Summary
Denne protokollen beskriver en metode for photoconversion av Kaede fluorescerende proteinet i endocardial cellene levende sebrafisk embryo som muliggjør sporing av endocardial celler under atrioventrikulær kanalen og atrioventrikulær hjertet ventil utvikling .
Abstract
Under embryogenesis, celler gjennomgå dynamiske endringer i celle atferd og tyde mobilnettet logikken bak disse endringene er et grunnleggende mål innen utviklingsbiologi. Oppdagelsen og utvikling av photoconvertible proteiner har sterkt hjulpet vår forståelse av disse dynamiske endringer ved å tilby en metode for å optisk markere celler og vev. Men mens photoconversion, time-lapse mikroskopi og påfølgende bildeanalyser har vist seg for å være svært vellykket i å avdekke mobilnettet dynamikk i organer som hjernen eller øyet, brukes denne tilnærmingen ikke vanligvis i utviklingsland hjertet grunn utfordringer som rask bevegelse av hjertet under cardiac syklus. Denne protokollen består av to deler. Første del beskriver en metode for photoconverting og senere sporing endocardial celler (EdCs) under sebrafisk atrioventrikulær kanalen (AVC) og atrioventrikulær hjertet ventil utvikling. Metoden innebærer timelig stoppe hjertet med et medikament for at nøyaktig photoconversion finne sted. Hjerter er tillatt å gjenoppta juling på fjerning av stoffet, og embryonale utvikling fortsetter som normalt til hjertet stoppes igjen ved høy oppløsning avbildning av photoconverted EdCs på en senere utviklingsmessige tidspunkt. Den andre delen av protokollen beskriver en bildet analysemetode for å kvantifisere lengden på et photoconverted eller ikke-photoconverted område i AVC i unge embryoer ved å tilordne fluorescerende signalet fra tredimensjonale strukturen til et todimensjonalt kart . Sammen de to delene av protokollen tillater en å undersøke opprinnelsen og oppførsel av celler som utgjør sebrafisk AVC og atrioventrikulær hjerteklaffen, og kan potensielt bli brukt for å studere mutanter, morphants eller embryo som har blitt behandlet med reagenser som forstyrrer AVC og/eller ventil utvikling.
Introduction
Sebrafisk er en av de viktigste virveldyr modellene å studere mobilnettet og utviklingsmessige prosesser i vivo. Dette skyldes den sebrafisk optisk åpenhet og amenability til genetikk, som gjør det en effektiv modell for bruk optisk teknikker med genetisk kodet photoresponsive protein teknologier1. Spesielt til studiet av heart utvikling, sebrafisk få tilstrekkelig oksygen via diffusjon slik at selv mutanter uten hjerterytme kan overleve gjennom den første uken i utvikling, tillater analyser på virkningene av utviklingsmessige gener og plaget blodstrøm på hjertet morphogenesis ikke mulig i de fleste virveldyr2.
Sebrafisk hjertet røret er dannet av 24 timer innlegget befruktning (hpf). Kort tid etter dannelsen begynner hjertet røret aktivt slo. Med 36 hpf, en klar innsnevring skiller atrium fra ventrikkel. Dette området av innsnevring kalles atrioventrikulær kanalen (AVC), og celler i denne regionen endringen fra en squamous morfologi til kubisk morfologi3. Sebrafisk atrioventrikulær ventil morphogenesis starter rundt 48 h legge befruktning. 5 dager post befruktning, to ventil brosjyrer utvide til AVC og forhindre tilbake flyten av blod fra ventrikkel til atriet under cardiac syklus4. Spore celler under AVC og ventil formasjon er utfordrende rask juling av hjertet gjør det vanskelig å følge celler via tradisjonelle time-lapse mikroskopi5,6. Denne protokollen, tilpasset fra Steed et al., 20167, beskriver en metode som bruker vs (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 sebrafisk transgene linjen, som photoconvertible protein Kaede uttrykkes i endotelceller, inkludert endocardium. Den narkotika 2,3-butanedione-2-monoxime (BDM) brukes til å midlertidig stoppe hjertet slo, slik at nøyaktig photoconversion av EdCs mellom 36 og 55 hpf og høy oppløsning avbildning av photoconverted EdCs på bestemte utviklingsmessige tidspunkt. Det har tidligere vært vist at EdCs photoconverted på denne måten kan forbli skilles fra sine uomvendte naboer i fem dager eller mer etter photoconversion7. Denne protokollen også detaljer en metode som brukes for bildeanalyse av photoconverted EdCs i embryoer yngre enn 48 hpf, som har blitt brukt til å følge vev bevegelser under AVC utvikling (Boselli et al., under trykking)9. Vi håper at leserne vil finne denne protokollen nyttig for å studere AVC og ventil utvikling i normal embryoer og mutanter, morphants eller narkotika-behandlet embryoer. For en mer generell protokoll knyttet til celle sporing ved hjelp av photoconvertible proteiner under sebrafisk utvikling, se artikkelen av Lombardo et al., 201210.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargjøre former og montering agarose
- Opprette en mold med dimensjoner som vist i figur 1 en 3D-skriver eller tradisjonell mekanisk bedrift verktøy.
- Pipetter ca 1,5 mL av smeltet 1% agarose i en 35 mm plast montering rett. Sett plast mold i de flytende agarose, ta vare for å unngå fangst luft mellom mold og agarose. Plasser rett ved 4 ° C, vente til agarose beskytter (dette tar ca 5 min), og deretter fjerner plast mold.
- For å lagre montering parabolen for senere bruk, dekke parabolen med sin lokk, deretter vikle både rett og lokket tett med parafilm. Montering parabolen kan deretter lagres lokket siden ned i opp til 5 dager på 4 ° C.
- Forberede på forhånd 1 mL dele 0,7% lavt Smeltepunkt agarose i 1,5 mL Eppendorf rør til bruk ved montering.
Merk: Agarose brønnene av montering retten vil deformeres over tid som vannet fordamper hvis parafilm ikke er pakket rundt rettene tett.
2. å få embryo for Photoconversion
- Incross vs (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) linje og vokse ca 200 embryo tilbakesetting medium i mørket på 28,5 ° C. For mer informasjon om hvordan å krysse sebrafisk linjer, se JoVE vitenskap utdanning Database11.
- Etter 5t men før 24 h, behandle embryo med 1-fenyl-2-thiourea (PTU) for å hindre pigment dannelse (0.003% PTU i fosteret medium).
- Ca 1 time før photoconversion, skjermen embryo under en fluorescerende stereoscope og velg 5 sunn embryo som vises å uttrykke den smarteste grønn fluorescensen. Bruk av lav intensitet lys når de visualiserer embryo anbefales å unngå eksponering av embryoene til omgivelseslyset for å unngå photoconverting Kaede i ikke-spesifikk celler.
3. innebygging
- Forberede 10 mL av montering media: 0.02% tricaine og 50 mM BDM i fosteret medium.
- Legg 2 mL av montering medium å montere parabolen og tillate 15-30 min for løsningen å spre inn i agarose.
- I mellomtiden, smelte en 1 mL aliquot av 0,7% lavt Smeltepunkt (LMP) agarose ved å plassere røret i en 70 ° C varme blokk i ca 5 min.
- Venter LMP agarose avkjøles litt, deretter legge 25 µL av 8 mg/mL tricaine løsning og 40 µL av 1M BDM løsning til tube lavt Smeltepunkt agarose. Blandingen av pipettering opp og ned, deretter overføre røret i et 38 ° C varme å holde LMP-agarose i flytende tilstand.
- I en Petri rett med embryoet medium, nøye dechorionate forhåndsvalgt embryo under stereomicroscope ved hjelp av pinsett, ta vare ikke for å skade embryoene.
- Overføre embryoene til en egen tallerken med 2 mL montering media.
- Når hjertene til embryoene stoppes (tar ca 5-10 min), overføre embryoene til montering rett og ordne embryo i brønnene med tang slik at de ligger i 25 graders vinkel, haler peker mot den dypere delen av brønnen eggeplomme grossist.
- Når embryoer er omtrent på plass, Fjern media, bygge embryoene i ~ 200 µL av 0,7% LMP agarose som inneholder tricaine og BDM, og justere de embryoene posisjoner, vippe embryoene til venstre eller høyre etter behov.
- Vent til LMP agarose sett (tar ca 5 min), deretter legge montering medium til parabolen. The embryo er nå klar til å bli photoconverted.
Merk: Tricaine og BDM brukes å bedøve embryoene og unngå de embryoene hjerte, henholdsvis. Monterer medier kan tilberedes dagen før bildebehandling, men sørg for å beskytte media fra lys.
Merk: Riktig posisjonering embryoene er viktig å gi en klar laser bane til cellene man ønsker å photoconvert. Plasser hodet av embryoet nær starten av brønnen slik at laserlys ikke trenger å reise langt etter fosteret, og slik at embryoene kan demonteres lett etter photoconversion.
4. Photoconversion
- På en oppreist AC confocal mikroskop (som Leica SP8) utstyrt med en 405 nm, 488 nm og 561 nm laser kilde, finne embryoet er hjertet bruker overføres hvitt lys (brightfield) og en linsen (som Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0,95 mål). Se etter røde Kaede fluorescens bruker 561 nm laser (dvs., DPSS 561 laser, ~ 5% intensitet, detektor satt til 589-728 nm). Deretter visualisere endocardium ved hjelp av 488 nm laser (dvs., 30 mW samkjørte Argon laser ~ 5% intensitet, detektor satt til 502-556 nm).
- Angi "FRAP" modus på mikroskopet oppkjøpet programvare. Velg ~ 1% laser makt for begge 488 nm og 561 nm lasere.
- Fokus på flyet av interesse, Velg et område av interesse (ROI), deretter photoconvert celler med 405 nm diode laser på 25% laser makt, skanning over Avkastningen tre ganger. Skal nok Kaede photoconverted i Avkastningen, skanne 405 nm laser over området tre ganger igjen. Gjenta dette trinnet for alle ROIs.
- Gå tilbake til "TCS SP8" modus på programvare og erverve en z-stabel, bruker 561 nm og 488 nm lasere sekvensielt. Kontroller at du velger 'toveis' å øke tenkelig hastigheten.
Merk: Hvor lang tid det tar å photoconvert og image hver embryoet varierer. Hjerteslag er kjent for å være viktig for normal hjertet ventiler, så unngå å holde hjertet stoppet for mer enn 30 min, selv om det betyr at du ikke har tid til å photoconvert alle 5 embryoer.
Merk: Under photoconversion prosessen, bruk avdrag detektorer, etter photoconversion, anbefales det å bruke hybrid detektorer satt til "telle" modus. Dette er fordi de hybrid detektorer er mer følsomme og kan produsere bedre bildekvalitet, men kan lett skades av overeksponering.
5. deaktivere photoconverted embryo
- Etter photoconversion, bruk en glass pipette for å trykke ned litt like over hodet av embryoet bryte LMP-agarose, så forsiktig suge opp fosteret.
- Løse ut fosteret fra glass Pipetter i en 35 mm Petriskål inneholder embryoet medium med PTU (for å vaske bort BDM inneholder middels).
- Overføre embryoet til et godt i en 6-vel plate som inneholder embryoet medium med PTU. I dette trinnet, sørg for å holde oppmerksom på hvilke embryoet går inn som vel, som dette er viktig å korrelere plasseringen av photoconverted celler på senere utviklingsstadier.
- Nå som embryoene fjernes fra BDM som inneholder mediet, skal deres hjerter starte slo igjen i ca 5 min. tilbake embryo til mørket på 28,5 ° C tillate embryo fortsette å utvikle normalt.
6. imaging photoconverted celler i senere embryonale stadier
- På ønsket scenen, stoppe hjertet og re bygge embryo som under trinn 3 i denne protokollen, med den viktige forskjellen at embryoer må behandles med BDM i merket, separate retter å holde oversikt over embryoer.
- For embryoer til 62 hpf, erverve z-stabler av endocardium bruker 561 nm og 488 nm for røde og grønne fluorescerende komponentsignalene. For embryoer på stadier eldre enn 62 hpf, bruk en multiphoton laser satt til 940 nm å image grønne Kaede i stedet for 488 nm laser.
7. bildeanalyser for embryoer under 48 hpf
Merk: Vev bevegelser av AVC kan være vanskelig å analysere på grunn av den komplekse tredimensjonale strukturen. For å måle lengden på et photoconverted område i AVC mellom to ikke-photoconverted regioner eller lengden på en ikke-photoconverted region i AVC mellom to photoconverted, kan det være ønskelig å tilordne tredimensjonale strukturen på en to-dimensjonale kart. Bilder av photoconverted embryo innhentet før 48 hpf kan analyseres med følgende metode.
- Importere ervervet bildene i Matlab eller lignende programvare.
- Delimitate manuelt Avkastningen, i.e. endocardium, og bruke en maske for å fjerne signalet utenfor dette området.
- Bruke en intensitet terskelen på bildet for å identifisere punktene på endocardium og tegne dem i tre-dimensjoner. Isolere poeng tilsvarer den smaleste og mest rett del av AVC, ved sletting manuelt ingen severdigheter på atrium og ventrikkel kommandoen Slett i programvaren.
- Bruk en sylinder til å passe punktene som representerer AVC så innhentet.
- Definere en referansesystem for å sammenligne flere prøver. For eksempel vedta senteret av massen av AVC punktene som opprinnelsen av og aksen av montert sylinder som z-aksen.
- Kontroller at positiv z-posisjonene tilsvarer alltid samme side av hjertet (ventrikkel eller atrial).
- Prosjektet AVC punktene på x-y flyet og bruk ellipse til å passe dem.
- Roter endocardial punktene rundt z-aksen krystallets ellipsen og y-aksen av parallelle og positiv y-verdiene samsvarer med den interne siden av AVC forhold til fosteret.
- For å segmentere AVC, kuttet den tredimensjonale datasettet med noen fly ved å rotere halv-flyet {y = 0, x > 0} i z-retningen.
- Project intensiteten av de nærliggende bildepunktene på disse flyene og definere endotelet på en konsekvent måte. For eksempel tegne manuelt fra den atrial på ventrikkel siden av AVC på halv tykkelsen på endotelet.
- Interpolere poeng av linjene representerer endotelet med en tredimensjonal spline bruke spline verktøykassen til å representere AVC med en overflate.
Merk: Antall skjæringsplanene bestemmer både nøyaktigheten av oppdeling og tidsforbruket for dette trinnet. Vanligvis er 8 fly nok til å oppnå gode resultater.
- Definere asimut posisjon hvert punkt på AVC overflaten bruker sylindriske koordinater.
- Definere en parametrisk kurve langs overflaten av AVC ved å beregne buelengde på overflaten mellom etterfølgende punkter på hver asimut posisjon.
- For hver parametrisk kurve, definere et punkt på kurven nærmest midten av AVC til null. Poeng av AVC er dermed fullt beskrevet av asimut posisjonen og sin posisjon på parametrisk kurven.
- Utfolde AVC til et todimensjonalt bilde ved hjelp av parametriske posisjonen til punktene.
- Finne kantene i regionen å kvantifisere som kantene av binære bilder terskelverdi forholdet mellom intensiteter av photoconverted og ikke-photoconverted kanaler. Rette resultatet manuelt om nødvendig.
- Beregne buelengde mellom kantene til å beregne lengden av vev som en funksjon av asimut plasseringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på et embryo photoconverted på 48 hpf og fotografert igjen på 80 hpf er vist i figur 2, filmer 1 og 2. Utsette Kaede 405 nm lys irreversibelt konverterer fra protein fra sin fluorescerende grønne form til fluoriserende rødt form, aktivere virkemåten til celler merket med grønn eller rød skjemaet skal følges med hensyn til deres ulikt fargede naboer i ventil formasjon. Det kan sees at de photoconverted cellene av 48 hpf AVC senere proliferated og senere bodde hovedsakelig på én side av ventilen heftet.
Et eksempel på resultatene som kan oppnås ved å bruke bildet analyse metoden beskrevet på en 36 hpf embryoet etter photoconverting EdCs i atriet og ventrikkel er vist i Figur 3. Oppdeling av AVC kan parametrization av tredimensjonale strukturen som anslås deretter i to dimensjoner for enklere visualisering og analyse. Metoden gjør det mulig å kvantifisere avstanden mellom de to photoconverted-regionene. Ved å gjenta denne prosessen til forskjellige utviklingsmessige tider er det mulig å studere migrering av celler mot AVC (Boselli et al., under trykking)9.
Figur 1 : Mold brukes til å opprette agarose brønner. A) foran visning. B) bakfra. C-D) Visninger. E-F) Skrå utsikt. Dimensjoner vises i millimeter. Den. STL-filen for malen mold tilbys i supplerende materiale. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant resultatene av en Vs (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) photoconverted embryonale hjertet. A) embryonale hjertet like etter photoconversion på 48 hpf. Cytoplasmatiske Kaede i flere celler av førsteklasses siden av AVC er konvertert fra sin grønne form til sin røde form. B) samme embryoet på 80 hpf. Det kan sees at den tidligere photoconverted celler har proliferated og har kommet i innsiden av overlegen atrioventrikulær ventilen. Skalere barer: 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Representant resultatene av bildet analyseprosessen på en 36 hpf fosteret. A) resultatet av de tre-dimensjonale segmenteringen av AVC i en referanse som er vanlig blant embryoene; signalet fra photoconverted (magenta) og ikke-photoconverted (grønn) Kaede er projisert på overflaten og markerer regionene photoconverted og ikke-photoconverted. B) det AVC er utslått i henhold til parametrisk posisjon av sine poeng og signalet forventes i to dimensjoner for enklere visualisering. Kantene av ikke-photoconverted regionen er merket i hvitt. C) lengden på ikke-photoconverted regionen skal tegnes som en funksjon av kantet posisjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: embryonale hjertet like etter photoconversion på 48 hpf. Knyttet til figur 2A. Filmen går gjennom ervervet z bunken av 48 hpf embryoet vist i figur 2A z skive av z skive. Bare en z-fly ble valgt under photoconversion prosessen, men det kan sees her at celler på ulike dyp har vært photoconverted. Z stykker er plasserte 2 µm fra hverandre. Rett Klikk for å laste ned filmen.
Movie 2: photoconverted embryonale hjertet 80 hpf. Knyttet til figur 2B. Filmen går gjennom ervervet z papirbunken 80 hpf embryoet vist i figur 2B z skive av z skive. Z stykker er plasserte 2 µm fra hverandre. Rett Klikk for å laste ned filmen.
Supplerende fil: Knyttet til figur 1. Den. STL-filen for malen mold. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Timing av photoconversion: selv om Kaede er fortsatt sterkt uttrykkes i EdCs på 96 hpf, bør det bemerkes at som fosteret vokser, laserlys diffunderer mer før den når AVC, gjør begrenset photoconversion av Kaede vanskeligere. At embryonale stadier senere enn 55 hpf, ballooning av ventrikkel og atrium også betyr at fiolett laserstrålen som brukes for photoconversion ikke kan nå AVC celler uten første går gjennom enten atrium eller ventrikkel. Dette betyr at utover 55 hpf, for photoconvert EdCs av AVC, en må også photoconvert ytterligere EdCs i atrium og ventrikkel.
BDM og tricaine: nøyaktig photoconversion av EdCs krever midlertidig stoppe hjertet fra juling. BDM (2,3-butanedione monoxime) er en elektro-kontraktile uncoupler kjent å undertrykke Hjertemuskel sammentrekning12. Vi følger ikke forskjellene mellom morfologi av embryo som er underlagt denne protokollen, og embryo som har vært økende normalt og ikke har hatt sine hjerter stoppet for bildebehandling. Risikoen er imidlertid at behandlingsapparatet er å endre normal utvikling13. Konsentrert tricaine kan også brukes til midlertidig å stoppe hjertet14. Vi finner at vi kan effektivt stoppe hjertet ved å plassere embryo i fosteret medium med 0,32% tricaine for 1 min, og opprettholde hjertet i stoppet tilstand ved å overføre embryoene til fosteret medium med 0,16% tricaine. Ligner BDM behandling, hjertet kan stoppes på denne måten i 30 min og hjerteslag kan sees å returnere innen 5 min etter hjemkomsten embryo i normal embryoet medium. Høyere konsentrasjoner av tricaine bør unngås; lave konsentrasjoner av tricaine lengre (h/dager) har blitt vist å påvirke normal embryonale utvikling15,16. Tricaine løsningen brukes for å stoppe hjertet er best tilberedt ferske. Hvis frosne dele, sikre å holde løsningen godt beskyttet fra lys og tine tricaine uten varme løsning over 30 ° C. Til slutt, blebbistatin har blitt rapportert å stoppe hjertet uten alvorlige bivirkninger13. Vi har ikke testet denne siste metoden i vår lab.
Montering og demontering: riktig posisjonering embryoene er kritiske under photoconversion. Mold for å gjøre agarose brønner muliggjør montering av embryo slik at anterior-posterior aksen av embryoet konsekvent ligger 25° i forhold til overflaten av fatet. Vi har funnet mold å gjelde for photoconversion hele utviklingsstadier mellom 36 og 55 hpf. Montering må vippe av embryoet i venstre høyre retning justeres i henhold til fosterets utviklingsstadiet og området man ønsker å photoconvert. For eksempel til photoconvert AVC på 36 hpf, fosteret skal vende omtrent 15° til venstre, mens på 55 hpf, fosteret skal vende omtrent 10° til venstre. Under stereomicroscope, skal du kunne se AVC unobscured av ventrikkel eller atriet. Hvis for eksempel atrium ligger over AVC, ville det ikke være mulig å photoconvert bare AVC eller bare atriet. Imaging formål, brukes samme mold å plassere embryo mellom 36 og 96 hpf. Formen kan gjøres ved hjelp av en rekke materialer ved hjelp av en 3D-skriver eller tradisjonell mekanisk bedrift verktøy. Rustfritt stål eller kjemiske og varme motstandsdyktig plast er både egnet materialer. Hvis leseren ønsker å opprette mold 3D skriveren, se tilleggsinformasjon for den. STL-filen av malen mold.
Legge til tilstrekkelig LMP anbefales agarose å dekke hele fosteret å sikre at embryoene ikke blir forskyves mellom montering og photoconversion/bildebehandling, spesielt hvis mikroskopet ikke ligger direkte ved montering stasjonen. Generelt, forutsatt at embryoene er riktig montert, fester LMP agarose ikke seg embryoene etter demontering. Imidlertid bør noen LMP agarose sitter fast på fosteret, LMP-agarose kan fjernes ved forsiktig teasing embryoet fra agarose ved hjelp av pinsett.
Embryo, spesielt embryoer mindre enn 48 hpf, kan lett skades under montering og demontering. For embryoer mindre enn 48 hpf, anbefaler vi brann polering slutten av glass pipette å forhindre skadelige embryo under pipettering.
Mikroskopet: denne protokollen ble utført Leica SP8 mikroskop. Men photoconversion er en veletablert prosess, og denne protokollen bør være lett konverteres til andre oppreist mikroskop utstyrt med lasere produsere 405 nm, 488 nm og 561 nm lys. For embryoer til 62 hpf, bildene ble anskaffet bruker en argon eksitasjon laser og en DPSS 561 laser for grønne og røde Kaede, henholdsvis. For embryoer på stadier eldre enn 62 hpf, green Kaede kan være glade med en multiphoton laser satt til 940 nm, som har en større penetrasjon dybde enn 488 nm lyset. I teorien, røde Kaede bør ha en to-fotonet eksitasjon spectra ligner på DsRed, og kan avbildes 950 nm17.
En linsen med en høy numeriske blenderåpning er nødvendig å effektivt photoconvert EdCs og hente bilder med høy oppløsning. Siden embryoene holdes i media, er det viktig å velge et mikroskop utstyrt med en vann linsen.
Photoconverting regionen rundt: det anbefales å være konservative når Avkastningen til photoconvert - 405 nm laser diffunderer gjennom vev og kan photoconvert celler i et område større enn valgt. Hvis for eksempel du vil merke en celle rød men ønsker cellen direkte tilknytning til forblir grønne, kan det være klokt å merke bare delen av cellen liggende ytterligere fra den nærliggende cellen som Avkastningen. Siden Kaede er uttrykt i cytoplasma i EdCs, vil photoconverted protein diffus til deler av cellen ikke valgt av Avkastningen.
Photobleaching og Phototoksisitet: The Kaede protein, begge sine grønne og røde former, er svært lyse og photobleaching er ikke en begrensende faktor i celle spore eksperimenter. Men laserlys kan påvirke embryonale utvikling og bør minimaliseres, spesielt i tidlige stadier av utviklingen. Tegn for phototoxicity inkluderer utviklingsmessige forsinkelser, og i mer alvorlige tilfeller, uriktig hjertet løkker og misformet ventiler.
Fiolett laser (25%) og antall gjentakelser fiolett laser skanner over Avkastningen (3 - 6 ganger) brukes i denne protokollen var bestemt empirisk. Disse innstillingene så vi nesten komplett konvertering av Kaede fra sin grønn til rød skjemaet uten merkbar utviklingsmessige forsinkelser. Mengden av laser makt i andre mikroskopi oppsett avhenger av laser intensitet. Det bør bemerkes at den røde formen av Kaede kan være bleket av intens 405 nm belysning, så lengre photoconversion ikke gir nødvendigvis mer rød fluorescens.
Bildeanalyse: metoden foreslått for det bildet er en nyutviklet prosess å beskrive tredimensjonale geometri i AVC og sammenligne den blant embryoer. Det er ment å brukes på monolayer stålrør strukturer, for eksempel AVC før 48 hpf og potensielt hjertet røret, den aorta dorsalis og andre. Det er hovedsakelig automatisk, selv om segmentering på skjæringsplanene utføres manuelt av brukeren og andre tiltak kan potensielt krever manuell korreksjon. Manuell segmenteringen representerer den mest kritiske delen av prosessen, siden kunnskap om strukturen geometri og opplæring er nødvendig for å oppnå gode resultater. Etter å praktisere, er tid-forbruk av dette trinnet betydelig redusert.
Protokollen beskrevet her gir en effektiv måte å spore endocardial vev bevegelser under AVC og atrioventrikulær hjertet ventil utvikling med vs (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) sebrafisk transgene linjen.
For øyeblikket er en av viktige begrensninger av denne metoden at fiolett laserstrålen ikke er begrenset i aksial dimensjon. Dette gjør målretting av enkeltceller for photoconversion, og dermed klonal analyser og enkelt celle sporing vanskelig. To år siden, ble det oppdaget at photoconvertible protein Dendra2 kan være primet konvertert - protein kan konverteres fra sin grønne form til sin røde form av første irradiating protein med blått lys, og deretter med nær-infrarøde lyset18. Mikroskopet oppsett som utnytte denne egenskapen kan photoconvert Dendra2 uttrykke celler i en romlig begrenset måte i komplekse 3D vev strukturer og unngå mange av Phototoksisitet problemene med intens nær-UV bestråling18 , 19 , 20. med den nylige oppdagelsen av molekylære mekanismen bak dette fenomenet, varianter av mange grønn til rød photoconvertible fluorescerende proteiner, inkludert Kaede, har blitt utviklet så det er også i stand til å angi en primet middels staten21. Vi vet er sebrafisk transgene linjer der en pådriver for eksempel fli1a eller kdrl stasjoner uttrykket protein Dendra2 eller andre primet konvertible fluorescerende proteiner i endotelceller ennå ikke tilgjengelig. Men linjer som uttrykker Dendra2 overalt er tilgjengelige og kan være nyttig i enkelte programmer 22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Noen interessekonflikt erklært.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli og Basile Gurchenkov for å utforme og lage mold beskrevet i denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av FRM (DEQ20140329553), ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), EMBO unge etterforsker Program, EU, ERC CoG N ° 682938 Evalve og av stipendet ANR-10-LABX-0030-INRT, en fransk Statens fondet forvaltes av Agence Nationale de la Recherche under ramme programmet Investissements d'Avenir merket ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
