Summary
Ce protocole décrit une méthode pour la photoconversion de la protéine fluorescente de Kaede dans les cellules du vivant endocardiques embryon de poisson zèbre qui permet le suivi des cellules endocardiaques pendant le canal atrio-ventriculaire et le développement de valve auriculo-ventriculaire cardiaque .
Abstract
Au cours de l’embryogenèse, les cellules subissent des changements dynamiques dans le comportement de la cellule, et déchiffrer la logique cellulaire sous-jacente de ces changements est des objectifs fondamentaux dans le domaine de la biologie du développement. La découverte et le développement de protéines et ont aidé considérablement notre compréhension de ces changements dynamiques en fournissant une méthode pour surligner optiquement les cellules et les tissus. Cependant, tandis que photoconversion, Time-lapse microscopie et analyse d’images ultérieures sont révélés très efficaces dans la découverte dynamique cellulaire dans des organes comme le cerveau ou le œil, cette approche est généralement pas utilisée en plein développement dû à défis posés par le mouvement rapide du cœur au cours du cycle cardiaque. Ce protocole se compose de deux parties. La première partie décrit une méthode pour photoconverting et par la suite suivi les cellules endocardiques (CPSE) pendant zebrafish canal atrio-ventriculaire (AVC) et le développement de valve auriculo-ventriculaire cardiaque. La méthode implique temporairement arrêter le cœur avec un médicament sous ordonnance pour photoconversion précise avoir lieu. Cœurs sont autorisés à reprendre le passage à tabac lors du retrait de la drogue et le développement de l’embryon continue normalement jusqu'à ce que le cœur est arrêté à nouveau pour l’imagerie haute résolution de photoconverted CDE à un moment du développement plus tard. La deuxième partie du protocole décrit une méthode d’analyse permettant de quantifier la longueur d’une région photoconverted ou non-photoconverted dans l’AVC chez les jeunes embryons en mappant le signal fluorescent de la structure en trois dimensions sur un plan bidimensionnel en image . Ensemble, les deux parties du protocole permet d’examiner l’origine et le comportement de cellules qui composent le poisson-zèbre AVC et la valvule auriculo-ventriculaire et peut potentiellement s’appliquer pour l’étude de mutants, morphants ou embryons qui ont été traités avec réactifs qui perturbent le développement AVC et/ou vanne.
Introduction
Le poisson-zèbre est actuellement un des modèles de vertébrés plus importants pour étudier les processus cellulaires et développement in vivo. C’est en grande partie en raison de la transparence optique du poisson-zèbre et susceptibilité génétique, qui en fait un modèle puissant pour l’application de techniques optiques impliquant génétiquement encodé photopériode protein technologies1. Spécifique à l’étude du développement du cœur, zebrafish reçoivent suffisamment d’oxygène par l’intermédiaire de diffusion tels que des mutants même sans battement de coeur peuvent survivre grâce à la première semaine de développement, permettant des analyses sur les effets des gènes du développement et perturbé circulation sanguine sur la morphogenèse du cœur n’est pas possible dans la plupart vertébrés2.
Le tube de coeur de poisson-zèbre est formé de 24 heures après la fécondation (hpf). Peu de temps après sa formation, le tube de coeur commence à battre activement. Par 36 hpf, une constriction claire sépare l’oreillette du ventricule. Cette région de constriction est appelée le canal atrio-ventriculaire (AVC) et les cellules dans ce changement de région d’une morphologie squameuse à une morphologie cubique3. Zebrafish commence de morphogenèse valve atrioventriculaire environ 48 h après la fécondation. Après 5 jours après la fécondation, deux feuillets de la valve s’étendent dans l’AVC et empêchent le reflux du sang du ventricule vers l’oreillette pendant le cycle cardiaque4. Cellules de suivi durant la formation AVC et vanne est difficile comme le battement rapid du cœur, il est difficile de suivre les cellules par l’intermédiaire de la microscopie traditionnelle Time-lapse5,6. Ce protocole, adapté de Steed et coll., 20167, décrit une méthode qui utilise la lignée transgénique de poisson zèbre8 du Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede), dans lequel la protéine et Kaede est exprimée en cellules endothéliales, y compris l’endocarde. Le médicament 2, 3-butanedione-2-monoxime (BDM) est utilisée pour arrêter temporairement le cœur battant, ce qui permet de photoconversion précise de la REE entre 36 et 55 hpf et l’imagerie à haute résolution des photoconverted CDE à des points spécifiques du développement. Auparavant, il a été démontré que les REE photoconverted à l’aide de cette méthode peut rester distingue de leurs voisins non convertis pendant cinq jours ou plus après l’heure de photoconversion7. Ce protocole décrit également une méthode utilisée pour l’analyse d’images de photoconverted perturbateurs endocriniens chez les embryons âgés de moins de 48 hpf, qui a été utilisé avec succès pour suivre les mouvements du tissu pendant AVC développement (Boselli et coll., sous presse)9. Nous espérons que les lecteurs trouveraient ce protocole utile pour étudier le développement AVC et vanne en embryons normaux et des mutants, morphants ou embryons traités. Pour un protocole plus général relatives au suivi de cellule à l’aide de protéines et au cours du développement du poisson zèbre, veuillez consulter l’article par Lombardo et al., 201210.
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Protocol
1. préparation des moules et montage d’agarose
- Créer un moule avec les dimensions indiquées à la Figure 1 à l’aide d’une imprimante 3D ou les outils de l’atelier de mécanique traditionnelle.
- Pipetter environ 1,5 mL d’agarose à 1 % fondu dans un plat de montage en plastique de 35 mm. Placer le moule en plastique dans l’agarose liquide, en prenant soin d’éviter l’air de piégeage entre le moule et le gel d’agarose. Placez le plat à 4 ° C, attendre jusqu'à ce que l’agarose durcit (cela prend environ 5 min), puis enlever le moule en plastique.
- Pour stocker le plat de montage pour une utilisation ultérieure, couvrir le plat avec son couvercle, puis envelopper le plat tant le couvercle hermétiquement avec du parafilm. Le plat de montage peut ensuite être stocké côté couvercle vers le bas jusqu'à 5 jours à 4 ° C.
- Préparer à l’avance 1 ml de 0,7 % point de fusion bas d’agarose dans 1,5 mL tubes Eppendorf à utiliser le jour du montage.
Remarque : Les puits du gel d’agarose du plat montage seront déformera au fil du temps, lorsque l’eau s’évapore si parafilm n’est pas encapsulé hermétiquement autour de la vaisselle.
2. obtention d’embryons pour la Photoconversion
- Dansledomainede la Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) ligne et poussent environ 200 embryons dans un milieu d’embryon dans l’obscurité à 28,5 ° C. Pour plus de détails sur la façon de franchir les lignes de poisson-zèbre, veuillez consulter le JoVE Science Education Database11.
- Après 5 h mais avant 24h, traiter les embryons avec 1-phényl-2-thiourée (PTU) pour empêcher la formation de pigment (0,003 % PTU dans le milieu de l’embryon).
- Environ 1 h avant le début du photoconversion, embryons d’écran sous un stéréoscope fluorescent et sélectionnez 5 embryons sains qui semblent exprimer la fluorescence verte plus brillants. L’utilisation de la lumière de faible intensité pendant la visualisation des embryons est recommandée pour éviter l’exposition des embryons à la lumière ambiante afin d’éviter photoconverting Kaede dans les cellules non spécifiques.
3. incorporation
- Préparer 10 mL de support de montage : tricaïne 0,02 % et 50 mM BDM dans le milieu de l’embryon.
- Ajouter 2 mL de milieu de montage pour le plat de montage et permettre aux 15-30 min pour la solution de diffuser dans l’agarose.
- Pendant ce temps, faire fondre une portion de 1 mL d’agarose bas point de fusion (LMP) de 0,7 % en plaçant le tube dans un bloc chauffant de 70 ° C pendant environ 5 min.
- Attendez que l’agarose LMP refroidir légèrement, puis ajouter 25 µL de solution de tricaïne 8 mg/mL et 40 µL de la solution 1M BDM dans le tube d’agarose de la bas point de fusion. Mix de pipetage de haut en bas, puis transférer le tube dans un bloc de chaleur de 38 ° C pour garder l’agarose LMP à l’état liquide.
- Dans un Petri plat avec support de l’embryon, soigneusement dechorionate les embryons présélectionnés sous le stéréomicroscope avec une pincette, prenant soin de ne pas pour endommager les embryons.
- Transférer les embryons dans un plat séparé contenant 2 mL de support de montage.
- Quand le cœur des embryons est arrêté (prend environ 5-10 min), des queues de transfert, les embryons au montage plat et organiser des embryons dans les puits à l’aide de pinces, afin qu’ils se situent à un angle de 25 degrés, pointant vers la partie plus profonde du puits, jaune vers le haut.
- Lorsque les embryons sont à peu près en place, retirez le support, incorporer les embryons dans ~ 200 µL de 0,7 % LMP d’agarose contenant tricaïne et BDM et réajuster les positions des embryons, l’inclinaison des embryons vers la gauche ou la droite selon les besoins.
- Attendre que les ensembles d’agarose LMP (cela prend environ 5 min), puis ajouter le support de montage au plat. Les embryons sont maintenant prêts à être photoconverted.
Remarque : Le tricaine et le BDM servent à anesthésier les embryons et d’arrêter le cœur des embryons, respectivement. Supports de montage peuvent être préparés la veille de l’imagerie, mais veillez à protéger les médias contre la lumière.
Remarque : Le positionnement correct des embryons est important pour permettre un chemin clair laser pour les cellules que l'on veut photoconvert. Placez la tête de l’embryon près le début du puits afin que la lumière laser ne doit pas voyager loin pour atteindre l’embryon, et que les embryons peuvent être facilement démontés après photoconversion.
4. Photoconversion
- Sur un microscope confocal vertical (comme Leica SP8) équipé d’un 405 nm, 488 nm et source de laser 561 nm, localisez l’embryon du cœur en utilisant transmis lumière blanche (fond clair) et une lentille d’objectif (comme Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0,95 objectif). Recherchez la fluorescence rouge de Kaede utilisant le laser nm 561 (c.-à-d., laser DPSS 561, à environ 5 % d’intensité, détecteur fixé à 589-728 nm). Puis, visualiser l’endocarde à l’aide du laser à 488 nm (c'est-à-dire, 30 mW multiligne laser Argon à ~ 5 % d’intensité, détecteur fixé à 502-556 nm).
- Passer en mode « PAF » sur le logiciel d’acquisition de microscope. Sélectionner la puissance du laser ~ 1 % pour les deux 488 nm et 561 nm lasers.
- Mettre l’accent sur le plan de l’intérêt, sélectionnez une région d’intérêt (ROI), puis photoconvert les cellules à l’aide de la 405 diode nm laser à la puissance de laser de 25 %, balayage sur le ROI trois fois. Kaede insuffisante soit photoconverted dans le retour sur investissement, Renumériser 405 nm laser au-dessus de la zone trois fois. Répétez cette étape pour tous les ROIs.
- Revenir au mode « TCS SP8 » sur le logiciel et d’acquérir un z-pile, à l’aide de le 561 nm et 488 nm laser séquentiellement. Veillez à sélectionner l’option « bidirectionnel » pour augmenter la vitesse d’imagerie.
Remarque : Combien de temps il faut pour photoconvert et image varie de chaque embryon. Battement de coeur est connu pour être important pour le développement de valve cardiaque normal, donc éviter de les conserver le cœur s’est arrêté pendant plus de 30 min, même si cela signifie que vous n’avez pas le temps de photoconvert tous les 5 embryons.
Remarque : Au cours du processus de photoconversion, détecteurs d’utilisation PMT, tandis qu’après photoconversion, il est recommandé d’utiliser des détecteurs hybride définis sur le mode « comptage ». C’est parce que les détecteurs hybrides sont plus sensibles et sont capables de produire des images de meilleure qualité, mais sont facilement endommagés par une surexposition.
5. démontage d’embryons photoconverted
- Après photoconversion, utiliser une pipette de verre pour enfoncer légèrement juste au-dessus de la tête de l’embryon pour briser l’agarose LMP, puis aspirer doucement de l’embryon.
- Éjectez l’embryon de la pipette de verre dans une boîte de Petri 35 mm contenant le support d’embryon avec PTU (pour laver BDM contenant le support).
- Transfert de l’embryon à un puits dans une plaque de 6 puits contenant le support d’embryon avec PTU. Au cours de cette étape, assurez-vous de prendre note des quel embryon va dans lequel le bien, car cela est essentiel pour établir une corrélation entre la position des cellules photoconverted à des stades de développement plus tard.
- Maintenant que les embryons soient écartés du milieu contenant de la BDM, leur cœur doit commencez à battre à nouveau dans environ 5 min. retour embryons à l’obscurité à 28,5 ° C afin de permettre des embryons de continuer à se développer normalement.
6. l’imagerie photoconverted cellules à plus tard les stades embryonnaires
- Au stade désiré, arrêter le coeur et ré-intégrer les embryons comme dans l’étape 3 du présent protocole, à la différence importante que les embryons doivent être traités avec BDM dans des plats séparés, marquées pour garder une trace des embryons.
- Pour les embryons jusqu'à 62 hpf, acquérir z-cheminées de l’endocarde à l’aide de 561 nm et 488 nm pour le rouge et le vert fluorescent de signaux, respectivement. Pour les embryons à des stades plus de 62 hpf, utilisez un multiphoton laser ensemble à 940 nm afin d’imager Kaede vert plutôt que le laser à 488 nm.
7. image analysis pour les embryons sous 48 hpf
Remarque : Les mouvements tissulaires de l’AVC peuvent être difficiles à analyser en raison de sa structure tridimensionnelle complexe. Afin de quantifier la longueur d’une région photoconverted dans l’AVC entre deux régions non-photoconverted ou la longueur d’une région non-photoconverted dans l’AVC entre deux régions de photoconverted, il peut être souhaitable pour cartographier la structure en trois dimensions sur un carte bidimensionnelle. Images d’embryons photoconverted obtenues avant 48 hpf peut être analysées à l’aide de la méthode suivante.
- Importer les images acquises dans Matlab ou tout autre logiciel similaire.
- Délimiter manuellement le retour sur investissement, c'est-à-dire l’endocarde et appliquer un masque pour supprimer le signal à l’extérieur de cette région.
- Appliquer un seuil d’intensité sur l’image pour identifier les points sur l’endocarde et tracer en trois dimensions. Isoler les points correspondant à la partie plus étroite et plus droite de l’AVC, en supprimant manuellement les points sans intérêt sur l’oreillette et le ventricule à l’aide de la commande Effacer dans le logiciel.
- Utilisez un cylindre pour adapter les points représentant le AVC ainsi obtenu.
- Définir un système de référence pour comparer plusieurs échantillons. Par exemple, adopter le centre de masse des points AVC comme l’origine du système de référence et l’axe du cylindre monté comme l’axe z.
- S’assurer que les positions z positives correspondent toujours sur le même côté du coeur (ventriculaire ou auriculaire).
- Les points AVC du projet sur le plan x-y et utiliser une ellipse pour s’adapter à eux.
- Faites pivoter les points endocardiques autour de l’axe z le grand axe de l’ellipse et l’axe des y du système de référence sont parallèles et y-valeurs positives correspondent à la face interne de l’AVC à l’égard de l’embryon.
- Pour segmenter l’AVC, couper le jeu de données en trois dimensions avec certains avions obtenues en faisant tourner le demi-plan {y = 0, x > 0} dans la direction z.
- L’intensité des pixels voisins du projet sur ces plans et définir l’endothélium d’une manière cohérente. Par exemple, tracer manuellement une ligne de l’auriculaire sur le côté ventriculaire de l’AVC à la moitié d’épaisseur de l’endothélium.
- Interpoler les points des lignes représentant l’endothélium avec une spline en trois dimensions à l’aide de la boîte à outils de spline pour représenter l’AVC avec une surface.
Remarque : Le nombre des plans sécants détermine aussi bien la précision de la segmentation et la consommation de temps de cette étape. 8 avions sont généralement suffisant pour obtenir de bons résultats.
- Définir la position azimutale de chaque point sur la surface de l’AVC à l’aide de coordonnées cylindriques.
- Dans chaque position azimutale, définir une courbe paramétrée, le long de la surface de l’AVC en calculant la longueur de l’arc sur la surface entre les points consécutifs.
- Pour chaque courbe paramétrique, définissez le point sur la courbe plus proche du centre de l’AVC à zéro. Les points de l’AVC sont donc entièrement décrits par leur position azimutale et leur position sur la courbe paramétrée.
- Se déploient l’AVC dans une image bidimensionnelle en utilisant la position paramétrique des points.
- Trouver les bords de la région à quantifier, comme les bords du seuillage d’une image binaire, le rapport entre les intensités de la photoconverted et les canaux non-photoconverted. Manuellement le résultat correct si nécessaire.
- Calculer la longueur de l’arc entre les bords pour calculer la longueur du tissu en fonction de la position azimutale.
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Representative Results
Un exemple d’un embryon de photoconverted à 48 hpf et imagé à nouveau à 80 hpf est montré dans la Figure 2, films 1 et 2. Exposant Kaede à 405 lumière nm irréversiblement convertis de la protéine de sa forme verte fluorescente de forme rouge fluorescente, permettant le comportement des cellules marquées avec la verte ou leur forme rouge à suivre avec respectent à leur façon différente couleur voisins pendant la formation de la soupape. On voit que le peu de cellules photoconverted de l’AVC de hpf 48 plus tard proliféré et plus tard résidait principalement sur un côté de la notice de la soupape.
Un exemple des résultats qui peuvent être obtenus en appliquant la méthode d’analyse image décrite sur un embryon de hpf 36 après que photoconverting REE dans l’oreillette et le ventricule est illustré à la Figure 3. La segmentation de l’AVC permet le paramétrage de la structure tridimensionnelle qui est ensuite projeté en deux dimensions pour la visualisation et l’analyse plus facile. La méthode permet de quantifier la distance entre les deux régions photoconverted. En répétant ce processus à différents moments du développement, il est possible d’étudier la migration des cellules vers les AVC (Boselli et coll., sous presse)9.
Figure 1 : Moule utilisé pour créer des puits du gel d’agarose. A) vue de face. B) vue arrière. C-D) Vues de côté. E-F) Vues obliques. Dimensions sont indiquées en millimètres. Le. Fichier STL pour le modèle de la moule est fourni dans les documents complémentaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Résultats représentatifs d’un Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) photoconverted coeur embryonnaire. A) le coeur embryonnaire juste après photoconversion à 48 hpf. Kaede cytoplasmique dans plusieurs cellules de la face supérieure de l’AVC a été converti de sa forme verte à sa forme rouge. B) l’embryon, même à 80 hpf. On voit que le précédemment photoconverted cellules se sont multipliés et sont arrivés à résider dans le côté intérieur de la valve auriculo-ventriculaire supérieure. Barreaux de l’échelle : 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Les résultats représentatifs du processus analyse image sur un embryon de hpf 36. A) le résultat de la segmentation en trois dimensions de l’AVC dans un système de référence commun parmi les embryons ; le signal de la photoconverted (magenta) et non-photoconverted (vert) Kaede est projeté sur sa surface et marque les régions photoconverted et non-photoconverted. B) l’AVC est déplié selon la position paramétrique de son point et le signal est projeté en deux dimensions pour la visualisation plus facile. Les bords de la région de non-photoconverted sont marqués en blanc. C) la longueur de la région de non-photoconverted est tracée en fonction de la position angulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Movie 1 : le coeur embryonnaire juste après photoconversion à 48 hpf. Associés à la Figure 2 a. Le film passe par la pile z acquise de l’embryon de hpf 48 illustré à la Figure 2 a tranche de z par tranche de z. Plan seul z a été choisi au cours du processus de photoconversion, mais on voit ici que les cellules à différentes profondeurs ont été photoconverted. Tranches de Z sont espacés de 2 µm dehors. Faites un clic droit pour télécharger ce film.
Le film 2 : le coeur embryonnaire de photoconverted à 80 hpf. Associés à la Figure 2 b. Le film passe par la pile z acquise de l’embryon de hpf 80 illustré à la Figure 2 b tranche de z par tranche de z. Tranches de Z sont espacés de 2 µm dehors. Faites un clic droit pour télécharger ce film.
Fichier supplémentaire : Associés à la Figure 1. Le. Fichier STL pour le modèle de la moule. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Calendrier des photoconversion: bien que Kaede reste brillamment exprimé en CDE même à 96 hpf, il convient de noter que que l’embryon se développe, la lumière laser diffuse plus avant qu’elle atteigne l’AVC, complique davantage la photoconversion clos de Kaede. Met en scène plus tard que 55 at embryonnaire hpf, la montgolfière le ventricule et l’oreillette signifie aussi que le faisceau laser violet utilisé pour photoconversion ne peut pas atteindre les cellules AVC sans la première traversée de l’oreillette ou le ventricule. Cela signifie qu’au-delà de 55 hpf, afin de photoconvert REE de l’AVC, il faut également photoconvert des perturbateurs endocriniens dans l’oreillette et le ventricule.
BDM et tricaïne: photoconversion précise de la REE nécessite temporairement arrêter le cœur battant. BDM (2, 3-butanedione monoxime) est un découpleur electro-contractiles qui est bien connu pour supprimer de la contraction de muscle cardiaque12. Nous n’observons pas de différences entre la morphologie des embryons qui ont été soumis à ce protocole, et les embryons qui ont crû normalement et n’ont pas eu leur cœur s’est arrêté pour l’imagerie. Cependant, le risque demeure que le traitement de la toxicomanie est altérer un développement normal,13. Concentré de tricaïne permet également d’arrêter temporairement le coeur14. Nous trouvons que nous pouvons arrêter le cœur en plaçant des embryons dans un milieu d’embryon avec tricaïne 0,32 % pendant 1 min et de maintenir efficacement le coeur dans son état arrêté par transfert des embryons au milieu de l’embryon avec tricaïne 0,16 %. Comme pour le traitement de la BDM, le cœur peut être arrêté cette manière pendant 30 min et des battements de coeur peuvent être vu à retourner dans les 5 min après le retour des embryons dans un milieu embryon normal. Des concentrations plus élevées de tricaïne doivent être évitées ; de faibles concentrations de tricaïne pendant des périodes prolongées (h/jours) a été démontré d’influer sur le développement embryonnaire normal15,16. Solution de tricaïne utilisée pour arrêter le cœur est mieux préparée frais. Si aliquotes congelées sont utilisés, assurez-vous de garder la solution bien protégée de la lumière et pour décongeler le tricaïne sans chauffer la solution au-dessus de 30 ° C. Enfin, blebbistatin a été signalé pour arrêter le cœur sans effets secondaires graves13. Nous n’avons pas testé cette dernière méthode dans notre laboratoire.
Montage et démontage: positionnement Correct des embryons est critique au cours de la photoconversion. Le moule pour faire des puits d’agarose facilite le montage des embryons, telle que l’axe antéro-postérieur de l’embryon se trouve toujours à 25° par rapport à la surface du plat. Nous avons trouvé le moule soit applicable pour les photoconversion à tous les stades entre 36 et 55 hpf. Dans le montage, l’inclinaison de l’embryon dans le sens gauche-droite doit être ajustée selon le stade de développement de l’embryon et la zone que l'on veut photoconvert. Par exemple, pour photoconvert l’AVC à 36 hpf, l’embryon doit faire face d’environ 15° vers la gauche, tout en 55 hpf, l’embryon doit faire face à peu près 10° vers la gauche. Sous le stéréomicroscope, vous devriez être en mesure de voir l’AVC rayent le ventricule ou l’oreillette. Si, par exemple, l’oreillette se trouve au-dessus de l’AVC, il ne serait pas possible de photoconvert juste l’AVC ou juste l’atrium. Pour des fins d’imagerie documentaire, le même moule sert à positionner les embryons entre 36 et 96 hpf. Le moule est possible en utilisant une variété de matériaux à l’aide d’une imprimante 3D ou à l’aide d’outils de l’atelier de mécanique traditionnelle. Plastique résistant en acier inoxydable ou chimique et thermique sont les deux matériaux appropriés. Si le lecteur souhaite créer le moule à l’aide d’une imprimante 3D, veuillez consulter les informations complémentaires sur l’au. Fichier STL du modèle de moule.
Ajouter suffisamment LMP agarose pour couvrir l’embryon entier est conseillé pour s’assurer que les embryons ne deviennent pas délogé entre montage et photoconversion/imagerie, surtout si le microscope n’est pas situé directement à côté de la station de montage. En général, sous réserve que les embryons sont correctement montés, LMP agarose n’adhère pas aux embryons après démontage. Toutefois, certains agarose LMP devrait rester coincé sur l’embryon, l’agarose LMP peut être enlevée en les taquinant doucement l’embryon de l’agarose à l’aide de pinces.
Embryons, surtout des embryons moins que 48 hpf, peuvent être facilement endommagées pendant le montage et le démontage. Pour les embryons moins que 48 hpf, nous recommandons l’extrémité de la pipette de verre pour empêcher des embryons nuisibles pendant le pipetage de polissage au feu.
Microscope: ce protocole a été réalisé à l’aide d’un microscope Leica SP8. Cependant, photoconversion est un processus bien établi et que ce protocole devrait être facilement convertible en autres microscopes verticale équipés de lasers capables de produire de 405 nm, 488 nm et 561 nm lumière. Pour les embryons jusqu'à 62 hpf, images ont été obtenues en utilisant un laser à argon excitation et un laser DPSS 561 pour Kaede vert et rouge, respectivement. Pour les embryons à des stades plus de 62 hpf, vert Kaede peut être excitée en utilisant un laser multiphotonique défini sur 940 nm, ce qui assure une plus grande profondeur de pénétration que la lumière 488 nm. En théorie, Kaede rouge devrait avoir une semblable à celle de DsRed des spectres d’excitation biphotonique et pouvait être photographié à 950 nm17.
Un objectif avec une grande ouverture numérique faut efficacement photoconvert REE et d’acquérir des images à haute résolution. Étant donné que les embryons sont conservés dans les médias, il est important de choisir un microscope équipé d’une lentille d’objectif de l’eau.
Photoconverting la région d’intérêt: il est conseillé d’être prudente lorsque vous sélectionnez le ROI à photoconvert - le laser à 405 nm diffuse lorsqu’il voyage à travers les tissus et peut photoconvert de cellules dans une zone plus grande que celle sélectionnée. Si, par exemple, vous souhaitez étiqueter une cellule rouge mais tiens la cellule directement à côté de rester vert, il peut être prudent de choisir uniquement la partie de la cellule se trouvant plus loin de la cellule adjacente dans le retour sur votre investissement. Étant donné que Kaede est exprimée dans le cytoplasme de la REE, photoconverted protéine diffusera aux parties de la cellule ne sont sélectionnés par le ROI.
Photoblanchiment et phototoxicité: Kaede la protéine, ses formes vertes et rouges, est très lumineux et photoblanchiment n’est généralement pas un facteur limitant dans la cellule de suivi des expériences. Cependant, la lumière laser peut influer sur le développement embryonnaire et devrait être réduite au minimum, surtout pendant les premiers stades du développement. Les signes de phototoxicité comprennent un retard de développement et, dans les cas plus graves, mauvais coeur looping et soupapes mal formés.
La puissance de la laser violet (25 %) et le nombre d’itérations, le laser violet scanne sur le retour sur investissement (3 à 6 fois) utilisé dans le présent protocole ont été déterminées de manière empirique. À ces paramètres, nous avons vu conversion quasi-complète de Kaede de son vert en forme rouge sans retard du développement notable. La quantité de puissance de laser nécessaire dans les autres configurations de microscopie dépendrait de l’intensité du laser. Il est à noter que la forme rouge de Kaede peut être blanchie par intense illumination dans 405 nm, donc plue photoconversion ne donne pas nécessairement une fluorescence rouge plus.
Analyse d’image: la méthode proposée pour l’analyse de l’image est un processus nouvellement développé pour décrire la géométrie tridimensionnelle de l’AVC et la comparer chez les embryons. Il est destiné à être appliqué à des structures tubulaires de monocouche, tels que l’AVC avant 48 hpf et potentiellement le tube de coeur, l’aorte dorsale et d’autres. Il est principalement automatique, même si la segmentation sur les plans de coupe est effectuée manuellement par l’utilisateur et d’autres mesures pourraient exiger que correction manuelle. La segmentation manuelle représente la partie la plus critique du processus, étant donné que la connaissance de la géométrie de la structure et la formation sont nécessaires pour obtenir de bons résultats. Après avoir pratiqué, la consommation de temps de cette étape est considérablement réduite.
Le protocole décrit ici fournit un moyen efficace pour suivre les mouvements tissu endocardique pendant l’AVC et le développement de valve auriculo-ventriculaire cardiaque à l’aide de la lignée transgénique de poisson-zèbre de Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) .
Actuellement, une des principales limites de cette méthode est que le faisceau laser violet ne se limite pas à la dimension axiale. Cela rend ciblage des cellules individuelles pour photoconversion et par conséquent clonales analyses et cellule de suivi, difficile. Il y a deux ans, on a découvert que les convertis de la protéine et que Dendra2 peut être amorcée - la protéine peut être convertie de sa forme verte à sa forme rouge en première irradiant la protéine avec la lumière bleue, puis avec la lumière proche-infrarouge18. Configurations de microscope qui exploitent cette propriété peuvent photoconvert Dendra2 cellules exprimant de manière dans l’espace confinée dans les structures tissulaires 3D complexes tout en évitant les nombreux problèmes phototoxicité associées intense irradiation UV-18 , 19 , 20. avec la découverte récente du mécanisme moléculaire derrière ce phénomène, des variantes de nombreuses protéines fluorescentes et vert ou rouge, y compris Kaede, ont été conçus qui sont également capables d’entrer un intermédiaire apprêté État,21. À notre connaissance, poisson zèbre des lignées transgéniques où un promoteur par exemple fli1a ou kdrl conduit l’expression de la protéine Dendra2 ou autre amorcée convertibles protéines fluorescentes dans les cellules endothéliales ne sont pas encore disponibles. Cependant, lignées qui expriment des Dendra2 partout sont disponibles et peuvent s’avérer utiles dans certaines applications 22,23.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli et Basile Gurchenkov pour aider à concevoir et fabriquer le moule décrit dans le présent protocole. Ce travail a été soutenu par l’ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), le EMBO Young Investigator programme, FRM (DEQ20140329553), la Communauté européenne, ERC CoG N ° 682938 Evalve et par la grant ANR-10-LABX-0030-INRT, un fonds de l’État français géré par l’Agence Nationale de la Recherche dans le cadre programme Investissements d’avenir marqué ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
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