Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für den Ladungszustand Kaede fluoreszierenden Proteins in endokardialen Zellen der lebenden Zebrafischembryo, die es die Verfolgung von endokardialen Zellen während der ventrikulären Kanal und ventrikulären Herz-Ventil-Entwicklung ermöglicht .
Abstract
In der Embryogenese Zellen durchlaufen dynamische Veränderungen der Zelle Verhalten und Entschlüsselung der zellulären Logik hinter diesen Veränderungen ist ein grundlegendes Ziel auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie. Die Entdeckung und Entwicklung von Photoconvertible Proteinen haben unser Verständnis dieser dynamischen Veränderungen durch die Bereitstellung einer Methode auf, um optisch markieren Sie Zellen und Gewebe unterstützt. Jedoch während Ladungszustand, Time-Lapse-Mikroskopie und anschließende Bildanalyse sich sehr erfolgreich bei der Aufdeckung zelluläre Dynamik in Organe wie das Gehirn oder das Auge als haben, diesen Ansatz dient in der Regel nicht in den Entwicklungsländern Herz Herausforderungen durch die schnelle Bewegung des Herzens während der Diastole. Dieses Protokoll besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil beschreibt ein Verfahren zur Photoconverting und anschließend tracking endokardialen Zellen (EDZ) im Zebrafisch ventrikulären Kanal (AVC) und ventrikulären Herz-Ventil-Entwicklung. Die Methode beinhaltet zeitlich stoppen das Herz mit einem Medikament in Reihenfolge für genaue Ladungszustand stattfinden. Herzen sind wieder erlaubt schlagen nach dem Entfernen der Drogen- und Embryonalentwicklung wird normal fortgesetzt, bis das Herz wieder für die hochauflösende Darstellung von Photoconverted EDZ einen Zeitpunkt später Entwicklung gestoppt wird. Der zweite Teil des Protokolls beschreibt eine Analysemethode Bild um die Länge einer Photoconverted oder nicht Photoconverted Region in AVC in jungen Embryonen zu quantifizieren, indem Sie das Fluoreszenzsignal aus der dreidimensionalen Struktur auf eine zweidimensionale Karte zuordnen . Zusammen, die beiden Teile des Protokolls ermöglicht zu prüfen, die Herkunft und das Verhalten von Zellen, aus denen der Zebrafisch AVC und ventrikulären Herzklappe und können potenziell studierst Mutanten, Morphants oder Embryonen, die mit behandelt wurden beantragt werden Reagenzien, die AVC und/oder Ventil Entwicklung stören.
Introduction
Der Zebrabärbling ist derzeit eines der wichtigsten vertebrate Modelle, Zell- und Entwicklungsbiologie Prozesse in Vivozu studieren. Dies ist vor allem wegen der Zebrabärbling optische Transparenz und Hilfsbereitschaft, Genetik, wodurch es ein leistungsfähiges Modell für die Anwendung von optischen Techniken genetisch codierte Photoresponsive Protein Technologien1. Speziell für die Untersuchung der Entwicklung von Herz, Zebrafisch erhalten genügend Sauerstoff durch Diffusion, so dass auch Mutanten ohne Herzschlag durch die ersten Wochen der Entwicklung, überleben können Analysen über die Auswirkungen von Entwicklungsgenen und verstört bei schönem Durchblutung am Herzen Morphogenese in die meisten Wirbeltiere2nicht möglich.
Die Zebrafisch Herz Röhre wird durch 24 Stunden Post Düngung (hpf) gebildet. Kurz nach ihrer Gründung fängt das Herz Rohr aktiv zu schlagen. Von 36 hpf, eine deutliche Einschnürung trennt das Atrium aus dem Ventrikel. Diese Region der Verengung ist ventrikulären Kanal (AVC) und Zellen in dieser Region Änderung von einem Plattenepithelkarzinom Morphologie zu einem quaderförmigen Morphologie3genannt. Zebrafisch ventrikulären Ventil Morphogenese beginnt etwa 48 h post Düngung. Durch 5 Tage nach Befruchtung, zwei Klappensegel erstrecken sich in der AVC und verhindern den Rückfluss des Blutes aus dem Ventrikel in den Vorhof während der Diastole4. Tracking-Zellen bei AVC und Ventil Bildung ist anspruchsvoll, da die schnellen Schläge des Herzens es schwierig macht, Zellen über traditionelle Zeitraffer Mikroskopie5,6folgen. Dieses Protokoll, adaptiert von Ross Et Al., 20167, beschreibt eine Methode, die Tg (Fli1a:gal4FFUbs, UAS:kaede)8 Zebrafisch transgene Linie, in der das Photoconvertible Protein Kaede in ausgedrückt wird Endothelzellen, einschließlich des Endokards. Die Droge 2,3-Butanedione-2-Monoxime (BDM) wird verwendet, um das Herz zu schlagen, so dass genaue Ladungszustand des EDZ zwischen 36 und 55 hpf und hochauflösende Bildgebung des Photoconverted EDZ an bestimmten Entwicklungszeit stellen vorübergehend zu stoppen. Es hat bisher gezeigt, dass EDZ Photoconverted mit dieser Methode für mindestens fünf Tage nach dem Zeitpunkt der Ladungszustand7unterscheidbar von den Unbekehrten Nachbarn bleiben kann. Dieses Protokoll beschreibt auch eine Methode für die Bildanalyse der Photoconverted EDZ in Embryonen, die jünger als 48 hpf, die erfolgreich verwendet wurde, um Gewebe Bewegungen während AVC Entwicklung (Boselli Et Al., im Druck)9folgen. Wir hoffen, dass die Leser dieses Protokoll nützlich finden würde, für AVC und Ventil Entwicklung in normalen Embryonen und Mutanten, Morphants oder Medikament behandelten Embryonen zu studieren. Lesen Sie für eine allgemeinere Protokoll in Bezug auf Zelle Tracking mit Photoconvertible Proteinen während der Zebrafisch-Entwicklung bitte den Artikel von Lombardo Et Al., 2012-10.
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Protocol
1. Vorbereitung Formen und Montage agarose
- Erstellen Sie eine Form mit den Maßen, die in Abbildung 1 mit einem 3D Drucker oder traditionelle mechanische Werkstatt Werkzeuge dargestellt.
- Pipette ca. 1,5 mL geschmolzene 1 % Agarose in eine Schale 35 mm Kunststoff Montage. Legen Sie den Kunststoff-Formenbau in die flüssige Agarose, kümmert sich um Trapping Luft zwischen der Form und der Agarose zu vermeiden. Legen Sie die Schale bei 4 ° C, warten Sie, bis die Agarose härtet (Dies dauert ca. 5 min.), dann entfernen Sie die Kunststoff-Formenbau.
- Um die Montage Schüssel für die spätere Verwendung zu speichern, bedecken Sie die Schüssel mit dem Deckel, dann wickeln Sie die Schale und den Deckel mit Parafilm fest. Die Montage-Schüssel kann dann gespeichert werden Deckel Seite nach unten bis zu 5 Tage bei 4 ° C.
- Bereiten Sie im Voraus 1 mL Aliquots von 0,7 % niedriger Schmelzpunkt Agarose in 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen, am Tag der Montage zu verwenden.
Hinweis: Die Agarose-Brunnen der Montage Schale werden im Laufe der Zeit verformen, wie Wasser verdunstet, wenn Parafilm nicht die Gerichte fest gewickelt ist.
2. Gewinnung Embryonen für den Ladungszustand
- Incross Tg (Fli1a:gal4FFUbs, UAS:kaede) Linie und wachsen etwa 200 Embryonen im Embryo Medium im Dunkeln bei 28,5 ° C. Weitere Informationen zum Zebrafisch Linien kreuzen finden Sie in der Jupiter Science Education Database11.
- Nach 5 h, aber vor 24 h behandeln Embryonen mit 1-Phenyl-2-Thioharnstoff (PTU) Pigmentbildung verhindern (0,003 % PTU im Embryo Medium).
- Ca. 1 h vor dem Start der Ladungszustand, Bildschirm Embryonen unter einem fluoreszierenden Stereoskop und wählen Sie 5 gesunde Embryonen angezeigt, die die hellsten grün fluoreszieren zum Ausdruck bringen. Niedriger Intensität Licht bei der Visualisierung von Embryonen wird empfohlen, um die Embryonen zu Umgebungslicht zur Vermeidung von Photoconverting Kaede in unspezifischen Zellen vermeiden.
3. einbetten
- 10 mL Montage Medien vorbereiten: 0,02 % Tricaine und 50 mM BDM Embryo Medium.
- Die Montage-Schale 2 mL Eindeckmedium hinzu und lassen Sie 15-30 min für die Lösung in der Agarose verbreiten.
- In der Zwischenzeit schmelzen Sie eine 1 mL-aliquoten von 0,7 % niedriger Schmelzpunkt (LMP) Agarose indem man das Rohr in einem Heizblock 70 ° C für ca. 5 Minuten.
- Warten auf die LMP-Agarose etwas abkühlen lassen, dann das Rohr des niedrigen Schmelzpunktes Agarose 25 µL 8 mg/mL Tricaine Lösung und 40 µL 1M BDM-Lösung hinzufügen. Mix von oben und unten, Pipettieren übertragen dann das Rohr auf 38 ° C Hitze Block die LMP-Agarose in seinem flüssigen Zustand zu halten.
- In einer Petri dish mit Embryo Medium, sorgfältig Dechorionate der vorgewählten Embryos unter dem Stereomikroskop mit Pinzette, kümmert sich nicht um die Embryonen zu beschädigen.
- Übertragen Sie die Embryonen auf eine separate Schale mit 2 mL Montage Medien.
- Wenn das Herz des Embryos gestoppt werden (dauert ca. 5-10 min.), Transfer der Embryonen, die Montage-Speise- und arrangieren Embryonen in den Vertiefungen mit Pinzette, so dass sie in einem Winkel von 25 Grad liegen tails in Richtung der tiefere Teil des Brunnens, Eigelb nach oben zeigt.
- Wenn Embryonen sind etwa vorhanden, entfernen Sie das Medium, die Embryonen in ~ 200 µL 0,7 % LMP Agarose, Tricaine und BDM enthält einbetten und Nachjustieren der Embryonen Positionen, kippen die Embryonen nach links oder rechts als notwendig.
- Warten Sie, bis die LMP-Agarose-Sets (dauert ca. 5 min.), dann das Gericht fügen Sie Eindeckmedium hinzu. Die Embryonen sind jetzt bereit, Photoconverted zu sein.
Hinweis: Die Tricaine und das BDM sind die Embryonen zu betäuben und die Embryonen Herz bzw. stoppen verwendet. Montage-Medien können am Vortag Bildgebung vorbereitet werden, aber achten Sie darauf, die Medien vor Licht zu schützen.
Hinweis: Die korrekte Positionierung der Embryonen ist wichtig, einen freie Laser-Pfad zu den Zellen zu erlauben, die man zu Photoconvert wünscht. Positionieren Sie den Kopf des Embryos in der Nähe der Start des Brunnens, so dass Laserlicht nicht weit reisen, um den Embryo zu erreichen und damit die Embryonen nach Ladungszustand leicht ausgehängt werden können.
4. Ladungszustand
- Auf eine aufrechte confocal Mikroskop (wie Leica SP8) ausgestattet mit einem 405 nm, 488 nm und 561 nm Laserquelle, lokalisieren den Embryo ist weißes Licht (Hellfeld) und einem Objektiv übertragen mit Herz (wie Leica HCX IRAPO L, 25 × N.A 0,95 Ziel). Suchen Sie nach roten Kaede Fluoreszenz mit dem 561 nm Laser (d.h. 561 DPSS Laser, bei ~ 5 % Intensität, Detektor bei 589-728 nm eingestellt). Dann visualisieren des Endokards mit 488 nm-Laser (d.h. 30 mW mehrzeilige Argon-Laser bei ~ 5 % Intensität, Detektor auf 502-556 nm eingestellt).
- Geben Sie "FRAP" Modus auf das Mikroskop-Datenerfassungs-Software. Wählen Sie ~ 1 % Laserleistung für beide 488 nm und 561 nm Laser.
- Konzentrieren Sie sich auf der Ebene von Interesse, wählen Sie eine Region of Interest (ROI) aus, dann auf 25 % Laserleistung, Scannen über den ROI dreimal Photoconvert Zellen unter Verwendung von 405 nm-Diode laser. Unzureichende Kaede Photoconverted im ROI sein sollte, wiederholen Sie den Scanvorgang 405 nm-Laser über die Fläche dreimal. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle ROIs.
- Die Software in den Modus "TCS SP8" Rendite und erwerben einen Z-Stack, mit Hilfe der 561 nm und 488 nm Laser gegenüber dem Vorquartal. Achten Sie darauf, wählen Sie die Option "bidirektionale" bildgebende Geschwindigkeit zu erhöhen.
Hinweis: Wie lange es dauert, um Photoconvert und Bild jedes Embryo variiert. Herzschlag ist bekannt für normale Herz-Ventil Entwicklung wichtig sein, so vermeiden halten das Herz für mehr als 30 min beendet, auch wenn es bedeutet, dass Sie keine Zeit zum Photoconvert haben alle 5 Embryonen.
Hinweis: Bei der Ladungszustand Verwendung PMT-Detektoren, während nach Ladungszustand, empfiehlt es, Hybrid-Detektoren setzen auf 'zählen' Modus zu verwenden. Dies ist da die Hybrid-Detektoren empfindlicher sind und sind in der Lage, bessere Bildqualität, aber werden leicht durch übermäßige beschädigt.
5. Demontage Photoconverted Embryonen
- Verwenden Sie nach Ladungszustand eine Glaspipette, um nach unten zu drücken, nur leicht über dem Kopf des Embryos zu brechen die LMP-Agarose, dann sanft saugen auf den Embryo.
- Auswerfen des Embryos aus der Glaspipette in einer 35-mm-Petrischale mit Embryo Medium mit PTU (um abzuwaschen BDM mit Medium).
- Übertragen Sie den Embryo zu einem Brunnen in einem 6-Well-Platte mit Embryo Medium mit PTU. Während dieses Schrittes geht achten Sie darauf, die Kenntnis von dem Embryo zu halten in die nun, wie dies wichtig ist, die Position der Photoconverted Zellen in später Entwicklungsstadien korrelieren.
- Nun, da die Embryonen aus dem BDM enthaltenden Medium entfernt sind, sollten ihre Herzen fangen schlagen und wieder in ca. 5 min. Return Embryonen an die Dunkelheit bei 28,5 ° C erlauben Embryonen weiterhin normal entwickeln.
6. Bildgebung Photoconverted Zellen später embryonalen Stadium
- Zum gewünschten Zeitpunkt stoppen Sie das Herz zu und erneut Betten Sie die Embryonen wie unter Schritt 3 dieses Protokolls ein, mit dem entscheidenden Unterschied, dass Embryonen mit BDM in separaten, markierte Gerichte zu verfolgen Embryonen behandelt werden müssen.
- Für Embryonen bis zu 62 hpf, erwerben Z-Stapel des Endokards mit 561 nm und 488 nm für Rot und grün fluoreszierenden signalisiert, beziehungsweise. Für Embryonen in Phasen älter als 62 hpf, verwenden Sie einen Multiphoton laser-Satz auf 940 nm grün Kaede anstelle von 488 nm Laser Image.
(7) Bildanalyse für Embryonen unter 48 hpf
Bemerkung: Gewebe Bewegungen von der AVC kann schwierig, aufgrund seiner komplexen dreidimensionalen Struktur zu analysieren. Um die Länge einer Photoconverted Region in AVC zwischen zwei nicht-Photoconverted-Regionen oder die Länge einer nicht-Photoconverted-Region in der AVC zwischen beiden Photoconverted Regionen zu quantifizieren, es kann wünschenswert sein, die dreidimensionale Struktur auf Karte ein zweidimensionale Karte. Bilder von Photoconverted Embryonen gewonnen vor 48 hpf kann mithilfe der folgenden Methode analysiert werden.
- Importieren Sie die aufgenommenen Bilder in Matlab oder ähnliche Software.
- Valencianischen Sie manuell den ROI, d. h. die Endokards und tragen Sie eine Maske um das Signal außerhalb dieser Region zu entfernen.
- Tragen Sie einen Schwellenwert für die Intensität auf das Bild, um die Punkte auf den Endokards zu identifizieren und Plotten sie in drei Dimensionen. Isolieren Sie die Punkte entsprechend der schmalste und am geraden Teil der AVC durch Löschen manuell kein Sehenswertes auf das Atrium und die Herzkammer mit dem Löschbefehl in der Software.
- Verwenden Sie einen Zylinder um die Punkte, die den so erhaltenen AVC passen.
- Definieren Sie ein Bezugssystem um mehrere Proben zu vergleichen. Beispielsweise übernehmen Sie den Massenmittelpunkt der AVC-Punkte als der Ursprung des Bezugssystems und die Achse des Zylinders als die z-Achse ausgestattet.
- Stellen Sie sicher, dass die positive Z-Positionen immer auf der gleichen Seite des Herzens (ventrikuläre oder Vorhofflimmern) entsprechen.
- Die AVC Projektpunkte auf der X-y-Ebene und verwenden Sie eine Ellipse zu ihnen passen.
- Drehen Sie die endokardialen Punkten um die z-Achse, so dass die Hauptachse der Ellipse und die y-Achse des Bezugssystems sind parallel und positive y-Werte der inneren Seite des AVC in Bezug auf den Embryo entsprechen.
- Um die AVC zu segmentieren, schneiden Sie das dreidimensionale Dataset mit einige Flugzeuge erhalten durch Drehen der Halbebene {y = 0, X > 0} in Z-Richtung.
- Projizieren Sie die Intensität der benachbarten Pixel auf diese Ebenen und definieren Sie das Endothel in konsistenter Weise zu. Z. B. manuell eine Linie aus dem Vorhofflimmern ventrikuläre neben der AVC auf halbe Stärke des Endothels.
- Interpoliert die Punkte der Linien repräsentieren das Endothel mit einer dreidimensionalen Spline mit der Spline Toolbox AVC mit einer Oberfläche dargestellt.
Hinweis: Die Anzahl der die Schnittebenen bestimmt sowohl die Genauigkeit der Segmentierung und den Verbrauch von diesem Schritt. 8 Flugzeuge sind in der Regel genug, um gute Ergebnisse zu erzielen.
- Legen Sie die azimutale Position jedes Punktes auf der AVC-Oberfläche unter Verwendung von zylindrischen Koordinaten.
- Definieren Sie an jede azimutale Position eine parametrische Kurve entlang der Oberfläche der AVC durch die Berechnung der Bogenlänge auf der Oberfläche zwischen aufeinander folgenden Punkten.
- Definieren Sie für jede parametrische Kurve den Punkt auf der Kurve am nächsten an der Mitte der AVC auf Null. Die Punkte der AVC sind somit vollständig durch ihre azimutale Position und ihre Position auf die parametrische Kurve beschrieben.
- Entfalten Sie die AVC in ein zweidimensionales Bild mithilfe der parametrischen Position der Punkte.
- Finden Sie die Kanten der Region, wie die Kanten der Schnittstellenüberwachung binäres Bild das Verhältnis der Intensitäten von der Photoconverted und der nicht-Photoconverted-Kanäle zu quantifizieren. Korrigieren Sie das Ergebnis bei Bedarf manuell.
- Berechnen Sie die Bogenlänge zwischen den Kanten die Länge des Gewebes als Funktion der azimutale Position berechnen.
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Representative Results
Ein Beispiel für ein Embryo Photoconverted um 48 hpf und wieder bei 80 hpf ist in Abbildung 2, Filme 1 und 2dargestellt. Kaede irreversibel 405 nm Licht aussetzen in Bezug auf ihre differentiell farbigen Konvertiten aus dem Protein aus seiner fluoreszierende grüne Form, fluoreszierende rote Form, damit das Verhalten von Zellen mit entweder grün oder ihre rote Form mit einzuhaltenden beschriftet Nachbarn bei Ventil-Bildung. Es ist ersichtlich, dass die paar Photoconverted Zellen 48 hpf-AVC später vermehrt und später vorwiegend auf der einen Seite die Ventil-Merkblatt residierten.
Ein Beispiel für die Ergebnisse, die erreicht werden kann, mit der Bild-Analysemethode beschrieben auf einem 36 hpf-Embryo nach Photoconverting EDZ im Atrium und in der Herzkammer in Abbildung 3dargestellt ist. Die Segmentierung der AVC ermöglicht die Parametrisierung der dreidimensionalen Struktur, die dann in zwei Dimensionen zum leichteren Visualisierung und Analyse projiziert wird. Die Methode erlaubt es, den Abstand zwischen den beiden Photoconverted Regionen zu quantifizieren. Durch Wiederholen dieses Prozesses zu unterschiedlichen Entwicklungsstörungen Zeiten ist es möglich, die Wanderung von Zellen in Richtung der AVC (Boselli Et Al., im Druck)9zu studieren.
Abbildung 1 : Werkzeug zur Erstellung von Agarose-Brunnen. (A) Frontansicht. B) Ansicht von hinten. C-D) Seitenansichten. E-F) Schrägen Ansichten. Abmessungen sind in Millimetern angezeigt. Die. STL-Datei für die Form-Vorlage ist in den ergänzenden Materialien zur Verfügung gestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Repräsentative Ergebnisse von einem Tg (Fli1a:gal4FFUbs, UAS:kaede) Photoconverted embryonale Herz. A) das embryonale Herz kurz nach Ladungszustand bei 48 hpf. Zytoplasmatischen Kaede in mehrere Zellen von der überlegenen Seite der AVC wurde von der grünen Form in seine rote Form umgewandelt. B) der gleichen Embryo bei 80 hpf. Es kann gesehen werden, die zuvor Photoconverted Zellen haben sich stark vermehrt und sind gekommen, um in die innere Seite des überlegenen ventrikulären Ventils befinden. Skalieren von Balken: 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Repräsentative Ergebnisse des Analyseprozesses Bild auf einem 36 hpf-Embryo. (A) das Ergebnis der dreidimensionalen Segmentierung der AVC in einem Bezugssystem, die häufig zwischen den Embryonen; das Signal vom Photoconverted (Magenta) und nicht-Photoconverted (grün) Kaede wird auf die Oberfläche projiziert und markiert die Regionen Photoconverted und nicht Photoconverted. B) der AVC ist entsprechend der parametrischen Position von seiner Stelle entfaltet und das Signal wird voraussichtlich in zwei Dimensionen für einfacher Visualisierung. Die Kanten der nicht-Photoconverted-Region sind in weiß beschriftet. C) die Länge des nicht-Photoconverted-Region ist in Abhängigkeit von der Winkelposition aufgetragen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Film 1: das embryonale Herz kurz nach Ladungszustand bei 48 hpf. Im Zusammenhang mit Figur 2A. Der Film geht durch den erworbenen Z-Stapel des 48 hpf-Embryos, dargestellt in Abbildung 2A Z-Scheibe von Z-Scheibe. Nur eine Z-Ebene wurde während des Prozesses der Ladungszustand gewählt, aber es kann hier gesehen werden, dass Zellen in verschiedenen Tiefen Photoconverted gewesen sein. Z-Scheiben sind Abstand 2 µm auseinander. Rechts klicken und diesen Film downloaden.
Movie 2: das Photoconverted embryonale Herz bei 80 hpf. In Bezug auf Abb. 2 b. Der Film geht durch den erworbenen Z-Stapel des 80 hpf-Embryos, dargestellt in Abbildung 2 b -Z-Scheibe von Z-Scheibe. Z-Scheiben sind Abstand 2 µm auseinander. Rechts klicken und diesen Film downloaden.
Ergänzende Datei: In Bezug auf Abbildung 1. Die. STL-Datei für die Form-Vorlage. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Timing der Ladungszustand: Obwohl Kaede bleibt hell ausgedrückt im EDZ sogar bei 96 hpf, ist anzumerken, dass der Embryo wächst, Laser-Licht mehr diffundiert bevor es die AVC, erschweren die engen Ladungszustand der Kaede erreicht. Bei embryonalen Stadien spätestens 55 hpf, Ballonfahren der Ventrikel und Atrium bedeutet auch, dass die violetten Laserstrahl verwendet für Ladungszustand AVC Zellen ohne ersten Durchgang durch die Atrium oder Ventrikel erreichen kann. Dies bedeutet, dass über 55 hpf, um zu Photoconvert EDZ der AVC muss man auch Photoconvert zusätzliche EDZ in den Vorhof und Ventrikel.
BDM und Tricaine: genaue Ladungszustand des EDZ erfordert vorübergehend stoppen das Herz von Schlägen. BDM (2,3-Butanedione Monoxime) ist ein Elektro-kontraktilen Entkuppler, das Unterdrücken des Herzmuskels Kontraktion12bekannt ist. Nicht beobachten wir Unterschiede zwischen der Morphologie der Embryonen, die dieses Protokoll unterzogen wurden, und Embryonen, die normalerweise wachsen und haben nicht hatte ihr Herz für die Bildgebung gestoppt. Allerdings bleibt das Risiko, dass die medikamentöse Behandlung ist normale Entwicklung13geändert. Konzentrierte Tricaine kann auch verwendet werden, die Herzen14vorübergehend zu stoppen. Wir finden, dass wir effektiv das Herz zu stoppen, indem man Embryonen in Embryo Medium mit 0,32 % Tricaine für 1 min und das Herz in seinen Zustand durch die Übertragung der Embryonen Embryo Medium mit 0,16 % Tricaine zu erhalten. Ähnlich wie bei der BDM-Behandlung, das Herz kann gestoppt werden auf diese Weise für 30 min und Herzschlag lässt sich innerhalb von 5 min nach der Rückkehr von Embryonen in normalen Embryo Medium zurück. Höhere Konzentrationen von Tricaine sollte vermieden werden; niedrige Konzentrationen von Tricaine über einen längeren Zeitraum (h/Tage) nachweislich Einfluss auf normale Embryonalentwicklung15,16. Tricaine Lösung fürs Herzen verwendet wird am besten frisch zubereitet. Wenn gefrorene Aliquote verwendet werden, stellen Sie sicher die Lösung gut vor Licht geschützt zu halten und die Tricaine Auftauen ohne Heizlösung über 30 ° C. Schließlich wurde Blebbistatin gemeldet, das Herz ohne schwere Nebenwirkungen13aufhören. Wir haben nicht diese letzte Methode in unserem Labor getestet.
Montage und Demontage: korrekte Positionierung der Embryonen während der Ladungszustand kritisch ist. Die Form für die Herstellung von Agarose Brunnen erleichtert die Montage von Embryonen, derart, dass die anterior-posterioren Achse des Embryos konsequent bei 25 ° c im Verhältnis zu der Oberfläche der Schale liegt. Wir haben dem Werkzeug für Ladungszustand anwendbar auf allen Entwicklungsstufen zwischen 36 und 55 hpf gefunden. Bei der Montage muss die Neigung des Embryos in der links-rechts-Richtung angepasst werden, je nach Entwicklungsstadium des Embryos und den Bereich, den man Photoconvert will. Z. B. in Photoconvert die AVC bei 36 hpf, der Embryo sollte ungefähr 15° nach links, während bei 55 Gesicht hpf, der Embryo sollte zeigen etwa 10° nach links. Sie sollten unter dem Stereomikroskop um die AVC unverdeckt durch die Herzkammer oder das Atrium zu sehen. Wenn zum Beispiel das Atrium über den AVC liegt, wäre es nicht Photoconvert nur die AVC oder nur das Atrium möglich. Für imaging-Zwecke, wird die gleiche Form verwendet, um Embryonen zwischen 36 und 96 hpf positionieren. Die Form konnte mit einer Vielzahl von Materialien mithilfe eines 3D-Druckers oder traditionelle mechanische Werkstatt Werkzeuge hergestellt werden. Edelstahl oder chemische und Hitze kältebeständigem Kunststoff sind beide geeigneten Materialien. Der Leser möchte den Schimmel mit einem 3D-Drucker erstellen, finden Sie ergänzende Informationen für die. STL-Datei der Form Vorlage.
Ausreichende LMP hinzufügen wird Agarose zur Deckung des gesamten Embryos empfohlen, um sicherzustellen, dass die Embryonen nicht verdrängt zwischen Montage und Ladungszustand/Imaging, vor allem, wenn das Mikroskop nicht direkt neben dem Montage-Bahnhof befindet. In der Regel unter der Voraussetzung, dass die Embryonen richtig montiert sind, klebt LMP Agarose nicht an den Embryonen nach aushängen. Jedoch sollten einige LMP Agarose bleiben stecken auf den Embryo kann die LMP-Agarose durch sanft Hänseleien des Embryos aus der Agarose mit Pinzette entfernt werden.
Embryonen, vor allem Embryonen weniger als 48 hpf, kann leicht beschädigt werden, während der Montage und Demontage. Für weniger als 48 Embryonen hpf, empfehlen wir Feuer Polieren zum Jahresende die Glaspipette schädliche Embryonen bei Pipettieren zu verhindern.
Mikroskop: dieses Protokolls erfolgte mittels einer Leica SP8-Mikroskop. Jedoch Ladungszustand ist ein etabliertes Verfahren und dieses Protokoll sollte leicht umsetzbaren, andere aufrechte Mikroskope, ausgestattet mit Laser in der Lage, 405 nm, 488 nm und 561 nm Licht. Für Embryonen bis zu 62 hpf, Bilder mit einem Argonlaser Erregung und 561 DPSS Laser für grüne und rote Kaede, bzw. erworben wurden. Für Embryonen in Phasen älter als 62 hpf, grün Kaede begeistert sein kann, mit einem multiphoton Laser setzen auf 940 nm, was eine größere Eindringtiefe als 488 nm Licht hat. In der Theorie rote Kaede sollte ein zwei-Photon Erregung Spektren ähnlich dem von DsRed haben, und könnte bei 950 nm17abgebildet werden.
Eine Objektiv mit hoher numerischer Apertur ist notwendig, um effizient Photoconvert EDZ und hochauflösende Bilder zu erwerben. Da die Embryonen in den Medien gehalten werden, ist es wichtig, ein Mikroskop, ausgestattet mit einem Wasser-Objektiv zu wählen.
Photoconverting der Region von Interesse: Es ist ratsam, konservativ zu sein, bei der Auswahl des ROI zu Photoconvert - 405 nm Laser diffundiert wie es durch Gewebe und können Photoconvert Zellen in einem Bereich größer ist als die ausgewählt reist. Wenn zum Beispiel Sie möchte die Zelle direkt neben grün bleiben aber eine Zelle rot kennzeichnen möchten, kann es ratsam, nur der Teil der Zelle liegen weiter entfernt von der angrenzenden Zelle als Ihren ROI zu wählen sein. Da Kaede im Zytoplasma der EDZ ausgedrückt wird, wird Photoconverted Protein auf Teile der Zelle von der ROI nicht ausgewählt diffundieren.
Immunofluoreszenz und Phototoxizität: The Kaede Protein, grünen und roten Formen, ist extrem hell und Immunofluoreszenz ist in der Regel kein limitierender Faktor in Zelle tracking-Experimente. Jedoch Laserlicht kann beeinträchtigen Embryonalentwicklung und minimiert werden, vor allem während der frühen Stadien der Entwicklung. Zeichen der Phototoxizität sind Entwicklungsverzögerung und in schweren Fällen, unsachgemäße Herz looping und fehlerhafte Ventile.
Die Kraft der violetten Laser (25 %) und die Anzahl der Iterationen der violette Laser über den ROI scannt (3 - 6 Mal) in diesem Protokoll verwendeten wurden empirisch ermittelt. Bei diesen Einstellungen sahen wir fast vollständige Umstellung von Kaede aus dem Grün auf rot Form ohne deutliche Entwicklungsverzögerung. Die Höhe der Laserleistung in andere Mikroskopie-Setups erforderlich würde die Laserintensität abhängen. Es sei darauf hingewiesen, dass rot aus Kaede durch intensive 405 nm Beleuchtung, gebleicht werden kann, also länger Ladungszustand nicht unbedingt mehr rote Fluoreszenz erbringt.
Bildanalyse: die Methode vorgeschlagen, für die Bildanalyse ist ein neu entwickelter Prozess beschreiben die dreidimensionale Geometrie der AVC und unter Embryonen zu vergleichen. Monolage röhrenförmigen Strukturen, wie z. B. die AVC vor 48 zugewiesen werden soll hpf und möglicherweise das Herz Rohr und der dorsalen Aorta. Es ist vor allem automatisch, obwohl die Segmentierung auf die Schnittebenen manuell durch den Benutzer erfolgt und andere Schritte könnte möglicherweise manuellen Korrektur erfordern. Die manuelle Segmentierung ist den wichtigsten Teil des Prozesses, da Kenntnisse der Struktur Geometrie und Ausbildung sind notwendig, um gute Ergebnisse zu erzielen. Nach dem üben, ist der Zeitaufwand für diesen Schritt erheblich reduziert.
Das hier beschriebene Protokoll bietet eine effektive Möglichkeit, endokardialen Gewebe Bewegungen während der AVC und ventrikulären Herz-Ventil-Entwicklung unter Verwendung der Tg (Fli1a:gal4FFUbs, UAS:kaede) Zebrafisch transgenen Linie zu verfolgen.
Derzeit ist eine der wichtigsten Einschränkungen dieser Methode, dass die violetten Laserstrahl ist nicht in der axialen Dimension beschränkt. Dies erschwert Angriffe auf einzelne Zellen für Ladungszustand, und daher klonalen Analysen und Einzelzelle tracking. Vor zwei Jahren entdeckte man, dass das Photoconvertible-Protein, das Dendra2 grundiert werden umgewandelt – das Protein kann von der grünen Form seiner roten Form konvertiert werden durch die erste Bestrahlung das Protein mit blauem Licht, und dann mit Nah-Infrarot-Licht18. Mikroskop-Setups, die diese Eigenschaft nutzen können Photoconvert Dendra2 mit dem Ausdruck ihrer Zellen in einer räumlich begrenzten Weise in komplexen 3D Gewebestrukturen unter Vermeidung vieler Phototoxizität Probleme im Zusammenhang mit intensiver in der Nähe von UV-Bestrahlung18 , 19 , 20. mit der jüngsten Entdeckung des molekularen Mechanismus hinter diesem Phänomen haben Varianten von vielen Photoconvertible grün-rot fluoreszierende Proteine, einschließlich Kaede, ausgeführt worden, so dass auch in der Lage eine grundierte Zwischenprodukt entstehen Stand21. Zebrafisch transgenen Linien wo Förderer wie fli1a oder Kdrl treibt die Expression des Proteins Dendra2 oder andere grundiert Cabrio fluoreszierende Proteine in Endothelzellen sind unseres Wissens noch nicht verfügbar. Jedoch Dendra2 ubiquitär express Linien stehen zur Verfügung und können nützlich in bestimmten Anwendungen 22,23.
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Disclosures
Kein Interessenkonflikt erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten danken Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli und Basile Gurchenkov für die Hilfe, konstruieren und fertigen die Form, die in diesem Protokoll beschrieben. Diese Arbeit wurde von der Europäischen Gemeinschaft, ERC CoG N ° 682938, EMBO Young Investigator Program, die ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), FRM (DEQ20140329553) unterstützt Evalve und geleitet durch den Zuschuss ANR-10-LABX-0030-INRT, ein französischer Staatsfonds die Agence Nationale De La Recherche unter dem Rahmen Programm Investissements Avenir beschriftet ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
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