Summary
نقدم هنا، بروتوكولا للشاشة البروتين خارج الخلية [ميكروارس] للتعرف على التفاعلات رواية مستقبلات-يجند في إنتاجية عالية. كما يصف لنا طريقة لتحسين الكشف عن تفاعلات البروتين البروتين عابر باستخدام مجمعات البروتين-ميكروبيد.
Abstract
يفرز عوامل ومستقبلات غشاء المربوطة وشركائها المتفاعلة الهيئات التنظيمية الرئيسية للاتصالات الخلوية والشروع في إشارات الشلالات خلال التوازن والمرض، وعلى هذا النحو تمثل الأهداف العلاجية الرئيسية. وعلى الرغم من أهميتها، تظل هذه الشبكات التفاعل الممثلة تمثيلاً ناقصاً إلى حد كبير في قواعد البيانات الحالية؛ ولذلك، يكون معظم البروتينات خارج الخلية لا شريك ملزمة موثقة. هذا التناقض يرجع أساسا إلى التحديات المرتبطة بدراسة البروتينات خارج الخلية، بما في ذلك التعبير عن البروتينات الوظيفية، وتقارب ضعف، وانخفاض، تفاعلات البروتين التي كثيرا ما تنشأ بين مستقبلات سطح الخلية. والغرض من هذا الأسلوب وصف طباعة مكتبة بروتينات خارج الخلية بتنسيق ميكرواري للفرز لتفاعلات البروتين البروتين. لتمكين الكشف عن التفاعلات الضعيفة، ويرد وصف أسلوب يقوم على مولتيميريزيشن البروتين الاستعلام قيد الدراسة. بالإضافة إلى هذا النهج القائم على ميكروبيد مولتيميريزيشن لزيادة مولتيفالينسي، ميكرواري البروتين يتيح الكشف عن قوي لتفاعلات البروتين البروتين عابر في إنتاجية عالية. ويوفر هذا الأسلوب عينة السريع وانخفاض استهلاك--نهجاً للتعرف على التفاعلات الجديدة تنطبق على أي البروتين خارج الخلية. ويرد وصف البروتين ميكرواري الطباعة والفرز بالبروتوكول. هذه التقنية ستكون مفيدة للمحققين التماس وسيلة قوية لاكتشاف تفاعلات البروتين في الفضاء خارج الخلية.
Introduction
ويصف الأسلوب الذي استعرض هنا طباعة مجموعة من البروتينات خارج الخلية في تنسيق ميكرواري، تليها طريقة لفحص هدفا لمصلحة ضد هذه المكتبة. لقد حددنا مولتيميريزيشن البروتين كخطوة حاسمة للكشف عن التفاعلات التي تتميز بالصلات ملزمة منخفضة. تعزيز الكشف عن هذه التفاعلات، يصف لنا بروتوكول استناداً إلى مولتيميريزيشن البروتين الاستعلام من اهتمام باستخدام ميكروبيدس.
يفرز والمنظمين الرئيسيين للاتصالات الخلوية والإشارات والتفاعل مع المكروية الخلية أعرب عن سطح البروتينات (يطلق عليها مجتمعة البروتينات خارج الخلية) جنبا إلى جنب مع شركائها في التفاعل. ولذلك، أنها ضرورية في تنظيم الكثير من العمليات الفسيولوجية والمرضية. تقريبا ربع المجين البشري (إيتش فايف، 000 البروتينات) ترميز للبروتينات خارج الخلية، التي، نظراً لأهميتها وإمكانية الوصول للأدوية تم تسليمها بشكل منهجي، وتمثل أهدافا رئيسية للمخدرات التنمية1. ونتيجة لذلك، تمثل البروتينات خارج الخلية أكثر من 70% الأهداف البروتين مع العمل الدوائية المعروفة للأدوية المعتمدة على السوق، والمعروفة باسم "البروتين دروجابل". على الرغم من أهميتها ووفرة، شبكات التفاعل (أبي) البروتين البروتين خارج الخلية يظل ناقصاً اللافت للنظر في قواعد البيانات المتاحة. وهذا يعود إلى طبيعة البيوكيميائية المعقدة من البروتينات خارج الخلية، مما يحول دون توصيف استخدام التكنولوجيات المتاحة الأكثر2. أولاً، يصعب بروتينات الغشاء من جعل، هي عملية غالباً ما ينطوي على ظروف قاسية الغسيل والمنظفات؛ ثانيا، غالباً ما تفتقد البروتينات خارج الخلية التعديلات ذات الصلة بوستترانسلاشونال مثل جليكوسيليشن التي غائبة عندما ترد هذه البروتينات في عادة تستخدم أنظمة مغايرة. وأخيراً، التفاعلات بين المستقبلات، مثل مستقبلات المشارك في الخلايا المناعية، وأعرب عن غالباً ما تكون عابرة واتسمت بوشائج منخفضة جداً (كد في ميكرومتر ~ 1 إلى > 100 ميكرومتر النطاق). بالإجمال، طبيعة هذه البروتينات وملزمة تقديم الشركاء الأكثر على نطاق واسع تستخدم التكنولوجيات، مثل تقارب تنقية/قياس الطيف الكتلي (AP/MS) أو خميرة-اثنين-الهجين، غير مناسب للكشف عن التفاعلات في الفضاء خارج الخلية 2 , 3.
في محاولة للتغلب على هذه التحديات التقنية والتعجيل باكتشاف رواية تفاعلات البروتينات خارج الخلية، قمنا بتطوير تغطية عالية بروتين خارج الخلية ميكرواري4،5. [ميكروارس] توفر ميزة توليد الأسطح عالية الكثافة مع كميات صغيرة من العينة، وهي عموما قابلة لدراسات الإنتاجية العالية. وفرت الدراسات ميكرواري البروتين سابقا أفكاراً ذات الصلة في تفاعلات البروتين لعدة نموذج الكائنات، أن كانت تركز أساسا على التفاعلات سيتوسوليك أو البروتين محددة الأسر6،7، 8. وفي المقابل، قد أنجز عمل محدودة للتحقيق في تفاعلات البروتين خارج الخلية باستخدام هذه التكنولوجيا. قمنا بتطوير أسلوب ميكرواري بروتين لتمكين الدراسات عبيس ببناء مكتبة شاملة ومتنوعة جداً من البروتينات يفرزها المنقي والمستقبلات (STM) transmembrane واحد أعرب عن المجالات خارج الخلية المؤتلف (النماء) تنصهر فيها العلامات الشائعة ل تنقية تقارب4. نجاح على شاشات ميكرواري البروتين تعتمد اعتماداً كبيرا على إنشاء مكتبة البروتين ذات جودة عالية. للتعبير عن البروتين كل مكتبة والاستعلام، خلايا الثدييات أو خلايا الحشرات تفضيلي اختيرت كأنظمة تعبير مغايرة، لضمان الصحيح إضافة التعديلات بوستترانسلاشونال مثل سندات glycosylation أو الميثيل. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، حجم الاستبعاد اللوني وضوء الليزر زاوية المتعددة تناثر من التقنيات الشائعة المستخدمة لتقييم نوعية البروتين المؤتلف. مكتبة البروتين ثم رصدت على الشرائح ابوكسيسيلاني وتخزينها في-20 درجة مئوية للاستخدام على المدى الطويل. وأوصت تركيزات البروتين تزيد من 0.4 ملغ/مل للبروتوكول هو موضح أدناه. ولذلك، قد تتطلب البروتينات منخفضة-وإذ يعرب عن خطوة تركيز قبل نموذج الطباعة والتخزين. ومع ذلك، مزايا رئيسية لهذا الأسلوب هي حجم صغير البروتين المطلوب (50 ميكروغرام من البروتين كافية لأداء > شاشات 2,000)، جنبا إلى جنب مع استهلاك البروتين الاستعلام الحد الأدنى (20-25 ميكروغرام كل التكرارات الشاشة). استخدام البروتوكول والمعدات الموصوفة هنا، وشريطة توافر المكتبات، يمكن توليد نتائج لاستعلام فردي البروتينات خلال يوم عمل واحد.
تحديا كبيرا في الكشف عن تفاعلات البروتين في البيئة خارج الخلية تنشأ من طبيعتها ضعيفة أو عابر مميز، مما يحول دون تحديد المنهجيات الأكثر استخداماً. ويحسن حساسية للكشف عن البروتين ضعف التفاعلات9،،من1011زيادة اللذة ملزمة إلى حد كبير. استناداً إلى هذا المبدأ قمنا بتطوير أسلوب مولتيميريزي البروتينات الاستعلام (معبراً عنها كالانصهار Fc) استخدام البروتين المغلفة بالخرز4،5. لتجنب أي المنظمة المحتملة من البروتين الاستعلام بوصفها عشوائية، نحن تسمية مناعي البشري غير ذي صلة ز مع Cy5 بدلاً من ذلك وإضافته جنبا إلى جنب مع البروتين الاستعلام الخرز البروتين أ، وبالتالي القضاء على أي القطع الأثرية بسبب تصريف مباشر صبغ لبروتين الفائدة. ونظرا للصلات micromolar عدة مستقبلات المشارك أزواج، يعزز المجمعات متعددي إشارة إلى نسبة الضوضاء، مقارنة بالبروتينات الاستعلام Fc-الانصهار فرزهم كالبروتينات القابلة للذوبان4.
وخلاصة القول، والهدف من هذا البروتوكول وصف إعداد الشرائح ميكرواري يحتوي على مكتبة بروتين خارج الخلية موجودة من قبل للتعرف على التفاعلات مستقبلات-يجند. نقوم بمراجعة الخطوات اللازمة للشرائح الطباعة، متبوعاً ببروتوكول لفحص بروتين تهم ضد المكتبة البروتين خارج الخلية. وعلاوة على ذلك، يصف لنا طريقة للكشف المعززة من أبيس استناداً إلى ميكروبيدس لتحقيق اللذة زيادة من البروتين قيد الدراسة. التكنولوجيا ميكرواري البروتين خارج الخلية الموضحة هنا تمثل نهجاً سريعة وقوية وفعالة للفحص والكشف عن أبي رواية مع انخفاض نسب إيجابية كاذبة، وعن طريق استخدام كميات ميكروغرام فقط من البروتين الاستعلام تحت التحقيق. وقد غذت هذه التكنولوجيا الدراسات المتعددة التي قدمت أفكاراً ذات الصلة في الوظائف الخلوية غير معروف سابقا ومسارات الإشارات لمجموعة متنوعة من مستقبلات12،13، بما في ذلك14من إيمونوريجولاتورس الفيروسية، ويمكن أن يستفاد من دي أورفانيزي أي البروتين خارج الخلية للفائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-جيل مكتبة بروتينات البشرية خارج الخلية
- تجميع قائمة من مستقبلات سطح الخلية أو البروتينات يفرز من الفائدة لبناء المكتبة ميكرواري البروتين. الأسر البروتين محددة (على سبيل المثال، فوق عائلة الغلوبولين المناعي) أو البروتينات أعربت بشكل انتقائي وبخاصة الخلية يمكن تحديد أنواع للدراسة.
- لمستقبلات الخلية السطحية، تحديد حدود المجال خارج الخلية (النماء) بتحديد إشارة هضميد ومناطق ترانسميمبراني باستخدام أدوات البرمجيات. بعض ذات الصلة أدوات، متاحة مجاناً على الإنترنت، ويتم الرجوع إليها في الجدول للمواد15،16،،من1718.
- توليف النماء للجينات للفائدة واستنساخ في ناقلات الأمراض ذات الصلة. يمكن تنقية البروتينات يفرزها أو مستقبلات "نماء الطفولة المبكرة لتحقيق الاستقرار والانتساب" تنصهر فيها إلى عدد من العلامات تقارب مشترك من الوسائط مكيفة من الخلايا transfected مع ناقل مناسب، أو من أنظمة تعبير خلية باكولوفيروس الحشرات.
ملاحظة: الأنظمة المستندة إلى خلية الثدييات (مثل HEK/293 أو خلايا تشو) ينصح إلى أقصى حد احتمال طي البروتين السليم، وإضافة التعديلات ذات الصلة بوستترانسلاشونال مثل جليكوسيليشن. - تنقية البروتينات بأساليب تنقية النسب القياسية. وقد وصف الجهود السابقة الإجراءات التلقائية أو شبه الآلية المناسبة لتنقية المئات من البروتينات، التي يمكن أن يكون تحجيم لتوليد مجموعة البروتينات للفائدة9،،من1920، 21.
ملاحظة: يوصي الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، حجم الاستبعاد اللوني (S)، أو الليزر زاوية المتعددة تناثر الضوء (مراكز التسوق) لتقييم أي تجميع غير التساهمية ومراقبة للجودة الشاملة للأعمال التحضيرية البروتين. - ضبط البروتينات إلى ميكروغرام/مل 200 أو 400 كلما كان ذلك ممكناً، وتمييع الأرصدة مع والغليسيرول 80% للتخزين على المدى الطويل في قنينات المبردة في-20 درجة مئوية. وهذه تمثل الأرصدة الرئيسية ويجب أن يكون الوصول إليها إلا عند الضرورة.
- نقل مختبرين لكل البروتين (100 ميكروليتر) إلى 96-جيدا لوحات (لوحات الأسهم) وختم مع إحباط لاصقة وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى ميكرواري إعداد الشرائح. يتم إنشاء لوحات الأسهم لتقليل دورات تجميد أذاب وضمان الاستقرار البروتين.
2-خارج الخلية البروتين ميكرواري الطباعة
- استخدام ميكروارايير قياسية لطباعة الشرائح. أداة تستخدم للبروتوكول هو موضح هنا له قدرة الشرائح 57/تشغيل ويستخدم رأس طباعة عقد دبابيس اكتشاف 48. هذه الدبابيس توليد البقع ~ 100 ميكرومتر قطرها مفصولة بمسافة بقعة إلى بقعة ميكرومتر ~ 350 وتوجه ميكروليتر 0.25 للتحميل. تحت هذا التكوين، حتى البقع 8,000 كل شريحة يمكن استيعابها.
- إنشاء لوحات العمل (384 لوحات جيدا، 10 ميكروليتر عينة/حسنا) من لوحات الأسهم. تنفيذ هذه الخطوة يدوياً قبل الطباعة الشريحة باستخدام في ميكروارايير. ثم، بقعة البروتينات مع دبابيس اكتشاف نوع الريشة على الشرائح ابوكسيسيلاني في الرطوبة 60% (منع جفاف البقع البروتين).
ملاحظة: يمكن رصدها ألبومين المصل البقري المسمى Cy3 (BSA) في التكرارات بين كل عينة البروتين (5 ميكروغرام/مل في الجلسرين PBS/40%) لتصور الصفيف للقناع المناسب (انظر القسم 4). على الرغم من أن أوصى، هذه الخطوة اختيارية. - بعد الطباعة، إزالة الشرائح ميكرواري البروتين من البيئة هوميديفيد ومنعها بين عشية وضحاها مع الحليب 5% في ببست لإلغاء تنشيط السطح.
ملاحظة: هو النهج المفضل لاستخدام هو الموجات فوق الصوتية لتوليد غرامة ضباب لعرقلة الحل الذي يستقر على سطح الشريحة. - تخزين الشرائح في-20 درجة مئوية في الجلسرين 50% لمنع تجمده.
3-إعداد مجمعات الطعم متعددي
ملاحظة: التفاعلات بين البروتينات خارج الخلية غالباً ما تتسم بانخفاض الانتماءات. لتمكين الكشف عن هذه التفاعلات بزيادة اللذة ملزمة، نهجاً متعددي استناداً إلى التقاط البروتين الاستعلام، أعرب كمعلم نادي نماء الطفولة المبكرة، على ميكروبيدس المغلفة بالبروتين كان نمواً4.
- تسمية الناقل مفتش المستخدمة للكشف مع صبغة مونوريكتيفي Cy5 وفصل صبغ مجاناً باستخدام أعمدة الملحي. تحديد الصبغة إلى نسب البروتين عن طريق قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 و 650 نانومتر.
ملاحظة: عادة ما تستخدم نسب البروتين-صبغ بين 2.0 و 4.0. من المستحسن أن تدور يصرف Cy5 في س 100,000 ز لمدة 15 دقيقة لإزالة المجاميع للذوبان المحتملة الناجمة عن عملية وضع العلامات. - تحديد نسبة ميكروبيد للبروتين المثلى بمعايرة البروتين A ضد كمية ثابتة من البروتين الاستعلام. حجم الحد الأدنى تشبع الخرز حيث لا يزال أي البروتين معلم Fc مجاناً، كما تقاس باستخدام مقايسة تنافسية يحددها قياس التداخل بيولايير، يستخدم للفحص.
- تشكل مجمعات ميكروبيد بالبروتين التي تفرخ الاستعلام Fc معلم ومفتش Cy5 مع ميكروبيدس البروتين A والمزيج على المدورة أنبوب في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.
- لتشكيل هذه المجمعات، استخدم البروتين الاستعلام بتركيز نهائي من 20 ميكروغرام/مل. لحساب نسبة البروتين الاستعلام ومفتش Cy5 المولى، تقسم الوزن الجزيئي للبروتين الاستعلام بالوزن الجزيئي لمفتش (150,000 دا) وقم بضرب 40 ميكروغرام/مل لتحديد تركيز Cy5-مفتش اللازمة.
- الملحق عينات مع البروتين للذوبان (1 ملغ/مل) مباشرة قبل الحضانة مع ميكرواري الشرائح (انظر القسم 4.2 أدناه) لمنع ملزمة لأي الخرز بالبروتين مجاناً إلى نادي الانصهار البروتينات التي قد تكون موجودة في الصفيف.
ملاحظة: قد تختلف عن حجم الرد النهائي الدائرة محطة أو حضانة التهجين باستخدام. الأجهزة المذكورة في الجدول للمواد يسمح حضانة العينات باستخدام كميات صغيرة نسبيا (~ 200 ميكروليتر كل شريحة).
4-خارج الخلية البروتين ميكرواري الفحص والمعالجة.
ملاحظة: هناك عدد من الشركات المصنعة التي توفر منصات المعالجة التلقائية. إذا لم يتوفر محطة تهجين، يمكن تنفيذ الخطوات التالية يدوياً، وضمان عدم وجود حجم كاف للمخزن المؤقت للحفاظ على الشرائح المغمورة في جميع الأوقات.
- الشرائح في درجة حرارة الغرفة دافئة وشطف مع توين PBS/0.1% 20 (ببست) لإزالة والغليسيرول المتبقية قبل تحميلها على محطة التهجين.
- استخدام بروتوكول الفحص التالية:
- غسل مع ببست لمدة 1 دقيقة.
- تحميل 200 ميكروليتر من البروتين 1 ملغ/مل A في اللبن PBS/5% واحتضان لمدة 30 دقيقة لمنع البروتين أونكومبليكسيد ميكروبيدس من الربط إلى معلم Fc البروتينات التي قد تكون موجودة في ميكرواري.
- غسل خمس مرات مع ببست لمدة 1 دقيقة.
- تحميل 200 ميكروليتر من مجمع حضور البروتين 1 ملغ/مل بالاستعلام: ميكروبيدس واحتضان لمدة 30 دقيقة.
- غسل مع ببست لمدة 1 دقيقة.
- بعد التهجين، شطف الشرائح مع المياه ووضع في أنابيب مخروطية 50 مل الفردية والجاف بالغزل في 900 غ س لمدة 5 دقائق.
- وأخيراً، مسح الشرائح مع الماسح الضوئي ميكرواري المناسبة للكشف عن Cy3 (إذا كان قد تم طبع جيش صرب البوسنة-Cy3) والأسفار Cy5 بإثارة في 532 و 635 نانومتر، على التوالي.
- القيام بتحليل البيانات باستخدام تحليل البيانات ميكرواري المصاحبة لها. يتم تحميل قائمة المصفوفة ذات الصلة (كملف.gal) إلى برنامج استخراج البيانات. وفي هذه المرحلة، الاستفادة من البقع Cy3-جيش صرب البوسنة للبحث عن القطع واستخدام خيارات السيارات لتركيب البرمجيات، متبوعاً بمحاذاة يدوياً من الميزات عند الضرورة. حفظ الملفات كملفات.gpr لمزيد من التحليل.
5-بيانات التحليل
- حفظ البيانات كملفات لائحة برلمان غرينلاند وعملية في البحث والتطوير باستخدام حزمة ليما، يشيع استخدامها لتحليل البيانات ميكرواري4،5.
- خلفية لتجهيزها، تصحيح والتطبيع داخل الشريحة. حيث تتم طباعة كل البروتين في البقع المكررة، الجمع بين كلا القياسات نسخ متماثل لإنشاء درجة واحدة لهذا البروتين في المكتبة.
- حساب الدرجات لكل شريحة، وتحليل النتائج للتقاطع بين المرشحين التهديف عالية بين الشرائح.
- [ميكروارس] مكررة من تشغيل طباعة منفصلة للتحكم لتقلب الشرائح واستخدامها المؤامرات تقاطع تمثل البيانات من كل من الشاشات لاستدعاء يضرب النهائي.
- وأخيراً، أداء مستوى إضافي من تصفية لاستبعاد البروتينات منحل داخل الصفيف. وتحدد هذه الاضبارات غير محددة البروتينات التي تتجاوز عتبة معينة ضرب التردد حسب تعريف المستخدم عبر شاشات مستقلة.
ملاحظة: يرد هذا البروتوكول بالتفصيل في توم et al. عام 20135. في حالتنا الموثق غير محددة تدعو يستند تحديد التراكمي فريسة بلغ معدل، ويتم استخدام عتبة القضاء المبنية على البيانات من 5%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد في الشكل 1تخطيطي لسير العمل للتكنولوجيا ميكرواري البروتين خارج الخلية. حالما تتوفر ميكرواري الشرائح التي تحتوي على مكتبة البروتين خارج الخلية، يمكن إكمال فحص البروتين الفائدة وتحليل البيانات خلال يوم واحد. العديد من التفاعلات الفيزيولوجية الصلة بين جزءا لا يتجزأ من الغشاء مستقبلات تتسم بالقوة الملزمة ضعيفة جداً (كد في نطاق micromolar). ووضعت لتحسين الكشف عن مثل هذه التفاعلات، أسلوب يستند إلى استعلام البروتين (معبراً عنها كالانصهار Fc) مولتيميريزيشن على البروتين A-ميكروبيدس. ويرد هذا البروتوكول في النص، ومثال ممثل لأداء هذا النهج لتعزيز الكشف عن مؤشر أسعار المنتجين ويرد في الشكل 2.
ويرد مثال ممثل من شاشة ميكرواري البروتين في الشكل 3. في المثال الموضح، يتم فرزهم للتفاعلات ضد مكتبة تتكون من أكثر من 1,500 مستقبلات النماء بروتين إيمونومودولاتوري إتش بشرية يتيم أو يفرز البروتينات14. كما هو موضح، نماء الطفولة المبكرة البروتينات الفيروسية ريكومبينانتلي معبراً عنها بروتين Fc انصهار، وثم المحتضنة مع البروتين ميكروبيدس المغلفة بهدف تشكيل مجمعات متعددي. تم فحص البروتين المجمعات استخدام محطة تهجين لتقليل العمليات اليدوية، ومع ذلك، يمكن تنفيذ شاشات مماثلة استخدام دائرة تهجين أو الأجهزة المماثلة. ينصح بتشغيل شاشات مكررة باستخدام الشرائح المطبوعة في تشغيل اكتشاف منفصلة من أجل السيطرة على أي تقلب أثناء النسخ المطبوعة. ويوضح الشكل المؤامرات تقاطع الناتجة من شاشات مكررة ومستقلة. هي سهولة تصور التفاعلات الإيجابية وخلفية الشريحة العامة عند المسح الضوئي من الألواح (Cy5 الأسفار)، تيسير الدعوة ضرب. علما بأن من المستحسن على الفور كل مستقبلات في المكتبة في التكرارات لزيادة الثقة ضرب. لمعظم الاستعلام البروتينات، لا شيء، ولوحظت يضرب واحد أو عدد قليل، مما يدل على خصوصية الأسلوب للكشف عن القياسية.
بعض البروتينات استعلام إظهار الخلفية عالية كما الكشف عنها بواسطة الربط لعدد ارتفاعا غير عادي من البروتينات داخل الصفيف و/أو إلى الشريحة. في تجربتنا، يلاحظ هذه الخلفية غير محددة لعدد قليل فقط من البروتينات. يمكن أن تؤثر العوامل المختلفة ذات الصلة بطبيعة البروتين التفاعلات غير محددة، مثل الاعتراف بالزخارف جليكوسيليشن. ويبين الشكل 3 مثال البروتين الفيروسي فحص ضد المكتبة ميكرواري تبين خلفية عالية، يحول دون تحديد عدد معين. وفي حين يمكن اعتبار إجراء تعديلات طفيفة في البروتوكول لخفض الخلفية (مثل زيادة الملح أو تركيز المنظفات)، وفي هذه الحالات يوصي باستكشاف طرق بديلة ديورفانيزيشن البروتين قيد الدراسة.
رقم 1: [ميكروارس] البروتين خارج الخلية لتحديد التفاعلات مستقبلات-يجند سريعة وقوية- (الخطوة 1) يتم تصنيف مكتبة بروتينات خارج الخلية للفائدة. (الخطوة 2) طباعة الشرائح ابوكسيسيلاني باستخدام طابعة ميكرواري البروتينات المنقاة وتخزينها في-20 درجة مئوية. (الخطوة 3) البروتين الاستعلام من مصلحة مولتيميريزيد على ميكروبيدس لزيادة اللذة والكشف عن تفاعلات البروتين البروتين عابرة. مفتش فلورسنت الرصاصية مع الاستعلام: ميكروبيدس كالناقل المسمى خاملة. (الخطوة 4) الكشف عن الشركاء ملزمة البروتين الاستعلام. فحص البروتين الفلورسنت الاستعلام معقدة ضد ميكرواري البروتين خارج الخلية استخدام محطة تهجين للتجهيز الآلي الشريحة. (الخطوة 5) هي تصور الشرائح ثم استخدام ماسح ضوئي ميكرواري. ويمكن ملاحظة البقع Cy3 جيش صرب البوسنة في قناة 535 نانومتر ويضرب من الشاشة ويمكن ملاحظة كبقع مكررة في 635 نانومتر. تحليل البيانات لضرب الدعوة يقوم بإنشاء مساحات التقاطع من تجربتين مستقلة. يضرب تسمى استناداً إلى درجات عالية بعضها بعضا فوق الخلفية، كما هو موضح في قسم البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: إشارة المعززة من خلال تشكيل مجمعات متعددي للبروتين الاستعلام. (أ) مولتيميريزيشن بروتينات الاستعلام. أعرب المؤتلف Fc الأنشطار البروتينات الاستعلام ومقترنة بالبروتين A ميكروبيدس على شكل مجمعات مولتيميريزيد. (ب) عالية-اللذة يؤدي إلى الكشف عن تفاعلات تقارب منخفضة. اللذة تتيحها نتائج الاستعلام مولتيميريزيد البروتين في تحقيق الاستقرار في التفاعلات الضعيفة على ميكرواري البروتين، مما يؤدي إلى أعلى إشارة إلى نسب الضوضاء وتعزيز الدعوة إلى ضرب. قطع يبين نتائج الفحص CD200، فحص ميكروبيد معقدة، أو بروتين قابل لذوبان يسمى مباشرة مع صبغ Cy5 لتمكين تصور الزيارات. مولتيميريزيشن (أشرطة حمراء) يتيح الكشف عن قوي الشريك ملزم تقارب منخفضة CD200R1، موجودة في مكتبة ميكرواري البروتين، مع نسبة كبيرة إشارة/الضوضاء بالمقارنة مع البروتين نفس فرزهم كمنتج قابل لذوبان (أشرطة زرقاء). وتبين أشرطة رمادية موثقات غير محددة. كانت ممثلة فقط التفاعلات 10 الأعلى في المؤامرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: ميكرواري البروتين التكنولوجيا للتعرف على التفاعلات رواية مستقبلات مستقبلات الفيروس--المضيف. (أ) نتائج اكتشاف مستقبلات المثالية لبروتين إيمونومودولاتوري أدينوفيرال يتيمة. وتمثل الصور ميكرواري الفعلية بالأشعة، تبين عدد الزيارات من البروتينات التي رصدت في التكرارات (أحمر). يتم إجراء فحوصات في التكرارات لمراقبة أي تقلب الشرائح، والنتائج ممثلة كقطع تقاطع. تمثل النقاط الحمراء والزرقاء في المؤامرات، يضرب يطلق فقط على تكرار صفيف واحد، بينما تمثل النقاط السوداء يضرب المتقاطعة من كلا تشغيل مستقلة. تتم طباعة المكتبة ميكرواري كامل على شريحتين لسهولة الاستخدام نظراً للعدد البروتينات موجودة في المجموعة، وضمان فصل ما يكفي لكل بروتين الفردية التي رصدت في الصفيف. (ب) ضرب الشاشة البروتينات الفيروسية العارضة الخلفية العالية التي تحول دون الاتصال. بعض البروتينات الاستعلام قد عرض خلفية عالية، كما الكشف عنها بواسطة ملزم للبروتينات متعددة و/أو الشرائح، ولذلك تشكل تحديات لتحديد مرات التهديف عالية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يظل عدد كبير من مستقبلات اليتيمة في الجينوم البشري، ويواصل الشركاء المتفاعلة رواية الخروج للبروتينات خارج الخلية مع يغاندس تتسم سابقا. تحديد التفاعلات مستقبلات-يجند في الإنسان والكائنات نموذج أمر ضروري لفهم الآليات التي تملي الاتصالات الخلوية أثناء التوازن، فضلا عن التقلبات التي تؤدي إلى المرض، وذلك إبلاغ جديدة أو محسنة الخيارات العلاجية. ومع ذلك، الكشف عن تفاعلات البروتين خارج الخلية بالتكنولوجيات المستخدمة على نطاق واسع تمثل حاجزاً كبيرا أساسا بسبب التحديات التقنية المرتبطة بالكيمياء الحيوية المستقبلات الخلوية وشركائها المتفاعلة. في هذا التقرير يصف لنا استخدام ميكرواري البروتين خارج الخلية لفحص البروتينات الاستعلام من اهتمام، مع التركيز على الاستفادة مجمعات ميكروبيد للكشف عن تعزيز القياسية.
استكشاف التفاعلات مستقبلات مستقبلات يشكل تحديا كبيرا، كما تتميز العديد من أزواج فسيولوجيا ذات الصلة بالتفاعل ضعيفة جداً مع ربط الصلات في نطاق micromolar2،3. تعزيز اللذة من خلال مولتيميريزيشن ثبت أن استراتيجية مفيدة لزيادة حساسية للكشف عن انخفاض النسب القياسية. قمنا بتطوير أسلوب يقوم على نادي الانصهار البروتينات، لتشكيل كفاءة البروتين ميكروبيد متعددي الاستعلام المجمعات4. مولتيميريزيشن البروتين الاستعلام خطوة أساسية للكشف عن انخفاض النسب القياسية. كما هو موضح في المثال في الشكل 2، أن هذا الأسلوب يعزز إلى حد كبير إشارة بالمقارنة مع البروتين الاستعلام نفسه فحص كأكثر (غير الرصاصية) القابلة لذوبان، مع الاحتفاظ بالحد الأدنى من المعلومات الأساسية. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يؤديها على شاشات ميكرواري البروتين مع البروتين للذوبان الاستعلام المسمى Cy5، نهج متوافق مع أي علامة الانصهار والتي قد تكون كافية لتحديد التفاعلات تقارب أكثر استقرارا وأعلى، كتلك القائمة بين بعض يغاندس القابلة للذوبان وهذه المستقبلات. تجدر الإشارة إلى أن سبب زيادة اللذة من خلال مولتيميريزيشن للاستعلام على ميكروبيدس، إشارة ميكرواري ليس مقياس كمي لقوة التفاعل. بدلاً من ذلك، ينبغي حساب ربط الصلات مع الإصدارات أحادي من البروتينات قيد التقييم. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه من المستحسن جداً أن يضرب أي يتم تحديدها من خلال التكنولوجيا ميكرواري يتم التحقق من صحة من خلال أساليب مستقلة. ونحن تستخدم بشكل روتيني الرنين السطحية مأكل مثل الطحين كأسلوب الفيزيائية معيار الذهب للدراسات PPI وقياس حركية ملزمة.
على الرغم من خارج نطاق هذا التقرير، تجدر الإشارة إلى أن نجاح أي جهود الفرز بشكل كبير باستخدام تكنولوجيا ميكرواري يعتمد على التحديد وتوفر مكتبة البروتين ذات جودة عالية. المعايير ذات الصلة بتحديد بروتينات خارج الخلية قد تم نشرها مسبقاً4،22. عدد من الأدوات المفيدة للتنبؤ بملامح البروتين ذات الصلة (مثل لوالب transmembrane أو الببتيدات إشارة) متاحة بحرية على شبكة الإنترنت، بما في ذلك الملقمات التالية: سيجنالب15و16تمهمم، فوبيوس17وتوبكونس 18-أساليب ممتازة الأوراق تصف أساليب تنقية تقارب متاحة في أماكن أخرى. كما تجدر الإشارة أن توليد مكتبة ميكرواري البروتين يعتمد على إنتاج البروتين أكدس كالمنتجات التوليفية للذوبان، وبالتالي يسمح هذا النهج الدراسات من النوع الأول والنوع الثاني، وخلية GPI رأسية المستقبلات السطحية ويفرز والبروتينات، ولكن عموما ليست مناسبة للبروتينات التي تحتوي على مولتيترانسميمبراني مثل مستقبلات البروتين-إلى جانب ز. تنقية مئات بروتينات كالبروتينات القابلة للذوبان المؤتلف يطالب بجهود لوجستية كبيرة ويمكن أن تكون الموارد جداً-وتستغرق وقتاً طويلاً. ومع ذلك، مع انخفاض تكاليف تركيب الجينات وزيادة إنتاجية نظم تنقية البروتين، مكتبة الجيل الآن أسرع نسبيا وأكثر بأسعار معقولة. وبدلاً من ذلك، توفر المصادر التجارية تنقية البروتينات خارج الخلية التي يمكن شراؤها بكميات ميكروغرام، الذي يكفي لجيل مكتبة ميكرواري البروتين دائم نظراً لمتطلبات الطباعة الشريحة الصغيرة. هذه القيود، ورغم التكنولوجيا ميكرواري يوفر مزايا كبيرة مثل استهلاك الحد الأدنى من البروتين الكواشف، قراءات سريعة (يمكن تحديد القياسية الجديدة خلال يوم واحد) والأجهزة بأسعار معقولة. وباﻹضافة إلى ذلك، متى تم إنشاء بنيات وتنقية الأوضاع، تنقية صغيرة يمكن أن تنتج ما يكفي من المواد لإعداد آلاف صفائف.
وأخيراً، الملاحظ في بعض الحالات، خلفية عالية نسبيا، تظهر بوصفها ملزمة للعديد من البروتينات على مكتبة ميكرواري. وهناك عدة عوامل قد تؤثر ملزمة غير محددة. على سبيل المثال، بعض البروتينات قد تكون مشحونة بدرجة عالية، أو تتفاعل مع الكربوهيدرات، المحاسبة للخلفية غير محددة عن طريق الاعتراف بزخارف المشتركة. وبالمثل، غير محددة ملزمة أيضا نظراً لطبيعة البروتين الاستعلام، مثل على سبيل المثال الاعتراف بزخارف الحامض اللعابي، ترد في العديد من البروتينات الأخرى. كما توسيع المكتبات ميكرواري، فمن المرجح أن أن قائمة مشتركة من موثقات غير محددة قد تكون موجودة. يمكن تحديد هذه الاضبارات غير محددة بتعقب سلوكهم عبر الشاشات المختلفة ضد البروتينات الاستعلام غير ذات صلة. فمن المستحسن لإنشاء قائمة موثقات غير محددة عبر الشاشات، لتحسين الاتصال ضرب محددة. وفي حالتنا، وجدنا أن تطبق قطع 5 ٪ (أي، هو إشارة بروتين كغير محددة إذا تم الكشف عن كما هو موثق 5% أو أكثر من شاشات البروتين الاستعلام غير صلة) مهم للحد من إيجابيات كاذبة. تجدر الإشارة إلى أنه إذا كان الغرض الرئيسي من الاختبارات لتشغيل فقط عدد قليل من شاشات المحدد، قد لا يكون جديرة بالاهتمام لتطوير تحليل الإحصائي. في هذه الحالة، قد لا يكون ممكناً للكشف عن إيجابيات كاذبة بسبب مجموعة من بيانات محدودة، و ولذلك نوصي بأن هناك تركيز خاص على تأكيد يضرب باستخدام أساليب بديلة.
ونحن نتوقع [ميكروارس] البروتين خارج الخلية، خاصة في تركيبة مع أساليب مولتيميريزيشن للكشف عن التفاعلات يجند مستقبلات عابرة، سوف تواصل تقديم منبرا فريداً لتحديد سريع وقوى للرواية مؤشر أسعار المنتجين في المساحة خارج الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
، ر. س-ص ونانسي مورغن-M. من الموظفين Genentech والأسهم الخاصة في المجموعة وشركة Genentech/روش.
Acknowledgments
ونشكر فيلامير كالسيس ويوين كوبي للغاية قراءة المخطوطة. ونحن ممتنون لراندي ين للمشورة التقنية الممتازة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
- Ramani, S. R., et al. A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery. Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).
- Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).
- Kaushansky, A., et al. Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays. Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
- Voulgaraki, D., et al. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).
- Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia. Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).
- Jaworski, A., et al. Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2. Science. 350 (6263), 961-965 (2015).
- Martinez-Martin, N., et al. The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation. Nature Communications. 7, 11473 (2016).
- Nielsen, H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).
- Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).
- Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology. Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).
- Gonzalez, R., et al. Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).
- Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).
- Clark, H. F., et al. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).
