Summary
هذا البروتوكول وصف أسلوب فوتوكونفيرسيون كايد الفلورسنت البروتين في الخلايا للوفلر المعيشة الجنين الزرد التي تمكن من تتبع الخلايا للوفلر خلال قناة بي وتطوير صمام قلب بي .
Abstract
أثناء امبريوجينيسيس، خلايا تغيرات دينامية في سلوك الخلية، وفك رموز الخلوية المنطق الكامن وراء هذه التغيرات هدف أساسي في مجال علم الأحياء التنموي. اكتشاف وتطوير فوتوكونفيرتيبلي البروتينات ساعدت إلى حد كبير فهمنا لهذه التغيرات الدينامية بتوفير أسلوب بصريا تسليط الضوء على الخلايا والأنسجة. ومع ذلك، بينما فوتوكونفيرسيون والوقت الفاصل بين الفحص المجهري، وتحليل الصور اللاحقة أثبتت أن تكون ناجحة جداً في الكشف عن ديناميات الخلوية في الأجهزة مثل الدماغ أو العين، هذا النهج لا يستخدم عادة في القلب النامية المستحقة التحديات التي تفرضها الحركة السريعة للقلب أثناء دورة القلب. يتألف هذا البروتوكول من جزأين. ويصف الجزء الأول أسلوب فوتوكونفيرتينج وبعد ذلك تتبع الخلايا للوفلر (EdCs) خلال قناة بي الزرد (افك) وتطوير صمام قلب بي. الأسلوب الذي ينطوي على وقتيا توقف القلب بدواء من أجل فوتوكونفيرسيون دقيقة تأخذ مكان. قلوب هي السماح باستئناف الضرب عند إزالة المخدرات والتنمية الجنينية يستمر عادة حتى يتم إيقاف القلب مرة أخرى لتصوير عالي الدقة من فوتوكونفيرتيد يشكل نقطة بعد ذلك وقت التنموية. ويصف الجزء الثاني من البروتوكول أسلوب تحليل صورة لقياس طول منطقة فوتوكونفيرتيد أو غير فوتوكونفيرتيد بافك في الأجنة الشباب عن طريق تعيين إشارة الفلورسنت من هيكل ثلاثي الأبعاد على مخطط ثنائي الأبعاد . معا، الجزأين من البروتوكول يسمح أحد لدراسة منشأ والسلوك من الخلايا التي تشكل الزرد افك وصمام القلب بي، ويمكن تطبيقها المحتمل لدراسة طفرات أو مورفانتس أو الأجنة التي قد تم التعامل مع الكواشف التي تعطل التنمية افك و/أو صمام.
Introduction
الزرد حاليا واحدة من أهم نماذج الفقاريات لدراسة العمليات الخلوية والإنمائية في فيفو. هذا إلى حد كبير بسبب الشفافية الضوئية الزرد وقابليتها لعلم الوراثة، مما يجعلها نموذجا قويا لتطبيق التقنيات البصرية التي تشمل وراثيا ترميز فوتوريسبونسيفي البروتين التكنولوجيات1. محددة لدراسة التطور القلب، الزرد تلقي الأوكسجين كافية عن طريق نشر أن طفرات حتى دون ضربات القلب يمكن البقاء على قيد الحياة من خلال الأسبوع الأول من التنمية، تسمح التحاليل على الآثار من جينات التنموية والقلق تدفق الدم في القلب morphogenesis ليس من الممكن في معظم الفقاريات2.
ويتكون أنبوب القلب الزرد خلال 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf). بعد وقت قصير من تشكيلها، يبدأ أنبوب القلب الضرب بنشاط. 36 هبف، انقباض واضح يفصل الأتريوم من البطين. يتم استدعاء هذه المنطقة من انقباض قناة بي (افك)، والخلايا في هذا التغيير المنطقة من مورفولوجيا صدفية إلى مورفولوجيا cuboidal3. الزرد صمام بي morphogenesis يبدأ حوالي 48 ساعة بعد الإخصاب. قبل 5 أيام بعد الإخصاب، واثنين من منشورات صمام تمتد إلى افك ومنع عودة تدفق الدم من البطين إلى الاذين أثناء دورة القلب4. تعقب الخلايا أثناء تشكيل افك وصمام تتحدى الضرب السريع للقلب يجعل من الصعب متابعة الخلايا عن طريق الفحص المجهري التقليدي في الوقت الفاصل بين5،6. ويصف هذا البروتوكول، مقتبس من ستيد et al., 20167، أسلوب يستخدم تيراغرام (fli1a:gal4FFيو بي إس، UAS:kaede)8 الزرد المعدلة وراثيا الخط، الذي أعرب فيه عن البروتين فوتوكونفيرتيبلي كايد في خلايا بطانية، بما في ذلك في البطانة. المخدرات 2، 3-بوتانيديوني-2-مونوكسيمي (متخذي قرارات العمل) تستخدم لإيقاف مؤقتاً قلب الضرب، مما يسمح فوتوكونفيرسيون دقيقة ليشكل بين 36 و 55 هبف، وتصوير عالي الدقة من فوتوكونفيرتيد يشكل نقطة زمنية إنمائية محددة. لقد ثبت سابقا أن يشكل فوتوكونفيرتيد باستخدام هذا الأسلوب يمكن أن تبقى مميزة من جيرانهم غير محولة لمدة خمسة أيام أو أكثر بعد وقت فوتوكونفيرسيون7. هذا البروتوكول أيضا تفاصيل أسلوب يستخدم لتحليل الصور من فوتوكونفيرتيد يشكل في أجنة أصغر سنا من 48 هبف، التي استخدمت بنجاح متابعة تحركات الأنسجة خلال افك التنمية (بوسيلي et al.، في الصحافة)9. ونأمل أن القراء سوف تجد هذا البروتوكول مفيدة لدراسة التنمية افك وصمام في الأجنة العادية، وطفرات أو مورفانتس أو الأجنة المعالجة بالعقاقير. لبروتوكول أعم تتصل بخلية تتبع استخدام البروتينات فوتوكونفيرتيبلي أثناء تطوير الزرد، الرجاء عرض المقالة لومباردو et al.، 201210.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد قوالب وتصاعد [اغروس]
- إنشاء قالب مع الأبعاد هو مبين في الشكل 1 باستخدام طابعة 3D أو أدوات الورش الميكانيكية التقليدية.
- "الماصة؛" حوالي 1.5 مل من ذاب 1% [اغروس] إلى طبق تركيب بلاستيك 35 ملم. ضع القالب البلاستيك في [اغروس] السائل، مع الحرص على تجنب الجوية الملائمة بين العفن و [اغروس]. ضع الطبق في 4 درجات مئوية، والانتظار حتى [اغروس] يصلب (هذا يستغرق حوالي 5 دقائق)، ثم إزالة العفن البلاستيك.
- لتخزين الطبق المتصاعدة لاستخدامها في وقت لاحق، وتغطي الطبق مع غطاء لها، ثم التفاف الطبق وغطاء محكم مع بارافيلم. الطبق المتصاعدة يمكن تخزينها ثم وجه غطاء لأسفل لمدة 5 أيام في 4 درجات مئوية.
- إعداد مقدما مختبرين 1 مل من 0.7 في المائة نقطة انصهار منخفضة [اغروس] في 1.5 مل أنابيب ايبندورف استخدامها في يوم تصاعد.
ملاحظة: سوف تشوه الآبار [اغروس] طبق المتصاعدة مع مرور الوقت كما يتبخر الماء إذا بارافيلم لا يتم التفاف حول الأطباق محكم.
2-الحصول على الأجنة فوتوكونفيرسيون
- إينكروس تيراغرام (fli1a:gal4FFيو بي إس، UAS:kaede) خط وينمو حوالي 200 الأجنة في المتوسط الجنين في الظلام في 28.5 درجة مئوية. لمزيد من التفاصيل حول كيفية عبور خطوط الزرد، يرجى الرجوع إلى "قاعدة بيانات التعليم العلوم جوف"11.
- بعد 5 ساعات ولكن قبل 24 ساعة، علاج الأجنة مع 1-فينيل-2-ال (PTU) لمنع تشكيل الصباغ (0.003% PTU في الجنين المتوسطة).
- التي تظهر في حوالي 1 ساعة قبل بدء فوتوكونفيرسيون، وفحص أجنة تحت ستيريوسكوبي فلورسنت وحدد 5 أجنة صحية للتعبير عن الفلورية الخضراء ألمع. يوصي باستخدام الضوء المنخفض الكثافة عند تصور الأجنة لتجنب التعرض للأجنة للإضاءة المحيطة تجنبا فوتوكونفيرتينج كايد في خلايا غير محددة.
3-التضمين
- إعداد 10 مل من تركيب وسائط: تريكيني 0.02 في المائة و 50 مم متخذي قرارات العمل في المتوسط الجنين.
- إضافة 2 مل من تصاعد المتوسطة إلى الطبق المتصاعدة وتسمح 15-30 دقيقة لحل منتشر في [اغروس].
- وفي الوقت نفسه، تذوب قاسمة 1 مل من 0.7 في المائة نقطة انصهار منخفضة (LMP) [اغروس] عن طريق وضع الأنبوب في كتلة حرارة 70 درجة مئوية لمدة حوالي 5 دقائق.
- انتظر LMP [اغروس] لتبرد قليلاً، ثم إضافة 25 ميليلتر من 8 ملغ/مل تريكيني الحل وميليلتر 40 م 1 متخذي قرارات العمل الحل إلى الأنبوب من نقطة انصهار منخفضة [اغروس]. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، ثم نقل الأنبوب إلى كتلة حرارة 38 درجة مئوية للحفاظ [اغروس] LMP في حالتها السائلة.
- في بتري طبق مع الجنين المتوسطة، ديتشوريوناتي بعناية الأجنة تم اختيارها مسبقاً تحت ستيريوميكروسكوبي استخدام الملقط، مع الحرص على عدم الأضرار الأجنة.
- نقل الأجنة إلى طبق منفصل يحتوي على 2 مل من تركيب وسائط.
- عندما يتم إيقاف قلوب الأجنة (يستغرق حوالي 5-10 دقيقة)، نقل الأجنة إلى التركيب صحن وترتيب الأجنة في الآبار باستخدام الملقط حتى أنهم يكذبون بزاوية 25 درجة، ذيول لافتاً نحو الجزء الأعمق من البئر، صفار مواجهة.
- عند الأجنة تقريبا في المكان، قم بإزالة الوسائط، وتضمين الأجنة في ~ 200 ميليلتر من 0.7% LMP [اغروس] يتضمن تريكيني ومتخذي قرارات العمل، وتعديل المواقف للأجنة، إمالة الأجنة إلى اليمين أو اليسار حسب الضرورة.
- الانتظار حتى بإضافة المجموعات [اغروس] LMP (يستغرق حوالي 5 دقائق)، ثم تصاعد المتوسطة إلى الطبق. الأجنة جاهزة الآن لتكون فوتوكونفيرتيد.
ملاحظة: في تريكايني ومتخذي قرارات العمل تستخدم لتخدير الأجنة ووقف القلب لدى الأجنة، على التوالي. تركيب وسائل الإعلام يمكن إعدادها قبل التصوير بيوم واحد، ولكن تأكد من أن حماية وسائل الإعلام من الضوء.
ملاحظة: تحديد المواقع الصحيحة للأجنة مهم للسماح لمسار ليزر واضحة للخلايا أحد يرغب في فوتوكونفيرت. وضع رأس الجنين قريبة من بداية البئر حيث يكون ضوء الليزر عدم السفر الآن للوصول إلى الجنين، وحيث أن الأجنة يمكن بسهولة صاعد بعد فوتوكونفيرسيون.
4-فوتوكونفيرسيون
- في مجهر [كنفوكل] تستقيم (مثل إيكا SP8) مجهزة 405 نانومتر، 488 شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط 561 الليزر المصدر، حدد موقع الجنين استخدام القلب أحال الضوء الأبيض (برايتفيلد) وعدسة الهدف (مثل إيكا HCX إيرابو L, × 25، N.A. 0.95 هدف). تحقق من وجود الأسفار كايد الحمراء باستخدام الليزر نانومتر 561 (أي، الليزر 561 والعسف، في كثافة ~ 5%، الكاشف في شمال البحر الأبيض المتوسط 589-728). ثم، تصور البطانة باستخدام الليزر 488 نانومتر (أي، 30 ميغاواط متعدد الأسطر ليزر الأرجون في كثافة ~ 5%، الكاشف في 502-556 nm).
- إدخال وضع "فراب" على البرمجيات اقتناء مجهر. حدد السلطة الليزر ~ 1% لكلا 488 نانومتر و 561 نانومتر الليزر.
- التركيز على طائرة الفائدة، حدد منطقة للفائدة (العائد على الاستثمار)، ثم فوتوكونفيرت الخلايا باستخدام صمام ثنائي نانومتر 405 الليزر طاقة الليزر 25%، مسح ثلاث مرات على مدى العائد على الاستثمار. ينبغي أن تكون غير كافية كايد فوتوكونفيرتيد في العائد على الاستثمار، تفحص 405 نانومتر الليزر فوق المنطقة ثلاث مرات مرة أخرى. كرر هذه الخطوة لكل رويس.
- العودة إلى وضع "TCS SP8" على البرمجيات واكتساب z كدسة، استخدام 561 نانومتر و 488 نانومتر ليزر تسلسلياً. تأكد من تحديد الخيار 'ثنائي' لزيادة سرعة التصوير.
ملاحظة: الزمن الذي يستغرقه فوتوكونفيرت والصورة يختلف كل جنين. من المعروف أن تكون هامة لتطوير صمام قلب العادي، لذا تجنب إبقاء قلب توقفت لأكثر من 30 دقيقة، حتى لو كان ذلك يعني ليس لديك وقت فوتوكونفيرت جميع الأجنة 5 ضربات القلب.
ملاحظة: أثناء عملية فوتوكونفيرسيون، استخدام كاشفات PMT، حين بعد فوتوكونفيرسيون، من المستحسن استخدام كاشفات الهجين تعيين إلى 'فرز' الوضع. هذا سبب كاشفات الهجين أكثر حساسية، وقادرة على إنتاج صور ذات جودة أفضل، لكن تتلف بسهولة التعرض المفرط.
5-إلغاء تحميل فوتوكونفيرتيد الأجنة
- بعد فوتوكونفيرسيون، استخدم ماصة زجاجية لاضغط لأسفل قليلاً فقط فوق رأس الجنين إلى كسر في [اغروس] LMP، ثم تمتص بلطف الجنين.
- إخراج الجنين من ماصة زجاجية في طبق بتري 35 ملم تحتوي على الجنين المتوسطة مع PTU (ليغسل متخذي قرارات العمل تتضمن المتوسطة).
- نقل الجنين إلى بئر في لوحة 6-جيدا المحتوية على الجنين المتوسطة مع PTU. أثناء هذه الخطوة، تأكد من إبقاء علما بالجنين الذي يذهب إلى فيها جيدا، كما أن هذا ضروري للربط بين موقف فوتوكونفيرتيد الخلايا في مراحل النمو في وقت لاحق.
- والآن بعد أن يتم إزالة الأجنة من المتوسطة المحتوية على متخذي قرارات العمل، ينبغي أن تبدأ قلوبهم ضرب مرة أخرى في حوالي 5 دقيقة الأجنة العودة إلى الظلام في 28.5 درجة مئوية للسماح للأجنة مواصلة تطوير عادة.
6-تصوير فوتوكونفيرتيد الخلايا في المراحل الجنينية في وقت لاحق
- في المرحلة المرجوة، توقف القلب وإعادة تضمين الأجنة مثل إطار الخطوة 3 من هذا البروتوكول، مع فارق هام أن الأجنة يجب أن تعامل مع متخذي قرارات العمل في أطباق منفصلة وملحوظ لتعقب الأجنة.
- للأجنة حتى 62 هبف، اكتساب z-رزمة شغاف استخدام 561 نانومتر و 488 نانومتر الفلورسنت الأحمر والأخضر إشارات، على التوالي. للأجنة في مراحل أقدم من 62 الليزر هبف، استخدم مولتيفوتون لتعيين 940 نانومتر صورة كايد الأخضر بدلاً من 488 نانومتر الليزر.
7-صورة التحليل للأجنة تحت 48 هبف
ملاحظة: تحركات الأنسجة افك يمكن أن تكون صعبة لتحليل سبب لها هيكل ثلاثي الأبعاد المعقدة. لتحديد طول منطقة فوتوكونفيرتيد في افك بين المنطقتين غير فوتوكونفيرتيد أو طول منطقة غير فوتوكونفيرتيد بافك بين المنطقتين فوتوكونفيرتيد، يمكن أن يكون من المستصوب خريطة هيكل ثلاثي الأبعاد على خريطة ثنائية الأبعاد. الحصول على صور للأجنة فوتوكونفيرتيد قبل 48 هبف يمكن تحليلها باستخدام الأسلوب التالي.
- استيراد الصور المكتسبة في Matlab أو أي برامج مشابهة.
- جارك يدوياً في العائد على الاستثمار، أي البطانة، وتطبيق قناع لإزالة الإشارة خارج هذه المنطقة.
- تطبيق حد كثافة في الصورة لتحديد النقاط على البطانة وارسم لهم في ثلاثة أبعاد. عزل على النقاط المقابلة للجزء الأكثر مباشرة وأضيق من افك، بمحو نقاط الاهتمام لا في الاذين والبطين استخدام الأمر مسح في البرنامج يدوياً.
- استخدم اسطوانة لتتناسب مع النقاط التي تمثل افك حتى الحصول عليها.
- تعريف نظام مرجعي للمقارنة بين عدة عينات. على سبيل المثال، تعتمد في مركز الكتلة النقاط افك كأصل النظام المرجعي ومحور الاسطوانة المجهزة كمحور ع.
- تأكد من أن z-مواقف إيجابية تتوافق دائماً على نفس الجانب من القلب (البطين أو الرجفان).
- مشروع النقاط افك على متن الطائرة س-ص واستخدام القطع ناقص ليصلح لهم.
- قم بتدوير النقاط للوفلر حول محور ع حيث تكون المحور الرئيسي للقطع الناقص والمحور الصادي النظام المرجعي موازية وتتوافق مع القيم y الإيجابية على الجانب الداخلي من افك فيما يتعلق بالجنين.
- لتجزئة افك، قص dataset ثلاثية الأبعاد مع بعض الطائرات التي تم الحصول عليها عن طريق تناوب النصف الطائرة {y = 0، س > 0} في الاتجاه-z.
- مشروع كثافة البيكسلات المجاورة لهذه الطائرات وتحديد البطانة بطريقة متسقة. على سبيل المثال، رسم يدوياً خط من الرجفان إلى جانب البطين افك في نصف سمك البطانة.
- اقحم نقاط خطوط تمثل البطانة مع شريحة ثلاثي الأبعاد باستخدام مربع الأدوات المفتاح لتمثيل افك مع سطح.
ملاحظة: يحدد عدد الطائرات قطع كل دقة التجزئة واستهلاك الوقت لهذه الخطوة. عادة، 8 طائرات بما يكفي لتحقيق نتائج جيدة.
- تعريف موقع مداري كل نقطة على السطح افك باستخدام الإحداثيات الاسطوانية.
- تحدد في كل موقع مداري منحنى حدودي على طول سطح افك عن طريق حساب طول القوس على السطح بين نقاط متتالية.
- لكل منحنى حدودي، تحديد النقطة على المنحنى الأقرب إلى مركز افك إلى الصفر. وهكذا تماما نقاط افك يرد وصف موقفهم السمتية وموقفهم على المنحنى حدودي.
- تتكشف افك في صورة ثنائية الأبعاد باستخدام الموقف حدودي من النقاط.
- العثور على حواف المنطقة لقياس النسبة بين كثافة فوتوكونفيرتيد والقنوات غير فوتوكونفيرتيد حواف العتبة الصورة الثنائية. تصحيح النتيجة يدوياً إذا لزم الأمر.
- حساب طول القوس بين الحواف لحساب طول الأنسجة كدالة للموقف مداري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مثال على فوتوكونفيرتيد الجنين في 48 هبف وتصويرها مرة أخرى في 80 هبف ويبين الشكل 2 وأفﻻم 1 و 2. تعريض كايد إلى 405 نانومتر الضوء لا رجعة فيه تحولوا من البروتين من شكله أخضر نيون للنموذج الأحمر نيون، تمكين سلوك الخلايا المسماة بالأخضر أو شكلها الأحمر الواجب اتباعها مع احترام إلى بهم الأثران الملونة الدول المجاورة من خلال تشكيل صمام. يتضح أن بعض الخلايا فوتوكونفيرتيد لافك هبف 48 انتشرت في وقت لاحق وبعد ذلك أقام يغلب على جانب واحد من هذه النشرة صمام.
مثال عن النتائج التي يمكن تحقيقها بتطبيق أسلوب تحليل الصورة ووصف جنينا هبف 36 بعد فوتوكونفيرتينج يشكل في الحديقة الشتوية وفي البطين ويرد في الشكل 3. تجزئة افك يسمح باراميتريزيشن لهيكل ثلاثي الأبعاد التي من المتوقع ثم في أبعاد اثنين لتسهيل التحليل والتصور. الأسلوب الذي يسمح أحد لقياس المسافة بين المنطقتين فوتوكونفيرتيد. بتكرار هذه العملية في بعض الأحيان الإنمائية المختلفة فمن الممكن لدراسة هجرة الخلايا تجاه افك (بوسيلي et al.، في الصحافة)9.
الشكل 1 : القالب المستخدم لإنشاء الآبار [اغروس]. A) الأمامية عرض. ب) المنظر الخلفي. ج-د) آراء الجانب. E-F) الآراء منحرف. وتظهر الأبعاد في ملليمتر. . ملف STL لقالب العفن ترد في "المواد التكميلية". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : نتائج الممثل تيراغرام (fli1a:gal4FFيو بي إس، UAS:kaede) قلب الجنين فوتوكونفيرتيد. A) قلب الجنينية فقط بعد فوتوكونفيرسيون في 48 هبف. كايدى هيولى داخل خلايا عديدة من جانب متفوقة افك تم تحويلها من شكلها الأخضر إلى شكله أحمر. ب) الجنين نفسه في 80 هبف. يمكن أن نرى أن سابقا تكاثرت الخلايا فوتوكونفيرتيد وقد تأتي بالإقامة في الجانب الداخلي من صمام بي متفوقة. تغيير حجم أشرطة: 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الممثل نتائج عملية تحليل الصورة في جنينا هبف 36. A) نتيجة لتقسيم ثلاثي الأبعاد لافك في نظام مرجعي شائع بين الأجنة؛ الإشارة من فوتوكونفيرتيد (أرجواني) وغير فوتوكونفيرتيد (الأخضر) كايد هو إسقاط على سطحه، ويصادف في منطقتي فوتوكونفيرتيد وغير فوتوكونفيرتيد. ب) افك تكشفت وفقا لموقف حدودي من وجهة نظرها، ويتوقع الإشارة في أبعاد اثنين للتصور أسهل. حواف المنطقة غير فوتوكونفيرتيد المسماة بالأبيض. ج) المرسومة طول المنطقة غير فوتوكونفيرتيد كدالة للموقف الزاوي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
1 فيلم: قلب الجنينية فقط بعد فوتوكونفيرسيون في 48 هبف. تتصل الشكل 2A. يذهب الفيلم عبر كومة الجنين هبف 48 هو مبين في الشكل 2 أ z شريحة بشريحة z z المكتسبة. تم اختيار طائرة z واحدة فقط أثناء عملية فوتوكونفيرسيون، ولكن فإنه يمكن أن نرى هنا أن الخلايا في أعماق مختلفة قد فوتوكونفيرتيد. شرائح Z هي ميكرومتر 2 متباعدة عن بعضها البعض. فوق الحق في تحميل هذا الفيلم-
2 فيلم: قلب فوتوكونفيرتيد الجنينية في 80 هبف. تتصل الرقم 2. الفيلم غنى عن طريق المكدس z المكتسبة للجنين هبف 80 هو مبين في الشكل 2 z شريحة بشريحة z. شرائح Z هي ميكرومتر 2 متباعدة عن بعضها البعض. فوق الحق في تحميل هذا الفيلم-
الملف التكميلي: تتصل الرقم 1. . ملف STL لقالب العفن. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توقيت فوتوكونفيرسيون: "كايد على الرغم من أن" يظل الزاهية المعرب عنها في EdCs حتى في 96 هبف، تجدر الإشارة إلى أنه مع نمو الجنين، ضوء الليزر ينشر المزيد قبل أن تصل إلى افك، يزيد من صعوبة فوتوكونفيرسيون المحصورة من كايد. الجنينية وفي مراحل يتجاوز 55 هبف، يعني تضخم في البطين والاذين أيضا أن شعاع الليزر فوق البنفسجية المستخدمة فوتوكونفيرسيون لا يمكن أن تصل إلى الخلايا افك دون يمر أولاً عبر الاذين أو البطين. وهذا يعني أنه يتجاوز 55 هبف، كي فوتوكونفيرت يشكل افك، يجب على المرء أيضا فوتوكونفيرت يشكل إضافية في الاذين والبطين.
متخذي قرارات العمل وتريكيني: فوتوكونفيرسيون دقيقة ليشكل يتطلب إيقاف مؤقتاً في القلب من الضرب. متخذي قرارات العمل (2، 3-بوتانيديوني مونوكسيمي) هو أونكوبلير الكهربائية-الهوس الذي معروف جيدا لقمع تقلص عضلة القلب12. ونحن لا تراعي الاختلافات بين مورفولوجية الأجنة التي خضعت لهذا البروتوكول، والأجنة التي تنمو بشكل طبيعي ولم قلوبهم توقف للتصوير. ومع ذلك، يظل الخطر أن العلاج من تعاطي المخدرات هو تغيير التطور الطبيعي13. يمكن أيضا استخدام تريكيني مركزة مؤقتاً إيقاف القلب14. أننا نجد أنه يمكننا فعلياً توقف القلب بوضع الأجنة في المتوسط الجنين مع tricaine 0.32 في المائة لمدة 1 دقيقة، والحفاظ على القلب في حالة توقف عن طريق نقل الأجنة للجنين المتوسطة مع tricaine 0.16 في المائة. مماثلة لمعاملة متخذي قرارات العمل، القلب يمكن إيقاف هذه الطريقة لمدة 30 دقيقة ويمكن رؤية ضربات القلب العودة في غضون 5 دقائق بعد إرجاع الأجنة في المتوسط الجنين الطبيعي. وينبغي تجنب تركيزات أعلى من تريكيني؛ تركيزات منخفضة من تريكيني لفترات طويلة (ح/يوم)، لقد ثبت أن تؤثر على التطور الجنيني الطبيعي15،16. تريكيني الحل المستخدم لوقف القلب أفضل استعداد الطازجة. وإذا استخدمت مختبرين المجمدة، تأكد من إبقاء الحل محمية بشكل جيد من الضوء وتذويب تريكيني دون تدفئة الحل أعلاه 30 درجة مئوية. وأخيراً، أبلغ بليبيستاتين توقف القلب دون آثار جانبية حادة13. نحن لم اختبر هذا الأسلوب الأخير في مختبر لدينا.
المتصاعدة وإلغاء تحميل: الموضع الصحيح للأجنة الحرجة أثناء فوتوكونفيرسيون. العفن لصنع الآبار [اغروس] يسهل تصاعد الأجنة أن المحور الأمامي الخلفي للجنين تكمن دائماً في 25 درجة مئوية بالنسبة إلى سطح الطبق. وقد وجدنا العفن تكون قابلة للتطبيق فوتوكونفيرسيون مراحل النمو على الإطلاق بين هبف 36 و 55. في تصاعد، الميل للجنين باتجاه اليسار واليمين يحتاج إلى تعديلها وفقا لمرحلة النمو للجنين ومنطقة واحدة ترغب في فوتوكونفيرت. على سبيل المثال، أن فوتوكونفيرت افك في 36 هبف، الجنين ينبغي أن يواجه ما يقرب من 15° إلى اليسار، بينما في 55 هبف، الجنين ينبغي أن يواجه حوالي 10 درجة إلى اليسار. تحت ستيريوميكروسكوبي، يجب أن تكون قادراً على رؤية افك اللاتلامسي في البطين أو الاذين. إذا، على سبيل المثال، الأتريوم يكذب على افك، لن يمكن فوتوكونفيرت فقط افك أو مجرد الأتريوم. لأغراض التصوير، ويتم استخدام نفس القالب لوضع الأجنة بين هبف 36 و 96. يمكن جعل القالب باستخدام مجموعة متنوعة من المواد باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد أو باستخدام أدوات الورش الميكانيكية التقليدية. البلاستيك مقاومة الفولاذ المقاوم للصدأ أو الكيميائية والحرارة هي كل المواد المناسبة. وينبغي أن يرغب القارئ في إنشاء قالب باستخدام طابعة 3D، يرجى الاطلاع على معلومات تكميلية. STL ملف قالب العفن.
إضافة LMP كافية ينصح [اغروس] لتغطية كامل الجنين التأكد من أن الأجنة لا تصبح المزاحة بين التركيب وفوتوكونفيرسيون/التصوير، لا سيما إذا كان غير موجود المجهر المتاخمة مباشرة إلى محطة المتصاعدة. وبصفة عامة، شريطة أن يتم تحميلها بشكل صحيح الأجنة، لا عصا LMP [اغروس] للأجنة بعد إلغاء تحميل. ومع ذلك، ينبغي أن بعض [اغروس] LMP تظل عالقة في الجنين، يمكن إزالتها LMP [اغروس] بلطف إغاظة الجنين من [اغروس] استخدام الملقط.
الأجنة، لا سيما الأجنة أقل من 48 هبف، يمكن أن تتلف بسهولة أثناء تحميل وإلغاء تحميل. للأجنة أقل من 48 هبف، نوصي بالنار التلميع نهاية ماصة زجاجية لمنع الأجنة الضارة أثناء بيبيتينج.
المجهر: أجرى هذا البروتوكول باستخدام مجهر SP8 إيكا. ومع ذلك، فوتوكونفيرسيون عملية راسخة وهذا البروتوكول ينبغي أن تكون قابلة للتحويل بسهولة إلى المجاهر تستقيم أخرى مجهزة بأشعة الليزر قادرة على إنتاج 405 نانومتر، 488 نانومتر و 561 نانومتر الضوء. للأجنة حتى 62 هبف، الصور تم الحصول عليها استخدام ليزر أرجون إثارة وليزر 561 والعسف كايدى الأخضر والأحمر، على التوالي. للأجنة في مراحل أقدم من 62 هبف، الأخضر يمكن متحمس كايدى استخدام ليزر مولتيفوتون تعيين إلى 940 نانومتر، الأمر الذي عمق تغلغل أكبر من 488 نانومتر الضوء. من الناحية النظرية، كايد حمراء ينبغي أن يكون إثارة اثنين-فوتون أطياف مماثلة لتلك التي دسريد، ويمكن تصويرها في شمال البحر الأبيض المتوسط 95017.
عدسة الهدف مع فتحه عددية عالية ضروري لكفاءة فوتوكونفيرت يشكل والحصول على صور عالية الدقة. حيث يتم الاحتفاظ الأجنة في وسائل الإعلام، فإنه من المهم اختيار مجهر مجهزة بعدسة هدف مياه.
فوتوكونفيرتينج منطقة الفائدة: فمن المستحسن أن يكون متحفظاً عند تحديد العائد على الاستثمار إلى فوتوكونفيرت--ينشر 405 نانومتر الليزر كما أنه ينتقل عن طريق الأنسجة ويمكن أن الخلايا فوتوكونفيرت في منطقة أكبر من المحدد. إذا، على سبيل المثال، كنت ترغب في تسمية خلية حمراء، لكن أود الخلية المتاخمة مباشرة تبقى خضراء، قد يكون من الحكمة لتحديد الجزء من الخلية الكذب أخرى بعيداً عن الخلية المجاورة كعائد الاستثمار الخاص بك فقط. حيث يتم التعبير عن كايد في السيتوبلازم ليشكل، سوف منتشر فوتوكونفيرتيد البروتين إلى أجزاء من الخلية غير المحددة بالعائد على الاستثمار.
فوتوبليتشينج والضيائيه: "كايدى" البروتين، كل أشكاله الأخضر والأحمر ومشرق للغاية وعموما فوتوبليتشينج ليست عاملاً محدداً في خلية تتبع التجارب. ومع ذلك، ضوء الليزر يمكن أن يؤثر على التطور الجنيني وينبغي تدنية، خاصة خلال المراحل الأولى من التنمية. وتشمل علامات لالضيائيه تأخر في النمو، وفي الحالات الأكثر خطورة، وحلقات القلب غير لائق وصمامات تالفة.
وقد تحددت قوة الليزر البنفسجي (25 في المائة) وعدد مرات التكرار الليزر فوق البنفسجية الأشعة عبر العائد على الاستثمار (3-6 مرات) المستخدمة في هذا البروتوكول تجريبيا. في هذه الإعدادات، شاهدنا تحويل كايد كاملة تقريبا من به الأخضر إلى الأحمر النموذج دون تأخر ملحوظ في النمو. كمية الليزر الطاقة المطلوبة في الأجهزة الأخرى الفحص المجهري يعتمد على كثافة الليزر. تجدر الإشارة إلى أن يمكن مقصور على شكل أحمر كايد بكثافة من 405 نانومتر الإضاءة، حيث فوتوكونفيرسيون أطول لا تؤدي بالضرورة إلى ومضان أحمر أكثر.
تحليل الصور: الأسلوب المقترح لتحليل الصور عملية المطورة حديثا لتصف هندسة ثلاثي الأبعاد افك ومقارنتها بين الأجنة. ويعتزم تطبيقها على هياكل أنبوبية أحادي الطبقة، مثل افك قبل 48 هبف ويحتمل أن أنبوب القلب والشريان الاورطي الظهرية وغيرهم. أنها أساسا التلقائي، حتى على الرغم من التجزئة على قطع الطائرات تتم يدوياً حسب المستخدم ويمكن أن تتطلب خطوات أخرى يحتمل التصحيح اليدوي. تجزئة دليل يمثل أهم جزء من هذه العملية، حيث تلزم المعرفة بهندسة الهيكل والتدريب لتحقيق نتائج جيدة. بعد ممارسة، هو إلى حد كبير تخفيض استهلاك الوقت لهذه الخطوة.
ينص البروتوكول على وصف هنا وسيلة فعالة لتعقب تحركات الأنسجة للوفلر خلال افك وتطوير صمام قلب بي باستخدام السطر المعدلة وراثيا الزرد تيراغرام (fli1a:gal4FFيو بي إس، UAS:kaede) .
حاليا، أحد أوجه القصور الرئيسية في هذا الأسلوب أن شعاع الليزر فوق البنفسجية لا تنحصر في البعد المحوري. وهذا يجعل استهداف الخلايا المفردة فوتوكونفيرسيون، والتحليلات ومن ثم الاستنساخ وخلية واحدة تتبع، صعبة. قبل عامين، وقد اتضح أن تحويل البروتين فوتوكونفيرتيبلي Dendra2 يمكن أن تكون جاهزة للانفجار-يمكن تحويل البروتين من شكله الخضراء بشكله الأحمر بأول الإشعاعية البروتين مع الضوء الأزرق، ومن ثم بالقرب من الأشعة تحت الحمراء الخفيفة18. مجهر على الأجهزة التي تستغل هذه الخاصية يمكن فوتوكونفيرت Dendra2 الخلايا وإذ تعرب عن بطريقة مكانياً محصورة في هياكل الأنسجة 3D المعقدة مع تجنب الكثير من المشاكل لالضيائيه المرتبطة بشديد القرب من الأشعة فوق البنفسجية تشعيع18 , 19 , 20-مع اكتشاف الآلية الجزيئية الكامنة وراء هذه الظاهرة الأخيرة، تم تصميم المتغيرات من العديد من البروتينات الفلورية فوتوكونفيرتيبلي الأخضر إلى الأحمر، بما في ذلك كايد، حتى التي أيضا قادرة على الدخول متوسط معبي 21من الدولة. على حد علمنا، خطوط الزرد المحورة وراثيا حيث يدفع مروج مثل fli1a أو كدرل أو التعبير عن البروتين Dendra2 أو أخرى تستعد البروتينات الفلورية القابلة للتحويل في خلايا بطانية لا تتوفر حتى الآن. ومع ذلك، الخطوط التي تعبر عن Dendra2 أوبيكويتوسلي متوفرة وقد يكون من المفيد في بعض التطبيقات،من 2223.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وأعلن عدم تضارب المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر أن-لور Duchemin ودينيس Duchemin، ناتالي فاجيانيلي وجورتشينكوف باسيل للمساعدة في تصميم وصنع العفن الموصوفة في هذا البروتوكول. وأيده عمل هذه العلاجات (DEQ20140329553)، وكالة الاستخبارات الوطنية (ANR-15-CE13-0015-01، ANR-12-ISV2-0001-01)، البرنامج محقق الشباب التطريز، الجماعة الأوروبية، ن منسق الإغاثة الطارئة CoG ° 682938 افالفي ومن منحة ANR-10-لابكس-0030-إينرت، يديره صندوق الدولة الفرنسية الوكالة الوطنية للبحث تحت دعفينير يشرف البرنامج الإطار المسمى ANR-10-معرض أيدكس-0002-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
