Summary
Hier presenteren we een protocol bij scherm extracellulaire proteïne microarrays voor de identificatie van nieuwe receptor-ligand interacties in hoge-doorvoer. Ook beschrijven we een methode ter verbetering van de opsporing van voorbijgaande eiwit-eiwitinteractie met behulp van eiwit-microbead complexen.
Abstract
Secreted factoren, membraan-gebonden receptoren en hun interactie partners zijn belangrijkste regulatoren van cellulaire communicatie en initiatie van signalering cascades tijdens homeostase en ziekte, en als zodanig vertegenwoordigen voornaamste therapeutische doelen. Ondanks hun relevantie blijven deze interactienetwerken aanzienlijk ondervertegenwoordigde in huidige databanken; Daarom moeten de meest extracellulaire eiwitten geen gedocumenteerde bindende partner. Deze discrepantie is voornamelijk te wijten aan de uitdagingen in verband met de studie van de extracellulaire eiwitten, met inbegrip van expressie van functionele eiwitten, en de zwakke, lage affiniteit, eiwitinteractie vaak tot stand gebracht tussen oppervlakte cel receptoren. Het doel van deze methode is om te beschrijven van het afdrukken van een bibliotheek van extracellulaire eiwitten in een microarray opmaken voor screening van eiwit-eiwitinteractie. Als u wilt inschakelen van detectie van zwakke interacties, wordt een methode gebaseerd op multimerization van het query-eiwit onder studie beschreven. Gekoppeld aan deze benadering van de microbead gebaseerde multimerization voor verhoogde multivalency, maakt de eiwit microarray de robuuste ontdekking van voorbijgaande eiwit-eiwitinteractie in hoge-doorvoer. Deze methode biedt een snelle en lage monster consumeren-benadering voor de identificatie van nieuwe interacties die van toepassing zijn op elke extracellulaire proteïne. Eiwit microarray afdrukken en screening protocol worden beschreven. Deze technologie zal zitten nuttig voor onderzoekers op zoek naar een robuuste methode voor ontdekking eiwitinteractie in de extracellulaire ruimte.
Introduction
De hier besproken methode beschrijft het afdrukken van een verzameling van extracellulaire eiwitten in een microarray opmaken, gevolgd door een methode voor screening van een doelwit van belang tegen deze bibliotheek. We hebben eiwit multimerization aangewezen als een cruciale stap voor de detectie van interacties gekenmerkt door lage bindende verwantschappen. Om detectie van deze interacties te verbeteren, beschrijven we een protocol op basis van multimerization van de query-proteïne van belang met behulp van microbeads.
Uitgescheiden en cel oppervlak-uitgedrukt eiwitten (collectief genoemd extracellulaire eiwitten) samen met hun interactie partners zijn belangrijke regulatoren van cellulaire communicatie, signalering en interactie met de communicatie. Ze zijn daarom essentieel bij het reguleren van veel fysiologische en pathologische processen. Ongeveer een kwart van het menselijk genoom (≈5, 000 eiwitten) codeert voor extracellulaire eiwitten, die, gezien hun betekenis en toegankelijkheid aan systematisch geleverde drugs, vertegenwoordigen belangrijke doelen voor drug ontwikkeling1. Bijgevolg, extracellulaire eiwitten vertegenwoordigen meer dan 70% van het eiwit doelen met bekende farmacologische werking voor goedgekeurde geneesmiddelen op de markt, bekend als de "druggable Proteoom". Ondanks hun belang en overvloed blijven de extracellulaire eiwit-eiwit-interactienetwerken (ePPI) opmerkelijk ondervertegenwoordigde in de beschikbare databases. Dit is fundamenteel te wijten aan de complexe biochemische aard van de extracellulaire eiwitten, die zich verzet tegen hun karakterisering met behulp van de meeste beschikbare technologieën2. In de eerste plaats zijn membraaneiwitten moeilijk te solubilize, een proces dat vaak hard wassen voorwaarden en detergentia gaat; Ten tweede, extracellulaire eiwitten vaak geen relevante posttranslationele modificaties zoals glycosylatie die zijn afwezig wanneer deze eiwitten worden uitgedrukt in algemeen gebruikte heterologe systemen. Ten slotte, interacties tussen receptoren, zoals co receptoren uitgedrukt op immune cellen, zijn vaak van voorbijgaande aard en gekenmerkt door zeer lage affiniteit (KD in de ~ 1 micrometer tot > 100 μM-bereik). Over het geheel genomen de aard van deze eiwitten en hun bindende partners maken het wijdst gebruikt technologieën, zoals affiniteit zuivering/massaspectrometrie (AP/MS) of gist-twee-hybride, ongeschikt voor detectie van interacties in de extracellulaire ruimte 2 , 3.
In een poging deze technische uitdagingen te overwinnen en de ontdekking van nieuwe interacties voor extracellulaire eiwitten versnellen, hebben we een hoge dekking extracellulaire eiwit microarray4,5. Microarrays bieden het voordeel van het genereren van high-density oppervlakken met kleine hoeveelheden van het monster, en zijn over het algemeen vatbaar voor hoge doorvoer studies. Eiwit microarray gebaseerde studies hebben eerder verstrekte relevante inzichten in eiwitinteractie voor verscheidene modelorganismen, zij het hoofdzakelijk gericht op cytosolische interacties of op specifieke proteïne gezinnen6,7, 8. Daarentegen heeft beperkt gewerkt om te onderzoeken van extracellulaire eiwitinteractie met behulp van deze technologie. We hebben een eiwit microarray methode ontwikkeld om bestudering van ePPIs mogelijk te maken door het bouwen van een uitgebreide en zeer divers bibliotheek van gezuiverde secreted eiwitten en één transmembraan (STM) receptoren uitgedrukt als recombinante extracellulaire domeinen (ECD) tot gesmolten gemeenschappelijke tags voor affiniteit zuivering4. Het succes van de eiwit microarray schermen leunt op de oprichting van een hoge kwaliteit eiwit bibliotheek. Voor de uitdrukking van de bibliotheek en de query eiwit, werden zoogdiercellen of insect cellen bij voorkeur gekozen als heterologe expressiesystemen, om goede toevoeging van posttranslationele modificaties zoals glycosylatie of dissulfide bindingen. SDS-pagina, grootte uitsluiting chromatografie en multi hoek laserlicht verstrooiing zijn technieken die vaak gebruikt om te beoordelen van de kwaliteit van recombinante eiwitten. De eiwit-bibliotheek is dan gespot in epoxysilane dia's en opgeslagen bij-20 ° C voor langdurig gebruik. Eiwit concentraties boven van 0,4 mg/mL worden aanbevolen voor het protocol die hieronder worden beschreven. Daarom uiten van lage eiwitten mogelijk een concentratie stap vóór monster afdrukken en opslag. Een belangrijkste voordeel van deze techniek is echter de kleine hoeveelheid eiwit nodig (50 μg van eiwit is voldoende om uit te voeren > 2.000 schermen), naast de minimale query eiwit consumptie (20-25 μg per duplicaten scherm). Met behulp van het protocol en de apparatuur die hier worden beschreven, en mits de bibliotheken beschikbaar zijn, resultaten voor afzonderlijke query eiwitten binnen één werkdag kunnen worden gegenereerd.
Een grote uitdaging voor het opsporen van eiwitinteractie in de extracellulaire omgeving vloeit voort uit hun typisch zwak of voorbijgaande aard, die zich verzet tegen de identificatie door de meest gebruikte methoden. Uitbreiding van de bindende avidity sterk verbetert de gevoeligheid voor de detectie van zwakke eiwit interacties9,10,11. Gebaseerd op dit principe ontwikkelden we een methode om multimerize de query eiwitten (uitgedrukt als Fc fusion) met behulp van eiwit A beklede kralen4,5. Om te voorkomen dat elke potentiële inactivering van het query-eiwit door willekeurige labeling, wij in plaats daarvan een irrelevant menselijk immunoglobuline met Cy5 label en erbij samen met de query-eiwit moet de EiwitA kralen, waardoor alle artefacten als gevolg van de directe vervoeging van een kleurstof voor de proteïne van belang. Gezien de micromolar verwantschappen van verschillende co receptor paren, verbeteren de multivalent complexen sterk signaal / ruisverhouding, in vergelijking met Fc-fusion query eiwitten gescreend als oplosbare eiwitten4.
Kortom is het doel van dit protocol voor het beschrijven van de voorbereiding van microarray dia's met een bestaande bibliotheek van extracellulaire proteïne voor identificatie van receptor-ligand interacties. We bekijken de stappen voor dia afdrukken, gevolgd door een protocol voor screening van een proteïne van belang tegen de extracellulaire proteïne-bibliotheek. Daarnaast beschrijven we een methode voor de verbeterde detectie van ePPIs gebaseerd op microbeads om hogere avidity van de eiwitten bestudeerde. De extracellulaire eiwit microarray technologie hier beschreven vertegenwoordigt een snelle, krachtige en effectieve benadering van screening en opsporen van roman ePPI met lage vals-positieve ratio's, en door gebruik te maken van enige microgram hoeveelheden van het query-eiwit onder onderzoek. Deze technologie heeft aangewakkerd meerdere studies die relevante inzichten in voorheen onbekende cellulaire functies en signaalroutes hebben gezorgd voor een verscheidenheid van receptoren12,13, met inbegrip van virale immunoregulators14, en kan worden gebruikt om de orphanize elke extracellulaire proteïne van belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generatie van een bibliotheek van extracellulaire menselijke eiwitten
- Een lijst samenstellen van cel oppervlakte receptoren of secreted proteïnen van belang voor de eiwit microarray bibliotheek bouwen. Specifieke proteïne families (bijvoorbeeld de immunoglobuline superfamilie) of eiwitten selectief aangegeven met name cel typen kunnen worden geselecteerd voor de studie.
- Voor oppervlakte cel receptoren, bepalen de extracellulaire domeingrenzen (ECD) door het identificeren van de signaal-peptide en transmembraan regio's met behulp van softwaretools. Sommige van de relevante instrumenten, vrij beschikbare online, wordt verwezen in de Tabel van materialen15,16,17,18.
- Het ECD voor de genen van belang en kloon synthetiseren in de relevante vector. Secreted eiwitten of het ECD van STM-receptoren gesmolten tot een aantal gemeenschappelijke affiniteit tags gezuiverd kunnen worden vanuit de geconditioneerde media van cellen transfected met de juiste vector of vanuit baculovirus-insect cel expressiesystemen.
Opmerking: Zoogdieren cel-gebaseerde systemen (zoals HEK/293 of CHO cellen) worden aanbevolen om de kans op goede eiwitvouwing en toevoeging van relevante posttranslationele modificaties zoals glycosylatie te maximaliseren. - Het zuiveren van de eiwitten door standaard affiniteit zuivering methoden. Eerdere pogingen hebben beschreven automatische of semi-geautomatiseerde procedures voor zuivering van eiwitten, die kunnen worden aangepast voor het genereren van de set van proteïnen van belang9,19,20, honderden geschikte 21.
Opmerking: SDS-pagina, chromatografie (S) van de uitsluiting van de grootte of multi hoek laser licht verstrooiing (WINKELCENTRA) worden aanbevolen beoordelen van elke niet-covalente aggregatie en besturing voor de algehele kwaliteit van de voorbereidingen van het eiwit. - Aanpassen van eiwitten tot 200 of 400 μg/mL zoveel mogelijk, en verdunnen van de voorraden met 80% glycerol voor langdurige opslag in cryogene flesjes bij-20 ° C. Deze master voorraden vertegenwoordigen en slechts wanneer noodzakelijk moeten worden benaderd.
- Aliquots van elke proteïne (100 μl) overbrengen in 96-wells-platen (voorraad platen), verzegelen met zelfklevende folie en opslaan bij-20 ° C tot microarray prepareren van objectglaasjes. Voorraad platen worden gegenereerd om te minimaliseren van cycli bevriezen-ontdooien en zorgen van eiwitstabiliteit.
2. de extracellulaire eiwit Microarray afdrukken
- Gebruik een standaard microarrayer voor dia-afdrukken. Het instrument gebruikt voor het protocol hier beschreven heeft een capaciteit van 57 dia's / uitvoeren en een printkop holding 48 spotten pinnen gebruikt. Deze pinnen genereren plekken van ~ 100 μm diameter gescheiden door een afstand van de plek-naar-spot van ~ 350 μm en trekt 0,25 μL per lading. Onder deze configuratie, een tot 8.000 plekken per dia kan worden ondergebracht.
- Genereer werken platen (384 goed platen, 10 μL monster per putje) uit de voorraad platen. Voer deze stap handmatig voorafgaand aan dia-afdrukken met behulp van de microarrayer. Vervolgens ter plaatse eiwitten met ganzenveer-type spotten pinnen in epoxysilane dia's op 60% vochtigheid (om uitdroging te voorkomen van de vlekken van eiwit).
Opmerking: Cy3-geëtiketteerden bovien serumalbumine (BSA) kunnen worden gespot in duplicaten tussen elke eiwitSteekproef (5 μg/mL in PBS/40% glycerol) om te visualiseren de matrix voor het masker aanbrengen (zie punt 4). Hoewel aanbevolen, is deze stap optioneel. - Na afdrukken, verwijdert u de eiwit microarray dia's uit de bevochtigde omgeving en blokkeren ze 's nachts met 5% melk in PBST naar de inactivering van het oppervlak.
Opmerking: De voorkeurs benadering is het gebruik van een ultrasone rookmachine voor het genereren van een fijne nevel van het blokkeren van de oplossing die vestigt zich op de dia-oppervlak. - Dia's bij-20 ° C opslaan in 50% glycerol ter voorkoming van bevriezing.
3. bereiding van Multivalent aas complexen
Opmerking: Interacties tussen extracellulaire eiwitten worden vaak gekenmerkt door lage verwantschappen. Als u wilt inschakelen van detectie van deze interacties doordat bindende avidity, een multivalent aanpak gebaseerd op het vastleggen van het query-eiwit, uitgedrukt als Fc-gelabeld ECD, was op eiwit A beklede microbeads ontwikkelde4.
- Label de vervoerder IgG gebruikt voor de detectie met Cy5 monoreactive kleurstof en de gratis kleurstof met behulp van demineralisatie kolommen scheiden. De kleurstof aan eiwit verhoudingen bepalen door het meten van de ultraviolette absorptie bij 280 en 650 nm.
Opmerking: Eiwit-kleurstof verhoudingen tussen 2.0 en 4.0 worden normaal gebruikt. Het is aanbevolen om de spin van de geconjugeerde Cy5 bij 100.000 x g gedurende 15 min om potentiële oplosbare aggregaten als gevolg van de labeling proces. - Bepalen van de optimale microbead-naar-eiwitverhouding door titratie van EiwitA tegen een constante hoeveelheid eiwit van de query. De minimale hoeveelheid saturating kralen waar geen gratis Fc-gelabeld eiwit blijft, wordt zoals gemeten met behulp van een concurrerende assay bepaald door biolayer interferometrie, gebruikt voor de screening.
- De microbead-eiwitcomplexen vormen door het broeden van de query Fc-gelabeld en de Cy5-IgG met EiwitA microbeads en meng op een rotator van de buis in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
- Om deze complexen, gebruik van de query-eiwit op een eindconcentratie van 20 μg/mL. Voor het berekenen van de molaire verhouding van de query eiwitten en Cy5-IgG, verdeel het molecuulgewicht van het query-eiwit door het molecuulgewicht van de IgG (150.000 Da) en vermenigvuldig met 40 μg/mL tot het bepalen van de concentratie van Cy5-IgG nodig.
- Monsters met oplosbaar eiwit een (1 mg/mL) onmiddellijk voorafgaand aan de incubatie met de microarray dia's (zie 4.2 hieronder) om te voorkomen dat de binding van een gratis eiwit A kralen aan de Fc fusie-eiwitten die mogelijk aanwezig zijn op de matrix te vullen.
Opmerking: De uiteindelijke reactie volume kan variëren afhankelijk van de kruising station of incubatie kamer gebruikt. De instrumentatie die is beschreven in de Tabel van materialen kunt monster incubatie gebruik van relatief kleine volumes (~ 200 μL per dia).
4. extracellulaire eiwit Microarray Screening en verwerking.
Opmerking: Er zijn een aantal fabrikanten die geautomatiseerde verwerking platforms bieden. Als een kruising-station niet beschikbaar is, de volgende stappen kunnen handmatig worden uitgevoerd, om ervoor te zorgen dat er voldoende hoeveelheid buffer te houden van de dia's ondergedompeld te allen tijde.
- Warm de dia's bij kamertemperatuur en spoel met PBS/0.1% Tween 20 (PBST) residuele glycerol vóór het laden op de kruising station verwijderen.
- Gebruik het volgende screening-protocol:
- Wassen met PBST voor 1 min.
- Laden van 200 μL van 1 mg/mL EiwitA in PBS/5% melk en incubeer gedurende 30 minuten om te voorkomen dat uncomplexed eiwit een microbeads van bindende aan Fc-gelabelde proteïnen die mogelijk aanwezig zijn in de microarray.
- Wassen vijf keer met PBST voor 1 min.
- Laden van 200 μL van de query: microbeads complex in aanwezigheid van 1 mg/mL EiwitA en incubeer gedurende 30 min.
- Wassen met PBST voor 1 min.
- Na kruising, spoel van dia's met water, plaats in individuele 50 mL conische buisjes en droog door spinnen bij 900 x g gedurende 5 min.
- Ten slotte, scannen de dia's met een microarray scanner te detecteren Cy3 (als BSA-Cy3 is afgedrukt) en Cy5 fluorescentie spannend op 532 en 635 nm, respectievelijk.
- Uitvoeren van data-analyse met behulp van de bijbehorende microarray gegevensanalyse. De lijst van de relevante matrix (als een .gal-bestand) wordt geladen in de software van de extractie van de gegevens. Gebruiken in dit stadium de Cy3-BSA plekken om te zoeken van blokken en gebruik de auto-montage-opties in de software, gevolgd door handmatige aanpassing van de functies wanneer dat nodig is. Bestanden opslaan als .gpr bestanden voor verdere analyse.
5. de gegevensanalyse
- Gegevens opslaan als GPR bestanden en processen in R met het limma pakket, vaak gebruikt voor analyse van microarray gegevens4,5.
- Voor het voorbewerken, achtergrond correctie en de binnen-dia normalisatie. Aangezien elke proteïne wordt afgedrukt in de gedupliceerde vlekken, combineren beide repliceren metingen te maken van een enkele score voor dat eiwit in de bibliotheek.
- Scores voor elke dia te berekenen en analyseren van de resultaten voor het snijpunt van hoog scoren kandidaten tussen dia's.
- Gebruik van dubbele microarrays van afzonderlijke afdrukken-punten om te bepalen voor dia variabiliteit en snijpunt percelen die gegevens uit beide schermen Bel van de laatste hits.
- Tot slot voeren een extra niveau van het filtreren om uit te sluiten van de promiscue eiwitten binnen de matrix. Dergelijke niet-specifieke bindmiddelen zijn geïdentificeerd als eiwitten meer dan een bepaalde drempel frequentie hit zoals gedefinieerd door de gebruiker over onafhankelijk schermen.
Opmerking: Dit protocol wordt gedetailleerd beschreven in Tom et al. 20135. In ons geval de aspecifieke binder bellen is gebaseerd op de bepaling van de cumulatieve prooi hit rate, en een gegevensgestuurde eliminatie drempel van 5% wordt gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematische voorstelling van de workflow voor de extracellulaire eiwit microarray technologie is afgebeeld in Figuur 1. Zodra de microarray dia's met de extracellulaire proteïne bibliotheek beschikbaar zijn, kan de screening van de proteïne van belang en data analyse binnen één dag worden voltooid. Vele fysiologisch relevante interacties tussen membraan-embedded receptoren worden gekenmerkt door zeer zwak bindende kracht (KD in de micromolar bereik). Ter verbetering van de opsporing van dergelijke interacties, werd een methode gebaseerd op query eiwit (uitgedrukt als Fc fusion) multimerization op eiwit A-microbeads ontwikkeld. Dit protocol wordt beschreven in de tekst, en een representatief exemplaar van de prestaties van deze benadering voor verbeterde detectie van PPI is afgebeeld in Figuur 2.
Een representatief voorbeeld van een eiwit microarray scherm wordt weergegeven in Figuur 3. In het voorbeeld, een zwevend menselijke adenovirus immunomodulerende eiwit wordt vertoond voor interacties tegen een bibliotheek die bestaat uit meer dan 1.500 receptor ECD of uitgescheiden eiwitten14. Zoals is beschreven, is het ECD van de virale eiwitten recombinantly uitgedrukt als een fusieproteïne Fc en vervolgens geïncubeerd met eiwit A beklede microbeads om multivalent complexen. De eiwitcomplexen werden onderzocht met behulp van een kruising-station om te minimaliseren van handmatige bewerkingen, vergelijkbare schermen kunnen echter worden uitgevoerd met behulp van een hybridisatie kamer of vergelijkbare apparaten. Het is aangeraden om uit te voeren van de dubbele schermen met behulp van dia's afgedrukt in aparte spotten punten om te controleren voor elke variabiliteit tijdens de oplage. De figuur toont de resulterende snijpunt percelen van dubbele, onafhankelijke schermen. Positieve interacties en algemene achtergrond van de dia worden gemakkelijk gevisualiseerd op het scannen van de platen (Cy5 fluorescentie), vergemakkelijking van hit roeping. Opmerking het wordt aangeraden om ter plaatse van elke receptor in de bibliotheek in duplicaten teneinde hit vertrouwen. Voor de meeste query eiwitten, geen, één, of enkele klappen in acht worden genomen, tonen de specificiteit van de methode voor de detectie van PPIs.
Bepaalde eiwitten query weergegeven hoge achtergrond als gedetecteerd door binding aan een ongewoon hoog aantal eiwitten binnen de matrix en/of de dia. In onze ervaring, wordt dergelijke niet-specifieke achtergrond waargenomen voor slechts een klein aantal eiwitten. Verschillende factoren met betrekking tot de aard van het eiwit kunnen beïnvloeden van niet-specifieke interacties, zoals erkenning van glycosylatie motieven. Figuur 3 toont een voorbeeld van een virale eiwitten gescreend tegen de microarray-bibliotheek die toonde de hoge achtergrond, uitschakeling van de identificatie van specifieke hits. Terwijl kleine wijzigingen in het protocol kunnen worden beschouwd als achtergrond (zoals verhoogde zout of wasmiddel concentratie), afname van deze gevallen is het aanbevolen om het verkennen van alternatieve methoden voor het deorphanization van de eiwitten bestudeerde.
Figuur 1: extracellulaire proteïne microarrays voor snelle en robuuste identificatie van receptor-ligand interacties. (Stap 1) Een bibliotheek van extracellulaire proteïnen van belang wordt gecompileerd. (Stap 2) De gezuiverde eiwitten zijn afgedrukt op epoxysilane dia's een microarray-printer gebruikt en opgeslagen bij-20 ° C. (Stap 3) De query proteïne van belang is multimerized op microbeads voor hogere avidity en opsporing van voorbijgaande eiwit-eiwitinteractie. Een fluorescerend IgG is complexvorm met de query: microbeads als inerte gelabelde drager. (Stap 4) Screening voor bindende partners van een query-eiwit. De fluorescerende query eiwit complex wordt tegen de extracellulaire eiwit microarray met behulp van een kruising station voor verwerking van geautomatiseerde dia vertoond. (Stap 5) Dia's worden vervolgens gevisualiseerd met behulp van een scanner microarray. De BSA-Cy3 vlekken kunnen worden waargenomen in de 535 nm-kanaal en de hits opgeleverd van het scherm kunnen worden waargenomen als dubbele spots op 635 nm. Data-analyse voor hit bellen wordt uitgevoerd door het creëren van de percelen van het snijpunt van twee onafhankelijke experimenten. Hits worden genoemd op basis van wederzijds hoge scores boven achtergrond, zoals beschreven in de sectie protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: verbeterde signaal via de vorming van multivalent complexen voor de proteïne van de query. (A) Multimerization van query eiwitten. Query eiwitten zijn uitgedrukt als recombinante Fc fusies en gekoppeld aan eiwit A microbeads naar formulier multimerized complexen. (B) hoge-avidity leidt tot opsporing van lage affiniteit interacties. De avidity die worden geboden door de multimerized eiwit queryresultaten in de stabilisering van de zwakke interacties op de eiwit microarray, wat leidt tot hogere signaal ruisverhoudingen en verbeterde hit roeping. Percelen toont de resultaten van de screening voor CD200, als een microbead complex gescreend of een oplosbaar eiwit direct gelabeld met Cy5 kleurstof om visualisatie van de hits. Multimerization (rode balken) maakt de robuuste ontdekking van de lage affiniteit bindende partner CD200R1, aanwezig in de eiwit microarray bibliotheek, met belangrijke signaal/ruis verhouding ten opzichte van hetzelfde eiwit vertoond als een oplosbare product (blauwe staven). Grijze balken geven aan niet-specifieke bindmiddelen. Alleen de top 10 interacties zijn vertegenwoordigd in het proefvlak. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: eiwit microarray technologie voor de identificatie van nieuwe receptor-receptor virus-gastheer interacties. (A) voorbeeldige receptor ontdekking resultaten voor een zwevend adenovirale immunomodulerende eiwit. Afbeeldingen vertegenwoordigen feitelijke microarray scans, tonen treffers van eiwitten gespot in duplicaten (rood). Testen worden uitgevoerd in controle voor elke dia variabiliteit, en de resultaten weergegeven als snijpunt percelen van duplicaten. In de percelen die de rode en blauwe stippen hits alleen opgeroepen een array repliceren, terwijl zwarte stippen kruisende hits uit beide onafhankelijke runs vertegenwoordigen. De gehele microarray bibliotheek wordt afgedrukt op twee dia's voor gebruiksgemak, gezien het aantal eiwitten aanwezig in de collectie, en te zorgen voor een voldoende scheiding voor elke individuele proteïne gespot op de matrix. (B) virale eiwitten scherm vertoont hoge achtergrond die uitsluit sloeg roeping. Bepaalde eiwitten query kunnen hoge achtergrond, weergeven, zoals gedetecteerd door binding aan meerdere eiwitten en/of de dia's, dus poseren uitdagingen voor identificatie van hoog scoren hits. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een aanzienlijk aantal gekoppelde receptoren blijven in het menselijk genoom, en roman interagerende partners blijven voor extracellulaire eiwitten met eerder gekarakteriseerd liganden ontstaan. Vaststelling van de receptor-ligand interacties in mens en modelorganismen is essentieel om te begrijpen van de mechanismen die de cellulaire communicatie tijdens de homeostase, evenals disregulatie leidt tot ziekte dicteren en daarom nieuwe of verbeterde kennis therapeutische opties. Detectie van extracellulaire eiwitinteractie door gebruikte technologieën heeft echter een belangrijke barrière voornamelijk te wijten aan de technische uitdagingen in verband met de biochemie van de cellulaire receptoren en hun interactie partners vertegenwoordigd. In dit rapport beschrijven we het gebruik van een extracellulaire eiwit microarray voor screening van query proteïnen van belang, met nadruk op het gebruik van microbead complexen voor verbeterde detectie van PPIs.
Indringende receptor-receptor interakties vormt een bijzondere uitdaging, zoals vele fysiologisch relevante paren worden gekenmerkt door zeer zwakke kernkracht met bindende affiniteiten in de micromolar bereik2,3. Avidity verbetering via multimerization heeft bewezen een bruikbare strategie aan het verhogen van de gevoeligheid voor de detectie van lage affiniteit PPIs. We hebben een methode gebaseerd op Fc fusion eiwitten, voor efficiënte vorming van multivalent microbead-eiwit query complexen4ontwikkeld. Multimerization van het query-eiwit is een belangrijke stap naar het opsporen van lage affiniteit PPIs. Zoals aangetoond in het voorbeeld in Figuur 2, verhoogt deze methode aanzienlijk signaal in vergelijking met de dezelfde query proteïne vertoond als een oplosbare (niet-complexvorm) analyt, met behoud van minimaal achtergrond. Als alternatief, de eiwit microarray schermen kunnen worden uitgevoerd met oplosbare Cy5-geëtiketteerden query eiwit, een aanpak die compatibel is met een fusie-code en dat kan volstaan voor de identificatie van stabieler, hogere affiniteit interacties, zoals die tussen Sommige oplosbare liganden en hun receptoren. Opgemerkt moet worden dat, omdat de avidity wordt verhoogd door de multimerization van de query op microbeads, het microarray signaal niet een kwantitatieve maat voor de sterkte van de interactie is. Bindende affiniteiten moet daarentegen worden berekend met de monomere versies van de eiwitten onder evaluatie. Bovendien is het zeer raadzaam dat alle hits geïdentificeerd door middel van de microarray technologie worden gevalideerd via onafhankelijke methoden. We gebruiken regelmatig oppervlak plasmon resonantie als een gouden standaard biofysische methode voor PPI studies en meting van de bindende kinetiek.
Hoewel buiten het bereik van dit verslag, moet worden opgemerkt dat het succes van de inspanningen van een screening met behulp van de microarray technologie sterk afhankelijk van de selectie en de beschikbaarheid van een hoge kwaliteit eiwit bibliotheek is. Relevante criteria voor selectie van extracellulaire eiwitten geweest eerder gepubliceerde4,22. Een aantal nuttige hulpmiddelen voor voorspelling van relevante eiwit functies (zoals transmembraan helices of signaal peptiden) zijn vrij online beschikbaar, met inbegrip van de volgende servers: SignalP15, TMHMM16, Phobious17en TOPCONS 18. uitstekende methoden papers beschrijven affiniteit zuivering methoden zijn beschikbaar elders. Ook moet worden vermeld dat de microarray eiwit bibliotheek generatie is gebaseerd op de productie van eiwitten ECDs als oplosbare recombinante producten en daarom deze aanpak studies toelaat van type I, type II en GPI-verankerd cel receptoren oppervlakte en uitgescheiden eiwitten, maar is over het algemeen niet geschikt voor multitransmembrane-bevattende eiwitten zoals G eiwit-gekoppelde receptoren. De zuivering van honderden eiwitten als recombinante oplosbare eiwitten vereist aanzienlijke logistieke inspanningen en kan zeer resource - en tijdrovend. Echter met de verminderde kosten van gene synthese en grotere gegevensdoorvoer van de reinigingssystemen van eiwit, bibliotheek generatie is nu relatief sneller en meer betaalbaar. Anderzijds bieden commerciële bronnen gezuiverde extracellulaire eiwitten die kunnen worden gekocht in microgram bedragen, die voldoende voor de generatie van een duurzaam eiwit microarray bibliotheek gezien de kleine eisen voor dia-afdrukken zijn. Deze beperkingen ondanks biedt microarray technologie grote voordelen zoals minimale consumptie van eiwitten reagentia, snelle uitlezingen (nieuwe PPIs kunnen worden geïdentificeerd binnen één dag) en betaalbare instrumentatie. Bovendien, zodra de constructies en zuivering voorwaarden zijn vastgesteld, kunnen kleinschalige zuivering produceren genoeg materiaal om voor te bereiden van duizenden van arrays.
Ten slotte, in sommige gevallen relatief hoge achtergrond wordt waargenomen, verschijnen als bindend te veel eiwitten op de microarray-bibliotheek. Er zijn meerdere factoren die van invloed kunnen zijn op niet-specifieke binding. Bijvoorbeeld, sommige eiwitten sterk kunnen worden gebracht, of een wisselwerking met koolhydraten, administratieve verwerking van niet-specifieke achtergrond via de erkenning van gemeenschappelijke motieven. Ook kan niet-specifieke binding ook worden vanwege de aard van het query-eiwit, zoals bijvoorbeeld de erkenning van sialic zuur motieven, gevonden in meerdere andere eiwitten. Als de microarray bibliotheken uit te breiden, het is waarschijnlijker dat dat een gemeenschappelijke lijst van niet-specifieke bindmiddelen aanwezig zou kunnen zijn. Dergelijke niet-specifieke bindmiddelen kunnen worden geïdentificeerd door het bijhouden van hun gedrag over verschillende schermen tegen onafhankelijke query proteïnen. Het is raadzaam voor het genereren van een lijst van niet-specifieke bindmiddelen over schermen, om specifieke hit roeping. In ons geval hebben we gevonden dat het toepassen van een 5% cutoff (dat wil zeggen, een proteïne is gemarkeerd als niet-specifieke als gedetecteerd als bindmiddel 5% of meer onafhankelijke query eiwit schermen is) belangrijk is om valse positieven. Opgemerkt moet worden dat als het belangrijkste doel van de tests uit te voeren slechts een paar geselecteerde schermen is het wellicht niet de moeite waard om een statistische analyse. In dit geval het wellicht niet haalbaar is om het detecteren van valse positieven als gevolg van een beperkte gegevensset, en daarom is het raadzaam dat bijzondere nadruk wordt gelegd op de bevestiging van de hits met alternatieve methodes.
We anticiperen op dat de extracellulaire proteïne microarrays, vooral in combinatie met multimerization methoden voor de detectie van voorbijgaande receptor-ligand interacties, zal blijven bieden een uniek platform voor snelle en robuuste identificatie van roman PPI in de extracellulaire ruimte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.H., S.R-R en N.M-M. zijn Genentech werknemers en eigen aandelen in de groep van Genentech Inc/Roche.
Acknowledgments
Wij danken Philamer Calses en Kobe Yuen voor het kritisch lezen van het manuscript. Wij zijn dankbaar Randy Yen voor uitstekende technisch advies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
- Ramani, S. R., et al. A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery. Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).
- Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).
- Kaushansky, A., et al. Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays. Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
- Voulgaraki, D., et al. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).
- Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia. Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).
- Jaworski, A., et al. Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2. Science. 350 (6263), 961-965 (2015).
- Martinez-Martin, N., et al. The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation. Nature Communications. 7, 11473 (2016).
- Nielsen, H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).
- Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).
- Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology. Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).
- Gonzalez, R., et al. Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).
- Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).
- Clark, H. F., et al. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).
