Summary
Este protocolo describe un método para la photoconversion de Kaede proteína fluorescente en células endocárdicos de la vida del embrión de pez cebra que permite el seguimiento de células del Canal auriculoventricular durante canal atrio-ventricular y el desarrollo de la válvula auriculoventricular del corazón .
Abstract
Durante la embriogénesis, las células se someten a cambios dinámicos en el comportamiento de la célula, y descifrar la lógica celular detrás de estos cambios es una meta fundamental en el campo de la biología del desarrollo. El descubrimiento y desarrollo de proteínas de photoconvertible han ayudado grandemente nuestra comprensión de estos cambios dinámicos al proporcionar un método para resaltar ópticamente las células y tejidos. Sin embargo, mientras que photoconversion, Time-lapse microscopía y análisis posteriores han demostrado para ser muy exitosa en descubrir dinámica celular en órganos como el cerebro o el ojo, este enfoque generalmente no se utiliza en pleno desarrollo debido a desafíos planteados por el rápido movimiento del corazón durante el ciclo cardíaco. Este protocolo consta de dos partes. La primera parte describe un método para photoconverting y posteriormente seguimiento de células del Canal auriculoventricular (EdCs) en pez cebra canal auriculoventricular (CAV) y el desarrollo de la válvula auriculoventricular del corazón. El método consiste en detener temporalmente el corazón con una droga en orden para photoconversion exacto lugar. Corazones están autorizados a reanudar la paliza sobre retiro de la droga y el desarrollo embrionario continúa normalmente hasta que el corazón está parado otra vez para la proyección de imagen de alta resolución de photoconverted EdCs en un punto del tiempo de desarrollo más adelante. La segunda parte del protocolo describe un método de análisis de imagen para cuantificar la longitud de una región photoconverted o no photoconverted en el AVC en embriones jóvenes mediante la asignación de la señal fluorescente de la estructura tridimensional en un mapa bidimensional . Juntas, las dos partes del protocolo permite examinar el origen y el comportamiento de las células que conforman el pez cebra AVC y válvula auriculoventricular del corazón y potencialmente puede aplicarse para el estudio de mutantes, morphants o embriones que han sido tratados con reactivos que interrumpen el desarrollo AVC o válvula.
Introduction
El pez cebra es actualmente uno de los más importantes modelos vertebrados para estudiar los procesos celulares y de desarrollo en vivo. Esto es en gran parte debido a la transparencia óptica de pez cebra y receptividad a la genética, que es un potente modelo para la aplicación de técnicas ópticas genéticamente codificado photoresponsive proteína tecnologías1. Específicas para el estudio del desarrollo del corazón, pez cebra recibe suficiente oxígeno por difusión que incluso mutantes sin latidos del corazón pueden sobrevivir a través de la primera semana de desarrollo, que permitan el análisis de los efectos de los genes del desarrollo y perturbado flujo de sangre en la morfogénesis del corazón no es posible en la mayoría vertebrados2.
El tubo de corazón de pez cebra está formado por 24 horas post fecundación (hpf). Poco después de su formación, el tubo del corazón comienza batiendo activamente. Por 36 hpf, una clara constricción separa la aurícula del ventrículo. Esta región de constricción se llama el canal auriculoventricular (CAV) y las células en esta región el cambio de una morfología escamosa a una morfología cuboidal3. Pez cebra válvula auriculoventricular morfogénesis se inicia alrededor de 48 h post fertilización. 5 días post fertilización, dos valvas se extienden al AVC y prevenir el flujo retrógrado de sangre desde el ventrículo a la aurícula durante el ciclo cardíaco4. Seguimiento de las células durante la formación de AVC y la válvula es un reto como el latido rápido del corazón hace que sea difícil seguir las células vía microscopia Time-lapse tradicional5,6. Este protocolo, adaptado de Steed et al., 20167, describe un método que utiliza la Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 pez cebra transgénica línea, en la que la proteína de photoconvertible Kaede se expresa en células endoteliales, incluyendo el endocardio. La droga 2, 3-butanedione-2-monoxima (BDM) se utiliza para detener temporalmente el corazón latiendo, lo que permite photoconversion exacta de EdCs entre 36 y 55 hpf y proyección de imagen de alta resolución de photoconverted EdCs en momentos específicos de desarrollo. Se ha demostrado previamente que EdCs photoconverted utilizando este método puede seguir siendo distinguible de sus vecinos inconversos durante cinco días o más después del tiempo de photoconversion7. Este protocolo también detalla un método utilizado para el análisis de la imagen de photoconverted EdCs en embriones menores de 48 hpf, que se ha utilizado con éxito para seguir movimientos de tejido durante el desarrollo de AVC (Boselli et al., en prensa)9. Esperamos que los lectores encontrarán este protocolo útil para el estudio de AVC y válvula de desarrollo de embriones normales y mutantes, morphants o embriones tratados con drogas. Para un protocolo más general sobre rastreo de celulares usando photoconvertible proteínas durante el desarrollo del pez cebra, vea por favor el artículo por Lombardo et al., 201210.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparación de moldes y montaje agarosa
- Crear un molde con las dimensiones indicadas en la figura 1 utilizando una impresora 3D o herramientas de taller mecánico tradicional.
- Pipetee aproximadamente 1,5 mL de agarosa 1% fundido en un plato de montaje plástico 35 mm. Colocar el molde de plástico en la agarosa líquida, teniendo cuidado de evitar atrapar aire entre el molde y la agarosa. Coloque el plato a 4 ° C, espere hasta que la agarosa endurece (esto toma alrededor de 5 minutos), luego retire el molde de plástico.
- Para guardar el plato de montaje para su uso posterior, cubrir el plato con su tapa y, a continuación, envuelva el plato y la tapa con parafilm. Luego puede almacenarse el plato de montaje lateral de la tapa hacia abajo hasta 5 días a 4 ° C.
- Prepara con antelación alícuotas de 1 mL de agarosa de bajo punto de fusión de 0,7% en 1,5 mL tubos Eppendorf para usar en el día de montaje.
Nota: Los pozos de agarosa del plato de montaje se deformen con el tiempo como el agua se evapora si parafilm no envuelve los platos bien.
2. obtención de embriones para la Photoconversion
- Incross Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) línea y crecen aproximadamente 200 embriones en medio del embrión en la oscuridad a 28,5 ° C. Para obtener más información sobre cómo cruzar líneas de pez cebra, consulte la base de datos educación ciencia de JoVE11.
- Después de 5 h, pero antes de 24 h, tratamiento de embriones con la 1-fenil-2-tiourea (PTU) para evitar la formación de pigmento (0.003% PTU en medio del embrión).
- Sobre 1 h antes del comienzo de photoconversion, pantalla embriones bajo un estereoscopio fluorescente y seleccionarlos embriones sanos 5 parecen expresar la fluorescencia verde brillante. Se recomienda el uso de luz de baja intensidad al visualizar los embriones para evitar la exposición de los embriones a la luz ambiente para evitar photoconverting Kaede en células no específicas.
3. incrustar
- Preparar 10 mL de medio de montaje: Metanosulfonato de 0,02% y el 50 mM BDM en medio embrión.
- Añadir 2 mL de medio de montaje en el plato de montaje y permite 15-30 min de la solución que se difunden en la agarosa.
- Mientras tanto, derrita una alícuota de 1 mL de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) de 0,7% colocando el tubo en un bloque de calor de 70 ° C durante aproximadamente 5 minutos.
- Espere la agarosa de la LMP se enfríe un poco, luego añada 25 μl de solución de metanosulfonato de 8 mg/mL y 40 μl de solución de 1 M de la BDM al tubo de agarosa de bajo punto de fusión. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo, luego transferir el tubo a un bloque de 38 ° C de calor para mantener la agarosa de la LMP en su estado líquido.
- En una Petri dish con medio embrión, dechorionate cuidadosamente los embriones previamente seleccionados bajo el estereomicroscopio con unas pinzas, procurando no para dañar los embriones.
- Transfiera los embriones a un plato separado que contiene 2 mL de medio de montaje.
- Cuando se detuvo el corazón de los embriones (tarda unos 5-10 min), colas de transferencia los embriones para el montaje del plato y colocar los embriones en los pozos con unas pinzas que se encuentran en un ángulo de 25 grados, apuntando hacia la parte más profunda del pozo, yema mirando hacia arriba.
- Cuando embriones son más o menos en su lugar, eliminar los medios de comunicación, integrar los embriones en ~ 200 μL de agarosa LMP de 0,7% que contiene Metanosulfonato y BDM y reajustar la posición de los embriones, inclinando los embriones a la izquierda o derecha según sea necesario.
- Espere a que los conjuntos de agarosa LMP (tarda unos 5 minutos), luego agregar medio de montaje en el plato. Los embriones están ahora listos para ser photoconverted.
Nota: El Metanosulfonato y el BDM se utilizan para anestesiar los embriones y para detener el corazón de los embriones, respectivamente. Medios de montaje se pueden preparar el día antes de la proyección de imagen, pero no se olvide de proteger los medios de comunicación de la luz.
Nota: La correcta colocación de los embriones es importante para permitir un camino claro láser a las células que se desea photoconvert. Coloque la cabeza del embrión cerca de la salida del pozo para que la luz láser no tiene que viajar lejos para llegar hasta el embrión, y para que los embriones pueden ser fácilmente desmontados después de photoconversion.
4. Photoconversion
- En un microscopio confocal vertical (como Leica SP8) equipado con un 405 nanómetro, 488 nanómetro y 561 nm láser fuente, localizar el embrión del corazón usando transmite luz blanca (brightfield) y un objetivo (como Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objetivo). Compruebe la fluorescencia roja de Kaede usando el 561 nm láser (es decir, láser DPSS 561, en ~ 5% de intensidad, detector colocado a 589 728 nm). A continuación, visualizar el endocardio usando el 488 nm láser (es decir, láser de argón multilínea de 30 mW en ~ 5% de intensidad, detector colocado a 502 556 nm).
- Entrar en modo "FRAP" en el software de adquisición de microscopio. Seleccione la potencia de láser de ~ 1% para ambos 488 nm y 561 nm láseres.
- Centrarse en el plano de interés, seleccione una región de interés (ROI), y células photoconvert con diodo 405 nm láser en energía del laser de 25%, tres veces la exploración sobre el ROI. Kaede insuficiente debe photoconverted en el ROI, escanee el 405 nm láser sobre el área tres veces nuevamente. Repita este paso para todos ROIs.
- Volver al modo "TCS SP8" en el software y adquirir una pila de z, usando la 561 nm y 488 nm láser secuencialmente. Asegúrese de seleccionar la opción 'bidireccional' para aumentar la velocidad de proyección de imagen.
Nota: Cuánto tiempo tarda en photoconvert y la imagen de cada embrión varía. Latido del corazón se sabe para ser importante para el desarrollo de la válvula de corazón normal, así que evite mantener el corazón parado durante más de 30 minutos, incluso si esto significa que no tienes tiempo para photoconvert todos los 5 embriones.
Nota: Durante el proceso de photoconversion, uso de detectores de PMT, mientras que después de photoconversion, se recomienda usar detectores de híbrido a modo de conteo. Esto es porque los detectores híbridos son más sensibles y son capaces de producir imágenes de mejor calidad, pero se dañan fácilmente por la sobre exposición.
5. Desmontaje de embriones photoconverted
- Después de photoconversion, utilice una pipeta de vidrio para presionar un poco justo por encima de la cabeza del embrión para romper la agarosa de la LMP, luego aspirar suavemente el embrión.
- Expulsar el embrión de la pipeta de vidrio en un plato de Petri de 35 mm que contiene medio de embrión con PTU (a lavar que contiene medio de BDM).
- Transferir el embrión a un pozo en una placa de 6 pozos que contienen medio embrión con PTU. Durante este paso, asegúrese de que tome nota de que embrión entra que bien, ya que es esencial para correlacionar la posición de las células photoconverted en etapas tardías del desarrollo.
- Ahora que los embriones se quitan del medio con BDM, deben comenzar sus corazones batiendo otra vez en unos 5 minutos embriones retorno a la oscuridad a 28,5 ° C para permitir que los embriones continuar desarrollando normalmente.
6. proyección de imagen de células de photoconverted en etapas embrionarias tardías
- En la etapa deseada, detener el corazón y volver a embeber los embriones como en el paso 3 de este protocolo, con la importante diferencia de que los embriones deben ser tratados con BDM en platos separados, marcados para seguimiento de embriones.
- De embriones hasta 62 hpf, adquirir z-pila del endocardio con 561 nm y 488 nm para el rojo y verde fluorescente señales, respectivamente. Embriones en etapas mayores de 62 hpf, use un multifotón laser set a 940 nm imagen Kaede verde en vez del láser de 488 nm.
7. Análisis de la imagen embriones bajo 48 hpf
Nota: Movimientos de tejido del AVC pueden ser difíciles de analizar debido a su estructura tridimensional compleja. Para cuantificar la longitud de una región de photoconverted en el AVC entre dos regiones no photoconverted o la longitud de una región no photoconverted en el AVC entre dos regiones de photoconverted, puede ser deseable para cartografiar la estructura tridimensional en un mapa de dos dimensiones. Imágenes de photoconverted embriones obtienen antes de 48 hpf puede analizarse mediante el método siguiente.
- Importar las imágenes adquiridas en Matlab o cualquier software similar.
- Delimitar manualmente el retorno de la inversión, es decir, el endocardio y aplicar una mascarilla para quitar la señal de fuera de esta región.
- Aplicar un umbral de intensidad en la imagen para identificar los puntos en el endocardio y el terreno en tres dimensiones. Aislar los puntos correspondientes a la parte más estrecha y más recta de la AVC, borrando manualmente los puntos de ningún interés en la aurícula y el ventrículo mediante el comando borrar en el software.
- Use un cilindro para adaptarse a los puntos que representan el AVC así obtenido.
- Definir un sistema de referencia para comparar varias muestras. Por ejemplo, adoptar el centro de la masa de los puntos de AVC como el origen del sistema de referencia y el eje del cilindro equipado como el eje z.
- Asegúrese de que z-posiciones positivas corresponden siempre al mismo lado del corazón (ventricular o atrial).
- Proyectar los puntos de AVC en el plano x-y y una elipse para que encajen.
- Rotar los puntos endocárdicos alrededor del eje z para que el eje mayor de la elipse y el eje y del sistema de referencia son paralelos y los y-valores positivos corresponden a la parte interna de la AVC con respecto a los embriones.
- Para segmentar el AVC, corte el dataset tridimensional con algunos aviones obtenidas haciendo girar el plano de media {y = 0, x > 0} en la dirección z.
- La intensidad de los píxeles vecinos en estos planos del proyecto y definir el endotelio de manera consistente. Por ejemplo, dibujar manualmente una línea desde el auricular en el lado ventricular del AVC en el espesor medio del endotelio.
- Interpolar los puntos de las líneas que representan el endotelio con una spline tridimensional usando el toolbox de spline para representar el AVC con una superficie.
Nota: El número de los planos de corte determina tanto la precisión de la segmentación y el consumo de tiempo de este paso. Generalmente, 8 planos son suficientes para lograr buenos resultados.
- Definir la posición azimutal de cada punto sobre la superficie de AVC usando coordenadas cilíndricas.
- En cada posición azimutal definir una curva paramétrica a lo largo de la superficie de la AVC mediante el cálculo de la longitud de arco en la superficie entre puntos consecutivos.
- Para cada curva paramétrica, definir el punto en la curva más cercana al centro del AVC a cero. Los puntos del AVC así son descritos totalmente por su posición azimutal y su posición en la curva paramétrica.
- El AVC se despliegan en una imagen bidimensional usando la posición paramétrica de los puntos.
- Encontrar los bordes de la región para cuantificar como los bordes de la umbralización binaria de la imagen de la relación entre las intensidades de lo photoconverted y los canales no photoconverted. Manualmente el resultado correcto si es necesario.
- Calcular la longitud del arco entre los bordes para calcular la longitud de los tejidos en función de la posición azimutal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un ejemplo de un embrión photoconverted en 48 hpf y reflejada otra vez 80 hpf se muestra en la figura 2, cine 1 y 2. Exponer Kaede a la luz nm 405 irreversiblemente conversos de la proteína de su forma verde fluorescente para formar rojo fluorescente, que permite el comportamiento de las células con el verde o su forma roja a seguir con respetan a su color diferenciado vecinos durante la formación de la válvula. Se puede ver que las pocas células photoconverted de la AVC hpf 48 proliferaron más tarde y más tarde residieron principalmente en un lado del prospecto de la válvula.
Un ejemplo de los resultados que pueden lograrse aplicando el método de análisis de imagen que se describe en un embrión de hpf 36 después photoconverting EdCs en la aurícula y el ventrículo se muestra en la figura 3. La segmentación de la AVC permite la parametrización de la estructura tridimensional que luego se proyecta en dos dimensiones para facilitar su visualización y análisis. El método permite cuantificar la distancia entre las dos regiones photoconverted. Repitiendo este proceso en diferentes momentos del desarrollo es posible estudiar la migración de células hacia el AVC (Boselli et al., en prensa)9.
Figura 1 : Molde utilizado para crear pozos de agarosa. A) vista frontal. B) vista posterior. C-D) Vistas de lado. E-F) Vistas oblicuas. Dimensiones se muestran en milímetros. La. Archivo STL para la plantilla del molde se proporciona en los materiales complementarios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Resultados representativos de un Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) corazón embrionario photoconverted. A) el corazón embrionario justo después de photoconversion en 48 hpf. Kaede citoplasmático de varias células de la parte superior de lo AVC se ha convertido desde su forma verde a su forma roja. B) el mismo embrión en 80 hpf. Puede verse que el anteriormente photoconverted células han proliferado y han llegado a residir en la parte interior de la válvula auriculoventricular superior. Barras de escala: 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Resultados representativos del proceso de análisis de imagen en un embrión de hpf 36. A) el resultado de la segmentación tridimensional de la AVC en un sistema de referencia que es común entre los embriones; la señal de la photoconverted (magenta) y Kaede (verde) no photoconverted se proyecta sobre su superficie y marca las regiones de photoconverted y no photoconverted. B) el AVC está desplegado según la posición paramétrica de su punto y la señal se proyecta en dos dimensiones para mejor visualización. Los bordes de la región de photoconverted no están marcados en blanco. C) la longitud de la región de photoconverted no se traza en función de la posición angular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Pelicula 1: el corazón embrionario justo después de photoconversion en 48 hpf. Relacionadas con la figura 2A. La película pasa a través de la pila z adquirida del embrión 48 hpf se muestra en la figura 2A rebanada de z por corte z. Plano sola z fue elegido durante el proceso de photoconversion, pero se observa aquí que las células en varias profundidades han sido photoconverted. Rebanadas de Z son μm 2 espaciados aparte. Click derecho para descargar esta peli.
Película 2: el corazón embrionario de photoconverted 80 hpf. Relacionadas con la figura 2B. La película pasa a través de la pila z adquirida del embrión hpf 80 se muestra en la figura 2B rebanada de z por corte z. Rebanadas de Z son μm 2 espaciados aparte. Click derecho para descargar esta peli.
Archivo complementario: Relacionadas con la figura 1. La. Archivo de STL para la plantilla del molde. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tiempo de photoconversion: Kaede aunque sigue siendo brillantemente expresada en EdCs en 96 hpf, cabe señalar que a medida que el embrión crece, la luz laser difunde más antes de que llegue el AVC, dificultando el photoconversion confinado de Kaede. En embrionario etapas después de 55 años hpf, la dilatación del ventrículo y la aurícula también significa que el haz de láser violeta utilizado para photoconversion no puede llegar a las células de AVC sin pasar a través de la aurícula o ventrículo. Esto significa que más allá de 55 hpf, en orden a photoconvert interruptores endocrinos del AVC, uno debe también photoconvert EdCs adicional en la aurícula y ventrículo.
BDM y Metanosulfonato: photoconversion exacta de EdCs requiere detener temporalmente el corazón de latir. BDM (2, 3-butanedione monoxima) es un uncoupler electro-contráctil que es conocida para inhibir la contracción de músculo cardíaco12. No observamos diferencias en la morfología de los embriones que han sido objeto de este protocolo, y los embriones que han ido creciendo normalmente y no tenían su corazón se detuvo para la proyección de imagen. Sin embargo, el riesgo sigue siendo que el tratamiento farmacológico está alterando el desarrollo normal13. Tricaine concentrada puede usarse para detener temporalmente el corazón14. Encontramos que efectivamente podemos parar el corazón mediante la colocación de embriones en medio embrión con Metanosulfonato de 0.32% por 1 min y mantener el corazón en su estado detenido mediante la transferencia de los embriones al medio de embrión con Metanosulfonato de 0.16%. Similar de la BDM, el corazón se puede parar esta manera durante 30 min y latido del corazón puede verse a devolver en 5 minutos después de regresar a embriones en medio embrión normal. Deben evitarse concentraciones más altas de Metanosulfonato; bajas concentraciones de Metanosulfonato durante períodos prolongados (h/día) se ha demostrado para afectar el desarrollo embrionario normal15,16. Mejor, fresco se prepara solución de Metanosulfonato utilizada para detener el corazón. Si se utilizan alícuotas congeladas, asegúrese de mantener la solución bien protegida de la luz y el Metanosulfonato de descongelación sin calentar la solución por encima de 30 ° C. Por último, blebbistatin se ha divulgado para parar el corazón sin efectos secundarios graves13. No hemos probado este último método en nuestro laboratorio.
Montaje y desmontaje de: correcta colocación de los embriones es esencial durante la photoconversion. El molde para hacer pozos de agarosa facilita el montaje de los embriones que el eje antero-posterior del embrión se encuentra constantemente a 25° con respecto a la superficie del plato. Hemos encontrado el molde a ser aplicable para photoconversion en todo desarrollo etapas entre 36 y 55 hpf. En el montaje, la inclinación del embrión en la dirección de izquierda a derecha debe ajustarse según etapa de desarrollo del embrión y el área que se desea photoconvert. Por ejemplo, a photoconvert el AVC en 36 hpf, el embrión debe estar aproximadamente de 15° a la izquierda, mientras que en 55 hpf, el embrión debe quedar aproximadamente 10° hacia la izquierda. Bajo el estereomicroscopio, debería poder ver el AVC aclarado por el ventrículo o la aurícula. Si, por ejemplo, la aurícula se encuentra en el AVC, no sería posible photoconvert solo el AVC o sólo el atrio. Para propósitos de la proyección de imagen, el mismo molde se utiliza para colocar los embriones entre 36 y 96 hpf. El molde se puede hacer usando una variedad de materiales utilizando una impresora 3D o herramientas de taller mecánico tradicional. Plástico a prueba de acero inoxidable o químico y el calor son dos materiales adecuados. Si el lector desea crear el molde utilizando una impresora 3D, por favor vea información adicional para el. Archivo STL de la plantilla del molde.
Agregar suficiente LMP agarosa para cubrir el embrión entero se recomienda para asegurar que los embriones no se desalojada entre montaje y photoconversion/proyección de imagen, especialmente si el microscopio no se encuentra directamente junto a la estación del montaje. En general, siempre que los embriones están correctamente montados, LMP agarosa no se pegue a los embriones después de desmontar. Sin embargo, algunos agarosa LMP debe permanecer atascado en el embrión, la agarosa de la LMP puede eliminarse suavemente bromas el embrión de la agarosa con unas pinzas.
Embriones, especialmente embriones menos 48 hpf, pueden ser fácilmente dañados durante el montaje y desmontaje. De embriones de menos de 48 hpf, recomendamos fuego pulido el extremo de la pipeta de cristal para evitar dañar los embriones durante el pipeteo.
Microscopio: este protocolo fue realizada usando un microscopio Leica SP8. Sin embargo, photoconversion es un proceso bien establecido y este protocolo debe ser fácilmente convertible a otros microscopios verticales equipados con láseres capaces de producir el 405 nanómetro, 488 nanómetro y 561 nm luz. De embriones hasta 62 hpf, imágenes fueron adquiridas mediante un láser de excitación de argón y láser DPSS 561 para Kaede verde y rojo, respectivamente. Embriones en etapas mayores de 62 hpf, verde Kaede puede ser excitada mediante un láser multifotón a 940 nm, que tiene una mayor profundidad de penetración de luz de 488 nanómetro. En teoría, Kaede rojo debe tener una similar a la de DsRed espectros de excitación de dos fotones y podría ser reflejada en el 950 nm17.
Un objetivo con una alta apertura numérica es necesario eficientemente photoconvert EdCs y adquirir imágenes de alta resolución. Puesto que los embriones se mantienen en los medios de comunicación, es importante elegir un microscopio equipado con una lente de objetivo de agua.
Photoconverting la región de interés: se recomienda ser conservador al seleccionar el ROI a photoconvert - el láser de 405 nm difunde mientras que viaja a través de células de tejido y puede photoconvert en un área mayor que la seleccionada. Si, por ejemplo, usted desea una celda de la etiqueta roja pero como la célula directamente adyacente a permanecen verdes, puede ser prudente seleccionar sólo la parte de la célula miente más lejos de la célula adyacente que su ROI. Ya que Kaede se expresa en el citoplasma de los EdCs, proteína photoconverted difundirá a las partes de la célula no seleccionado por el retorno de la inversión.
Fotoblanqueo y fototoxicidad: Kaede la proteína, sus formas verdes y rojos, es extremadamente brillante y photobleaching no suele ser un factor limitante en la célula de seguimiento de experimentos. Sin embargo, luz láser puede afectar el desarrollo embrionario y debe ser minimizada, especialmente durante etapas tempranas del desarrollo. Síntomas de fototoxicidad incluyen retraso en el desarrollo y, en casos más graves, corazón inadecuada colocación y válvulas malformadas.
El poder de láser violeta (25%) y el número de iteraciones el láser violeta analiza sobre el ROI (3 - 6 veces) utilizado en este protocolo se determinaron empíricamente. Con estas posiciones, vimos la conversión casi completa de Kaede de su verde a rojo forma sin retraso sensible en el desarrollo. La cantidad de energía necesaria en otras configuraciones de microscopia dependerá de la intensidad del láser. Cabe señalar que la forma roja de Kaede puede ser blanqueada por la iluminación intensa del 405 nm, por lo que photoconversion más no necesariamente produce fluorescencia roja más.
Análisis de la imagen: el método propuesto para el análisis de la imagen es un proceso desarrollado recientemente para describir la geometría tridimensional de la AVC y comparar entre los embriones. Se pretende aplicar a estructuras tubulares monocapa, tales como el AVC antes 48 hpf y potencialmente el tubo del corazón y la aorta dorsal. Es principalmente automática, a pesar de la segmentación en los planos de corte se realiza manualmente por el usuario y otras medidas potencialmente podrían requerir corrección manual. La segmentación manual representa la parte más crítica del proceso, puesto que el conocimiento de la geometría de la estructura y la formación son necesarios para lograr buenos resultados. Después de practicar, se reduce considerablemente el consumo de tiempo de esta etapa.
El protocolo descrito aquí proporciona una manera eficaz para seguir los movimientos de tejido endocárdico en AVC y desarrollo de la válvula auriculoventricular del corazón usando la línea transgénica de pez cebra de Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) .
En la actualidad, una de las principales limitaciones de este método es que el rayo láser violeta no está confinado en la dimensión axial. Esto dificulta la orientación de las células para análisis por lo tanto clonales y photoconversion y la célula de seguimiento. Hace dos años, se descubrió que la proteína photoconvertible que dendra2 puede ser cebada convertida - la proteína se puede convertir de su forma verde en su forma roja por primera irradiación de la proteína con luz azul y luego con luz del infrarrojo cercano18. Configuraciones de microscopio que se aprovechan de esta propiedad pueden photoconvert Dendra2 células expresa de una manera espacial confinada en estructuras del complejo tejido 3D evitando muchos de los problemas de fototoxicidad asociados a intenso cerca UV irradiación18 , 19 , 20. con el reciente descubrimiento del mecanismo molecular detrás de este fenómeno, han sido diseñadas variantes de muchas proteínas fluorescentes photoconvertible de verde a rojo, incluyendo Kaede, por lo que son capaces de entrar en un medio preparado estado21. A nuestro conocimiento, pez cebra transgénico líneas donde un promotor como fli1a o kdrl conduce la expresión de la proteína Dendra2 u otro pintado convertibles proteínas fluorescentes en las células endoteliales no están todavía disponibles. Sin embargo, las líneas que expresan Dendra2 ubicuo están disponibles y pueden ser útiles en ciertas aplicaciones, 22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ningún conflicto de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli y Basile Gurchenkov para ayudar a diseñar y hacer el molde que se describe en este protocolo. Este trabajo fue financiado por la ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), el programa EMBO joven investigador, FRM (DEQ20140329553), la Comunidad Europea, ERC CoG N ° 682938 Evalve y por el subsidio ANR-10-LABX-0030-INRT, a cargo de un fondo del Estado francés la Agence Nationale de la Recherche en el marco programa Investissements Avenir etiquetado ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
