Summary
Nous présentons ici un protocole à l’écran une protéine extracellulaire microarrays pour l’identification des interactions ligand-récepteur roman en haut débit. On décrit également une méthode pour améliorer la détection des interactions protéine-protéine transitoires en utilisant des complexes protéine-faisant.
Abstract
Facteurs sécrétés, attaché à la membrane des récepteurs et leurs partenaires d’interactions sont les principaux régulateurs de la communication cellulaire et l’initiation des cascades de signalisation au cours de l’homéostasie et la maladie et ainsi représentent des cibles thérapeutiques. Malgré leur pertinence, ces réseaux d’interactions reste nettement sous-représentées dans des bases de données courantes ; par conséquent, plus les protéines extracellulaires n’ont aucun partenaire de liaison documentée. Cet écart est principalement en raison de relever les défis associés à l’étude des protéines extracellulaires, notamment de l’expression des protéines fonctionnelles et l’affinité faible, faible, interactions protéine souvent établies entre les récepteurs de surface cellulaire. Le but de cette méthode consiste à décrire l’impression d’une bibliothèque de protéines extracellulaires dans un format « microarray » pour le dépistage des interactions protéine-protéine. Pour activer la détection des interactions faibles, on décrit une méthode basée sur la multimerization de la protéine de requête à l’étude. Couplé à cette approche axée sur les faisant multimerization de MULTIVALENCE accrue, le microarray de protéine permet une détection robuste d’interactions protéine-protéine transitoire en haut débit. Cette méthode offre une échantillon rapide et faible consommation-approche pour l’identification de nouvelles interactions applicables à n’importe quelle protéine extracellulaire. Impression de microarray de protéine et le protocole de dépistage sont décrits. Cette technologie sera utile pour les chercheurs qui cherchent une méthode robuste à la découverte des interactions de protéine dans l’espace extracellulaire.
Introduction
La méthode examinée ici décrit l’impression d’une collection de protéines extracellulaires dans un format « microarray », suivie d’une méthode de dépistage d’une cible d’intérêt contre cette bibliothèque. Nous avons identifié des protéines multimerization comme une étape cruciale pour la détection des interactions caractérisées par affinités de liaison faible. Pour améliorer la détection de ces interactions, les auteurs décrivent un protocole basé sur multimerization de la protéine de requête d’intérêt à l’aide de microbilles.
Sécrétée et cell surface protéines exprimées (collectivement appelées protéines extracellulaires) ainsi que leurs partenaires d’interactions sont des régulateurs clés de communication cellulaire, la signalisation et l’interaction avec le microenvironnement. Ils sont, par conséquent, essentiels dans la régulation de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Environ un quart du génome humain (≈5, 000 protéines) codant pour des protéines extracellulaires, qui, compte tenu de leur importance et leur accessibilité aux médicaments systématiquement livrées, représentent des cibles clés pour drogues développement1. En conséquence, les protéines extracellulaires représentent plus de 70 % des cibles protéiques avec action pharmacologique connue pour des médicaments homologués sur le marché, connu comme le « proteome thérapeutiques ». Malgré leur importance et leur abondance, les réseaux d’interaction (ePPI) extracellulaire protéines restent remarquablement sous-représentées dans les bases de données disponibles. Il s’agit fondamentalement en raison de la complexité biochimique des protéines extracellulaires, qui s’oppose à leur caractérisation à l’aide de technologies plus disponible2. Tout d’abord, les protéines membranaires sont difficiles à solubiliser, un processus qui comporte souvent des conditions de lavage dure et détergents ; Deuxièmement, protéines extracellulaires manquent souvent des modifications post-traductionnelles telles que glycosylation qui sont absents lorsque ces protéines sont exprimées en couramment utilisées systèmes hétérologues. Enfin, les interactions entre les récepteurs comme corécepteurs exprimées sur les cellules immunitaires, sont souvent transitoires et caractérisé par une très faible affinité (KD dans le ~ 1 μM à > 100 gamme μM). Au total, la nature de ces protéines et leur liaison partenaires rendent plus largement utilisé des technologies, telles que l’affinité purification/spectrométrie de masse (AP/MS) ou levure-double-hybride, impropre à la détection des interactions dans l’espace extracellulaire 2 , 3.
Dans le but de relever ces défis techniques et d’accélérer la découverte de nouvelles interactions des protéines extracellulaires, nous avons développé une couverture élevée protéines extracellulaires microarray4,5. Microarrays offrent l’avantage de générer des surfaces à haute densité avec de petites quantités d’échantillon et généralement se prêtent à des études de haut débit. Études de puces de protéine fournis précédemment pertinentes aperçus des interactions de protéine pour plusieurs organismes modèles, quoique se concentrant principalement sur les interactions cytosoliques ou protéine spécifique familles6,7, 8. En revanche, travail limité a été fait pour étudier les interactions de protéine extracellulaire à l’aide de cette technologie. Nous avons développé une méthode de microarray de protéine pour permettre des études d’ePPIs en construisant une bibliothèque complète et diversifiée de protéines sécrétées purifiées et unique transmembranaire (STM) récepteurs exprimés comme recombinants domaines extracellulaires (DPE), fusionnées à balises communes pour affinité purification4. Le succès des écrans microarray protéine dépend fortement de la mise en place d’une bibliothèque de protéine de haute qualité. Pour l’expression de la protéine de la bibliothèque et la requête, les cellules de mammifères ou des cellules d’insecte préférentiellement apparaissaient comme des systèmes d’expression hétérologue, afin d’assurer le bon ajout de modifications post-traductionnelles telles que liaisons disulfure de glycosylation. SDS-PAGE, chromatographie d’exclusion et de diffusion de la lumière laser multi-angle sont des techniques couramment utilisées pour évaluer la qualité des protéines recombinantes. La bibliothèque de la protéine est ensuite repérée sur des diapositives epoxysilane et conservée à-20 ° C pour une utilisation à long terme. Les concentrations de protéine au-dessus de 0,4 mg/mL sont recommandées pour le protocole décrit ci-dessous. Par conséquent, faible exprimant des protéines peuvent exiger une étape de concentration avant l’impression de l’échantillon et le stockage. Néanmoins, un principal avantage de cette technique est le faible volume de protéine nécessaire (50 μg de protéines est suffisante pour exécuter > 2 000 écrans), aux côtés de la consommation de protéines de requête minimale (20 à 25 μg par écran de doublons). Utilisant le protocole et les équipements décrits ici, et autant de bibliothèques sont disponibles, des résultats pour les protéines de requêtes individuelles peuvent être générés un jour ouvrable.
Un défi majeur dans la détection des interactions de protéine dans l’environnement extracellulaire découle de leur caractère typiquement faible ou transitoire, qui s’oppose à une identification par des méthodologies plus couramment utilisés. Accroître l’avidité de liaison grandement améliore la sensibilité pour la détection des protéines faibles interactions9,10,11. Basé sur ce principe que nous avons développé une méthode pour multimerize les protéines de la requête (exprimées en fusion Fc) à l’aide de protéine A-enduit perles4,5. Pour éviter toute éventuelle inactivation de la protéine de la requête par marquage aléatoire, nous plutôt étiqueter une immunoglobuline humaine hors de propos G avec Cy5 et ajoutez-le ainsi que de la protéine de requête pour les billes de protéine A, éliminant ainsi tous les artefacts en raison de la conjugaison directe d’un teindre à la protéine d’intérêt. Étant donné les affinités micromolaires de plusieurs paires de corécepteur, les complexes multivalents augmentent considérablement le rapport signal sur bruit, par rapport aux protéines de requête Fc-fusion projetés en protéines solubles4.
En résumé, le but du présent protocole est de décrire la préparation de lames microarray contenant une bibliothèque de protéines extracellulaires préexistant pour l’identification des interactions de récepteur-ligand. Nous passons en revue les étapes de la diapositive, impression, suivi d’un protocole de dépistage d’une protéine d’intérêt à la bibliothèque de protéines extracellulaires. De plus, on décrit une méthode pour la détection améliorée d’ePPIs issu des microbilles pour atteindre une avidité accrue de la protéine étudiée. La technologie de microarray de protéine extracellulaire décrite ici représente une approche rapide, robuste et efficace pour le dépistage et détection ePPI roman avec faible de faux positifs et en utilisant seulement microgramme par quantités de la protéine de la requête en vertu de enquête. Cette technologie a alimenté de nombreuses études qui ont fourni des renseignements pertinents sur jusque-là inconnues des fonctions cellulaires et voies de signalisation pour une variété de récepteurs12,13, dont14d’immunoregulators virale, et peut être utilisé pour désactiver orphanize toute protéine extracellulaire d’intérêt.
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Protocol
1. génération d’une bibliothèque d’extracellulaires protéines humaines
- Dresser une liste des récepteurs de surface cellulaire ou des protéines sécrétées d’intérêt pour générer la bibliothèque de microarray de protéine. Familles de protéines spécifiques (par exemple, la superfamille des immunoglobulines) ou protéines sélectivement exprimé en particulier cellules types peuvent être sélectionnés pour l’étude.
- Pour les récepteurs de surface cellulaire, déterminer les limites du domaine extracellulaire (DPE) en identifiant le peptide signal et régions transmembranaires à l’aide d’outils logiciels. Certains des outils librement accessibles en ligne, sont référencés dans la Table des matières16,15,17,18.
- Synthétiser la DPE pour les gènes d’intérêt et clone dans le vecteur pertinent. Protéines sécrétées ou les récepteurs de DPE de STM fusionnés à un certain nombre de balises d’affinités communes peuvent être purifiés des milieux conditionnés des cellules transfectées avec le vecteur approprié ou de systèmes d’expression baculovirus-insecte cellule.
Remarque : Les systèmes basés sur les cellules mammifères (comme HEK/293 ou cellules CHO) sont recommandés pour maximiser la probabilité de repliement des protéines correcte et ajout de modifications post-traductionnelles pertinentes comme la glycosylation. - Purifier les protéines en méthodes de purification d’affinité standard. Des efforts antérieurs ont décrit des procédures automatisées ou semi-automatisées appropriées pour la purification des centaines de protéines qui peuvent être redimensionnées pour générer l’ensemble des protéines d’intérêt9,19,20, 21.
Remarque : SDS-PAGE, chromatographie d’exclusion (S) ou multi-angle laser light scattering (centres commerciaux) sont recommandés pour évaluer toute agrégation non covalents et contrôle de la qualité globale de la préparation de la protéine. - Protéines à 200 ou 400 μg/mL si possible, de régler et de diluer les stocks avec 80 % de glycérol pour le stockage à long terme dans des flacons cryogéniques à-20 ° C. Ceux-ci représentent les stocks maîtres et doivent être accessible uniquement lorsque c’est nécessaire.
- Transférer des aliquotes de chaque protéine (100 μL) aux plaques de 96 puits (plaques de stock), sceller avec du papier adhésif et conserver à-20 ° C jusqu'à microarray préparation. Plaques de stock sont générés afin de minimiser les cycles de gel-dégel et assurer la stabilité des protéines.
2. impression de Microarray de protéine extracellulaire
- Utiliser un microarrayer standard pour l’impression de la diapositive. L’instrument utilisé pour le protocole décrit ici a une capacité de 57 diapositives/exécuter et utilise une tête d’impression holding 48 bornes de repérage. Ces broches générer des taches de ~ 100 μm de diamètre séparés par une distance de spot à repérer de ~ 350 μm et dessine 0,25 μL / charge. Dans cette configuration, jusqu'à 8 000 spots par lame peuvent être logées.
- Générer des plaques de travail (384 plats, 10 μL/puits) des plaques stocks. Effectuez cette étape manuellement avant l’impression de diapositives à l’aide de la microarrayer. Ensuite, repérez les protéines avec des épingles de détachage quill-type sur glissières epoxysilane à 60 % d’humidité (pour éviter la déshydratation des taches protéiques).
Remarque : Cy3 marqués d’albumine sérique Bovine (BSA) peut être repéré en doublons entre chaque échantillon de protéine (5 μg/mL en PBS/40% glycérol) pour visualiser le tableau pour masque raccord (voir section 4). Bien que recommandé, cette étape est facultative. - Après impression, supprimer les diapositives de microarray de protéine de l’environnement humidifié et bloquer du jour au lendemain avec 5 % de lait dans le PBST pour inactiver la surface.
Remarque : L’approche privilégiée consiste à utiliser un brumisateur à ultrasons pour générer une fine brume de bloquant la solution qui se dépose sur la surface de glissement. - Stocker les diapositives à-20 ° C à 50 % de glycérol pour éviter le gel.
3. préparation des appâts multivalents Complexes
Remarque : Les Interactions entre protéines extracellulaires sont souvent caractérisées par des affinités faibles. Pour activer la détection de ces interactions en augmentant l’avidité de liaison, une approche multivalente basée sur la capture de la protéine de la requête, exprimée en Fc-tag DPE, microbilles de protéine A-enduit a été développé4.
- Étiqueter le transporteur IgG utilisée pour la détection avec Cy5 monoreactive colorant et séparer le colorant libre à l’aide de colonnes de dessalement. Déterminer le colorant aux ratios protéines en mesurant l’absorbance UV à 280 et 650 nm.
Remarque : Les ratios protéines-colorant entre 2,0 et 4,0 sont normalement utilisés. Il est recommandé de faire tourner les conjugués Cy5 à 100 000 x g pendant 15 min enlever d’éventuels agrégats solubles en raison du processus de labellisation. - Déterminer le ratio optimal de faisant-à-protéine par titrage de la protéine A contre une quantité constante de la protéine de la requête. Le volume minimal saturante de perles où aucune protéine Fc-tag libre ne reste, telle que mesurée par dosage compétitif déterminé par interférométrie à biolayer, est utilisé pour le dépistage.
- Former les complexes de protéine faisant en incubant la requête Fc-le tag et le Cy5-IgG avec des microbilles de protéine A et mélanger sur un rotateur de tube en PBS pendant 30 min à température ambiante, Abrie de la lumière.
- Pour former ces complexes, utiliser la protéine de requête à une concentration finale de 20 μg/mL. Pour calculer le rapport molaire des protéines de la requête et Cy5-IgG, divisez le poids moléculaire de la protéine de la requête par le poids moléculaire de l’IgG (150 000 Da) et en multipliant par 40 μg/mL pour déterminer la concentration de Cy5-IgG nécessaire.
- Supplément des échantillons avec des protéines solubles A (1 mg/mL) immédiatement avant l’incubation avec la biopuce glisse (voir la section 4.2 ci-dessous) afin d’empêcher la liaison de toute protéine libre A perles pour les protéines de fusion de Fc qui peuvent être présents sur le tableau.
Remarque : Le volume réactionnel final peut varier selon la chambre de station ou incubation d’hybridation utilisée. L’appareillage décrit dans la Table des matières permet l’incubation échantillon utilisant des volumes relativement faibles (~ 200 μL / diapositive).
4. extracellulaire protéines Microarray de dépistage et de traitement.
Remarque : Il existe un certain nombre de fabricants qui offrent des plateformes de traitement automatique. Si une station d’hybridation n’est pas disponible, les étapes suivantes peuvent être effectuées manuellement, veillant à ce qu’il y a un volume suffisant de tampon de garder les lames immergées en permanence.
- Réchauffer les diapositives à la température ambiante et rincer avec PBS/0.1% Tween 20 (PBST) pour enlever le glycérol résiduelle avant le chargement de la station d’hybridation.
- Utiliser le protocole de dépistage suivants :
- Lavez-les avec PBST pendant 1 min.
- Charger 200 μL de la protéine A de 1 mg/mL dans le lait PBS/5% et incuber pendant 30 minutes afin d’empêcher la protéine non complexé un microbilles de se lier aux protéines Fc qui peuvent être présents dans la biopuce.
- Laver cinq fois avec PBST pendant 1 min.
- Charger 200 μL de la requête : microbilles complexe en présence de la protéine A de 1 mg/mL et incuber pendant 30 minutes.
- Lavez-les avec PBST pendant 1 min.
- Après hybridation, rincer les lames avec de l’eau, placer en individuels 50 mL tubes coniques et sécher par rotation à 900 x g pendant 5 min.
- Enfin, scanner les diapositives avec un scanner de microarray appropriée détecter Cy3 (si BSA-Cy3 a été imprimé) et la fluorescence Cy5 en excitant à 532 et 635 nm, respectivement.
- Effectuer une analyse de données en utilisant l’analyse de données microarray qui l’accompagne. La liste des baies concernées (comme un fichier .gal) est chargée dans le logiciel d’extraction de données. À ce stade, utiliser les spots de Cy3-BSA pour trouver des blocs et utiliser les options d’ajustement automatique dans le logiciel, suivi d’un alignement manuel des fonctionnalités lorsque cela est nécessaire. Enregistrer les fichiers sous forme de fichiers .gpr pour une analyse ultérieure.
5. analyse
- Enregistrer les données dans les fichiers GPR et processus de R en utilisant le paquet Leduc, couramment utilisé pour l’analyse de microarray data4,5.
- Pour le prétraitement, fond de correction et normalisation au sein de la diapositive. Étant donné que chaque protéine est imprimé en taches dupliqués, combiner les deux mesures répétées pour créer une partition unique pour cette protéine dans la bibliothèque.
- Calculer les scores pour chaque diapositive et analyser les résultats de l’intersection des scores élevés des candidats entre les diapositives.
- Utilisez microarrays en double de tirages distincts au contrôle de la variabilité de la diapositive et intersection parcelles représentant des données de deux écrans appeler finales hits.
- Enfin, effectuer un niveau supplémentaire de filtrage afin d’exclure des protéines promiscuités dans le tableau. Ces liants non spécifiques sont identifiés comme protéines dépassant un seuil spécifique frappé fréquence tel que défini par l’utilisateur à travers les écrans indépendants.
Remarque : Ce protocole est décrit en détail dans Tom et coll. 20135. Dans notre cas le liant non-spécifiques appelant repose sur la détermination de la cumulative de la proie des taux de succès, et un seuil d’élimination pilotés par les données de 5 % est utilisé.
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Representative Results
Un schéma du flux de travail pour la technologie des microréseaux protéine extracellulaire est illustré à la Figure 1. Une fois les lames microarray contenant la bibliothèque de protéines extracellulaires sont disponibles, la projection de la protéine d’intérêt et des données d’analyse peut être complétée en un jour. Nombreuses interactions physiologiquement pertinentes entre les récepteurs membranaires incorporées sont caractérisées par la forces de liaison très faible (KD la micromolaire). Pour améliorer la détection de ces interactions, a développé une méthode basée sur la requête protéique (exprimée en fusion Fc) multimerization sur la protéine A-microbilles. Ce protocole est décrit dans le texte, et un exemple représentatif de la performance de cette approche pour la détection améliorée des IPP est illustré à la Figure 2.
Un exemple représentatif d’un écran de microarray de protéine est présenté à la Figure 3. Dans l’exemple illustré, une protéine immunomodulatrice d’orphelin adénovirus humain est projetée pour les interactions contre une bibliothèque composée de plus de 1 500 récepteurs DPE ou sécrétée protéines14. Tel que décrit, la DCE de la protéine virale est inoculation exprimée comme une protéine de fusion Fc et puis incubées en présence de protéine A enduit microbilles afin de former des complexes multivalents. Les complexes de protéine ont été projetés à l’aide d’une station d’hybridation pour réduire au minimum les opérations manuelles, toutefois, des écrans similaires peuvent être effectuées à l’aide d’une chambre de l’hybridation ou dispositifs analogues. Il est conseillé de lancer des écrans en double à l’aide de diapositives imprimées dans les exécutions de détachage distinctes afin de maîtriser toute la variabilité pendant le tirage. La figure montre les parcelles intersection résultante des écrans en double, indépendants. Des interactions positives et l’arrière-plan de la diapositive sont facilement visualisées sur la numérisation des plaques (fluorescence Cy5), facilitant frappé d’appel. Notez qu’il est recommandé de repérer chaque récepteur dans la bibliothèque des doublons afin d’accroître la confiance des succès. Pour la plupart des protéines requête, zéro, un, ou quelques coups sont observées, démontrant la spécificité de la méthode pour la détection des IPP.
Certaines protéines de requête montrent haut fond tel que détecté par fixation d’un nombre anormalement élevé de protéines dans le tableau et/ou de la diapositive. Dans notre expérience, tel fond non spécifique est observé pour seulement un petit nombre de protéines. Différents facteurs relatifs à la nature de la protéine pourraient influencer les interactions non spécifiques, telles que la reconnaissance de motifs de glycosylation. Figure 3 illustre un exemple d’une protéine virale projeté contre la bibliothèque microarray démontrant ambiants, excluant l’identification de possibilités spécifiques. Alors que des modifications mineures dans le protocole sont envisageables pour diminuer le fond (comme sel accrue ou concentration de détergent), dans ces cas, il est recommandé d’explorer des méthodes alternatives pour deorphanization de la protéine étudiée.
Figure 1 : protéine extracellulaire puces à ADN pour l’identification rapide et robuste des interactions de récepteur-ligand. (Étape 1) Une bibliothèque de protéines extracellulaires d’intérêt est compilée. (Étape 2) Les protéines purifiées sont imprimées sur des lames d’epoxysilane à l’aide d’une imprimante de microarray et conservés à-20 ° C. (Étape 3) La protéine de requête d’intérêt est multimerized sur microbilles d’avidité accrue et de détection d’interactions protéine-protéine transitoire. Un fluorescent IgG est complexé avec la requête : microbilles comme porteur étiquetée inerte. (Étape 4) Dépistage de partenaires de liaison d’une protéine de la requête. La protéine fluorescente requête complexe est projetée contre le microarray de protéine extracellulaire à l’aide d’une station d’hybridation pour le traitement automatique pour lames. (Étape 5) Diapositives sont ensuite visualisées à l’aide d’un scanner de microarray. Les spots de BSA-Cy3 peuvent être observées dans le chenal nm 535 et les coups ont donné de l’écran peuvent être observées sous forme de taches en double à 635 nm. Analyse des données pour les appels de positionnement est effectuée en créant des courbes d’intersection de deux expériences indépendantes. Hits sont appelés selon mutuellement high scores supérieurs à fond, comme décrit dans la section protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : signal amélioré par formation de complexes multivalentes pour la protéine de la requête. (A) Multimerization de protéines de requête. Protéines de requête sont exprimées en recombinant Fc fusions et couplés aux protéines A microbeads pour former des complexes multimerized. (B) haute-avidité conduit à la détection des interactions de faible affinité. L’avidité offerte par résultats de protéine pour la requête multimerized dans la stabilisation des interactions faibles sur le microarray de protéine, menant au signal supérieur aux rapports de bruit et appel hit améliorée. Parcelles montre des résultats de dépistage pour CD200, projeté dans un complexe, faisant ou une protéine soluble directement marqués par Cy5 agent permettre la visualisation des hits. Multimerization (barres rouges) permet une détection robuste de la partenaire de liaison de faible affinité CD200R1, présents dans la bibliothèque de microarray de protéine, avec rapport signal/bruit important par rapport à la même protéine projetée comme un produit soluble (barres bleues). Barres grises indiquent des liants non spécifiques. Seulement les 10 interactions albums ont été représentées dans l’intrigue. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Protein microarray technologies pour l’identification des interactions virus-hôte nouveau récepteur-récepteur. (A) résultats de découverte de récepteurs exemplaire pour une protéine immunomodulatrice adénoviraux orphelin. Images représentent les analyses réelles microarray, montrant les grands succès des protéines repérés en doublons (rouge). Analyses en contrôle pour toute variabilité de diapositive et les résultats représentés comme des parcelles de l’intersection de doublons. Dans les parcelles, les points rouges et bleus représentent hits appelés uniquement sur une seule baie répétés, tandis que les points noirs représentent les visites croisées de deux essais indépendants. La bibliothèque entière « microarray » est imprimée sur deux lames pour la facilité d’utilisation, étant donnée le nombre de protéines présentes dans la collection et pour assurer un espacement suffisant pour chaque protéine individuelle repéré sur le tableau. (B) écran de protéine virale présentant ambiants qui s’oppose à frapper appel. Certaines protéines de requête peuvent afficher ambiants, détectée en se liant aux protéines multiples et/ou les diapositives, donc posant des défis pour l’identification des hits de notation élevées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Un nombre important de récepteurs orphelins demeure dans le génome humain, et nouveaux partenaires interdépendants continuent d’émerger des protéines extracellulaires avec des ligands précédemment caractérisées. Définir les interactions de récepteur-ligand dans l’homme et les organismes modèles est essentielle pour comprendre les mécanismes qui régissent la communication cellulaire lors de l’homéostasie, comme dérèglement conduisant à la maladie et par conséquent informer nouveaux ou améliorés options thérapeutiques. Néanmoins, détection des interactions protéine extracellulaire par des technologies largement utilisés a représenté un obstacle important, principalement en raison des défis techniques liés à la biochimie des récepteurs cellulaires et leurs partenaires qui interagissent. Dans ce rapport, nous décrivons l’utilisation d’une protéine extracellulaire « microarray » pour le dépistage des protéines de la requête d’intérêt, en mettant l’accent sur l’utilisation de complexes faisant pour la détection améliorée des IPP.
Détection des interactions de récepteur-récepteur est particulièrement difficile, comme beaucoup de paires physiologiquement pertinents est caractérisées par la très faible interaction avec les affinités de fixation dans le micromolaire2,3. Amélioration de l’avidité par multimerization s’est avéré pour être une stratégie utile pour augmenter la sensibilité pour la détection de faible affinité IPP. Nous avons développé une méthode basée sur les protéines de fusion Fc, pour une formation efficace de protéines faisant multivalents requêtes complexes4. Multimerization de la protéine de requête est une étape essentielle à la détection de faible affinité IPP. Comme illustré dans l’exemple de la Figure 2, cette méthode améliore considérablement les signaux par rapport à la même protéine requête projetée comme un analyte (non complexée) soluble, tout en conservant un minimum historique. Alternativement, les écrans de microarray de protéine peuvent être effectuées avec des protéines solubles requête étiquetés Cy5, une approche qui est compatible avec n’importe quelle balise fusion et qui peut suffire à l’identification des interactions affinité plus stable, plus élevées, comme celles entre quelques ligands solubles et leurs récepteurs. Il est à noter que, parce que l’avidité est augmentée par le biais de multimerization de la requête sur microbilles, le signal de « microarray » n’est pas une mesure quantitative de la force d’interaction. Plutôt, les affinités de liaison devrait être calculée avec les versions monomères des protéines en cours d’évaluation. En outre, il est fortement recommandé que tout succès identifiés par le biais de la technologie des microréseaux sont validées par le biais de méthodes indépendantes. Nous utilisons systématiquement résonance plasmonique de surface comme une méthode biophysique de l’étalon-or pour études IPP et la mesure de la cinétique de la liaison.
Bien que hors de la portée du présent rapport, il est à noter que le succès de tout effort de dépistage à l’aide de la technologie des microréseaux fortement s’appuie sur la sélection et la disponibilité d’une bibliothèque de protéine de haute qualité. Les critères de sélection des protéines extracellulaires ont été publiées antérieurement4,22. Un certain nombre d’outils utiles pour la prévision des caractéristiques de la protéine pertinents (tels que les hélices transmembranaires ou peptides signaux) est disponible gratuitement en ligne, y compris les serveurs suivants : SignalP15, TMHMM16, Phobious17et TOPCONS 18. papiers d’excellentes méthodes décrivant les méthodes de purification d’affinité sont disponibles ailleurs. Il convient également de mentionner que la génération de bibliothèque de protéines « microarray » repose sur la production de protéine livrets comme produits recombinants solubles et donc cette approche permet des études de type I, type II et ancrées à un GPI cellule récepteurs de surface et sécrétée protéines, mais n’est généralement pas adapté pour multitransmembrane contenant des protéines tels que les récepteurs couplés aux protéines G. La purification des centaines de protéines sous forme de protéines recombinantes solubles exige des efforts logistiques importants et peut être même ressource - et beaucoup de temps. Néanmoins, avec les diminution des coûts de la synthèse de gène et augmenter la productivité des systèmes de purification de la protéine, génération de la bibliothèque est maintenant relativement plus rapide et plus abordable. Alternativement, des sources commerciales offrent purifiées protéines extracellulaires qui peuvent être achetés en quantités microgramme, qui suffisent pour la génération d’une bibliothèque de microarray de protéine durable compte tenue de la petite pour l’impression de glisser. Ces limitations nonobstant, technologie des microréseaux présente de grands avantages tels que la consommation minimale des réactifs de protéine, des lectures rapides (nouvel IPP peut être identifié dans la journée) et instrumentation abordable. En outre, une fois que les constructions et les conditions de purification ont été établies, des purifications à petite échelle peuvent produire assez de matériel pour préparer des milliers de tableaux.
Enfin, dans certains cas, fond relativement élevé est observé, apparaissant comme la liaison aux protéines beaucoup sur la bibliothèque de puces. Il y a plusieurs facteurs qui pourraient influencer les liaisons non spécifiques. Par exemple, certaines protéines peuvent être extrêmement chargées, ou interagissent avec les hydrates de carbone, comptabilité pour le fond non spécifique par l’intermédiaire de la reconnaissance de motifs communs. De même, liaisons non spécifiques en raison de la nature de la protéine de la requête, comme par exemple la reconnaissance de motifs de l’acide sialique, figurent également dans plusieurs autres protéines. Car les bibliothèques de puces se dilate, il est plus probable qu’une liste commune de liants non spécifiques pouvant être présente. Ces liants non spécifiques peuvent être identifiés par scruter leur comportement dans les différents écrans contre les protéines de requête non apparentés. Il est recommandé de générer une liste des liants non spécifique sur les écrans, pour améliorer la vocation atteinte spécifique. Dans notre cas, nous avons trouvé qu’il est important de réduire les faux positifs d’appliquer un seuil de 5 % (c.-à-d., une protéine est signalée comme non spécifiques si détecté que binder est de 5 % ou plus d’écrans de protéine de requête non apparentés). Il est à noter que si le but principal des essais doit exécuter seulement quelques écrans sélectionnés, il ne peut-être pas utile de développer une analyse statistique. Dans ce cas, il ne peut être possible de détecter des faux positifs en raison d’un ensemble de données limité, et par conséquent, nous recommandons qu’un accent particulier est placé sur confirmation des succès à l’aide de méthodes alternatives.
Nous prévoyons que les puces à protéines extracellulaires, surtout en combinaison avec des méthodes de multimerization pour la détection des interactions ligand-récepteur transitoire, continuera d’offrir une plate-forme unique pour l’identification rapide et robuste du nouveau PPI dans l’espace extracellulaire.
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Disclosures
B.H., Sahm-R et M-N.M. sont employés de Genentech et actions propres effectuées dans le groupe de Genentech Inc. / Roche.
Acknowledgments
Nous remercions Philamer Calses et Kobe Yuen pour la lecture critique du manuscrit. Nous sommes reconnaissants à Randy yens pour les excellents conseils techniques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
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