Summary
Este protocolo descreve um método para o photoconversion de Kaede proteína fluorescente em células endocárdico dos vivos zebrafish embrião que permite o rastreamento de células endocárdico durante canal atrioventricular e desenvolvimento de válvula atrioventricular coração .
Abstract
Durante a embriogênese, as células passam por mudanças dinâmicas no comportamento da célula, e decifrar a celular lógica por trás destas mudanças é um objetivo fundamental no campo da biologia do desenvolvimento. A descoberta e o desenvolvimento de proteínas photoconvertible grandemente ajudado nossa compreensão dessas mudanças dinâmicas, fornecendo um método para opticamente destacar células e tecidos. No entanto, enquanto photoconversion, microscopia de lapso de tempo e análise de imagens subsequentes provaram para ser muito bem sucedido na descoberta dinâmica celular em órgãos como o cérebro ou os olhos, essa abordagem geralmente não é usada no coração em desenvolvimento devido à desafios colocados pelo movimento rápido do coração durante o ciclo cardíaco. Esse protocolo consiste de duas partes. A primeira parte descreve um método para photoconverting e posteriormente de rastreamento células endocárdico (CDE) durante zebrafish canal atrioventricular (AVC) e desenvolvimento de válvula atrioventricular coração. O método envolve temporariamente parando o coração com uma droga em ordem para photoconversion preciso tomar o lugar. Corações são permitidas para continuar batendo em cima da remoção da droga e desenvolvimento embrionário normalmente continua até que o coração está parado novamente para geração de imagens de alta resolução de photoconverted CDE em um ponto mais tarde o tempo do desenvolvimento. A segunda parte do protocolo descreve um método de análise de imagem para quantificar o comprimento de uma região photoconverted ou não-photoconverted no AVC em embriões jovens mapeando o sinal fluorescente da estrutura tridimensional em um mapa bidimensional . Juntas, as duas partes do protocolo permite examinar a origem e o comportamento das células que compõem o zebrafish AVC e válvula cardíaca atrioventricular e potencialmente pode ser aplicado para estudar os mutantes, morphants ou embriões que tenham sido tratados com reagentes que perturbam o desenvolvimento de AVC e/ou válvula.
Introduction
O peixe-zebra é atualmente um dos mais importantes modelos para estudar processos celulares e do desenvolvimento na vivovertebrados. Isto é principalmente devido a transparência óptica do zebrafish e acessibilidade à genética, o que o torna um poderoso modelo para a aplicação de técnicas ópticas envolvendo geneticamente codificado photoresponsive proteína tecnologias1. Específico para o estudo do desenvolvimento do coração, zebrafish receber oxigênio suficiente através de difusão tal que até mesmo mutantes sem batimento cardíaco podem sobreviver a primeira semana de desenvolvimento, permitindo análises sobre os efeitos de genes de desenvolvimento e perturbado o fluxo de sangue na morfogênese do coração não é possível na maioria dos vertebrados,2.
O tubo de coração zebrafish é formado por 24 horas pós fertilização (hpf). Logo após sua formação, o tubo de coração começa a bater uma ativamente. Por 36 hpf, uma constrição clara separa o átrio do ventrículo. Esta região de constrição é chamado o canal atrioventricular (AVC) e células nessa região de alteração de uma morfologia escamosa a morfologia cuboidal3. Começa a morfogênese zebrafish válvula atrioventricular cerca de 48 h pós fertilização. Por 5 dias pós fertilização, dois folhetos da válvula se estendem até o AVC e prevenir o refluxo do sangue do ventrículo para o átrio durante o ciclo cardíaco4. Rastreamento de células durante a formação de AVC e a válvula é um desafio como a batida rápida do coração torna difícil seguir as células através de microscopia de lapso de tempo tradicional5,6. Este protocolo, adaptado do corcel et al, 20167, descreve um método que usa a Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)zebrafish transgênica linha8 , em que a proteína photoconvertible Kaede é expresso em células endoteliais, incluindo o endocárdio. A droga 2,3-butanodiona-2-monoxime (BDM) é usado para interromper temporariamente o coração batendo, permitindo photoconversion exata de CDE entre 36 e 55 hpf e imagens de alta resolução de photoconverted CDE em pontos específicos de tempo no desenvolvimento. Tem sido mostrado anteriormente que CDE photoconverted usando este método pode permanecer distinguível de seus vizinhos não convertidos por cinco dias ou mais após o tempo de photoconversion7. Este protocolo também detalha um método usado para análise de imagem de photoconverted CDE em menos de 48 embriões hpf, que tem sido usada com sucesso para seguir os movimentos do tecido durante o desenvolvimento de AVC (Boselli et al, no prelo)9. Esperamos que os leitores encontraria este protocolo útil para estudar o desenvolvimento de AVC e válvula em embriões normais e em mutantes, morphants ou embriões tratados com drogas. Para um protocolo mais geral relacionadas com o rastreamento de pilha usando photoconvertible proteínas durante o desenvolvimento do zebrafish, por favor veja o artigo por Lombardo et al, 201210.
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Protocol
1. preparar moldes e montagem do agarose
- Crie um molde com as dimensões indicadas na Figura 1 , usando uma impressora 3D ou ferramentas de oficina mecânica tradicional.
- Pipete cerca de 1,5 mL de agarose a 1% derretido em um prato de plástico montagem 35mm. Coloque o molde de plástico o agarose líquido, tendo o cuidado de evitar armadilhas de ar entre o molde e o agarose. Coloque o prato em 4 ° C, espere até a agarose endurece (leva cerca de 5 min) e, em seguida, remover o molde plástico.
- Para armazenar o prato de montagem para uso posterior, cubra o prato com a sua tampa, em seguida, enrole tanto o prato e a tampa firmemente com parafilme. O prato de montagem pode ser armazenado lado tampa virada para baixo, para até 5 dias a 4 ° C.
- Prepare com antecedência alíquotas de 1 mL de agarose de baixo ponto de fusão de 0,7% em 1,5 mL a tubos de Eppendorf para usar no dia da montagem.
Nota: Os poços de agarose do prato montagem deformarão ao longo do tempo como a água evapora se parafilm não é enrolado os pratos firmemente.
2. obtenção de embriões para o Photoconversion
- Incross o Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) linha e crescer aproximadamente 200 embriões em meio de embrião no escuro a 28,5 ° C. Para obter mais detalhes sobre como cruzar linhas de zebrafish, refira por favor o JoVE ciência educação de banco de dados11.
- Depois de 5h, mas antes de 24 h, tratar os embriões com 1-fenil-2-tioureia (PTU) para evitar a formação de pigmento (0,003% PTU no meio do embrião).
- Cerca de 1h antes do início da photoconversion, embriões de tela sob um estereoscópio fluorescente e selecionados 5 embriões saudáveis que aparecem para expressar a fluorescência verde brilhante. O uso da luz de baixa intensidade ao Visualizar embriões é recomendado para evitar a exposição dos embriões a luz ambiente para evitar photoconverting Kaede em células não-específica.
3. incorporação
- Prepare-se 10 mL de mídia de montagem: 0,02% tricaina e 50mm BDM no meio do embrião.
- Adicionar 2 mL de meio de montagem para o prato de montagem e permitir a 15-30 min para a solução de agarose se espalham.
- Entretanto, derreta uma alíquota de 1 mL de agarose de baixo ponto de fusão (LMP) 0,7%, colocando o tubo em um bloco de calor de 70 ° C por cerca de 5 min.
- Esperar o LMP agarose esfriar um pouco e, em seguida, adicione 25 µ l de solução de metanosulfonato de 8 mg/mL e 40 µ l de solução 1M de BDM ao tubo de agarose de baixo ponto de fusão. Mix pipetando para cima e para baixo, então transfira o tubo para um bloco de calor de 38 ° C para manter o agarose LMP em estado líquido.
- Em uma Petri prato com meio de embrião, cuidadosamente dechorionate os embriões pré-selecionados sob o microscópio estereoscópico usando fórceps, tomando cuidado para não danificar os embriões.
- Transferi os embriões para um prato separado contendo 2 mL de mídia de montagem.
- Quando os corações dos embriões são interrompidos (leva cerca de 5-10 min), transferência de embriões para a montagem do prato e organizar embriões em poços usando fórceps para que eles mentem em um ângulo de 25 graus, coroa apontando em direção à parte mais profunda do poço, gema voltada para cima.
- Quando os embriões são mais ou menos no lugar, remova a mídia, incorporar os embriões em ~ 200 µ l de 0,7% LMP agarose contendo tricaina e BDM e reajustar as posições dos embriões, inclinando os embriões à esquerda ou à direita conforme necessário.
- Esperar até os conjuntos de agarose LMP (leva cerca de 5 min) e, em seguida, adicionar o meio de montagem para o prato. Os embriões estão agora prontos para ser photoconverted.
Nota: A tricaina e o BDM são usados para anestesiar os embriões e parar o coração dos embriões, respectivamente. Meios de montagem podem ser preparados no dia anterior de imagem, mas certifique-se de proteger os meios de comunicação de luz.
Nota: O posicionamento correto dos embriões é importante para permitir um caminho claro do laser para as células que deseja photoconvert. Posicione a cabeça do embrião perto do início do poço para que a luz do laser não tem de viajar para longe para alcançar o embrião, e para que os embriões podem ser facilmente desmontados depois de photoconversion.
4. Photoconversion
- Em um microscópio confocal na posição vertical (como Leica SP8) equipado com um 405 nm, 488 nm e fonte de laser 561 nm, localizar o embrião do coração usando transmitidos luz branca (brightfield) e uma lente objetiva (como Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objectivo). Verifique se há fluorescência vermelha de Kaede usando o laser nm 561 (ou seja, laser DPSS 561, na intensidade de ~ 5%, detector fixado em 728-589 nm). Em seguida, visualize o endocárdio usando laser 488 nm (ou seja, 30 mW várias linhas laser de argônio na intensidade de ~ 5%, detector fixado em 502-556 nm).
- Entra no modo de "FRAP" sobre o software de aquisição de microscópio. Selecione ~ 1% da potência do laser para ambos 488 nm e 561 nm de lasers.
- Concentre-se no avião de interesse, selecione uma região de interesse (ROI), em seguida, photoconvert células usando a 405 nm diodo do laser com potência de 25% do laser, varredura sobre o ROI três vezes. Kaede insuficiente deveria photoconverted no ROI, digitalizar a 405 nm laser sobre a área três vezes novamente. Repita este passo para todos os ROIs.
- Retornar para o modo "TCS SP8" sobre o software e adquirir uma z-pilha, usando a 561 nm e 488 nm lasers sequencialmente. Certifique-se de selecionar a opção 'bidirecional' para aumentar a velocidade de imagens.
Nota: Quanto tempo demora para photoconvert e imagem que varia de cada embrião. Batida do coração é conhecida por ser importante para o desenvolvimento de válvula do coração normal, então evite manter o coração parou durante mais de 30 min, mesmo que isso signifique que você não tem tempo para photoconvert todos os 5 embriões.
Nota: Durante o processo de photoconversion, utilizar detectores de PGTO, enquanto após a photoconversion, é recomendável usar detectores de híbrido definidos como 'contando' modo. Isso ocorre porque os detectores híbridos são mais sensíveis e são capazes de produzir imagens de melhor qualidade, mas são facilmente danificados pela superexposição.
5. desmontar os embriões photoconverted
- Depois photoconversion, use uma pipeta de vidro para pressionar para baixo apenas ligeiramente acima da cabeça do embrião para quebrar o agarose LMP e, em seguida, aspire suavemente o embrião.
- Ejete o embrião da pipeta vidro um-35mm de Petri contendo meio de embrião com PTU (para lavar o BDM contendo meio).
- Transferi o embrião para um poço em uma placa de 6 contendo meio de embrião com PTU. Durante esta etapa, certifique-se de manter a nota da qual embrião entra que bem, como isso é essencial para correlacionar a posição de photoconverted células em estádios de desenvolvimento mais tarde.
- Agora que os embriões são removidos do meio contendo BDM, seus corações devem começar a bater novamente em cerca de 5 min. embriões retorno à escuridão a 28,5 ° C, para permitir que os embriões continuar a desenvolver normalmente.
6. imaging photoconverted células em estádios de desenvolvimento embrionário mais tarde
- Na fase desejada, parar o coração e re-inserir os embriões como no passo 3 do presente protocolo, com a importante diferença de que os embriões devem ser tratados com BDM em pratos separados, marcados para rastrear os embriões.
- Para embriões até 62 hpf, adquirir z-pilhas de endocárdio usando 561 nm e 488 nm para o vermelho e verde fluorescente sinaliza, respectivamente. Para os embriões em estágios mais de 62 hpf, use um multiphoton laser conjunto para 940 nm a imagem Kaede verde em vez do 488 nm do laser.
7. análise de imagem embriões abaixo dos 48 hpf
Nota: Os movimentos de tecido do AVC podem ser difícil analisar devido à sua complexa estrutura tridimensional. Para quantificar o comprimento de uma região de photoconverted no AVC entre duas regiões não-photoconverted ou o comprimento de uma região não-photoconverted no AVC entre duas regiões de photoconverted, pode ser desejável para mapear a estrutura tridimensional em um mapa bidimensional. Imagens de photoconverted embriões obtidos antes 48 hpf pode ser analisado usando o método a seguir.
- Importe as imagens adquiridas em Matlab ou qualquer outro software similar.
- Delimitar manualmente o ROI, ou seja, o endocárdio e aplicar uma máscara para remover o sinal fora desta região.
- Aplica um limiar de intensidade na imagem para identificar os pontos no endocárdio e parcela-las em três dimensões. Isole os pontos correspondentes à parte mais estreita e mais reto o AVC, apagando manualmente os pontos de nenhum interesse na aurícula e o ventrículo usando o comando apagar no software.
- Use um cilindro para caber os pontos que representam o AVC então obtido.
- Defina um sistema de referência para comparar várias amostras. Por exemplo, adote o centro de massa dos pontos de AVC como a origem do sistema de referência e o eixo do cilindro equipado como o eixo z.
- Certifique-se de que a positivas z-posições correspondem sempre para o mesmo lado do coração (ventricular ou atrial).
- Os pontos de AVC de projeto no plano x-y e use uma elipse para encaixá-los.
- Rode os endocárdico pontos ao redor do eixo z para o eixo maior da elipse e o eixo y do sistema de referência são paralelas e y-valores positivos correspondem ao lado interno do AVC em relação ao embrião.
- Para segmentar o AVC, corte o conjunto de dados tridimensional com alguns aviões obtidas através da rotação do metade-plano {y = 0, x > 0} na direção z.
- A intensidade dos pixels vizinhos de projeto nesses planos e definir o endotélio de forma consistente. Por exemplo, retirar manualmente uma linha o atrial ao lado ventricular do AVC em metade da espessura do endotélio.
- Interpole os pontos das linhas que representam o endotélio com uma spline tridimensional usando a caixa de ferramentas spline para representar o AVC com uma superfície.
Nota: O número de aviões a corte determina tanto a precisão da segmentação e o consumo de tempo desta etapa. Geralmente, 8 aviões são suficientes para alcançar bons resultados.
- Defina a posição azimutal de cada ponto na superfície de AVC usando coordenadas cilíndricas.
- Em cada posição azimutal define uma curva parametrizada ao longo da superfície do AVC, calculando o comprimento do arco na superfície entre pontos consecutivos.
- Para cada curva parametrizada, defina o ponto sobre a curva mais próxima ao centro do AVC para zero. Os pontos do AVC, portanto, são totalmente descritos por sua posição azimutal e sua posição na curva paramétrica.
- Desdobre o AVC em uma imagem bidimensional usando a posição paramétrica dos pontos.
- Encontre as bordas da região para quantificar como as bordas de limiarização a imagem binária a relação entre as intensidades do photoconverted e os canais não-photoconverted. Se necessário, corrigi manualmente o resultado.
- Calcule o comprimento do arco entre as bordas para calcular o comprimento do tecido em função da posição azimutal.
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Representative Results
Um exemplo de um photoconverted de embrião em 48 hpf e fotografada novamente em 80 hpf é mostrado na Figura 2, filmes 1 e 2. Expondo a Kaede a luz de nm 405 irreversivelmente conversos da proteína de sua forma verde fluorescente para formar vermelho fluorescente, permitindo que o comportamento de células rotulado com o verde ou sua forma vermelha para ser seguido com respeitam aos seus diferencialmente coloridas vizinhos durante a formação da válvula. Pode ser visto que as células de photoconverted alguns do AVC hpf 48 proliferaram mais tarde e mais tarde residiam predominantemente em um lado do folheto da válvula.
Um exemplo dos resultados que pode ser conseguida aplicando o método de análise de imagem descrito em um embrião de hpf 36 depois photoconverting CDE no átrio e no ventrículo é mostrado na Figura 3. A segmentação do AVC permite a parametrização da estrutura tridimensional que é então projetada em duas dimensões para facilitar a visualização e análise. O método permite quantificar a distância entre as duas regiões photoconverted. Repetindo este processo em momentos diferentes do desenvolvimento, é possível estudar a migração de células em direção a AVC (Boselli et al, no prelo)9.
Figura 1 : Molde usado para criar poços de agarose. A) vista frontal. B) vista traseira. C-D) Vistas de lado. E-F) Oblíqua. Dimensões são mostrados em milímetros. A. Arquivo STL para o modelo do molde é fornecido nos materiais suplementares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Resultados representativos de um Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) coração embrionário photoconverted. A) o coração embrionário só depois photoconversion em 48 hpf. Kaede citoplasmático dentro de várias células do lado superior do AVC foi convertido de sua forma verde para sua forma vermelha. B) o mesmo embrião em 80 hpf. Pode ser visto que o anteriormente photoconverted células têm proliferado e passaram a residir no lado interno da válvula atrioventricular superior. Barras de escala: 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Resultados representativos do processo de análise de imagem em um embrião de hpf 36. A) o resultado da segmentação tridimensional do AVC em um sistema de referência que é comum entre os embriões; o sinal do photoconverted (magenta) e não-photoconverted (verde) Kaede é projectado em sua superfície e marca as regiões photoconverted e não-photoconverted. B) o AVC é desdobrado de acordo com a posição paramétrica de seu ponto e o sinal é projectado em duas dimensões para visualização mais fácil. As bordas da região não-photoconverted são rotuladas em branco. C) o comprimento da região não-photoconverted é plotado como uma função da posição angular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: O coração embrionário só depois photoconversion em 48 hpf. Relacionado a Figura 2A. O filme passa pela pilha do embrião hpf 48 mostrado na Figura 2A fatia de z por fatia z z adquirida. Z apenas um plano foi escolhido durante o processo de photoconversion, mas pode ser visto aqui que a células em várias profundidades foram photoconverted. Fatias de Z são espaçados 2 µm separados. Clique com o botão direito para baixar este filme.
Filme 2: photoconverted coração embrionário em 80 hpf. Relacionado a Figura 2B. O filme passa pela pilha do embrião 80 hpf mostrado na Figura 2B fatia de z por fatia z z adquirida. Fatias de Z são espaçados 2 µm separados. Clique com o botão direito para baixar este filme.
Arquivo complementar: Relacionadas com a Figura 1. A. Arquivo STL para o modelo do molde. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Calendário de photoconversion: apesar de Kaede permanece brilhantemente expressa em CDE mesmo em 96 hpf, deve-se notar que o embrião cresce, luz laser difunde-se mais antes de atingir o AVC, tornando mais difícil a photoconversion confinado de Kaede. At embrionária dos estágios, o mais tardar 55 hpf, o Balonismo do ventrículo e o átrio também significa que o feixe de laser violeta, usado para photoconversion não pode atingir células de AVC sem primeiro passando o átrio ou ventrículo. Isso significa que, além de 55 hpf, a fim de photoconvert CDE do AVC, um deve também photoconvert CDE adicionais no átrio e ventrículo.
BDM e tricaina: photoconversion precisa de CDE requer temporariamente parando o coração de bater. BDM (2,3-butanodiona monoxime) é um desacoplador electro-contrátil que é bem conhecido para suprimir de contração do músculo cardíaco12. Não observamos diferenças entre a morfologia dos embriões que tenham sido objecto do presente protocolo, e embriões que têm vindo a crescer normalmente e não tinham seus corações pararam para a imagem latente. No entanto, o risco continua a ser que o tratamento medicamentoso é alterando o normal desenvolvimento13. Tricaina concentrada também pode ser usada para interromper temporariamente o coração14. Achamos que podemos efetivamente parar o coração, colocando os embriões em meio de embrião com metanosulfonato de 0.32% por 1 min e manter o coração em seu estado parado por transferir os embriões para meio de embrião com metanosulfonato de 0,16%. Semelhante ao tratamento BDM, o coração pode ser parado assim por 30 min e batimento cardíaco pode ser visto para retornar dentro de 5 min após o retorno de embriões em meio normal do embrião. Concentrações mais altas de tricaina devem ser evitadas; baixas concentrações de tricaina por períodos prolongados (h/dias) foi mostrado para afetar o desenvolvimento embrionário normal15,16. Solução de tricaina usada para parar o coração é melhor preparada fresco. Se alíquotas congeladas são usadas, certifique-se de manter a solução bem protegida da luz e para descongelar a tricaina sem aquecer a solução acima de 30 ° C. Finalmente, o blebbistatin tem sido relatado para parar o coração sem efeitos colaterais graves13. Nós não testamos este último método em nosso laboratório.
Montagem e desmontagem: posicionamento correto dos embriões é crítico durante photoconversion. O molde para fazer poços de agarose facilita a montagem de embriões, tal que o eixo ântero-posterior do embrião, consistentemente, encontra-se a 25° em relação à superfície do prato. Encontramos o molde para ser aplicável para photoconversion estádios de desenvolvimento em tudo entre 36 e 55 hpf. Na montagem, a inclinação do embrião na direção esquerda-direita precisa ser ajustada de acordo com o grau de desenvolvimento do embrião e a área que deseja photoconvert. Por exemplo, para photoconvert o AVC em 36 hpf, o embrião deve enfrentar cerca de 15° para a esquerda, enquanto em 55 hpf, o embrião deve enfrentar aproximadamente 10° para a esquerda. Sob o microscópio, você deve ser capaz de ver o AVC obscurecido pelo ventrículo ou o átrio. Se, por exemplo, o átrio encontra-se sobre o AVC, não seria possível photoconvert apenas o AVC ou apenas o átrio. Para fins de geração de imagens, o mesmo molde é usado para posicionar os embriões entre 36 e 96 hpf. O molde pode ser feito usando uma variedade de materiais, usando uma impressora 3D ou usando ferramentas de oficina mecânica tradicional. Plástico resistente de aço inoxidável ou químico e calor são ambos os materiais apropriados. Se o leitor desejar criar o molde usando uma impressora 3D, por favor consulte informações suplementares para o. Arquivo STL do modelo de molde.
Adicionando suficiente LMP agarose para cobrir o embrião inteiro é aconselhado para garantir que os embriões não se soltam entre montagem e photoconversion/imagens, especialmente se o microscópio não está localizado diretamente adjacente à estação de montagem. Em geral, desde que os embriões são montados de forma adequada, agarose LMP não grude os embriões após a desmontagem. No entanto, alguns agarose LMP deve permanecer preso no embrião, a agarose LMP pode ser removida por suavemente, provocando o embrião do agarose usando fórceps.
Embriões, especialmente embriões inferior a 48 hpf, podem ser facilmente danificados durante a montagem e desmontagem. Para embriões inferior a 48 hpf, recomendamos que o polimento final da pipeta de vidro para evitar danificar embriões durante a pipetagem de fogo.
Microscópio: Este protocolo foi realizado utilizando um microscópio Leica SP8. No entanto, photoconversion é um processo bem estabelecido e este protocolo deve ser facilmente conversível em outros microscópios vertical equipados com lasers capazes de produzir 405 nm, 488 nm e 561 luz nm. Para embriões até 62 hpf, imagens foram adquiridas utilizando um laser de excitação de argônio e um laser DPSS 561 para Kaede verde e vermelho, respectivamente. Para os embriões em estágios mais de 62 hpf, verde Kaede pode ser animado, usando um laser do multiphoton definido como 940 nm, que tem uma profundidade de penetração maior do que a luz de nm 488. Em teoria, Kaede vermelho deve ter um similar de DsRed de espectros de excitação de dois fotões e poderia ser fotografada em 950 nm17.
Uma objectiva com uma abertura numérica elevada é necessária para adquirir imagens de alta resolução e eficientemente photoconvert CDE. Desde que os embriões são mantidos nos meios de comunicação, é importante escolher um microscópio equipado com uma lente objetiva de água.
Photoconverting a região de interesse: é aconselhável ser conservador quando selecionando o ROI para photoconvert - laser 405 nm difunde enquanto viaja através de células de tecidos e pode photoconvert em uma área maior do que o selecionado. Se, por exemplo, você deseja rotular uma célula vermelha mas gostaria que a célula adjacente permanecem verdes, pode ser prudente selecionar apenas a parte da célula que mentir mais longe da célula adjacente como seu ROI. Desde que Kaede manifesta-se no citoplasma de CDE, photoconverted proteína será difuso de partes da célula não selecionado pelo ROI.
Fotobranqueamento e fototoxicidade: Kaede a proteína, suas formas de verdes e vermelhas, é extremamente brilhante e fotobranqueamento geralmente não é um fator limitante em experimentos de rastreamento de celular. No entanto, a luz laser pode afetar o desenvolvimento embrionário e deve ser minimizada, especialmente durante as fases iniciais de desenvolvimento. Sinais de fototoxicidade incluem atraso de desenvolvimento e, em casos mais graves, coração imprópria looping e válvulas malformadas.
O poder do laser violeta (25%) e o número de iterações, o laser violeta examina sobre o ROI (3 - 6 vezes) usado neste protocolo foram determinados empiricamente. Com essas configurações, vimos quase completa conversão de Kaede de seu verde para vermelha forma sem atraso de desenvolvimento perceptível. A quantidade de energia de laser necessária em outras configurações de microscopia dependeria a intensidade do laser. Note-se que a forma vermelha de Kaede pode ser branqueada por intensa iluminação nm 405, então photoconversion mais não necessariamente produz fluorescência vermelha mais.
Análise de imagem: O método proposto para a análise de imagem é um processo recém-desenvolvido para descrever a geometria tridimensional do AVC e compará-lo entre os embriões. Se destina a ser aplicado a estruturas tubulares monocamada, tais como o AVC antes 48 hpf e potencialmente o tubo de coração, a aorta dorsal e outros. É principalmente automático, mesmo que a segmentação sobre os planos de corte é realizada manualmente pelo usuário e outros passos potencialmente poderiam exigir correção manual. A segmentação manual representa a parte mais crítica do processo, desde que o conhecimento da geometria da estrutura e treinamento são necessários para alcançar bons resultados. Depois de praticar, o consumo de tempo desta etapa é consideravelmente reduzido.
O protocolo descrito aqui fornece uma maneira eficaz para controlar movimentos de tecido endocárdico durante AVC e desenvolvimento de válvula atrioventricular coração usando a linha de transgenic zebrafish Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) .
Atualmente, uma das principais limitações desse método é que o feixe de laser violeta não é confinado na dimensão axial. Isto faz direcionamento de células únicas para photoconversion e daí clonais análises e única célula de rastreamento, difícil. Há dois anos, foi descoberto que a proteína photoconvertible que dendra2 pode ser ferrado convertido - a proteína pode ser convertida de sua forma verde para sua forma vermelha pela primeira irradiando a proteína com luz azul e depois com infravermelho luz18. Configurações de microscópio que exploram essa propriedade podem photoconvert Dendra2 células expressando de forma espacialmente confinada em estruturas de tecido 3D complexo, evitando muitos dos problemas associados com irradiação intensa de perto-UV18 fototoxicidade , 19 , 20. com a recente descoberta do mecanismo molecular por trás deste fenômeno, variantes de muitas proteínas fluorescentes photoconvertible verde e vermelho, incluindo Kaede, têm sido projetadas para que também sejam capazes de entrar em um intermediário aprontado estado21. A nosso conhecimento, zebrafish transgênicos linhas onde um promotor como fli1a ou kdrl leva a expressão da proteína Dendra2 ou outro preparado proteínas fluorescentes conversíveis em células endoteliais ainda não estão disponíveis. No entanto, as linhas que expressam Dendra2 ubiquitously estão disponíveis e podem ser úteis em determinadas aplicações 22,23.
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Disclosures
Não há conflito de interesse declarado.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli e Basile Gurchenkov ajuda a projetar e fazer o molde descrito neste protocolo. Este trabalho foi apoiado pela FRM (DEQ20140329553), o ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), a EMBO Young Investigator programa da Comunidade Europeia, a ERC CoG N ° 682938 Evalve e pela subvenção ANR-10-LABX-0030-INRT, um fundo de Estado francês gerenciado pelo a Agence Nationale de la Recherche sob o quadro programa Investissements d'Avenir rotulado ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
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