Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מסך חלבון חוץ-תאי מיקרו-מערכים זיהוי הקולטן הרומן-ליגנד אינטראקציות תפוקה גבוהה. אנו גם מתארים שיטה כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות חלבון ארעי באמצעות קומפלקסים של חלבונים-microbead.
Abstract
גורמים המופרש, קולטני ממברנה-קשורה ושותפים שמעצבת את הרגולטורים העיקריים של התקשורת הסלולארית. והתחלה איתות cascades במהלך הומאוסטזיס ומחלות, וככזה מייצגים עיקרי מטרות טיפוליות. למרות הרלוונטיות שלהם, רשתות אינטראקציה אלה נותרו באופן משמעותי underrepresented במסדי הנתונים הנוכחי; לכן, ביותר חוץ-תאית חלבונים שיהיה אין שותף מחייב מתועדת. חוסר התאמה זה נובע בעיקר האתגרים הקשורים בחקר החלבונים חוץ-תאית, כולל ביטוי של חלבונים פונקציונליים, ואינטראקציות בזיקה חלש, נמוך, חלבון שנוצר לעיתים קרובות בין קולטני פני שטח התא. מטרת שיטה זו היא לתאר את הדפסת ספריה של חלבונים חוץ-תאית בתבנית microarray להקרנה של אינטראקציות חלבון-חלבון. כדי לאפשר זיהוי של אינטראקציות חלשות, מתוארת שיטה המבוססת על multimerization של החלבון שאילתה שנבחנה. מצמידים לגישה זו מבוססת על microbead multimerization על multivalency מוגברת, microarray חלבון מאפשרת זיהוי חזקים של אינטראקציות חלבון ארעי תפוקה גבוהה. שיטה זו מציעה מדגם מהיר ונמוך לצרוך-גישה לזיהוי של אינטראקציות חדשות החלות על כל חלבון חוץ-תאית. חלבון microarray הדפסה וסינון פרוטוקול מתוארים. טכנולוגיה זו תהיה שימושית עבור חוקרים המבקשים שיטה חזקה של גילוי של אינטראקציות חלבון בחלל חוץ-תאית.
Introduction
השיטה שנסקרו כאן מתאר ההדפסה של אוסף של חלבונים חוץ-תאית בתבנית microarray, ואחריו שיטה להקרנה של מטרה עניין נגד בספריה זו. זיהינו את החלבון multimerization כצעד מכריע לצורך זיהוי של אינטראקציות מאופיין על ידי איגוד נמוך הזיקות. כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות אלה, אנו מתארים פרוטוקול מבוסס על multimerization של החלבון שאילתה עניין באמצעות גרגרי.
מופרש, תא השטח הביע חלבונים (הנקרא באופן קולקטיבי חלבונים חוץ-תאית) יחד עם שותפים שמעצבת את הרגולטורים מפתח תקשורת סלולרית, איתות ואינטראקציה עם microenvironment. הם חיוניים, לכן, בוויסות תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים. בערך רבע של הגנום האנושי (≈5, 000 חלבונים) מקודד חלבונים חוץ-תאית, אשר, בהתחשב שלהם משמעות, נגישות לתרופות מועברות באופן שיטתי, מייצגים מטרות המפתח עבור פיתוח תרופה1. כתוצאה מכך, חוץ-תאית חלבונים מייצגים יותר מ 70% של המטרות חלבון עם פעולה תרופתי ידוע עבור תרופות שאושרו על השוק, המכונה "פרוטאום druggable". למרות החשיבות שלהם, שפע, הרשתות אינטראקציה (אפי) חלבון חוץ-תאית נשארים להפליא underrepresented במסדי הנתונים הזמינים. . זאת באופן מהותי בשל האופי הביוכימי המורכב של החלבונים חוץ-תאית, שמונע את האפיון שלהם באמצעות טכנולוגיות הזמינה ביותר2... ראשית, קרום חלבונים קשים solubilize, תהליך זה כרוך לעתים קרובות תנאים קשים כביסה וחומרי ניקוי; שנית, חלבונים חוץ-תאית לעתים קרובות חוסר שינויים post-translational רלוונטי כגון גליקוזילציה כי הם נעדרים כאשר חלבונים אלה באים לידי ביטוי נפוץ המשמש במערכות heterologous. בסופו של דבר, אינטראקציות בין רצפטורים, כגון קולטנים לעבודה הביעו על תאים חיסוניים, הם לעיתים קרובות ארעי, המאופיינת הזיקות נמוך מאוד (KD μM ~ 1 ל > 100 μM טווח). בסך הכל, הטבע של חלבונים אלה ואיגוד שלהם שותפים רינדור נרחב ביותר מנוצל טכנולוגיות, כגון זיקה טיהור/ספקטרומטריית (AP/MS) או שמרים-שני-היברידית, מתאימים לצורך זיהוי של אינטראקציות במרחב חוץ-תאית 2 , 3.
בניסיון להתגבר על אתגרים טכניים אלה ולהאיץ את הגילוי של אינטראקציות הרומן חלבונים חוץ-תאית, פיתחנו4,5microarray חלבון חוץ-תאית כיסוי גבוהה. מיקרו-מערכים מציעים את היתרון של יצירת משטחים בצפיפות גבוהה עם כמויות קטנות של המדגם, נתונות בדרך כלל מחקרים תפוקה גבוהה. חלבון מבוססי microarray מחקרים בעבר סיפקו תובנות רלוונטיות אינטראקציות חלבון עבור אורגניזמים מספר דגם, אמנם בעיקר תוך התמקדות על אינטראקציות cytosolic או חלבון ספציפי משפחות6,7, 8. לעומת זאת, עבודה מוגבל סיים לחקור אינטראקציות חלבון חוץ-תאית באמצעות טכנולוגיה זו. פיתחנו שיטה microarray חלבון כדי לאפשר מחקרים של ePPIs על ידי בניית ספרייה מקיפה ומגוונת מאוד של חלבונים מטוהרים המופרש והביע קולטנים (STM) transmembrane יחיד רקומביננטי כמו תחומים חוץ-תאית (ECD) מחובר לגבו תגיות נפוצות עבור טיהור זיקה4. ההצלחה של המסכים microarray חלבון מתבסס בעיקר על הקמת ספריה חלבון באיכות גבוהה. ביטוי של חלבון ספריית והן השאילתה, בתרבית של תאים או תאים חרקים מעדיפים נבחרו כמערכות ביטוי heterologous, כדי להבטיח תוספת נכונה של שינויים post-translational כגון אגרות חוב גליקוזילציה או disulphide. מרחביות-דף, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה, אור לייזר רב זווית פיזור הן טכניקות נפוצות מנוצל כדי להעריך את איכות חלבון רקומביננטי. הספרייה חלבון הוא הבחין על גבי שקופיות epoxysilane ואז ומאוחסנים ב-20 ° C לשימוש ארוך טווח. ריכוז חלבון מעל 0.4 מ"ג/מ"ל מומלצים עבור פרוטוקול המתואר להלן. לכן, נמוך-ביטוי חלבונים עשויה לדרוש צעד ריכוז לפני הדפסת דוגמת ואחסון. למרות זאת, יתרון הראשי של טכניקה זו הוא נפח קטן של החלבון הנדרש (μg 50 של חלבון מספיקה לבצע > מסכי 2,000), לצד צריכת חלבון שאילתה מינימלי (20-25 μg לכל מסך כפילויות). באמצעות פרוטוקול הציוד שמתואר כאן, בתנאי ספריות זמינים, ניתן להפיק תוצאות השאילתה בודדים חלבונים תוך יום עבודה אחד.
האתגר העיקרי באיתור אינטראקציות חלבון בסביבה חוץ-תאית נובע טבעם כאופייני חלש או ארעית, שמונע את זיהוי באמצעות מתודולוגיות הנפוצות ביותר. הגדלת ובצמא מחייב את מאוד משפר את הרגישות לגילוי חלבון חלש אינטראקציות9,10,11. מבוסס על עיקרון זה פיתחנו שיטה כדי multimerize את החלבונים שאילתה (המבוטא פיוז'ן Fc) באמצעות חלבון חרוזים מצופים A4,5. כדי למנוע כל איון פוטנציאלי של החלבון שאילתה על-ידי תיוג אקראי, אנחנו במקום תווית לא רלוונטית האנושי בנוגדנים G עם Cy5 ולהוסיף אותו יחד עם החלבון השאילתה החרוזים חלבון א', וכך למנוע פריטים בשל הבניין ישירה של לצבוע את החלבון עניין. בהתחשב את הזיקות micromolar של מספר זוגות קולטן שיתוף, מתחמי multivalent מאוד לשפר את האות לרעש יחס, לעומת Fc-fusion שאילתה חלבונים מוקרן חלבונים מסיסים4.
לסיכום, המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את הכנת שקופיות microarray המכיל ספריה חלבון חוץ-תאית קיימים עבור זיהוי של קולטן-ליגנד אינטראקציות. אנו בודקים את השלבים עבור שקופית הדפסה, ואחריו פרוטוקול להקרנה של חלבון עניין נגד הספרייה חלבון חוץ-תאית. יתר על כן, אנו מתארים שיטה לגילוי משופרת של ePPIs מבוסס על גרגרי להשגת ובצמא מוגברת של החלבון שנבחנה. חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה microarray המתוארים כאן מייצג גישה מהירה, עמיד ויעיל של ההקרנה וכן זיהוי אפי הרומן עם יחס חיובי-false נמוכה, על ידי ניצול מיקרוגרם בלבד, כמויות החלבון השאילתה תחת החקירה. טכנולוגיה זו הניע מחקרים רבים שסיפקו תובנות רלוונטיות תאיים לא מוכרת, איתות המסלולים למגוון רחב של קולטנים12,13, לרבות נגיפי immunoregulators14, יכול להיות מנוצל כדי לבטל את orphanize חלבון חוץ-תאית בכל עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. דור של ספריה של חלבונים אנושיים חוץ-תאית
- בצע הידור רשימה של קולטני פני שטח התא או חלבוני המופרש עניין לבנות את ספריית microarray חלבון. משפחות חלבון ספציפי (לדוגמה, superfamily immunoglobulin) או חלבונים באופן סלקטיבי לידי ביטוי בפרט תא ניתן לבחור סוגי לצורך המחקר.
- עבור קולטני פני שטח התא, לקבוע את גבולות התחום חוץ-תאית (ECD) על-ידי זיהוי האות פפטיד ואזורים transmembrane באמצעות כלי תוכנה. חלק הרלוונטי כלים, זמינה בחופשיות באינטרנט, שאליהם מפנה את השולחן של חומרים15,16,17,18.
- לסנתז ECD על הגנים של עניין שיבוט לתוך הווקטור הרלוונטיים. חלבוני המופרש או קולטני ECD של STM התמזגו מספר תגיות נפוצות זיקה יכול להיטהר מהתקשורת ממוזגים תאים transfected עם הווקטור המתאים, או ממערכות ביטוי תא baculovirus-חרק.
הערה: מערכות מבוססות תא יונקים (כגון HEK/293 או תאי CHO) מומלץ להגדיל את הסיכוי של קיפול חלבונים נאותה, תוספת של שינויים posttranslational רלוונטי כגון גליקוזילציה. - לטהר את החלבונים על ידי שיטות טיהור זיקה סטנדרטי. מאמצים קודמים תיארו נהלים אוטומטית או חצי אוטומטית מתאימה טיהור של מאות חלבונים, אשר וניתן לשנותם כדי ליצור את קבוצת חלבונים של ריבית9,19,20, 21.
הערה: מרחביות-דף, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (S) או זווית רב לייזר אור פיזור (קניונים) מומלץ כדי להעריך כל צבירת קשרי ערכיות וכדי לשלוט על האיכות הכוללת של ההכנות חלבון. - להתאים את החלבונים עד 200 או 400 μg/מ"ל כל אימת שניתן, ו לדלל מניות עם 80% גליצרול לאחסון לטווח ארוך בבקבוקונים קריוגני ב-20 ° C. אלה מייצגים מניות האב, צריך לגשת רק בשעת הצורך.
- להעביר את aliquots של כל חלבון (100 μL) 96-ובכן צלחות (לוחות מניות) לאטום בנייר דבק, לאחסן ב-20 ° C עד microarray שקופית הכנה. לוחות מניות נוצרים למזער מחזורים ההקפאה-הפשרה ולהבטיח את יציבות החלבון.
2. הדפסה Microarray חלבון חוץ-תאית
- השתמש microarrayer סטנדרטי של שקופית להדפסה. המכשיר מנוצל עבור פרוטוקול המתוארים כאן בעל קיבולת של שקופיות 57/הפעלה ומשתמש של ראש ההדפסה מחזיק סיכות spotting 48. . סיכות ליצור כתמים ~ 100 μm קוטר המופרדים במרחק ספוט-כדי-spot של ~ 350 μm ומצייר μL 0.25 לכל עומס. תחת בתצורה זו, עד 8,000 מקומות לכל שקופית נענות בחיוב.
- צור לוחות עבודה (384 צלחות היטב, מדגם μL 10/טוב...) מן הלוחות מניות. יש לבצע פעולה זו באופן ידני לפני ההדפסה שקופיות באמצעות את microarrayer. ואז, במקום חלבונים בעזרת סיכות spotting קוויל-סוג אל epoxysilane שקופיות ב- 60% לחות (כדי למנוע התייבשות של המקומות חלבון).
הערה: התווית על-ידי Cy3 שור אלבומין (BSA) ניתן הבחין ב כפילויות בין כל מדגם חלבון (5 μg/mL גליצרול PBS/40%) לדמיין במערך מסיכת התאמת (ראה סעיף 4). על אף מומלץ, שלב זה הוא אופציונלי. - לאחר ההדפסה, להסיר את השקופיות microarray חלבון מן הסביבה humidified ולחסום אותם בן לילה עם 5% חלב ב- PBST כדי להשבית את פני השטח.
הערה: הגישה המועדפת היא לשימוש של התרסיס אולטראסוניות לשם יצירת התמוססו לערפל של חסימת פתרון המתיישבת על גבי המשטח שקופיות. - לאחסן שקופיות ב-20 ° C ב- 50% גליצרול למניעת קיפאון.
3. הכנת קומפלקסים Multivalent פיתיון
הערה: אינטראקציות בין חלבונים חוץ-תאית מאופיינים לעתים קרובות על ידי הזיקות נמוכה. כדי לאפשר זיהוי של אינטראקציות אלה על-ידי הגדלת איגוד ובצמא, בגישה multivalent מבוסס על לכידת החלבון שאילתה, המבוטא מתויג Fc ECD, על חלבון מצופים של גרגרי היה מפותח4.
- תווית המוביל IgG המשמש לצורך זיהוי עם צבע monoreactive Cy5 ולהפריד את צבען חינם תוך שימוש בעמודות desalting. לקבוע לצבוע את החלבון יחסי על ידי מדידת ספיגת סגול-280, 650 ננומטר.
הערה: בדרך כלל משמשים חלבון-צבע יחסי בין 2.0 ל- 4.0. מומלץ לסובב את conjugates Cy5 ב 100,000 x g למשך 15 דקות להוציא אגרגטים מסיסים פוטנציאלי עקב תהליך תיוג. - לקבוע את היחס microbead-כדי-חלבון אופטימלי על ידי טיטור של חלבון A נגד כמות קבועה של החלבון שאילתה. נפח saturating מינימלית של חרוזים איפה נשאר אין חלבונים מתויג Fc חינם, כפי שנמדד שימוש assay תחרותי נקבע על ידי אינטרפרומטריה biolayer, משמש ההקרנה.
- טופס את מתחמי microbead-חלבון על-ידי המקננת השאילתה מתויג Fc ו- Cy5-אג עם גרגרי חלבון א', תערובת על שפופרת מסובב ב- PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.
- ליצירת קומפלקסים אלה, השתמש החלבון שאילתה בריכוז סופי של 20 μg/mL. כדי לחשב את היחס טוחנת של השאילתה חלבונים ו- Cy5-IgG, לחלק את המשקל המולקולרי של החלבון שאילתה על-ידי המשקל המולקולרי של IgG (150,000 Da) ולהתרבות על ידי 40 μg/mL כדי לקבוע הריכוז של Cy5-IgG הדרושים.
- תוספת דגימות עם חלבון מסיס (1 מ"ג/מ"ל) מייד לפני הדגירה עם microarray שקופיות (ראה בסעיף 4.2 להלן) כדי למנוע קשירה של חרוזים A חלבון חינם כל החלבונים פיוז'ן Fc שעשויים להיות נוכח על המערך.
הערה: שעוצמת התגובה הסופי עשוי להשתנות בהתאם הכלאה התחנה או הדגירה תא מנוצל. המכשור המתוארות בטבלה של חומרים מאפשר הדגירה דוגמת שימוש באמצעי אחסון קטן יחסית (~ 200 μL לכל שקופית).
4. חוץ-תאית חלבון Microarray סינון ועיבוד.
הערה: ישנם מספר יצרנים המספקים פלטפורמות עיבוד אוטומטי. אם תחנה הכלאה אינו זמין, ניתן לבצע את הפעולות הבאות באופן ידני, המבטיח כי יש נפח מספיק של המאגר כדי לשמור את השקופיות שקוע בכל עת.
- לחמם את השקופיות בטמפרטורת החדר ולשטוף עם Tween PBS/0.1% 20 (PBST) כדי להסיר גליצרול שיורית לפני כשהעמיסו על תחנת הכלאה.
- השתמש בפרוטוקול ההקרנה הבאה:
- לשטוף עם PBST עבור 1 דקות.
- לטעון μL 200 של 1 מ"ג/מ"ל חלבון A בחלב PBS/5%, תקופת דגירה של 30 דקות למנוע uncomplexed חלבון של גרגרי מ מחייב חלבונים מתויג Fc שעשויים להיות נוכח microarray.
- לשטוף חמש פעמים עם PBST עבור 1 דקות.
- לטעון μL 200 של השאילתה: גרגרי מורכבים בנוכחות של 1 מ"ג/מ"ל חלבון A, דגירה למשך 30 דקות.
- לשטוף עם PBST עבור 1 דקות.
- לאחר הכלאה, לשטוף שקופיות עם מים, מניחים צינורות בודדים של חרוט 50-mL, יבשים ב- ספינינג-g x 900 עבור 5 דקות.
- לבסוף, סריקת השקופיות עם סורק microarray המתאים לזהות Cy3 (אם הודפסה BSA-Cy3), Cy5 זריחה על ידי מרגש-532, 635 nm, בהתאמה.
- לבצע ניתוח נתונים באמצעות ניתוח הנתונים microarray הנלווה. הרשימה מערך הרלוונטיים (בתור קובץ .gal) נטען את תוכנת חילוץ נתונים. בשלב זה, לנצל את הנקודות Cy3-BSA כדי למצוא רחובות, השתמשו באפשרויות התאמה אוטומטית התוכנה, ולאחריה יישור ידנית של תכונות בעת הצורך. לשמור קבצים כקבצי .gpr לצורך ניתוח נוסף.
5. ניתוח נתונים
- שמירת נתונים וקבצים הרדאר חודר הקרקע בתהליך R באמצעות החבילה limma, בדרך כלל מנוצל לניתוח של microarray נתונים4,5.
- עבור preprocessing, רקע תיקון ונורמליזציה בתוך שקופית. מאז כל חלבון מודפס המשוכפלת כתמים, לשלב שתי מדידות שכפל כדי ליצור תוצאה בודדת את הפרוטאין בספריה.
- חישוב ציונים עבור כל שקופית ולנתח תוצאות החיתוך של מועמדים הניקוד גבוה בין שקופיות.
- השתמש כפולים מיקרו-מערכים של הדפסה נפרדים-פועל כדי לשלוט על השתנות שקופית והשתמש לצומת לחלקות ייצוג נתונים בשני המסכים להתקשר מנה אחרונה.
- לבסוף, לבצע רמה נוספת של סינון כדי לא לכלול חלבונים מופקר בתוך המערך. קלסרים שאינם ספציפיים כאלה מזוהים כמו חלבונים העולה על סף מסוים פגע תדירות כפי שהוגדרו על ידי המשתמש על פני מסכי עצמאית.
הערה: פרוטוקול זה מתואר בפירוט טום. ואח 20135. במקרה שלנו קלסר שאינם ספציפיים מתקשר מבוסס על הקביעה של המצטבר טרף אחוזי ההצלחה, ומשמש הסף חיסול מבוססת נתונים של 5%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תיאור סכמטי של זרימת העבודה עבור טכנולוגיית microarray חלבון חוץ-תאית מוצג באיור1. וברגע שהשקופיות microarray המכיל ספריית חלבון חוץ-תאית זמינים, ההקרנה של החלבון עניין וניתוח נתונים יכולה להסתיים תוך יום אחד. רבים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית האינטראקציות בין קולטני ממברנה-מוטבע מאופיינים על ידי איגוד חלש מאוד החוזקות (KD בטווח micromolar). כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות כאלה, פותחה שיטה המבוססת על השאילתה multimerization חלבון (המבוטא פיוז'ן Fc)-חלבון A-גרגרי. פרוטוקול זה מתואר בטקסט, דוגמה מייצגת של הביצועים של גישה זו לצורך זיהוי משופרת של PPI מוצגת באיור2.
דוגמה מייצגת של מסך microarray חלבון מוצג באיור3. בדוגמה המוצגת, חלבון immunomodulatory יתומה אדנו האנושי מוקרן על אינטראקציות נגד ספריה בהיקף של למעלה מ-1,500 קולטן ECD או מופרש חלבונים14. כפי שתואר, ECD של החלבון הנגיפי המבוטא recombinantly חלבון כימרי Fc, ואז מתפשט עם חלבון גרגרי מצופים A כדי ליצור קומפלקסים multivalent. מתחמי חלבון הוקרנו באמצעות תחנת הכלאה כדי למזער את פעולות ידניות, אולם מסכי דומה ניתן לבצע באמצעות תא הכלאה או מכשירים דומים. מומלץ להפעיל במסכים כפולים באמצעות שקופיות שהודפס פועל spotting נפרד על מנת לשלוט על כל השתנות במהלך ההדפסה. האיור מציג החלקות לצומת הנובעת מן המסכים הכפולים, עצמאית. אינטראקציה חיובית ועל רקע השקופית הכוללת ברצון דמיינו בעת סריקה של הלוחות (זריחה Cy5), להקל על קריאה פגע. שימו לב: מומלץ לזהות כל קולטן בספרייה שבו כפילויות כדי להגביר את האמון פגע. עבור רוב החלבונים שאילתה, אף אחד, אחד, או כמה להיטים הם נצפו, הממחיש את ייחודה של שיטת גילוי של להדברה.
חלבונים מסוימים השאילתה להציג רקע כפי שזוהו על-ידי איגוד מספר גבוה של חלבונים בתוך המערך ו/או לשקופית. מניסיוננו, כגון רקע שאינם ספציפיים הוא ציין עבור כמות קטנה של חלבונים. גורמים שונים הקשורים מהות החלבון יכול להשפיע על אינטראקציות שאינם ספציפיים, כגון זיהוי של מוטיבים גליקוזילציה. איור 3 מראה דוגמה של חלבון נגיפי מוקרן נגד הספרייה microarray הראה רקע גבוה, מסלק זיהוי פגיעות ספציפית. בזמן שינויים מזעריים בפרוטוקול יכול להיחשב כדי להקטין את הרקע (כגון מלח מוגברת או דטרגנט ריכוז), במקרים אלה מומלץ לחקור על deorphanization של החלבון שנבחנה שיטות אלטרנטיביות.
איור 1: מיקרו-מערכים חוץ-תאית חלבון לזיהוי מהיר וחזק של אינטראקציות קולטן-ליגנד. (שלב 1) ספריה של חלבונים חוץ-תאית עניין עוברת קומפילציה. (שלב 2) החלבונים מטוהרים מודפס על epoxysilane שקופיות באמצעות מדפסת microarray ומאוחסנים ב-20 ° C. (שלב 3) החלבון שאילתה של עניין הוא multimerized על גרגרי ובצמא מוגברת, זיהוי של אינטראקציות חלבון ארעית. IgG פלורסנט הוא ומורכבת עם השאילתה: גרגרי כנשא שכותרתו אינרטי. (שלב 4) הקרנת עבור איגוד שותפים של חלבון שאילתה. השאילתה פלורסנט החלבונים מוקרן נגד microarray חלבון חוץ-תאית באמצעות תחנת הכלאה לעיבוד שקופיות אוטומטיים. (שלב 5) שקופיות הם מכן visualized באמצעות סורק microarray. המקומות BSA-Cy3 יכול להיות שנצפו בתעלה 535 nm ו הלהיטים הניב של המסך יכול להיות שנצפו כפולים. נקודות בעומק 635 ננומטר. ניתוח נתונים שהתקשרת פגע מתבצע על-ידי יצירת חלקות הצטלבות של שני ניסויים עצמאית. להיטים נקראים בהתבסס על ציונים גבוהים הדדית מעל רקע, כמתואר בסעיף פרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: האות משופרת באמצעות הקמת מתחמי multivalent החלבון שאילתה. (א) Multimerization של חלבונים שאילתת. השאילתה חלבונים המבוטא fusions Fc רקומביננטי, מצמידים חלבון A. גרגרי על טופס multimerized תסביכים. (B) גבוהה-ובצמא מוביל זיהוי של אינטראקציות זיקה נמוכה. ובצמא המוענקת על ידי תוצאות חלבון multimerized השאילתה בהייצוב של אינטראקציות חלשות-microarray חלבון, המוביל אל האות גבוה יותר רעש ratios וקורא פגע משופרת. מגרשים מראה ההקרנה תוצאות עבור CD200, מוקרן על microbead מורכבים, או חלבון מסיס ישירות עם Cy5 צבע תוויות לאפשר ויזואליזציה של מכה. Multimerization (ברים אדומה) מאפשר זיהוי חזקים של שותף מחייב זיקה נמוכה CD200R1, נוכח בספריה microarray חלבון, עם יחס אות/רעש משמעותית בהשוואה החלבון אותו מוקרן כמוצר מסיסים (סרגל כחול). ברים אפורים מציינים שאינם ספציפיים קלסרים. רק את האינטראקציות 10 המובילים מיוצגים בעלילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: חלבון microarray טכנולוגיית זיהוי הקולטן הרומן-קולטן וירוס-פונדקאי אינטראקציות. (א) קולטן למופת גילוי תוצאות חלבון יתומה immunomodulatory adenoviral. תמונות מייצגות סריקות microarray בפועל, מציג כניסות של חלבונים, זוהו כפילויות (אדום). מבחני מבוצעות בכפילויות לפקד עבור כל שקופית השתנות ותוצאות מיוצג לצומת לחלקות. בהחלקות, הנקודות אדום וכחול מייצגים להיטים קרא רק מערך אחד שכפול, ואילו נקודות שחורות לייצג להיטים מצטלבים בין שני מסלולים עצמאיים. הספרייה microarray כולה מודפסת על שתי שקופיות עבור קלות שימוש, לנוכח מספר חלבונים נוכח באוסף, וכדי להבטיח מספיק הפרדה כל חלבון בודדים הבחין במערך. (B) חלבון נגיפי המסך מציג רקע שמונע פגע הייעוד. חלבונים שאילתה מסוימים עשויים להציג רקע גבוה, כפי שזוהו על-ידי איגוד מספר חלבונים ו/או השקופיות, לכן פוזות אתגרים עבור זיהוי של להיטים ניקוד גבוה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר משמעותי של קולטנים יתומה הגנום האנושי ו הרומן שותפים שמעצבת להמשיך להופיע חלבונים חוץ-תאית עם ליגנדים מאופיין בעבר. הגדרת קשרי הגומלין ליגנד לקולטן של האדם ואורגניזמים דגם חיוני להבין את המנגנונים מכתיב תקשורת סלולרית במהלך הומאוסטזיס, וכן dysregulation למחלות, ולהודיע לכן חדשות או משופרות אפשרויות טיפוליות. למרות זאת, זיהוי של אינטראקציות חלבון חוץ-תאית על ידי טכנולוגיות בשימוש נרחב ייצג חסם משמעותי בעיקר בשל האתגרים הטכניים משויך את הביוכימיה של קולטני הסלולר ובין שותפותיהן אינטראקציה. בדו ח זה אנו מתארים את השימוש microarray חלבון חוץ-תאית להקרנה של חלבונים שאילתה של עניין, תוך שימת דגש על ניצול של קומפלקסים microbead זיהוי משופרת של להדברה.
חיטוט אינטראקציות קולטן קולטן הוא מאתגר במיוחד, כמו זוגות פיזיולוגית רלוונטיים רבים מאופיינים על ידי הכוח הגרעיני החלש מאוד עם איגוד הזיקות של טווח micromolar2,3. שיפור ובצמא דרך multimerization הוכיחה להיות שימושי אסטרטגיה להגביר את רגישות גילוי של זיקה נמוכה להדברה. פיתחנו שיטה המבוססת על חלבונים פיוז'ן Fc, עבור מערך יעיל של microbead multivalent-חלבון שאילתה מתחמי4. Multimerization של החלבון השאילתה נמצא צעד מפתח זיהוי זיקה נמוכה להדברה. כמוצג בדוגמה באיור2, שיטה זו משפרת באופן משמעותי אות בהשוואה החלבון באותה שאילתה מוקרן analyte (שאינם ומורכבת), מסיסים תוך שמירה על רקע מינימלי. לחלופין, ניתן לבצע את המסכים microarray חלבון עם חלבון מסיס שאילתה התווית על-ידי Cy5, גישה זה תואם עם כל תג פיוז'ן, זה עשוי להספיק לצורך זיהוי של אינטראקציות זיקה גבוהה יותר, יציבה יותר, כגון אלה בין כמה ליגנדים מסיסים ואת רצפטורים שלהם. יצוין, כי ובצמא הוא עלה דרך multimerization של השאילתה על גרגרי, האות microarray שאין מדד כמותי של עוצמת האינטראקציה. במקום זאת, איגוד הזיקות יש לחשב עם גירסאות monomeric של החלבונים תחת הערכה. בנוסף, רצוי מאוד כי כל בנפילות שאותרו באמצעות הטכנולוגיה microarray מאומתות באמצעות שיטות עצמאית. אנו משתמשים באופן שגרתי פלזמון משטח תהודה כשיטה biophysical תקן זהב עבור לימודי PPI ומדידה של קינטיקה איגוד.
למרות מתוך הטווח של דו ח זה, יצוין כי ההצלחה של כל המאמצים ההקרנה microarray בטכנולוגיה בכבדות מסתמך על הבחירה ואת הזמינות של ספרייה חלבון באיכות גבוהה. הקריטריונים לבחירה של חלבונים חוץ-תאית כבר שפורסמו בעבר4,22. מספר כלים שימושיים עבור חיזוי של חלבון הרלוונטיים תכונות (כגון transmembrane helices או פפטידים אות) זמינים באופן חופשי באינטרנט, כולל השרתים הבאים: SignalP15,16TMHMM, Phobious17, ו TOPCONS 18. שיטות מעולה מסמכים המתארים שיטות לטיהור זיקה זמינים במקום אחר. יש גם לציין כי הדור ספריה של חלבון microarray מסתמך על ייצור החלבון ECDs כמוצרים רקומביננטי מסיסים, ולכן גישה זו מאפשרת לימודים מסוג, סוג II, המעוגנת GPI תא הקולטנים על פני השטח והוא מופרש חלבונים, אבל בדרך כלל לא מתאים multitransmembrane המכילים חלבונים כגון G-חלבון בשילוב קולטנים. הטיהור של מאות חלבונים כמו חומרים מסיסים דורש מאמצים לוגיסטיים משמעותיים והוא יכול להיות משאב מאוד - וצורך. למרות זאת, עם עלויות ירד סינתזה ג'ין, תפוקה מוגברת של מערכות טיהור חלבון, ספריית הדור הוא עכשיו יחסית מהיר וזול יותר. לחלופין, מקורות מסחריים מציעים חלבונים מטוהרים חוץ-תאית, שניתן לרכוש בכמויות מיקרוגרם, אשר יספיק לדור של ספרייה microarray חלבון עמיד בהתחשב בדרישות קטן עבור הדפסת שקופית. הגבלות אלה על אף האמור, טכנולוגיית microarray מציעה יתרון רב כגון צריכת מינימלית של חלבון ריאגנטים, המפרט מהיר (להדברה החדש ניתן לזהות תוך יום אחד) ומכשור במחירים סבירים. בנוסף, ברגע המבנים והתנאים טיהור הוקמו, purifications בקנה מידה קטן יכול לייצר מספיק חומר כדי להכין אלפי מערכים.
לבסוף, במקרים מסוימים, רקע גבוה יחסית הוא ציין, מופיעה מחייב חלבונים רבים על הספרייה microarray. ישנם גורמים רבים אשר עשויים להשפיע על הכריכה לא ספציפית. לדוגמה, חלבונים מסוימים עשויים להיות טעונות, או לקיים אינטראקציה עם פחמימות, והיוו רקע שאינם ספציפיים באמצעות זיהוי של מוטיבים משותפים. באופן דומה, שאינם ספציפיים איגוד עשוי גם בשל אופיו של החלבון שאילתה, כמו למשל הכרה של מוטיבים חומצה sialic, למצוא מספר חלבונים אחרים. כפי להרחיב הספריות microarray, סביר יותר כי רשימה משותפת של קלסרים שאינם ספציפיים העשויים להיות קיימים. קלסרים שאינם ספציפיים כזה יכול להיות מזוהה על-ידי מעקב אחר אופן הפעולה שלהם ברחבי המסכים השונים נגד חלבונים שאילתה שאינה קשורה. רצוי ליצור רשימה של קלסרים שאינם ספציפיים על פני מסכי, לשיפור הייעוד פגע ספציפיים. במקרה שלנו, מצאנו כי החלת על 5% קיצוץ (קרי, חלבון מסומנת בתור שאינם ספציפיים אם זוהה כפי קלסר הוא 5% או יותר של שאילתה שאינה קשורה חלבון מסכי) חשוב לצמצם את תוצאות חיוביות שגויות. יצוין, כי אם המטרה העיקרית של מבחני לפעול רק מספר מסכי שנבחרו, לא יתכן ששווה לפתח ניתוח סטטיסטי. במקרה זה, זה לא יכול להיות ריאלי לאתר תוצאות חיוביות שגויות עקב dataset מוגבל, לכן מומלץ כי דגש מיוחד מושם על אישור של מכה באמצעות שיטות חלופיות.
אנו צופים שמיקרו-מערכים חלבון חוץ-תאית, במיוחד בשילוב עם multimerization שיטות לזיהוי של אינטראקציות קולטן ארעי-ליגנד, תמשיך להציע פלטפורמה ייחודית לזיהוי מהיר וחזק של הרומן PPI ב המרחב חוץ-תאית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.H., S.R-R ו- N.M-M. הם עובדים Genentech ומניות עצמו בקבוצה Genentech בע מ/רושה.
Acknowledgments
אנו מודים Philamer Calses, קובי יואן על באורח קשה לקרוא את כתב היד. . אנחנו אסירי תודה רנדי ין לקבלת עצה טכנית מצוינת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
- Ramani, S. R., et al. A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery. Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).
- Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).
- Kaushansky, A., et al. Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays. Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
- Voulgaraki, D., et al. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).
- Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia. Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).
- Jaworski, A., et al. Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2. Science. 350 (6263), 961-965 (2015).
- Martinez-Martin, N., et al. The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation. Nature Communications. 7, 11473 (2016).
- Nielsen, H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).
- Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).
- Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology. Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).
- Gonzalez, R., et al. Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).
- Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).
- Clark, H. F., et al. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).
