Summary
Denne protokol beskriver en metode til photoconversion af Kaede fluorescerende proteiner i endokardial celler levende zebrafisk embryon, der muliggør sporing af endokardial celler under atrioventrikulær canal og atrioventrikulær hjertet ventilen udvikling .
Abstract
Under embryogenese, celler undergå dynamiske ændringer i celle adfærd og decifrere cellulære logikken bag disse ændringer er et grundlæggende mål inden for udviklingsmæssige biologi. Opdagelse og udvikling af photoconvertible proteiner har stærkt hjulpet vores forståelse af disse dynamiske ændringer ved at give en metode til optisk fremhæve celler og væv. Men mens photoconversion, time-lapse mikroskopi og efterfølgende billedanalyse har vist sig for at være meget vellykket i afsløring cellulære dynamics i organer såsom hjernen eller øjet, denne tilgang er generelt ikke bruges i udviklingslandene hjertet grund udfordringerne i forbindelse med den hurtige bevægelse i hjertet i løbet af hjertets cyklus. Denne protokol består af to dele. Den første del beskriver en metode til photoconverting og efterfølgende sporing endokardial celler (EDC) under zebrafisk atrioventrikulær kanalen (AVC) og atrioventrikulær hjertet ventilen udvikling. Metoden indebærer tidsligt stoppe hjertet med et stof i ordre til nøjagtig photoconversion skal finde sted. Hjerter er tilladt at genoptage slå efter udtagning af narkotika- og embryonale udvikling fortsætter normalt indtil hjertet stoppes igen for høj opløsning billeddannelse af photoconverted EDC for en senere udviklingsmæssige tidspunkt. Den anden del af protokollen beskriver et billede analysemetode for at kvantificere længden af en photoconverted eller ikke-photoconverted regionen i AVC i unge embryoner ved at kortlægge den fluorescerende signal fra de tre-dimensionelle struktur på en to-dimensionel kort . Sammen, de to dele af protokollen tillader en at undersøge oprindelsen og opførsel af celler, der udgør den zebrafisk AVC og atrioventrikulær hjerteklap, og kan potentielt anvendes til at studere mutanter, morphants eller embryoner, der er blevet behandlet med reagenser, der forstyrrer AVC og/eller ventil udvikling.
Introduction
For zebrafisk er i øjeblikket en af de vigtigste hvirveldyr modeller til at studere cellulær og udviklingsmæssige processer i vivo. Dette skyldes hovedsageligt den zebrafisk optisk åbenhed og imødekommenhed til genetik, hvilket gør det en kraftfuld model for anvendelsen af optiske teknikker der involverer genetisk kodet photoresponsive protein technologies1. Specifikke undersøgelse af hjertet udvikling, zebrafisk modtage tilstrækkelig ilt via diffusion sådan, at selv mutanter uden hjerteslag kan overleve gennem den første uge af udvikling, tillader analyser af virkningerne af udviklingsmæssige gener og foruroliget blodgennemstrømning på hjertet morfogenese ikke muligt i de fleste hvirveldyr2.
Zebrafisk hjerte tube er dannet af 24 timer post befrugtning (hpf). Kort efter sin dannelse starter hjerte tube aktivt slå. 36 hpf, en klar konstriktion adskiller atrium fra ventriklen. Denne region af konstriktion kaldes atrioventrikulær kanalen (AVC) og celler i denne region ændring fra en planocellulære morfologi til en cuboidal morfologi3. Zebrafisk atrioventrikulær ventil morfogenese starter omkring 48 h post befrugtning. 5 dage til at bogføre befrugtning, to ventilen foldere udvide AVC og forhindrer tilbage flow af blod fra ventriklen til atriet under hjertets cyklus4. Spore celler under AVC og ventil dannelse udfordrende som den hurtige slå af hjertet gør det vanskeligt at følge celler via traditionelle time-lapse mikroskopi5,6. Denne protokol, tilpasset fra hest et al., 20167, beskriver en metode, der bruger Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 zebrafisk transgene linjen, hvor photoconvertible protein Kaede er udtrykt i endotelceller, herunder endokardiet. Stof 2,3-butanedione-2-monoxime (BDM) bruges for midlertidigt at stoppe hjertet slå, gør det muligt nøjagtig photoconversion af EDC mellem 36 og 55 hpf og høj opløsning billeddannelse af photoconverted EDC på specifikke udviklingsmæssige tidspunkter. Det er tidligere påvist, at EDC photoconverted ved hjælp af denne metode kan forblive adskiller sig fra deres ikke-konverterede naboer i fem dage eller mere efter tidspunktet for photoconversion7. Denne protokol beskriver også en metode, der anvendes til billedanalyse af photoconverted EDC i embryoner yngre end 48 hpf, som med held har været anvendt til at følge væv bevægelser under AVC udvikling (Boselli et al., i pressen)9. Vi håber, at læserne ville finde denne protokol nyttigt for at studere AVC og ventil udvikling i normal embryoner og i mutanter, morphants eller de behandlede embryoner. For en mere generel protokollen til celle sporing ved hjælp af photoconvertible proteiner under zebrafisk udvikling, se venligst artiklen af Lombardo et al., 201210.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberede forme og montering Agarosen
- Oprette en mold med de dimensioner, der er vist i figur 1 ved hjælp af enten en 3D printer eller traditionelle mekaniske værksted værktøjer.
- Der afpipetteres omkring 1,5 mL af smeltet 1% Agarosen i en 35-mm plastik montering parabol. Placer den plast skimmel i den flydende agarosegelelektroforese, pasning til undgå fældefangst luft mellem formen og agarosegelelektroforese. Placer skålen på 4 ° C, vent til Agarosen hærder (dette tager ca. 5 min.), derefter fjerne den plast skimmel.
- At gemme montering parabol til senere brug, Dæk fadet med låg, så wrap både skålen og låget stramt med parafilm. Montering parabol kan derefter gemmes låg side vender nedad i op til 5 dage ved 4 ° C.
- Forberede på forhånd 1 mL alikvoter af 0,7% lavt smeltepunkt Agarosen i 1,5 mL Eppendorf-rør til brug på dagen for montering.
Bemærk: Agarosen wells af montering parabol vil deformere over tid, når vandet fordamper hvis parafilm ikke er ombrudt omkring retterne stramt.
2. at opnå embryoner for Photoconversion
- Konkurrencefremmende Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) linje og vokse ca 200 embryoner i embryo medium i mørke ved 28,5 ° C. For flere detaljer om, hvordan man krydse zebrafisk linjer, henvises til JoVE videnskab uddannelse Database11.
- Efter 5 h men før 24 h, behandle embryoner med 1-phenyl-2-thiourinstof (PTU) at forhindre pigment dannelse (0,003% PTU i embryo medium).
- Ca 1 time før start af photoconversion, screene fostre under en fluorescerende Stereoskopet og vælg 5 sunde embryoer, synes at udtrykke den lyseste grønne fluorescens. Brugen af lav intensitet lys når visualisere embryoner anbefales at undgå eksponering af embryoner til omgivende lys for at undgå photoconverting Kaede i ikke-specifikke celler.
3. integrering
- Forberede 10 mL af montering medier: 0,02% tricaine og 50 mM BDM i embryo medium.
- Der tilsættes 2 mL af montering medium til fadet, montering og tillade 15-30 min for løsning til diffus i agarosegelelektroforese.
- I mellemtiden, Smelt en 1 mL alikvot af 0,7% lavt smeltepunkt (LMP) Agarosen ved at placere røret i en 70 ° C varme blok i ca 5 min.
- Afvente LMP Agarosen køle lidt, så tilsæt 25 µL af 8 mg/mL tricaine løsning og 40 µL 1M BDM løsning til rør af lavt smeltepunkt Agarosen. Mix af pipettering op og ned, derefter overføre røret til en 38 ° C varme blok til at holde LMP Agarosen i flydende tilstand.
- I en Petri fad med embryo medium, omhyggeligt dechorionate de forudvalgte embryoner under stereomikroskopet bruge pincet, pas på ikke for at beskadige embryoner.
- Overførsel af embryoner til en separat skål indeholdende 2 mL montering medier.
- Når hjerter af embryoner er stoppet (tager ca 5-10 min), overførsel af embryoner til montering fad og arrangere embryoner i brøndene med pincet, så de ligger i en 25 graders vinkel, haler peger mod den dybere del af brønden, æggeblomme opad.
- Når embryoner er nogenlunde på plads, fjerne medier, integrere embryoner i ~ 200 µL af 0,7% LMP Agarosen indeholdende tricaine og BDM, og justere embryoner holdninger, vippe embryoner til venstre eller højre som nødvendigt.
- Vent indtil LMP Agarosen sæt (tager ca. 5 min.), derefter tilføje montering medium til fadet. Embryonerne er nu klar til at blive photoconverted.
Bemærk: Tricaine og BDM bruges, bedøver embryoner og stoppe embryoner hjerte, henholdsvis. Montering medier kan tilberedes dagen før imaging, men sørg for at beskytte mediet fra lys.
Bemærk: Den korrekte placering af embryoner er vigtigt at give en klar laser sti til de celler, man ønsker at photoconvert. Placer lederen af embryonet tæt på starten af brønden, så laserlys ikke skal rejse langt for at nå fosteret og embryonerne kan afmonteres let efter photoconversion.
4. Photoconversion
- På et opretstående Konfokal mikroskop (ligesom Leica SP8) udstyret med en 405 nm, 488 nm og 561 nm Laserkilde, Find embryoet er hjertet ved hjælp af overførte hvidt lys (brightfield) og en mål linse (som Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0,95 mål). Check for røde Kaede fluorescens ved hjælp af 561 nm laser (dvs., DPSS 561 laser, på ~ 5% intensitet, detektor sat til 589-728 nm). Derefter, visualisere endokardiet ved hjælp af 488 nm laser (dvs., 30 mW multiline Argon laser på ~ 5% intensitet, detektor sat til 502-556 nm).
- Indtast "FRAP" mode på mikroskop erhvervelse software. Vælg ~ 1% laser power for begge 488 nm og 561 nm lasere.
- Fokusere på flyet af interesse, Vælg en region af interesse (ROI), derefter photoconvert celler ved hjælp af 405 nm diode laser på 25% laser power, scanning over ROI tre gange. Bør utilstrækkelig Kaede photoconverted i ROI, scanne 405 nm laser over området tre gange igen. Gentag dette trin for alle ROIs.
- Vende tilbage til tilstanden "TCS SP8" på software og erhverve en z-stak, ved hjælp af 561 nm og 488 nm lasere sekventielt. Sørg for at vælge indstillingen 'tovejs' at øge imaging hastighed.
Bemærk: Hvor lang tid det tager at photoconvert og billede hver embryo varierer. Hjerterytme er kendt for at være vigtig for normal hjerte ventil udvikling, så undgå at holde hjertet stoppede for mere end 30 min, selv hvis det betyder, at du ikke har tid til at photoconvert alle 5 embryoner.
Bemærk: Under photoconversion processen, brug ydelse detektorer, mens efter photoconversion, anbefales det at bruge hybrid detektorer indstillet til 'optælling' tilstand. Dette skyldes, at hybrid-detektorer er mere følsomme og er i stand til at producere bedre kvalitetsbilleder, men er let beskadiget af overeksponering.
5. afmontering photoconverted embryoner
- Efter photoconversion, skal du bruge et glas pipette for at trykke ned lidt lige over hovedet af embryonet til bryde LMP agarosegelelektroforese, så forsigtigt suger op embryonet.
- Skubbe embryo fra glas pipetteres i et 35-mm petriskål indeholdende embryo medium med PTU (til at vaske væk BDM indeholdende medium).
- Overføre embryonet til en brønd i en 6-godt plade der indeholder fosteret medium med PTU. Under dette trin, Sørg for at holde notat af hvilken embryoner går ind som godt, da dette er afgørende for at korrelere position af photoconverted celler på senere udviklingsstadier.
- Nu, hvor embryonerne er fjernet fra BDM indeholdende medium, indleder deres hjerter slå igen i ca. 5 min. tilbagevenden embryoner til mørke ved 28,5 ° C at tillade embryoner til fortsat at udvikle normalt.
6. imaging photoconverted celler på senere vorden
- På det ønskede tidspunkt, stoppe hjertet og re integrere embryoner som under trin 3 i denne protokol, med den vigtige forskel at embryonerne skal behandles med BDM i separate, markerede retter til at holde styr på embryoner.
- For embryoner op til 62 hpf, erhverve z-stakke i endokardiet bruger 561 nm og 488 nm for rødt og grønt fluorescerende signaler, henholdsvis. For embryoner på trin ældre end 62 hpf, bruge en multiphoton laser sæt til 940 nm til billede grønne Kaede i stedet for 488 nm laser.
7. billedanalyse for embryoner under 48 hpf
Bemærk: Væv bevægelser af AVC kan være vanskelige at analysere på grund af dens komplekse tredimensionelle struktur. For at måle længden af en photoconverted region i AVC mellem to ikke-photoconverted regionerne eller længden af en ikke-photoconverted regionen i AVC mellem to photoconverted regioner, kan det være ønskeligt at kortlægge den tre-dimensionelle struktur på en to-dimensionelle kort. Billeder af photoconverted embryoner opnået inden 48 hpf kan analyseres ved hjælp af følgende metode.
- Importere de erhvervede billeder i Matlab eller lignende software.
- Afgrænser manuelt ROI, dvs endokardiet, og anvende en maske for at fjerne signal uden for denne region.
- Anvende en intensitet tærskel på billedet for at identificere punkterne på endokardiet og plot dem i tre dimensioner. Isolere de punkter svarer til den snævreste og mest lige del af AVC, ved at slette manuelt ingen interessepunkter på atrium og ventrikel ved hjælp af slettekommandoen i softwaren.
- Bruge en cylinder til at passe de punkter, der repræsenterer AVC således fremkomne.
- Definere et referencesystem for at sammenligne flere prøver. For eksempel, vedtage center of mass AVC punkter som oprindelsen af referencesystemet og akse monteret cylinderen som z-aksen.
- Sørg for, at positiv z-positioner svarer altid til den samme side af hjertet (ventrikulær eller atrieflimren).
- Projektet AVC punkter i x-y plane og bruge en ellipse til at passe dem.
- Rotere de endokardial punkter omkring z-aksen, så den største akse for ellipsen og y-aksen af referencesystemet er parallelle og positiv y-værdier svarer til den indre side af AVC for embryoet.
- For at segmentere AVC, skæres den tre-dimensionelle datasæt med nogle fly fremstillet af roterende half-plane {y = 0, x > 0} i z-retning.
- Projekt intensiteten af de tilstødende pixel på disse fly og definere endotelet på en ensartet måde. For eksempel trække manuelt en linje fra den atriale til den ventrikulære side af AVC på halv tykkelse af endotelet.
- Interpolere punkterne de linjer, der repræsenterer endotelet med en tre-dimensionel spline bruger spline værktøjskassen til at repræsentere AVC med en overflade.
Bemærk: Antallet af beskæringsplaner bestemmer både nøjagtigheden af segmenteringen og tidsforbrug på dette trin. Normalt er 8 fly nok til at opnå gode resultater.
- Definere den azimutale placering af hvert punkt på AVC overfladen ved hjælp af cylindriske koordinater.
- Definere en parametrisk kurven langs overfladen af AVC ved beregning af bue længde på overfladen mellem på hinanden følgende punkter på hver azimutale position.
- For hver parametrisk kurve, skal du definere punktet på kurven tættest på midten af AVC til nul. Punkterne i AVC er således fuldt ud beskrevet af deres azimutale position og deres position på parametrisk kurven.
- Udfolde AVC i en to-dimensionelle billede ved hjælp af parametrisk placeringen af punkterne.
- Find kanter i regionen til at kvantificere som kanterne af binært billede tærskel forholdet mellem intensiteten af photoconverted og de ikke-photoconverted kanaler. Manuelt at korrigere resultatet hvis nødvendigt.
- Beregne bue længde mellem kanter til at beregne længden af vævet som en funktion af den azimutale position.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på et embryo photoconverted på 48 hpf og afbildet igen på 80 hpf er vist i figur 2, film 1 og 2. Udsætter Kaede til 405 nm lys uigenkaldeligt konvertitter fra protein fra sin fluorescerende grøn form til fluorescerende rød form, gør det muligt for opførsel af celler mærket med enten grønne eller røde formularen skal følges med hensyn til deres varierende farvede naboer under ventil dannelse. Det kan ses, at de få photoconverted celler af de 48 hpf AVC senere tilvækst og senere opholdt sig overvejende på den ene side af ventilen indlægsseddel.
Et eksempel på de resultater, der kan opnås ved at anvende den beskrevne analysemetode i billedet på en 36 hpf embryo efter photoconverting EDC i atrium og ventrikel er vist i figur 3. Segmentering af AVC giver mulighed for parametrization af den tredimensionale struktur, der forventes derefter i to-dimensioner for lettere visualisering og analyse. Metoden gør det muligt at kvantificere afstanden mellem de to photoconverted områder. Ved at gentage denne proces på forskellige udviklingsmæssige tidspunkter er det muligt at studere migration af celler mod AVC (Boselli et al., i pressen)9.
Figur 1 : Skimmel bruges til at oprette Agarosen brønde. A) Front view. B) vist bagfra. C-D) Side synspunkter. E-F) Skrå visninger. Dimensioner er vist i millimeter. Den. STL fil til skabelonen mug er fastsat i de supplerende materialer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentative resultater af en Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) photoconverted embryonale hjertet. A) embryonale hjertet lige efter photoconversion på 48 hpf. Cytoplasmatisk Kaede inden for flere celler af den overlegne side af AVC er blevet konverteret fra sin grønne form til den røde form. B) den samme embryo på 80 hpf. Det kan ses at den tidligere photoconverted celler har spredt og er kommet til at opholde sig i den indvendige side af den overlegne atrioventrikulær ventil. Skalere barer: 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Repræsentative resultater af billede analyse proces på en 36 hpf embryo. A) resultatet af tre-dimensionelle segmenteringen af AVC i et referencesystem, der er udbredt blandt embryoner; signalet fra photoconverted (magenta) og ikke-photoconverted (grøn) Kaede er projiceret op på dens overflade og markerer photoconverted og ikke-photoconverted regionerne. B) The AVC er udfoldet ifølge parametrisk placeringen af dens punkt og signalet er fremskrevet i to-dimensioner for lettere visualisering. Kanterne af regionen ikke-photoconverted er mærket i hvid. C) længden af den ikke-photoconverted region er afbildet som en funktion af den Vinkelposition. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: embryonale hjertet lige efter photoconversion på 48 hpf. Relateret til figur 2A. Filmen går gennem erhvervede z stakken af 48 hpf embryonet vist i figur 2A z udsnit af z skive. Kun én z flyet blev valgt i løbet af photoconversion proces, men det kan ses her, at celler på forskellige dybder har været photoconverted. Z skiver er fordelt 2 µm fra hinanden. Højre klik for at downloade denne film.
Movie 2: photoconverted embryonale hjertet på 80 hpf. Relateret til figur 2B. Filmen går gennem erhvervede z stakken af 80 hpf embryonet vist i figur 2B z udsnit af z skive. Z skiver er fordelt 2 µm fra hinanden. Højre klik for at downloade denne film.
Supplerende fil: Relateret til figur 1. Den. STL fil til skabelonen skimmel. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Timing af photoconversion: selv om Kaede forbliver smukt udtrykte i EDC selv på 96 hpf, det skal bemærkes, at som fosteret vokser, laserlys diffunderer mere før det når AVC, vanskeliggør begrænset photoconversion af Kaede. At embryonale etaper senere end 55 hpf, ballooning af ventriklen og atrium også betyder, at den violette laserstråle bruges til photoconversion ikke kan nå AVC celler uden først at passere gennem enten atrium eller ventrikel. Det betyder, at ud over 55 hpf, for at photoconvert EDC af AVC, man skal også photoconvert yderligere EDC i atrium og ventrikel.
BDM og tricaine: nøjagtig photoconversion af EDC kræver midlertidigt standse hjertet fra at slå. BDM (2,3-butanedione monoxime) er en electro-kontraktile uncoupler, der er kendt for at undertrykke hjerte muskel sammentrækning12. Vi overholder ikke forskelle mellem morfologi af embryoner, der har været omfattet af denne protokol, og embryoner, der har været stigende normalt og har ikke havde deres hjerter stoppede for billeddannelse. Risikoen er imidlertid, at behandlingen er at ændre normale udvikling13. Koncentreret tricaine kan også bruges til at stoppe midlertidigt hjerte14. Vi finder, at vi effektivt kan stoppe hjertet ved at placere embryoner i embryo medium med 0,32% tricaine for 1 min, og opretholde hjertet i dens stoppet tilstand ved at overføre embryonet til embryo medium med 0,16% tricaine. Lig BDM behandling, hjertet kan stoppes denne måde i 30 min og hjerterytme kan ses at vende tilbage inden for 5 min efter hjemkomsten embryoner ind i normale embryo medium. Højere koncentrationer af tricaine bør undgås; lave koncentrationer af tricaine for længere perioder (h/dage) har vist sig at påvirke normale embryonale udvikling15,16. Tricaine løsning bruges til at stoppe hjertet er bedst forberedt friske. Hvis der bruges frosne delprøver, Sørg for at holde den løsning, godt beskyttet mod lys og til optøning af tricaine uden varme løsningen over 30 ° C. Endelig, blebbistatin er blevet rapporteret til at standse hjertet uden alvorlige bivirkninger13. Vi har ikke testet dette sidste metode i vores laboratorium.
Montering og afmontering: korrekt placering af embryoner er kritisk under photoconversion. Mug for at gøre Agarosen wells letter montering af embryoner, anterior-posterior akse af embryonet konsekvent ligger ved 25° i forhold til overfladen af fadet. Vi har fundet formen til at gælde for photoconversion på alle udviklingsstadier mellem 36 og 55 hpf. I montering skal hældning af embryo i venstre-højre retning justeres efter den embryo udviklingsstadiet og det område, man ønsker at photoconvert. For eksempel, at photoconvert AVC på 36 hpf, embryonet bør ansigt omtrent 15° til venstre, mens på 55 hpf, embryonet bør ansigt ca 10° til venstre. Under stereomikroskopet, bør du kunne se AVC unobscured af ventriklen eller atrium. Hvis for eksempel atrium ligger over AVC, ville det ikke være muligt at photoconvert bare AVC eller bare atrium. For imaging formål, er den samme mold bruges til at placere embryoner mellem 36 og 96 hpf. Formen kunne gøres ved hjælp af en række forskellige materialer ved hjælp af en 3D printer eller ved hjælp af traditionelle mekaniske værksted værktøjer. Rustfrit stål eller kemiske og varme resistent plast er begge egnede materialer. Hvis læseren ønsker at skabe formen ved hjælp af en 3D-printer, henvises til supplerende oplysninger for den. STL fil, mold skabelon.
Tilføje tilstrækkelig LMP er Agarosen til at dække hele fosteret rådes til at sikre, at embryonerne ikke bliver forrykke mellem montering og photoconversion/imaging, især hvis mikroskop ikke er placeret støder direkte op til montering station. I almindelighed, forudsat at embryonerne er korrekt monteret, LMP Agarosen ikke holde sig til embryoner efter afmontering. Dog bør nogle LMP Agarosen sidder fast på fosteret, LMP Agarosen kan fjernes ved forsigtigt drilleri embryo fra Agarosen med pincet.
Embryoner, især embryoner mindre end 48 hpf, kan let skadet under montering og afmontering. For embryoner, mindre end 48 hpf, vi anbefaler brand polering slutningen af glas pipette til at forhindre skadelige embryoner under pipettering.
Mikroskop: denne protokol blev udført ved hjælp af en Leica SP8 mikroskop. Men photoconversion er en veletableret proces og denne protokol bør kunne nemt konverteres til andre opretstående mikroskoper udstyret med lasere kan producere 405 nm, 488 nm og 561 nm lys. For embryoner op til 62 hpf, billeder er anskaffet med en argon excitation laser og en DPSS 561 laser for grøn og rød Kaede, hhv. For embryoner på trin ældre end 62 hpf, grøn Kaede kan blive ophidset ved hjælp af en multiphoton laser indstillet til 940 nm, som har en større indtrængningsdybde end 488 nm lys. I teorien, røde Kaede bør have en to-foton excitation spectra svarer til DsRed, og kunne være afbildet på 950 nm17.
En målsætning linse med en høj numerisk blænde er nødvendigt at effektivt photoconvert EDC og at erhverve billeder med høj opløsning. Da embryonerne opbevares i medierne, er det vigtigt at vælge et mikroskop udstyret med en vand mål linse.
Photoconverting region af interesse: det er tilrådeligt at være konservative, når du vælger ROI til photoconvert - 405 nm laser diffunderer da det rejser gennem væv og kan photoconvert celler i et større areal end der valgt. Hvis, for eksempel, du ønsker at mærke en celle rød men gerne cellen støder direkte op til forblive grøn, kan det være klogt at vælge kun del af cellen liggende yderligere fra den tilstødende celle som dit Investeringsafkast. Da Kaede udtrykkes i cytoplasma af EDC, diffuse photoconverted protein til dele af cellen ikke udvalgt af ROI.
Photobleaching og fototoksicitet: The Kaede protein, både grønne og røde former, er meget lyse og photobleaching er generelt ikke en begrænsende faktor i celle tracking eksperimenter. Men laserlys kan påvirke fosterudviklingen og bør minimeres, især i tidlige stadier af udvikling. Tegn af fototoksicitet omfatter udviklingsmæssige forsinkelse og i mere alvorlige tilfælde, forkert hjerte looping og misdannede ventiler.
Magt violet laser (25%) og antallet af gentagelser af violet laser scanner over ROI (3 - 6 gange) anvendes i denne protokol blev bestemt empirisk. På disse indstillinger så vi næsten komplet konvertering af Kaede fra sin grøn til rød form uden mærkbar udviklingsmæssige forsinkelse. Mængden af laser power kræves i andre mikroskopi opsætninger vil afhænge af den laser intensitet. Det skal bemærkes, at den røde form af Kaede kan blive bleget af intens 405 nm belysning, så længere photoconversion ikke nødvendigvis giver mere røde fluorescens.
Billedanalyse: metoden, der foreslås for en billedanalyse er en nyudviklet proces til at beskrive AVC tre-dimensionel geometri og sammenligne det blandt embryoner. Denne bevilling skal anvendes til éncellelag rørformede strukturer, såsom AVC inden 48 hpf og potentielt hjerte røret og dorsal aorta. Det er hovedsageligt automatisk, selvom segmentering på beskæringsplaner udføres manuelt af brugeren og andre foranstaltninger kunne potentielt kræver manuel korrektion. Den manuelle segmentering repræsenterer den mest kritiske del af processen, da viden om struktur geometri og uddannelse er nødvendige for at opnå gode resultater. Efter at øve, er tidsforbrug på dette trin væsentligt reduceret.
Protokollen beskrevet her giver en effektiv måde at spore endokardial væv bevægelser under AVC og atrioventrikulær hjertet ventilen udvikling ved hjælp af Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) zebrafisk transgene linje.
I øjeblikket er en af de vigtigste begrænsninger af denne metode at violet laserstrålen ikke er begrænset i den aksiale dimension. Dette gør målretning af enkelt celler til photoconversion, og dermed klonede analyser og enkelt celle tracking, vanskeligt. For to år siden blev det opdaget, at det photoconvertible protein Dendra2 kan være primet konverteret - protein kan blive konverteret fra sin grønne form til den røde form af første bestråling protein med blåt lys, og derefter med nær-infrarødt lys18. Mikroskop opsætninger, der udnytter denne egenskab kan photoconvert Dendra2 udtrykker celler i et rumligt begrænset måde i komplekse 3D strukturer samtidig undgå mange af fototoksicitet problemerne i forbindelse med intense nær-UV bestråling18 , 19 , 20. varianter af mange grøn til rød photoconvertible fluorescerende proteiner, herunder Kaede, med den nylige opdagelse af den molekylære mekanisme bag dette fænomen har været manipuleret så der er også i stand til at indtaste en PRIMES mellemliggende staten21. Til vores viden er zebrafisk transgene linjer hvor en promotor såsom fli1a eller kdrl drev udtryk for protein Dendra2 eller anden primet konvertible fluorescerende proteiner i endothelial celler endnu ikke tilgængelige. Men linjer, der udtrykker Dendra2 allestedsnærværende er tilgængelige og kan vise sig nyttige i visse programmer 22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nogen interessekonflikt erklæret.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli og Basile Gurchenkov for at hjælpe med at designe og gøre formen beskrevet i denne protokol. Dette arbejde blev støttet af FRM (DEQ20140329553), ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), EMBO Young Investigator Program, det Europæiske Fællesskab, ERC CoG N ° 682938 Evalve og af grant ANR-10-LABX-0030-INRT, en fransk statens fond forvaltet af Agence Nationale de la Recherche under ramme program Investissements d'Avenir mærket ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
