kalbini tüp 24 saat sonrası döllenme (hpf) tarafından kuruldu. Kısa bir süre sonra oluşumu, kalbini tüp aktif dayak başlar. 36 tarafından hpf, açık bir daralma ayıran atrium ventrikül üzerinden. Daralma bu bölgesine Atriyoventriküler kanal (AVC) ve bu bölge değişikliği hücrelerinin Skuamöz Morfoloji tetrahedron Morfoloji3denir. Zebra balığı Atriyoventriküler kapak morfogenez başlar yaklaşık 48 h Döllenme sonrası. Tarafından 3 gün Döllenme sonrası, iki kapak Beyannameler AVC genişletmek ve ventrikül kan atrium için geri akışı sırasında kalp döngüsü4önlemek. Hızlı atan kalp hücreleri geleneksel hızlandırılmış mikroskobu5,6takip etmek zor yapar gibi hücreleri AVC ve Vana oluşumu sırasında izleme meydan okuyor. Steed ve ark., 20167, uyarlanmış bu iletişim kuralı, photoconvertible protein Kaede olarak ifade edilir Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 Zebra balığı mutant satýr, bir yöntem açıklar endotel hücreleri, endokard dahil olmak üzere. Uyuşturucu 2,3-butanedione-2-monoxime (BDÖ) yenerek, EdCs 36 55 hpf ve photoconverted EdCs gelişimsel zaman belirli noktalarda yüksek çözünürlüklü görüntüleme arasında doğru photoconversion sağlayan kalp geçici olarak durdurmak için kullanılır. Daha önce bu yöntemi kullanarak EdCs photoconverted beş gün veya daha fazla photoconversion7saat sonra dönüştürülmeyen komşularını ayırt kalabileceği gösterilmiştir. Bu iletişim kuralı da photoconverted EdCs embriyo 48 genç görüntü analizi için kullanılan bir yöntem detaylar doku hareketleri sırasında AVC geliştirme (Boselli vd., Basında)9takip için başarılı bir şekilde kullanılmıştır hpf. Biz okuyucular bu protokolü yararlı AVC ve Vana geliştirme normal embriyo ve mutantlar, morphants veya uyuşturucu tedavi edilen embriyolar eğitimi için bulacağını umuyoruz. Zebra balığı geliştirme sırasında photoconvertible proteinleri kullanarak hücre izleme ile ilgili daha genel bir protokol için lütfen Lombardo vdtarafından 201210makaleyi görüntüleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kalıp hazırlama ve özel montaj
- Bir 3D printerlere harcama maddeler veya geleneksel mekanik atölye araçlarını kullanarak şekil 1 ' de gösterilen boyutları ile bir kalıp oluşturun.
- Yaklaşık 1,5 mL erimiş % 1'özel bir 35 mm plastik montaj kabına pipet. Plastik kalıp kalıp ve özel arasındaki bindirme hava önlemek için dikkat çekici sıvı özel yerleştirin. 4 ° C'de çanak yerleştirin, özel (Bu alır yaklaşık 5 dk) sertleşir kadar bekle, sonra plastik kalıp kaldırın.
- Montaj çanak daha sonra kullanmak üzere saklamak için kapağı ile çanak kapağı sonra çanak ve kapak parafilm ile sıkıca sarın. Montaj çanak-ebilmek var olmak stok sonra kapak yüzü aşağı bakacak şekilde-4 ° C'de 5 güne kadar
- Önceden 1 mL aliquots %0,7 düşük erime noktası özel 1,5 ml, montaj gününde kullanılacak Eppendorf tüpleri hazırlayın.
Not: Eğer parafilm yemekler sıkıca sarılır değil su buharlaşır gibi montaj çanak özel kuyu zamanla deforme.
2. Photoconversion için embriyo elde
- Incross Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) satır ve yaklaşık 200 embriyo 28.5 ° C'de karanlıkta embriyo ortamda büyümeye Zebra balığı çizgiyi hakkında daha fazla bilgi için lütfen Jüpiter bilim eğitim veritabanı11' e bakın.
- 5 h sonra ancak 24 saat önce 1-fenil-2-Tioüre (PTU pigment oluşumunu önlemek için) ile embriyo tedavi (%0,003 PTU embriyo orta).
- 1 h, photoconversion, ekran embriyo bir floresan stereoscope altında ve select 5 sağlıklı embriyoların başlamadan en parlak yeşil Floresans ifade etmek için görünür. Embriyo görüntülenmesi zaman düşük yoğunluktaki ışık kullanımı photoconverting Kaede non-spesifik hücrelerdeki önlemek için embriyoların maruz ortam ışığı önlemek için önerilir.
3. katıştırma
- Ortam takma 10 mL hazırlamak: %0,02 tricaine ve 50 mM BDÖ embriyo orta.
- Montaj yemek için montaj orta 2 mL ekleyin ve özel yaygın çözüm için 15-30 dakika.
- Bu arada, 1 mL aliquot %0,7 düşük erime noktası (LMP) özel bir tüp hakkında 5 min için 70 ° C ısı bloğu yerleştirerek eritebilir.
- LMP özel biraz soğumasını bekleyin sonra 25 µL 8 mg/mL tricaine çözüm ve 1 M BDÖ çözüm 40 µL düşük erime noktası özel tüp için ekleyin. Yukarı ve aşağı, pipetting tarafından Mix ardından LMP özel sıvı durumundaki tutmak için 38 ° C ısı bloğu için tüp aktarın.
- Bir Petri embriyoya zarar vermemeye dikkat çekici forseps kullanarak stereomicroscope altında önceden seçilen embriyolar ile embriyo orta, dikkatle dechorionate çanağı.
- Embriyo medya montaj 2 mL içeren ayrı bir yemek için transfer.
- Ne zaman kalpleri embriyoların durdurulur (yaklaşık 5-10 dakika sürer), montaj için embriyo çanağı ve embriyo Wells 25 derece açıyla yalan forseps kullanarak düzenlemek transfer kuyrukları daha derin kuyu, yukarı dönük olacak şekilde sarısı parçası doğru işaret.
- Ne zaman embriyo olan kabaca yerde, medyayı çıkarın, embriyo % 0.7 LMP özel tricaine ve BDÖ içeren ~ 200 µL içinde embed ve embriyo pozisyonları, yeniden ayarlamak için sola veya sağa gerektiği gibi embriyo devirme.
- Yemek için montaj orta LMP özel setleri (alır yaklaşık 5 dk), o zaman eklemek kadar bekleyin. Embriyo şimdi photoconverted olmaya hazırız.
Not: Tricaine ve BDÖ embriyo anestezi ve embriyo kalp, sırasıyla durdurmak için kullanılır. Montaj medya görüntüleme önceki gün hazırlanabilir, ama medya ışıktan korumak emin olun.
Not: Embriyo doğru konumlandırma bir net lazer yol bir photoconvert için dilek hücrelere izin vermek önemlidir. Embriyo başkanı böylece lazer ışık çok embriyo ulaşmak için seyahat etmek zorunda değildir ve böylece embriyo photoconversion sonra kolayca monte edilmemiş olabilir iyi başlangıç yakın yerleştirin.
4. Photoconversion
- Bir 405 ile donatılmış bir dik confocal mikroskobu (gibi Leica SP8) üzerinde nm, 488 nm 561 nm lazer kaynak, yerini öğrenmek ve embriyonun kalp kullanarak beyaz ışık (aydınlık alan) ve bir objektif lens aktarılan'ın (tarihlerde Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0,95 amaç). Kırmızı Kaede floresan 561 nm lazer (örneğin, ~ %5 yoğunluğu, 589-728 nm'de ayarla dedektörü, DPSS 561 lazer) kullanarak kontrol edin. O zaman, endokard 488 nm lazer (Yani, 30 mW çok satırlı Argon lazer ~ %5 yoğunluğu, 502-556 nm'de ayarla dedektörü) kullanarak görselleştirmek.
- "Sıkı BAĞLAMAK" moduna mikroskop edinme yazılım. % ~ 1 lazer güç için her iki 488 seçin nm ve 561 nm lazerler.
- Faiz uçakta odaklanmak, photoconvert hücreleri 405 nm diyot kullanarak yatırım Getirisi üzerinde üç kez tarama % 25 lazer güçte lazer sonra faiz (ROI), bir bölge seçin. Yetersiz Kaede-meli var olmak photoconverted içinde yatırım Getirisi, 405 nm Lazer alanı üzerinde üç kez tekrar tarayın. Tüm ROIs için bu adımı yineleyin.
- Yazılım "Kıbrıslı Türkler SP8" moduna dönmek ve bir z-yığını, 561 kullanarak elde nm ve 488 nm lazerler sırayla. Görüntüleme hızını artırmak için 'çift yönlü' seçeneğini seçtiğinizden emin olun.
Not: Ne kadar photoconvert ve her embriyo değişir görüntü için gereken. Kalp atışı normal kalp kapak geliştirme için önemli, yani tüm 5 embriyo photoconvert için vaktin var mı anlamına gelse bile daha--dan 30 dk için durdu kalp tutulması önlemek için bilinir.
Not: photoconversion işlemi sırasında kullanım Devresel_ödeme dedektörleri, photoconversion iken sonra bu melez dedektörleri 'modu bu sayıma' ayarla kullanmak için tavsiye edilir. Bunun nedeni hibrid dedektörleri daha hassas ve daha iyi kalitede görüntüler üretebilen, ama dozun tarafından kolayca zarar görebilir.
5. photoconverted embriyo çıkarma
- Photoconversion sonra bir cam pipet LMP özel kırmak, sonra yavaşça embriyo kadar emmek için embriyo başkanı biraz hemen üzerinde bastırın için kullanın.
- Cam pipet gelen embriyo bir 35 mm Petri PTU (orta içeren BDÖ silsin için) ile embriyo orta içeren içine dışarı atmak.
- PTU ile embriyo ortam içeren bir 6-şey plaka bir kuyuda embriyo transfer edin. Bu photoconverted hücreler konumunu daha sonra gelişim aşamalarında ilişkilendirmek için gerekli olduğu gibi bu adım sırasında hangi iyi, hangi embriyo Not tutmak emin olun gider.
- Şimdi bu embriyoların BDÖ içeren ortamından kaldırılır, kalplerini 5 dk. içinde karanlık 28.5 ° C'de embriyo normalde geliştirmeye devam etmek izin vermek için dönüş embriyolar tekrar atmaya başlayacaktır.
6. photoconverted hücreleri embriyonik aşamada daha sonra görüntüleme
- İstenen aşamada kalbini durdurması ve yeniden gibi embriyo altında Bu protokol, adım 3 embriyo embriyo izlemek için ayrı, işaretli yemeklerinde BDÖ ile tedavi edilmelidir önemli farkı embed.
- Embriyolar kadar 62 için hpf, z-561 kullanarak diyaframdan yığını elde nm ve 488 nm için kırmızı ve yeşil floresan sinyallerini, anılan sıraya göre. Embriyo aşamalarında 62 büyük için hpf, kullanım multiphoton bir lazer kümesine 940 nm 488 nm lazer yerine yeşil Kaede görüntü.
7. görüntü analizi için embriyo küçük 48 hpf
Not: AVC doku hareketleri nedeniyle karmaşık üç boyutlu yapısını analiz etmek zor olabilir. AVC iki sigara photoconverted bölgeler veya AVC iki photoconverted bölgeler arasındaki bir sigara photoconverted bölgede uzunluğu arasında photoconverted bölgede uzunluğunu ölçmek için bu üç boyutlu yapısını eşlemek için arzu olabilir bir iki boyutlu harita. Photoconverted embriyo görüntülerini elde önce 48 hpf analiz istimal ertesi gün yöntem.
- Matlab veya benzer herhangi bir yazılım alınan görüntüleri içe.
- El ile yatırım Getirisi, Yani endokard sınırlandırmak ve bu bölgenin dışında sinyal kaldırmak için bir maske uygulayın.
- Diyaframdan noktalarında belirlemek ve onları üç-boyutlu olarak çizmek için resmi bir yoğunluk eşik uygulanır. Hiçbir ilgi atrium ve ventrikül yazılımda Sil komutunu kullanarak el ile silerek AVC, dar ve en düz parçası karşılık gelen Puan yalıtmak.
- Yani elde AVC temsil eden noktaları uyacak bir silindir kullanın.
- Çeşitli örnekleri karşılaştırmak için bir referans sistemi tanımlayın. Örneğin, AVC Puan kütlenin merkezi başvuru sisteminin başlangıç noktası ve z ekseni olarak monte silindirin ekseni olarak kabul eder.
- Pozitif z-pozisyonlar her zaman kalp (ventrikül veya Atriyal) aynı tarafına karşılık emin olun.
- AVC Puan x-y uçakta proje ve onlara uyacak bir elips kullanın.
- Z ekseni etrafında endocardial Puan elipsin büyük ekseni ve y ekseni başvuru sisteminin paralel ve AVC embriyo ile ilgili iç tarafına pozitif y-değerlerini karşılık döndürür.
- AVC segmentlere ayırmak için uçakları yarı-uçak döndürerek elde edilen üç boyutlu veri kümesi kesme {y = 0, x > 0} z yönünde.
- Komşu piksel yoğunluğu bu uçaklarda proje ve endotel tutarlı bir şekilde tanımlayın. Örneğin, el ile bir çizgi Atriyal yarım endotel kalınlığı, AVC ventrikül tarafına çizin.
- Endotel ile üç boyutlu bir eğri yüzeyli AVC temsil etmek için eğri toolbox'ı kullanarak temsil eden satır ayırıcıları tanımlar.
Not: Her iki ayrılmasını doğruluğunu ve zaman tüketimi bu adımın kesme uçak sayısını belirler. Genellikle, 8 uçak iyi sonuçlar elde etmek için yeterlidir.
- Her bir noktanın azimut yerini AVC yüzeyde silindirik koordinatları kullanarak tanımlar.
- Azimut her konumda AVC yüzeyi boyunca parametrik eğri ardışık noktaları arasındaki yüzeyinde yay uzunluğu hesaplayarak tanımlayın.
- Her parametrik eğri için AVC sıfıra ortasına yakın eğride nokta tanımlayın. AVC noktaları böylece tamamen azimut konumlarını ve konumlarına göre parametrik eğri üzerinde açıklanmıştır.
- AVC Puan parametrik konumunu kullanarak iki boyutlu bir görüntü içine açılmak.
- Bölge İkili resim eşik kenarları photoconverted yoğunluklarda ve sigara photoconverted kanalları arasındaki oran ölçmek için kenarları bulun. El ile sonuç gerekirse düzeltin.
- Azimut pozisyon bir fonksiyonu olarak doku uzunluğunu hesaplamak için kenarları arasındaki yay uzunluğu hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Örnek olarak bir embriyo photoconverted 48 hpf ve tekrar 80 yansıma hpf gösterilen Şekil 2, film 1 ve 2. Kaede geri dönüşümsüz 405 nm ışığa maruz yeşil ya da kırmızı kendi formu ile takip edilmesi ile etiketli hücreleri davranışını etkinleştirme dönüştürür floresan yeşil şekliyle protein flüoresan kırmızı forma,--dan onların differentially renkli için saygı Komşular Vana oluşumu sırasında. 48 hpf AVC kaç photoconverted hücrelerinin daha sonra hızla ve daha sonra ağırlıklı olarak ikamet Vana belgesi bir tarafında görülebilir.
Photoconverting EdCs atrium ve ventrikül şekil 3' te gösterilen sonra 36 hpf embriyo üzerinde olan görüntü analiz yöntemi uygulayarak elde sonuçları örneği. AVC ayrılmasını parametrization sonra iki-boyutlu daha kolay görselleştirme ve analiz için öngörülen üç boyutlu yapısı sağlar. Yöntemi bir iki photoconverted bölgeler arasındaki uzaklığı ölçmek sağlar. Farklı gelişim zamanlarda bu işlemi yineleyerek hücreleri AVC (Boselli vd., Basında)9doğru göç çalışma mümkündür.
Resim 1 : Özel kuyuları oluşturmak için kullanılan kalıp. A) ön görünümü. B) arkadan görünüm. C-D) Görünümleri. E-F) Eğik kez dinlendi. Boyutları milimetre cinsinden gösterilir. . Kalıp şablonu için STL dosyasına ek materyalleri sağlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Temsilcisi sonuçlarını bir Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) photoconverted embriyonik kalp. A) hemen sonra photoconversion 48 embriyonik kalp hpf. AVC üstün tarafının çeşitli hücrelerde sitoplazmik Kaede onun yeşil formundan kırmızı şekliyle dönüştürüldü. B) 80, aynı embriyo hpf. O-ebilmek var olmak seen bu daha önce photoconverted hücreleri hızla ve üstün Atriyoventriküler kapak iç tarafında bulunan için geldim. Ölçek çubukları: 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : 36 hpf embriyo üzerinde görüntü analiz sürecinin temsilcisi sonuçları. A) AVC embriyolar arasında; ortak bir referans sisteminde üç boyutlu ayrılmasını sonucu photoconverted (macenta) ve non-photoconverted (yeşil) Kaede sinyalini yüzeyi yansıtılır ve photoconverted ve photoconverted olmayan bölgeler işaretler. B) AVC onun noktanın parametrik konumuna göre gelişeceğini ve sinyal daha kolay görüntüleme için iki boyutta öngörülmektedir. Photoconverted bölge kenarları beyaz olarak etiketlenir. C) photoconverted bölge uzunluğu açısal pozisyon bir fonksiyonu olarak çizilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Film 1: 48 photoconversion hemen sonra embriyonik kalp hpf. Şekil 2Aiçin ilgili. Film şekil 2A z dilim z dilim tarafından gösterilen 48 hpf embriyo elde edilen z yığını geçer. Tek bir z uçak photoconversion işlemi sırasında seçildi, ancak hücreleri çeşitli derinliklerde photoconverted edilmiştir burada görülebilir. Z dilimler aralıklı 2 µm ayrı olur. Bu film indirmek için sağ'ı tıklatın.
Movie 2: 80 photoconverted embriyonik kalbinde hpf. Şekil 2Biçin ilgili. Film şekil 2B z dilim z dilim tarafından gösterilen 80 hpf embriyo elde edilen z yığını geçer. Z dilimler aralıklı 2 µm ayrı olur. Bu film indirmek için sağ'ı tıklatın.
Ek dosya: Şekil 1' e ilgili. . STL dosya kalıp şablonu için. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Photoconversion zamanlaması: her ne kadar Kaede bile 96 EdCs içinde parlak ifade kalır hpf, embriyo büyüdükçe, Kaede kapalı photoconversion daha zor hale AVC ulaşmadan önce lazer ışığı daha fazla yayılır olduğunu belirtmek gerekir. At embriyonik aşamalarında 55'dan sonra hpf, aynı zamanda atrium ve ventrikül Balonculuk anlamına gelir photoconversion için kullanılan Menekşe lazer ışını AVC hücreleri atrium ya da ventrikül üzerinden ilk geçen olmadan ulaşamıyorum. Bu demektir ki 55 hpf, photoconvert AVC, EdCs amacıyla bir gerekir Ayrıca photoconvert atrium ve ventrikül ek EdCs.
BDÖ ve tricaine: EdCs doğru photoconversion gerektirir dayaktan kalp geçici olarak durdurma. BDÖ (2, 3-butanedione monoxime) kalp kası kasılması12bastırmak için bilinen bir elektro-contractile uncoupler olduğunu. Biz bu protokolü tabi olmuştur embriyo morfolojisi arasında farklılıklar uygulamıyor ve normalde büyüyen ve yok embriyo kalplerini görüntüleme için durdu vardı. Ancak, risk uyuşturucu tedavi normal gelişim13değiştiriyor kalır. Konsantre tricaine kalp14geçici olarak durdurmak için de kullanılabilir. Biz biz etkili %0,32 tricaine 1 dk ile embriyo orta embriyo yerleştirerek kalbini durdurması ve embriyo Orta %0.16 tricaine ile embriyo transfer ederek kalbi durdu durumunda korumak olduğunu bulmak. Benzer şekilde BDÖ tedavi, kalp 30 dk için bu şekilde durdurulabilir ve kalp atışı normal embriyo orta embriyo döndükten sonra 5 dk içinde dönmek için görülebilir. Tricaine daha yüksek konsantrasyonlarda kaçınılmalıdır; tricaine düşük konsantrasyonlarda takmaktan (h/gün) gösterildi normal embriyonik gelişim15,16etkileyecek. Kalbi durdurmak için kullanılan Tricaine çözüm en iyi taze hazırlanır. Donmuş aliquots kullandıysanız, çözüm de ışıktan korunan tutmak için ve 30 ° c yukarıda çözüm Isıtma olmadan tricaine defrost için emin olun Son olarak, blebbistatin ciddi yan etkileri13kalpsiz durdurmak için rapor edildi. Biz bu son yöntemi bizim laboratuarımızda test etmedim.
Montaj ve çıkarma: photoconversion sırasında kritik embriyoların doğru konumlandırma. Öyle ki embriyo ön-arka ekseninin sürekli çanak yüzeyine göre 25 ° yatıyor. özel wells yapmak için kalıp embriyo montajı kolaylaştırır. Tüm gelişim dönemleri arasında 36 ve 55 hpf kalıp photoconversion için geçerli olabileceğini bulduk. Montaj içinde soldan sağa yönde embriyo tilt embriyo'nın gelişimsel sahne ve bir photoconvert için dilek alan göre ayarlanması gerekir. Örneğin, photoconvert AVC 36 için hpf, embriyo kabaca 15° 55 iken sol yüz hpf, embriyo yüz kabaca 10° sola. Stereomicroscope altında ventrikül veya atrium unobscured AVC görmek gerekir. Eğer, örneğin, atrium AVC üzerinde yatıyor, photoconvert sadece AVC ya da sadece atriyum mümkün olmazdı. Görüntüleme amaçları için aynı kalıp embriyo 36 ve 96 hpf arasında konumlandırmak için kullanılır. Kalıp bir 3D printerlere harcama maddeler veya geleneksel mekanik atölye araçları kullanarak malzemelerin çeşitli kullanarak yapılabilir. Paslanmaz çelik veya kimyasal ve ısı dayanıklı plastik her iki uygun maddeler olduğunu. Lütfen ek bilgi için bkz: bir 3D printerlere harcama maddeler kullanarak kalıp oluşturmak okuyucu isteyen gerekir. STL dosya kalıp şablonunun.
Yeterli LMP ekleme tüm embriyo karşılamak için özel embriyo montaj arasında yerinden çıkar ve photoconversion/görüntüleme, özellikle mikroskop montaj İstasyonu'na bitişik değilse olmazlar sağlamak için tavsiye edilir. Embriyo düzgün monte edilmiş olması koşuluyla, genel olarak, LMP özel embriyolar için çıkarma sonra yapışmaz. Ancak, bazı LMP özel sıkışmış kalmalıdır embriyo üzerinde LMP özel yavaşça embriyo forseps kullanarak özel üzerinden alay tarafından kaldırılabilir.
Embriyo, özellikle embriyo 48 daha az hpf, kolayca hasar takma ve çıkarma sırasında. Embriyo 48 daha az için hpf, zarar verici embriyo pipetting sırasında önlemek için cam pipet sonu parlatma yangın öneririz.
Mikroskop: Bu protokol bir Leica SP8 mikroskop kullanarak gerçekleştirildi. Ancak, photoconversion köklü bir süreçtir ve bu iletişim kuralı-meli var olmak kolayca dönüştürülebilir 405 üretebilen lazerler ile donatılmış diğer dik mikroskoplar nm, 488 nm ve 561 nm ışık. Embriyolar kadar 62 için hpf, görüntüleri bir argon uyarma lazer ve DPSS 561 lazer yeşil ve kırmızı Kaede için sırasıyla kullanarak elde. Embriyo aşamalarında 62 büyük için hpf, Kaede heyecanlı 940 için ayarla multiphoton lazer kullanarak yeşil nm, 488 nm ışıktan daha büyük bir penetrasyon derinliği vardır. Teorik olarak, kırmızı Kaede DsRed için benzer bir iki fotonlu uyarma spectra olmalı ve 950 nm17, yansıma.
Yüksek sayısal diyafram açıklığı ile bir objektif lens verimli bir şekilde photoconvert EdCs ve yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için gereklidir. Bu yana embriyo medyada tutulur, bir su amaç objektifi mikroskop seçmek önemlidir.
Photoconverting bölgenin ilgi: yatırım Getirisi photoconvert için seçerken muhafazakar olmak tavsiye edilir - doku ve -ebilmek photoconvert hücreler seçili daha büyük bir alanda üzerinden seyahat olarak 405 nm lazer yayılır. Eğer, örneğin, bir hücre kırmızı etiket istiyor ama hücreyi bitişik yeşil kalmasını istiyorum, yatırım Getirinizi olarak bitişik hücreye uzak daha fazla yalan hücre yalnızca bir bölümünü seçmek ihtiyatlı olabilir. Kaede EdCs sitoplazma içinde ifade edilir beri photoconverted protein ROI tarafından seçilmemiş hücre bölümlerine yaygın.
Photobleaching ve fototoksisite: Kaede protein, her iki yeşil ve kırmızı formları, son derece parlak ve photobleaching değil genellikle kısıtlayıcı bir faktör deneyleri izleme hücre. Ancak, lazer ışık embriyonik geliştirme etkisi olabilir ve özellikle erken gelişim evrelerinde indirilmelidir. Fototoksisite mucizesi vardır gelişimsel gecikme ve daha ciddi durumlarda, uygun olmayan kalp döngü ve hatalı biçimlendirilmiş vanalar.
Menekşe lazer (% 25) ve menekşe lazer inceden inceye gözden geçirmek (3 - 6 kez) Bu protokol için kullanılan yatırım Getirisi üzerinde yineleme sayısını gücünü tespit ampirik olarak. Bu ayarlar neredeyse tamamen dönüştürülmesine ilişkin Kaede, yeşil kırmızı forma belirgin gelişimsel gecikme olmadan gördük. Lazer güç diğer mikroskobu kurulumları gerekli miktarı lazer'ın yoğunluğu üzerinde bağlı olacaktır. Bu yüzden daha uzun photoconversion daha fazla kırmızı Floresans verim vermez Kaede kırmızı şeklinde yoğun 405 nm aydınlatma, ağartılmış unutulmamalıdır.
Görüntü analizi: yöntem önerilen için görüntü analizi AVC üç boyutlu geometriyi açıklamanız ve embriyo arasında karşılaştırmak için yeni geliştirilen bir süreçtir. Monolayer yapılar, 48 önce AVC gibi uygulanmak üzere tasarlanmıştır hpf ve potansiyel olarak kalp tüp, dorsal aort ve diğerleri. Esas olarak otomatik kesme uçakta ayrılmasını el ile kullanıcı tarafından gerçekleştirilen ve diğer adımları potansiyel olarak el ile düzeltme gerektiren rağmen. Yapısı geometri ve eğitim bilgisine ihtiyaç vardır bu yana iyi sonuçlar elde etmek için el ile segment oluşturma işleminin, en kritik parçası temsil eder. Pratik sonra bu adımın zaman tüketimini önemli ölçüde azalır.
Burada açıklanan protokol AVC ve Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) Zebra balığı mutant satırını kullanarak Atriyoventriküler kalp kapak geliştirme sırasında endocardial doku hareketlerini izlemek için etkili bir yol sağlar.
Şu anda, bu yöntem anahtar sınırlamaları Menekşe lazer ışını Aksiyel boyutta sınırlı değildir biridir. Bu photoconversion ve bu nedenle klonal analizleri için tek hücreleri ve tek hücre izleme, hedefleme güçleştirir. İki yıl önce bu dönüştürülmüş Dendra2 astarlanmalıdır photoconvertible protein - protein onun yeşil formundan kırmızı şekliyle ilk mavi ışık ve o zaman yakın kızılötesi ışık18ile protein irradiating tarafından dönüştürülebilir keşfedilmiştir. Bu özellik yararlanmak mikroskop kurulumları photoconvert Dendra2 ifade hücreleri dağınık şekilde sınırlı bir şekilde karmaşık 3D doku yapılarda yoğun UV yakınındaki ışınlama18 ile ilişkili fototoksisite sorunların çoğunu kaçınırken olabilir , 19 , 20. bu da astarlanmalıdır orta girme yeteneğine sahiptirler bu yüzden bu fenomeni arkasında moleküler mekanizması son keşfi ile değişik-in Kaede, dahil olmak üzere birçok yeşil kırmızı photoconvertible floresan protein si-mühendislik Devlet21. Bilgimizi, nerede bir organizatörü fli1a veya kdrl gibi bir protein Dendra2 ifade sürücüler veya diğer endotel hücrelerinde Cabrio floresan proteinler astarlanmalıdır Zebra balığı transgenik hatları henüz mevcut değildir. Ancak, Dendra2 ubiquitously hızlı hatları kullanılabilir ve belirli uygulamalar 22,23' işe yarayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli ve Basile Gurchenkov tasarım ve bu protokol için açıklanan kalıp yapmak yardımcı olduğunuz için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser desteklenen FRM (DEQ20140329553), (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01) ANR, EMBO genç araştırmacı programı, Avrupa Topluluğu, ERC CoG N ° 682938 tarafından Evalve ve bir Fransız devlet Fonu ANR-10-LABX-0030-INRT grant tarafından yönetilen tarafından Agence Nationale de la Recherche çerçeve programı Investissements d'Avenir altında ANR-10-IDEX-0002-02 etiketli.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
