Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para tela extracelular da proteína microarrays para identificação de interações ligante-receptor romance em alta taxa de transferência. Também descrevemos um método para realçar a deteção de interações da proteína-proteína transiente usando complexos proteína-Microconta.
Abstract
Fatores secretados, receptores de membrana-amarrados e seus parceiros de interação são os principais reguladores da comunicação celular e início de cascatas de sinalização durante a homeostase e a doença e como tal representam alvos terapêuticos. Apesar de sua relevância, estas redes de interação permanecem significativamente sub-representados em bancos de dados atuais; Portanto, mais proteínas extracelulares não tem nenhum parceiro de vinculação documentada. Esta discrepância deve-se principalmente os desafios associados com o estudo das proteínas extracelulares, incluindo a expressão de proteínas funcionais e a fraca, baixa afinidade, interações proteína frequentemente estabelecidas entre receptores de superfície celular. A finalidade desse método é descrever a impressão de uma biblioteca de proteínas extracelulares em um formato de microarray para rastreio de interações da proteína-proteína. Para habilitar a detecção de interações fracas, é descrito um método baseado na multimerization da proteína consulta sob estudo. Acoplado a essa abordagem baseada em Microconta multimerization para multivalency de aumento, o microarray da proteína permite a detecção robusta de interações da proteína-proteína transitória em alta taxa de transferência. Este método oferece uma amostra rápida e baixo consumo-abordagem para identificação de novas interações aplicáveis para qualquer proteína extracelular. Impressão de microarray de proteína e protocolo de triagem são descritos. Esta tecnologia será útil para os investigadores procuram um método robusto para descoberta de interações da proteína no espaço extracelular.
Introduction
O método aqui analisado descreve a impressão de uma coleção de proteínas extracelulares em um formato de microarray, seguido por um método para a seleção de um alvo de interesse com esta biblioteca. Nós identificamos proteínas multimerization como um passo crucial para a deteção de interações caracterizada por afinidades de ligação baixa. Para realçar a deteção dessas interações, descrevemos um protocolo baseado em multimerization da proteína de interesse usando microbeads consulta.
Segregada e célula superfície-expresso proteínas (coletivamente denominadas proteínas extracelulares) juntamente com seus parceiros de interação são reguladores chaves da comunicação celular, sinalização e interação com o microambiente. Eles são, portanto, essenciais na regulação de muitos processos fisiológicos e patológicos. Aproximadamente um quarto do genoma humano (≈5, 000 proteínas) codifica para proteínas extracelulares, que, dado o seu significado e acessibilidade às drogas sistematicamente entregues, representam os principais alvos para o desenvolvimento de drogas1. Consequentemente, as proteínas extracellular representam mais de 70% das metas de proteína com ação farmacológica conhecido por drogas aprovadas no mercado, conhecido como o "proteome druggable". Apesar da sua importância e abundância, as redes de interação (ePPI) da proteína-proteína extracelular permanecem notavelmente sub-representados nos bancos de dados disponíveis. Isto é, fundamentalmente, devido à natureza complexa bioquímica das proteínas extracelulares, que impede a sua caracterização usando mais disponíveis tecnologias2. Em primeiro lugar, as proteínas de membrana são difíceis de solubilizar, um processo que muitas vezes envolve lavagem duras condições e detergentes; em segundo lugar, as proteínas extracellular faltam frequentemente relevantes modificações borne-translational como glicosilação que estão ausentes quando estas proteínas são expressas em comumente utilizados sistemas heterólogos. Finalmente, interações entre receptores, tais como co receptores expressados em células do sistema imunológico, são muitas vezes transitórios e caracterizada por afinidades muito baixas (KD no ~ 1 μM para > intervalo de 100 μM). No total, a natureza destas proteínas e sua vinculação parceiros processam mais amplamente utilizadas tecnologias, tais como espectrometria de massa/purificação de afinidade (AP/MS) ou fermento-dois-híbrido, impróprio para a deteção das interações no espaço extracelular 2 , 3.
Em um esforço para superar esses desafios técnicos e acelerar a descoberta de novas interações para proteínas extracelulares, desenvolvemos uma cobertura alta proteína extracelular microarray4,5. Microarrays oferecem a vantagem de gerar superfícies de alta densidade com pequenas quantidades de amostra e são geralmente favoráveis aos estudos de alto rendimento. Proteína microarray baseado em estudos anteriormente forneceu insights relevantes sobre interações da proteína por vários organismos-modelo, embora concentrando-se principalmente no citosol interações ou na proteína específica famílias6,7, 8. Em contraste, limitado de trabalho tem sido feito para investigar interações de proteínas extracelulares usando esta tecnologia. Nós desenvolvemos um método de microarray da proteína para permitir estudos de ePPIs através da construção de uma biblioteca abrangente e altamente diversa de proteínas purified segregadas e único receptores transmembranares de (STM) expressaram como recombinação domínios extracelulares (ECD) fundidos a tags comuns para afinidade purificação4. O sucesso das telas do microarray da proteína baseia-se fortemente sobre a criação de uma biblioteca de proteína de alta qualidade. Para a expressão da proteína de biblioteca e consulta, nas células de mamíferos ou insetos foram preferencialmente escolhidos como sistemas de expressão heteróloga, para garantir a adequada adição de modificações borne-translational como glicosilação ou dissulfureto de títulos. SDS-PAGE, cromatografia de exclusão e espalhamento de luz laser de multi-ângulo são técnicas comumente utilizadas para avaliar a qualidade da proteína recombinante. A biblioteca de proteína é então manchada em epoxysilane slides e armazenada a-20 ° C para uso a longo prazo. As concentrações de proteína acima de 0,4 mg/mL são recomendadas para o protocolo descrito abaixo. Portanto, baixa-expressando proteínas podem exigir uma etapa de concentração antes da impressão de amostra e armazenamento. No entanto, a principal vantagem desta técnica é o pequeno volume de proteína necessária (50 μg de proteína é suficiente para executar > 2.000 telas), juntamente com o consumo de proteína de consulta mínima (20-25 μg por tela de duplicatas). Usando o protocolo e o equipamento descrito aqui, e desde que as bibliotecas estão disponíveis, resultados para proteínas de consultas individuais podem ser gerados dentro de um dia de trabalho.
Um grande desafio na detecção de interações da proteína no meio extracelular decorre sua natureza caracteristicamente fraca ou transitória, que impede a identificação por metodologias mais comumente usadas. A avidez de vinculação a aumentar grandemente melhora a sensibilidade para a deteção de proteínas fracas interações9,10,11. Baseado neste princípio que desenvolvemos um método para multimerize as proteínas de consulta (expressadas como fusão Fc) usando a proteína grânulos revestidos A4,5. Para evitar qualquer potencial inactivação da proteína consulta pela rotulagem aleatória, nós em vez disso rotular uma irrelevante a imunoglobulina humana G com Cy5 e adicioná-lo juntamente com a proteína de consulta para os grânulos de proteína A, eliminando assim qualquer artefatos devido a conjugação direta de um tintura à proteína de interesse. Tendo em conta as afinidades micromolar de vários pares de co do receptor, os complexos multivalentes aumentar consideravelmente o sinal à relação de ruído, em comparação com proteínas da consulta Fc-fusão selecionadas como proteínas solúveis4.
Em resumo, o objetivo do presente protocolo é descrever a preparação de microarray slides contendo uma biblioteca de proteína extracelular pré-existentes para identificação de interações ligante-receptor. Revemos as etapas para slide, impressão, seguido por um protocolo para a seleção de uma proteína de interesse contra a biblioteca de proteína extracelular. Além disso, descrevemos um método para a detecção avançada de ePPIs baseada microbeads para alcançar maior avidez da proteína em estudo. A tecnologia de microarray de proteína extracelular descrita aqui representa uma abordagem rápida, robusta e eficaz para a seleção e detectando ePPI romance com baixos índices de falso-positivos e utilizando apenas as quantidades de microgramas da proteína sob consulta investigação. Esta tecnologia tem alimentado vários estudos que forneceram insights relevantes sobre previamente desconhecida de funções celulares e vias de sinalização para uma variedade de receptores12,13, incluindo immunoregulators viral14, e pode ser utilizado para orphanize de qualquer extracelular da proteína de interesse.
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Protocol
1. geração de uma biblioteca de proteínas humanas extracelulares
- Compile uma lista de receptores de superfície celular ou proteínas secretadas de interesse para criar a biblioteca de microarray de proteína. Famílias de proteínas específicas (por exemplo, a superfamília das imunoglobulinas) ou proteínas seletivamente expressaram em particular célula tipos que podem ser selecionados para o estudo.
- Para receptores de superfície celular, determine os limites do domínio extracelular (ECD), identificando o peptídeo sinal e regiões transmembranares, usando ferramentas de software. Alguns dos relevantes ferramentas, disponível gratuitamente online, são referenciados na Tabela de materiais15,16,17,18.
- Sintetiza a ECD para os genes de interesse e clone para o vector relevante. Proteínas secretadas ou os receptores de ECD do STM fundidos a um número de marcas de afinidade comum podem ser purificados da mídia condicionada de células transfectadas com o vetor apropriado, ou de sistemas de expressão de células de baculovirus-inseto.
Nota: Sistemas de baseados em células mamíferos (como HEK/293 ou células CHO) são recomendados para maximizar a probabilidade do enovelamento de proteínas adequada e adição de relevantes modificações posttranslational como glicosilação. - Purifica as proteínas através de métodos de purificação da afinidade padrão. Esforços anteriores descreveram automatizados ou semi-automatizadas procedimentos adequados para a purificação de centenas de proteínas, que podem ser escaladas para gerar o conjunto de proteínas de interesse9,19,20, 21.
Nota: SDS-PAGE, cromatografia de exclusão (S) ou multi-ângulo laser luz espalhamento (shoppings) são recomendados para avaliar qualquer agregação não-covalente e controle para a qualidade geral de preparações de proteína. - Ajustar as proteínas para 200 ou 400 μg/mL, sempre que possível e diluir as existências com 80% de glicerol para armazenamento a longo prazo em frascos criogênicos, a-20 ° C. Estas representam estoques mestre e devem ser acessadas somente quando necessário.
- Transferir alíquotas de cada proteína (100 μL) para placas de 96 poços (estoque chapas), selar com folha adesiva e armazenar a-20 ° C até preparação de corrediça microarray. Placas de estoque são geradas para minimizar os ciclos de congelamento e descongelamento e garantir a estabilidade da proteína.
2. extracelular da proteína Microarray impressão
- Use um padrão microarrayer para impressão de slide. O instrumento utilizado para o protocolo descrito aqui tem uma capacidade de 57 slides/executar e usa uma cabeça de impressão segurando 48 pinos spotting. Esses pinos geram manchas de ~ 100 μm de diâmetro separados por uma distância ponto-a-ponto ~ 350 μm e desenha 0.25 μL por carga. Sob esta configuração, até 8.000 pontos por slide pode ser acomodado.
- Gere trabalho placas (384 placas bem, amostra de 10 μL/poço) as chapas em estoque. Execute esta etapa manualmente antes da impressão de slide usando o microarrayer. Em seguida, detectar proteínas com pinos de spotting quill-tipo sobre guias de epoxysilane em 60% de umidade (para evitar desidratação dos spots de proteína).
Nota: Cy3-rotulado albumina de soro bovino (BSA) pode ser vista em duplicatas entre cada amostra de proteína (5 μg/mL de glicerol PBS/40%) para visualizar a matriz de máscara montagem (ver secção 4). Embora seja recomendado, este passo é opcional. - Após a impressão, remover os slides de microarray da proteína do ambiente umidificado e bloqueá-los durante a noite com 5% de leite em PBST para inactivar a superfície.
Nota: A melhor abordagem é usar um nebulizador ultra-sônico para gerar uma névoa fina de bloqueio solução que liquida até a superfície do slide. - Armazenar slides a-20 º C em glicerol 50% para evitar o congelamento.
3. preparação dos complexos de isca multivalentes
Nota: Interações entre proteínas extracelulares são frequentemente caracterizadas por baixas afinidades. Para habilitar a detecção dessas interações, aumentando a avidez de vinculação, uma abordagem multivalentes baseada na captura da proteína de consulta, expressada como Fc-com a tag ECD, na proteína revestido A microbeads foi desenvolvido4.
- Rotular a transportadora IgG usado para detecção com Cy5 monoreactive corante e separar o corante livre usando colunas do desalting. Determine o corante para rácios de proteína através da medição ultravioleta absorbância em 280 e 650 nm.
Nota: Rácios de proteína-tintura entre 2.0 e 4.0 são normalmente utilizados. Recomenda-se girar os Cy5 conjugados a 100.000 x g durante 15 min remover potenciais agregados solúveis devido ao processo de rotulagem. - Determine a relação de Microconta-a-proteína ideal por titulação de proteína A contra uma quantidade constante de proteína a consulta. O volume mínimo de impregnação dos grânulos, onde permanece sem proteína livre Fc-marcados, como medido usando um ensaio competitivo determinado pela interferometria de biolayer, é usado para o rastreio.
- Formam os complexos de Microconta-proteína incubando a consulta Fc-tag e Cy5-IgG com proteína A microbeads e mistura em rotacao tubo em PBS por 30 min em temperatura ambiente protegida da luz.
- Para formar estes complexos, use a proteína de consulta em uma concentração final de 20 μg/mL. Para calcular a proporção molar da proteína de consulta e Cy5-IgG, dividir o peso molecular da proteína consulta pelo peso molecular do IgG (150.000 Da) e multiplique por 40 μg/mL para determinar a concentração de IgG-Cy5 necessário.
- Suplemento de amostras com uma (1 mg/mL), imediatamente antes da incubação com o microarray slides (ver seção 4.2 abaixo) para impedir a ligação de qualquer proteína livre A contas para as proteínas de fusão de Fc que podem estar presentes na matriz de proteína solúvel.
Nota: O volume final da reação pode variar dependendo da câmara de estação ou incubação de hibridação utilizada. A instrumentação descrita na Tabela de materiais permite a incubação de amostra usando volumes relativamente pequenos (~ 200 μL por slide).
4. extracelular da proteína Microarray, triagem e processamento.
Nota: Há um número de fabricantes que oferecem plataformas de processamento automático. Se não houver uma estação de hibridação, as seguintes etapas podem ser executadas manualmente, garantir que não há volume suficiente de buffer para manter os slides submerso em todos os momentos.
- Aquecer as lâminas à temperatura ambiente e enxágue com PBS/0.1% Tween 20 (PBST) para remover o glicerol residual antes do embarque para a estação de hibridação.
- Use o seguinte protocolo de triagem:
- Lavar com PBST por 1 min.
- Carregar 200 μL de proteína 1 mg/mL A PBS/5% leite e incube por 30 min evitar uncomplexed proteína um microbeads de ligação às proteínas Fc-marcados que podem estar presentes no microarray.
- Lave cinco vezes com PBST por 1 min.
- Carregar 200 μL de consulta: microbeads complexa na presença de proteína 1 mg/mL A e incube por 30 min.
- Lavar com PBST por 1 min.
- Após a hibridização, slides com água de enxágue, coloque em tubos cónicos individuais de 50 mL e secar por girar a 900 x g por 5 min.
- Finalmente, digitalizar slides com um microarray scanner apropriado para detectar Cy3 (se foi impresso BSA-Cy3) e Cy5 fluorescência excitando a 532 e 635 nm, respectivamente.
- Realizar análise de dados utilizando a análise de dados microarray que acompanha. A lista de matriz relevantes (como um arquivo de .gal) é carregada no software de extração de dados. Nesta fase, utilize os pontos de Cy3-BSA para encontrar blocos e usar as opções de ajuste automático do software, seguido de alinhamento manual dos recursos quando necessário. Salve arquivos como arquivos de .gpr para posterior análise.
5. análise de dados
- Salve dados como arquivos GPR e processo em R usando o pacote se, comumente utilizado para a análise de dados de microarray4,5.
- Para pré-processamento, fundo de correção e normalização dentro do slide. Desde que cada proteína é impresso em duplicado spots, combine as duas medições replicar para criar um resultado individual para essa proteína na biblioteca.
- Partituras para cada slide de calcular e analisar os resultados para a interseção de alta pontuação candidatos entre os slides.
- Use microarrays duplicados de impressão-executa separado para controle variabilidade slide e usar parcelas de interseção que representa dados de ambas as telas para chamar os últimos chutos.
- Finalmente, execute um nível adicional de filtragem para excluir promíscuas proteínas dentro da matriz. Tais ligantes não-específicos são identificados como proteínas superior a um limite específico atingiu frequência conforme definido pelo usuário através das telas independentes.
Nota: Este protocolo é descrito em detalhes no Tom et al . 20135. No nosso caso o fichário específico chamado baseia-se na determinação do cumulativa presa a taxa de acerto, e um limiar de eliminação controlada por dados de 5% é usado.
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Representative Results
Um diagrama de fluxo de trabalho para a tecnologia de microarray de proteína extracelular é mostrado na Figura 1. Uma vez que os slides de microarray que contém a biblioteca de proteína extracelular estão disponíveis, o rastreio da proteína de interesse e análise de dados pode ser concluído dentro de um dia. Muitas interações fisiologicamente relevantes entre os receptores de membrana-incorporado são caracterizadas por forças de ligação muito fraca (KD na faixa de micromolar). Para melhorar a detecção de tais interações, foi desenvolvido um método baseado na consulta multimerization de proteínas (expressada em fusão Fc) na proteína A-microbeads. Este protocolo é descrito no texto, e um exemplo representativo do desempenho desta abordagem para a detecção avançada de PPI é mostrado na Figura 2.
Um exemplo representativo de uma tela de microarray da proteína é apresentado na Figura 3. No exemplo mostrado, uma proteína de imunomoduladores adenovírus humano órfão é projectada para interações contra uma biblioteca consiste em mais de 1.500 receptores ECD ou secretados proteínas14. Conforme descrito, o ECD da proteína viral é recombinantes expressas como uma proteína de fusão Fc e então incubada com proteína microbeads revestidos A fim de formar complexos multivalentes. Os complexos de proteína foram exibidos usando uma estação de hibridação para minimizar operações manuais, no entanto, telas semelhantes podem ser executadas usando uma câmara de hibridação ou dispositivos semelhantes. É aconselhável executar telas duplicadas usando slides imprimidos em separado corre manchar a fim de controlar qualquer variabilidade durante a tiragem. A figura mostra as parcelas resultantes do cruzamento de telas duplicadas, independentes. Interações positivas e fundo global de slide prontamente são visualizados mediante verificação das placas (fluorescência Cy5), facilitando a vocação de sucesso. Note que é recomendado para identificar cada receptor na biblioteca em duplicatas a fim de aumentar a confiança do sucesso. Para a maioria das proteínas de consulta, nenhum, observam-se um, ou alguns hits, demonstrando a especificidade do método de detecção de IPP.
Certas proteínas consulta mostram fundo elevado como detectado por ligação para um número invulgarmente elevado de proteínas dentro da matriz e/ou para o slide. Em nossa experiência, tal fundo específico é observado por apenas um pequeno número de proteínas. Diferentes factores relacionados com a natureza da proteína poderiam influenciar interacções não-específicas, tais como reconhecimento de motivos de glicosilação. A Figura 3 mostra um exemplo de uma proteína viral, protegido contra a biblioteca de microarray que mostrou o fundo elevado, impossibilitando a identificação de acessos específicos. Enquanto pequenas modificações no protocolo podem ser consideradas para diminuir o plano de fundo (como aumento de sal ou concentração de detergente), nestes casos é recomendável explorar métodos alternativos para o deorphanization da proteína em estudo.
Figura 1: proteína extracelular microarrays para identificação rápida e robusta de interações ligante-receptor. (Etapa 1) Uma biblioteca de proteínas extracelulares de interesse é compilada. (Etapa 2) As proteínas purified são impressos em epoxysilane slides usando uma impressora de microarray e armazenadas a-20 ° C. (Etapa 3) A proteína de consulta de interesse é multimerized na microbeads para maior avidez e detecção de interações da proteína-proteína transitória. Uma fluorescente IgG é complexado com a consulta: microbeads como portador rotulado inerte. (Passo 4) Triagem para parceiros de ligação de uma proteína de consulta. A proteína fluorescente consulta complexa é projectada contra o microarray da proteína extracelular usando uma estação de hibridização para o processamento automatizado de slide. (Etapa 5) Slides são então visualizados usando um scanner de microarray. As manchas de BSA-Cy3 podem ser observadas no canal 535 nm e os sucessos que renderam a partir da tela podem ser observados como pontos duplicados em 635 nm. Análise de dados para o hit chamada é executada, criando lotes de interseção de dois experimentos independentes. Sucessos são chamados com base em mutuamente altos escores acima do fundo, conforme descrito na seção de protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: sinal melhorada através da formação de complexos polivalentes para a proteína de consulta. (A) Multimerization de proteínas de consulta. Consulta as proteínas são expressas em recombinante Fc fusões e acopladas aos microbeads de A proteína para formar complexos multimerized. (B) alta avidez leva à detecção de interações de baixa afinidade. A avidez proporcionada pelos resultados da proteína de consulta multimerized na estabilização de interações fracas em microarray da proteína, levando a maior sinal para rácios de ruído e melhorada chamada sucesso. Parcelas mostra resultados de rastreio para CD200, projectado como uma Microconta complexa, ou uma proteína solúvel diretamente rotulado com tintura de Cy5 permitir a visualização dos hits. Multimerization (barras vermelhas) permite a detecção robusta do parceiro de ligação de baixa afinidade CD200R1, presente na biblioteca de microarray de proteína, com relação sinal/ruído significativo em comparação com a mesma proteína projectada como um produto solúvel (barras azuis). Barras cinzentas indicam ligantes não-específica. Só as top 10 interações tem sido representadas na trama. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: proteína microarray tecnologia para identificação de interações do vírus-anfitrião de romance do receptor-receptor. (A) resultados de descoberta exemplar do receptor para um órfão immunomodulatory adenovírus proteína. Imagens representam varreduras de microarray real, mostrando correspondências a partir de proteínas manchadas em duplicatas (vermelho). Ensaios são realizados em duplicatas para controle para qualquer slide variabilidade e resultados representados como parcelas de interseção. Nas tramas, os pontos vermelhos e azuis representam hits chamados apenas em uma matriz replicar, Considerando que os pontos pretos representam a interseção de sucessos de ambas as execuções independentes. A biblioteca inteira de microarray é impresso em duas lâminas para facilidade de uso, dado o número de proteínas presentes na coleção e para assegurar uma separação suficiente para cada proteína individual manchada na matriz. (B) tela de proteína Viral exibindo o fundo elevado que impede bateu chamando. Certas proteínas consulta podem exibir fundo elevado, como detectado por ligação a proteínas múltiplas e/ou os slides, portanto, colocando desafios para identificação dos sucessos de Pontuação altas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um número significativo de órfãos receptores permanecem no genoma humano, e novos parceiros de interação continuam a emergir para proteínas extracelulares com ligantes anteriormente caracterizadas. Definindo as interações ligante-receptor em humanos e organismos modelo é essencial para compreender os mecanismos que determinam a comunicação celular durante a homeostase, bem como a desregulação levando a doença e, portanto, informar novos ou melhorados opções terapêuticas. Não obstante, deteção de interações proteína extracelular por tecnologias amplamente utilizadas tem representado uma barreira significativa, principalmente devido as desafios técnicos associados à bioquímica de receptores celulares e seus parceiros de interação. Neste relatório, nós descrevemos o uso de um proteína extracelular microarray para rastreio de proteínas de consulta de interesse, com ênfase na utilização de complexos de Microconta para a detecção avançada de IPP.
Interações do receptor-receptor de sondagem é particularmente desafiadora, como muitos pares fisiologicamente relevantes são caracterizados por muito fraca com afinidades de ligação no intervalo micromolar2,3. Realce de avidez através de multimerization provou para ser uma estratégia útil para aumentar a sensibilidade para a deteção de baixa afinidade PPIs. Nós desenvolvemos um método baseado em proteínas da fusão Fc, para a formação eficiente de Microconta-proteína multivalentes consulta complexos4. Multimerization da proteína consulta é um passo fundamental para a detecção de baixa afinidade PPIs. Conforme mostrado no exemplo da Figura 2, esse método aumenta significativamente o sinal em comparação com a mesma proteína consulta projectada como um analito (não-complexado) solúvel, mantendo o fundo mínimo. Alternativamente, as telas de microarray da proteína podem ser executadas com proteína solúvel Cy5 marcado consulta, uma abordagem que é compatível com qualquer marca de fusão e que pode ser suficiente para a identificação das interações mais estável e de maior afinidade, tais como aqueles entre alguns ligantes solúveis e seus receptores. Deve notar-se que porque a avidez é aumentada através da multimerization da consulta na microbeads, o sinal de microarray não é uma medida quantitativa da força da interação. Pelo contrário, afinidades de ligação deve ser calculado com as versões monoméricas das proteínas sob avaliação. Além disso, é altamente recomendável que todos os acessos identificados através da tecnologia microarray são validados através de métodos independentes. Rotineiramente usamos ressonância de plasmon de superfície como um método biofísico do padrão-ouro para estudos PPI e medição a cinética de ligação.
Embora fora do escopo deste relatório, note-se que o sucesso de qualquer esforço de rastreio usando a tecnologia microarray fortemente baseia-se na seleção e disponibilidade de uma biblioteca de proteína de alta qualidade. Critérios relevantes para a seleção de proteínas extracelulares tem sido anteriormente publicado4,22. Uma série de ferramentas úteis para a previsão das características relevantes da proteína (tais como hélices transmembranares ou sinal peptídeos) está disponível gratuitamente on-line, incluindo os seguintes servidores: SignalP15,16TMHMM, Phobious17e TOPCONS 18. métodos excelente descrevendo métodos de purificação da afinidade estão disponíveis em outro lugar. Também deve ser mencionado que a geração de biblioteca do microarray da proteína baseia-se na produção de proteína ECDs como produtos recombinantes solúveis, e portanto, esta abordagem permite estudos de tipo I, tipo II e célula GPI-ancorada receptores de superfície e secretado proteínas, mas geralmente não é adequado para multitransmembrane, contendo proteínas tais como receptores de acoplado à proteína G. A purificação de centenas de proteínas, como proteínas recombinantes solúveis exige esforços significativos de logísticos e pode ser muito recurso - e demorado. No entanto, com os custos de diminuição da síntese do gene e maior throughput dos sistemas de purificação de proteínas, geração de biblioteca é relativamente mais rápido e mais acessível. Alternativamente, fontes comerciais oferecem proteínas extracelulares purified que podem ser compradas em quantidades de micrograma, que são suficientes para a geração de uma biblioteca de microarray durável proteína dada os pequenos requisitos para impressão de slide. Estas limitações não obstante, tecnologia microarray oferece grandes vantagens, tais como consumo mínimo dos reagentes de proteína, leituras rápidas (novos PPIs podem ser identificados dentro de um dia) e instrumentação acessível. Além disso, uma vez que as construções e condições de purificação foram estabelecidas, em pequena escala purificações podem produzir material suficiente para preparar milhares de matrizes.
Finalmente, em alguns casos, é observado fundo relativamente elevado, aparecendo como ligação para muitas proteínas na biblioteca de microarray. Existem vários fatores que podem influenciar a ligação não-específica. Por exemplo, algumas proteínas podem ser altamente carregadas, ou interagirem com os hidratos de carbono, contabilização de fundo específico através do reconhecimento dos motivos comuns. Da mesma forma, inespecificas podem também ser devido à natureza da proteína a consulta, como por exemplo o reconhecimento dos motivos de ácido siálico, encontradas em várias outras proteínas. Como as bibliotecas de microarray expandem, é mais provável que que uma lista comum de ligantes inespecíficos pode estar presente. Tais ligantes não-específica podem ser identificadas pelo acompanhamento de seu comportamento em várias telas contra proteínas independentes de consulta. É aconselhável para gerar uma lista de ligantes não-específica através das telas, para melhorar a chamada visita específica. No nosso caso, nós encontramos que aplicar um limite de 5% (i.e., uma proteína é sinalizada como não-específica, se detectado como fichário é 5% ou mais das telas de consulta independentes da proteína) é importante para reduzir falsos positivos. Note que se o objetivo principal dos ensaios é executar apenas algumas telas selecionadas, pode não ser a pena desenvolver uma análise estatística. Neste caso, pode não ser viável para detectar falsos positivos, devido a um conjunto limitado de dados, e, por conseguinte, recomendamos que a ênfase especial é colocada na confirmação dos hits usando métodos alternativos.
Nós antecipamos que os microarrays da proteína extracelular, especialmente em combinação com multimerization métodos para detecção de interações ligante-receptor transitória, continuará a oferecer uma plataforma única para a identificação rápida e robusta de romance PPI em o espaço extracelular.
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Disclosures
B.H., Renée-R e n. m-M. são empregados da Genentech e acções próprias no grupo Genentech Inc. / Roche.
Acknowledgments
Agradecemos Philamer Calses e Kobe Yuen criticamente a ler o manuscrito. Nós somos gratos a Randy Yen para aconselhamento técnico excelente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
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