Summary
Vi præsenterer her, en protokol til skærmen ekstracellulære protein microarrays for identifikation af roman receptor-ligand interaktioner i høj overførselshastighed. Vi beskriver også en metode til at forbedre afsløring af forbigående protein-protein interaktioner ved hjælp af protein-microbead komplekser.
Abstract
Udskilles faktorer, membran-bundet receptorer og deres interagerende partnere er vigtigste regulatorer af cellulære kommunikation og indledningen af signalering cascades under homøostase og sygdom, og som sådan repræsenterer primære terapeutiske mål. Trods deres relevans fortsat nettene interaktion markant underrepræsenterede i nuværende databaser; Derfor har mest ekstracellulære proteiner ingen dokumenteret bindende partner. Denne forskel skyldes primært de udfordringer forbundet med undersøgelse af de ekstracellulære proteiner, herunder udtryk for funktionelle proteiner, og de svage, lav affinitet, protein interaktioner ofte etableret mellem celle overfladen receptorer. Formålet med denne metode er at beskrive udskrivning af et bibliotek af ekstracellulære proteiner i microarray format til screening af protein-protein interaktioner. For at muliggøre påvisning af svage vekselvirkninger, er en metode baseret på multimerization af forespørgslen protein under undersøgelse beskrevet. Koblet til denne microbead-baseret multimerization tilgang til øget multivalency, giver protein microarray robust påvisning af forbigående protein-protein interaktioner i høj overførselshastighed. Denne metode giver en hurtig og lave prøve forbruger-tilgang til identifikation af nye interaktioner gælder for enhver ekstracellulære protein. Protein microarray udskrivning og screening protokol er beskrevet. Denne teknologi vil være nyttig for efterforskerne søger en robust metode til opdagelsen af protein interaktioner i det ekstracellulære rum.
Introduction
Metoden gennemgået her beskriver udskrivning af en samling af ekstracellulære proteiner i et microarray format, efterfulgt af en metode til screening af et mål af interesse mod dette bibliotek. Vi har identificeret protein multimerization som et afgørende skridt til påvisning af interaktioner kendetegnet ved lav bindende tilhørsforhold. For at forbedre detektion af disse interaktioner, beskriver vi en protokol baseret på multimerization af forespørgslen protein af interesse ved hjælp af microbeads.
Udskilles og celle overflade-udtrykte proteiner (kollektivt betegnet ekstracellulære proteiner) samt deres interagerende partnere er nøglen regulatorer af cellulære kommunikation, signalering og interaktion med mikromiljø. De er derfor vigtige i reguleringen af mange fysiologiske og patologiske processer. Ca. en fjerdedel af det menneskelige genom (≈5, 000 proteiner) koder for ekstracellulære proteiner, som får deres betydning og tilgængelighed til systematisk leverede lægemidler, repræsenterer centrale mål for drug udvikling1. Derfor udgør ekstracellulære proteiner mere end 70% af protein mål med kendte farmakologiske virkning for godkendte lægemidler på markedet, kendt som "druggable proteomet". Trods deres betydning og overflod forbliver de ekstracellulære protein-protein interaktion (ePPI) net bemærkelsesværdigt underrepræsenterede i de tilgængelige databaser. Dette er grundlæggende på grund af den komplekse biokemiske karakter af de ekstracellulære proteiner, som er til hinder for deres karakterisering, benytter de fleste tilgængelige teknologier2. For det første er Membranproteiner vanskeligt at solubilize, en proces, der involverer ofte barske vask betingelser og rengøringsmidler; for det andet mangler ekstracellulære proteiner ofte relevante posttranslationelle modifikationer som glykosylering, der er fraværende, hvis disse proteiner er udtrykt i almindeligt brugt heterolog systemer. Endelig, interaktioner mellem receptorer, såsom Co receptorer udtrykt på immunceller, er ofte forbigående og karakteriseret ved meget lav tilhørsforhold (KD i ~ 1 μM til > 100 μM range). Helt, arten af disse proteiner og deres bindende partnere gøre mest udnyttede teknologier, såsom affinitet rensning/massespektrometri (AP/MS) eller gær-to-hybrid, uegnet til påvisning af interaktioner i det ekstracellulære rum 2 , 3.
I et forsøg på at overvinde disse tekniske udfordringer og fremskynde opdagelsen af nye interaktioner for ekstracellulære proteiner, har vi udviklet en høj dækning ekstracellulære protein microarray4,5. Microarrays giver fordelen at generere high-density overflader med små mængder af prøven, og er generelt indstillet til høj overførselshastighed undersøgelser. Protein microarray-baserede undersøgelser har tidligere givet relevant indsigt i protein interaktioner for flere modelorganismer, omend hovedsagelig fokusere på cytosole interaktioner eller på specifikke protein familier6,7, 8. Derimod er begrænset arbejde gjort for at undersøge ekstracellulære protein interaktioner ved hjælp af denne teknologi. Vi har udviklet et protein microarray metode for at aktivere undersøgelser af ePPIs ved at bygge en omfattende og meget forskelligartede bibliotek af renset udskilles proteiner og enkelt transmembrane (STM) receptorer udtrykt som rekombinant ekstracellulære domæner (ECD) smeltet til fælles tags for affinitet rensning4. Succesen med protein microarray skærme er stærkt afhængig af etableringen af en høj kvalitet protein bibliotek. Udtryk for både biblioteket og forespørgsel protein, blev pattedyrsceller eller insekt celler fortrinsvis valgt som Heterolog ekspression systemer, at sikre korrekt tilføjelse af posttranslationelle modifikationer såsom glykosylering eller disulphide obligationer. SDS-PAGE, størrelse udstødelse kromatografi og multi-vinkel laserlys spredning er teknikker almindeligvis anvendes til at vurdere rekombinante protein kvalitet. Biblioteket protein er derefter spottet på epoxysilane dias og opbevares ved-20 ° C til lang tids brug. Protein koncentrationer over 0,4 mg/ml anbefales til protokollen beskrevet nedenfor. Derfor, lav-udtrykte proteiner kan kræve en koncentration skridt før prøven udskrivning og opbevaring. Ikke desto mindre en Hovedfordelen ved denne teknik er den lille mængde af protein kræves (50 μg af protein er tilstrækkeligt til at udføre > 2.000 skærme), sammen med minimal forespørgsel protein forbrug (20-25 μg pr. dubletter skærm). Ved hjælp af protokollen og udstyr beskrevet her, og forudsat at biblioteker er tilgængelige, resultater for individuelle forespørgsel proteiner kan genereres inden for én arbejdsdag.
En stor udfordring i forbindelse med afsløring protein interaktioner i det ekstracellulære miljø udspringer af deres karakteristisk svage eller forbigående karakter, som er til hinder for identifikation af mest almindeligt anvendte metoder. Stigende bindende aviditet høj grad forbedrer følsomheden for påvisning af svage protein interaktioner9,10,11. Baseret på dette princip, vi udviklet en metode til at multimerize forespørgsel proteiner (udtrykt som Fc fusion) ved hjælp af protein A-belagte perler4,5. For at undgå enhver potentiel inaktivering af forespørgsel protein ved tilfældige mærkning, vi i stedet mærke en irrelevant Humant immunglobulin G med Cy5 og tilføje det sammen med forespørgslen protein til protein A perler, hvilket eliminerer enhver artefakter på grund af den direkte konjugation af en farvestof til protein af interesse. I betragtning af de micromolar tilhørsforhold af flere Co receptor par, multivalent komplekser i høj grad øge signal til støjforhold, i forhold til Fc-fusion forespørgsel proteiner screenet som opløselige proteiner4.
Sammenfattende er er målet med denne protokol at beskrive forberedelse af microarray dias indeholder en allerede eksisterende ekstracellulære protein bibliotek for identifikation af receptor-ligand interaktioner. Vi gennemgår trin for dias udskrives, efterfulgt af en protokol til screening af en protein af interesse mod ekstracellulære protein bibliotek. Desuden, vi beskriver en metode til forbedret detektion af ePPIs baseret på microbeads at opnå øget aviditet af protein under undersøgelsen. Den ekstracellulære protein microarray teknologi beskrevet her repræsenterer en hurtig, robust og effektiv tilgang til screening og afsløre roman ePPI med lav falsk-positive nøgletal, og ved at udnytte eneste mikrogram mængder af forespørgsel protein under undersøgelsen. Denne teknologi har næret flere undersøgelser, der har fastsat en række receptorer12,13, herunder viral immunoregulators14, relevant indsigt i hidtil ukendt cellulær funktion og signalering veje og kan udnyttes til at de-orphanize nogen ekstracellulære protein af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generation af et bibliotek af ekstracellulære humane proteiner
- Udarbejde en liste over celle overfladen receptorer eller udskilles proteiner af interesse at bygge protein microarray bibliotekets. Specifikke protein familier (for eksempel immunoglobulin superfamilien) eller proteiner udtrykte selektivt især celle typer kan være udvalgt til undersøgelsen.
- For celle overfladen receptorer, bestemme de ekstracellulære domæne (ECD) grænser ved at identificere signal peptid og transmembrane områder ved hjælp af software-værktøjer. Nogle af de relevante værktøjer, frit tilgængelige online, der refereres til i Tabellen af materialer15,16,17,18.
- Syntetisere ECD for gener af interesse og klon til det relevante vektor. Udskilles proteiner eller ECD af STM receptorer smeltet til en række fælles affinitet tags kan renses fra celler transfekteret med den relevante vektor konditioneret medier eller fra baculovirus-insekt celle udtryk systemer.
Bemærk: Pattedyr celle-baserede systemer (såsom HEK/293 eller CHO celler) anbefales at maksimere sandsynligheden for ordentlig proteinfoldning og tilsætning af relevante posttranslationelle modifikationer såsom glykosylering. - Rense proteiner af standard affinitet rensning metoder. Tidligere indsats har beskrevet automatiske eller halvautomatiske procedurer velegnet til rensning af hundredvis af proteiner, der kan skaleres til at generere sæt af proteiner af interesse9,19,20, 21.
Bemærk: SDS-PAGE, størrelse udstødelse kromatografi (S) eller multi-vinkel laser lys spredning (MALLS) anbefales at vurdere eventuelle ikke-kovalente sammenlægning og kontrollere for den samlede kvalitet af protein præparater. - Justere proteiner til 200 eller 400 μg/mL når det er muligt, og fortynd bestande med 80% glycerol til langtidsopbevaring i kryogene hætteglas ved-20 ° C. Disse repræsenterer master bestande og skal tilgås når det er nødvendigt.
- Overføre delprøver af hvert protein (100 μL) til 96-brønd plader (stock plader), forsegle med selvklæbende folie, og opbevares ved-20 ° C indtil microarray dias forberedelse. Stock plader er genereret for at minimere fryse-tø cykler og sikre protein stabilitet.
2. ekstracellulære Protein Microarray udskrivning
- Brug en standard microarrayer til dias udskrivning. Instrumentet udnyttet til protokollen beskrevet her har en kapacitet på 57 dias/run og bruger en printhoved holding 48 spotting pins. Disse nåle generere steder på ~ 100 μm i diameter adskilt af en spot til spot afstand ~ 350 μm og trækker 0,25 μL per belastning. Under denne konfiguration, kan op til 8.000 steder pr. slide imødekommes.
- Generere arbejder plader (384 godt plader, 10 μL prøve/brønd) fra stock plader. Udføre dette trin manuelt før dias udskrivning ved hjælp af microarrayer. Derefter, spot proteiner med quill-type spotting pins på epoxysilane dias på 60% fugtighed (for at forhindre dehydrering af protein steder).
Bemærk: Cy3-mærket bovint serumalbumin (BSA) kan blive opdaget i dubletter mellem hver protein prøve (5 μg/mL i PBS/40% glycerol) for at visualisere array til maske montering (Se afsnit 4). Selvom det anbefales, er dette trin valgfrit. - Efter udskrivning, fjerne protein microarray dias fra befugtet miljøet og blokere dem natten over med 5% mælk i PBST til at inaktivere overfladen.
Bemærk: Den foretrukne metode er at bruge en ultralyds tåget til at generere en fin tåge af blokering løsning, der udligner overfladen, dias. - Gem dias ved-20 ° C i 50% glycerol til at forebygge nedfrysning.
3. forberedelse af multivalente Bait komplekser
Bemærk: Interaktioner mellem ekstracellulære proteiner er ofte karakteriseret ved lav tilhørsforhold. For at muliggøre påvisning af disse interaktioner ved at øge bindende aviditet, en multivalent tilgang baseret på at erobre forespørgsel protein, udtrykt som Fc-tagged ECD, blev på protein A-belagt microbeads udviklet4.
- Etiket carrier IgG bruges til registrering med Cy5 monoreactive farvestof og adskille de gratis dye bruger udvanding kolonner. Bestemme farvestof protein Fordelingerne af måling ultraviolet absorbans ved 280 og 650 nm.
Bemærk: Protein-dye nøgletal mellem 2,0 og 4,0 bruges normalt. Det anbefales at spinde Cy5 konjugater på 100.000 x g i 15 min. at fjerne potentielle opløselige aggregater på grund af den mærkning proces. - Bestemme den optimale microbead til protein-forhold ved titrering af protein A mod en konstant mængde af forespørgsel protein. Minimal mætte mængden af perler, hvor ingen gratis Fc-mærkede protein forbliver, der som målt ved hjælp af en konkurrencemæssig analyse bestemmes af biolayer interferometri, bruges til screening.
- Danne microbead-protein komplekser af inkubere forespørgslen Fc-mærket og Cy5-IgG med protein A microbeads og blandes på en tube rotator i PBS i 30 min. ved stuetemperatur beskyttet mod lys.
- For at danne disse komplekser, bruge forespørgslen protein i en endelig koncentration på 20 μg/mL. For at beregne det molære forholdet mellem forespørgsel protein og Cy5-IgG, opdele molekylvægt af forespørgsel protein af molekylevægt af IgG (150.000 Da) og ganger med 40 μg/mL til at bestemme koncentrationen af Cy5-IgG behov.
- Supplere prøver med opløseligt protein en (1 mg/mL) umiddelbart før inkubation med microarray dias (Se 4.2 nedenfor) for at forhindre binding af nogen gratis protein A perler til Fc fusion proteiner, der kan være til stede på arrayet.
Note: Den endelige reaktion volumen kan variere afhængigt af hybridisering station eller inkubation kammer udnyttet. Instrumenteringen er beskrevet i Tabel af materialer kan prøve inkubation ved hjælp af relativt små mængder (~ 200 μl pr. dias).
4. ekstracellulære Protein Microarray Screening og behandling.
Bemærk: Der er en række producenter, der leverer automatisk behandling platforme. Hvis der ikke findes en hybridisering station, følgende trin kan udføres manuelt, at sikre, at der er tilstrækkelig volumen af buffer til at holde diasene nedsænket på alle tidspunkter.
- Varm dias ved stuetemperatur og skyl med PBS/0.1% Tween 20 (PBST) at fjerne resterende glycerol før pålæsning på hybridisering station.
- Brug følgende screening protokol:
- Vask med PBST for 1 min.
- Indlæse 200 μl af 1 mg/mL protein A i PBS/5% mælk og Inkuber i 30 min til at forhindre uncomplexed protein en microbeads fra bindende til Fc-tagged proteiner, der kan være til stede i microarray.
- Vask fem gange med PBST for 1 min.
- Indlæse 200 μl af forespørgsel: microbeads kompleks ved tilstedeværelse af 1 mg/mL protein A og Inkuber i 30 min.
- Vask med PBST for 1 min.
- Efter hybridisering, skyl dias med vand, sted i individuelle 50 mL koniske rør og tørre ved spinning på 900 x g i 5 min.
- Endelig, scanne dias med et microarray scanner hensigtsmæssigt at opdage Cy3 (hvis BSA-Cy3 er blevet udskrevet) og Cy5 fluorescens af spændende på 532 og 635 nm, henholdsvis.
- Udføre dataanalyse ved hjælp af den medfølgende microarray dataanalyse. Relevante array listen (som en .gal fil) er indlæst i data udvinding software. På dette stadium, udnytte Cy3-BSA steder for at finde blokke og bruge indstillingerne auto-montering i software, efterfulgt af Manuel justering af funktionerne, når det er nødvendigt. Gemme filer som .gpr filer til yderligere analyse.
5. dataanalyse
- Gemme data som GPR filer og proces i R ved hjælp af pakken limma, almindeligvis anvendes til analyse af microarray data4,5.
- Til forbehandling, baggrunden korrektion og inden for dias normalisering. Da hvert protein er trykt i duplikerede steder, kombinere begge gentagne målinger for at oprette en enkelt score for at protein i biblioteket.
- Beregne noder for hvert dias og analysere resultater for skæringspunktet mellem høj-scoring kandidater mellem dias.
- Bruge dublerede microarrays fra separate print-løber til kontrol dias variabilitet og skæringspunktet parceller der repræsenterer data fra begge skærme til at kalde endelige hits.
- Endelig, udføre et ekstra niveau af filtrering for at udelukke promiskuøs proteiner i en matrix. Sådanne ikke-specifikke bindemidler er identificeret som proteiner overstiger en bestemt tærskel ramte frekvens som defineret af brugeren på tværs af uafhængige skærme.
Bemærk: Denne protokol er beskrevet i detaljer i Tom et al. 20135. I vores tilfælde uspecifikke bindemiddel ringer er baseret på bestemmelse af den kumulative bytte hit-rate, og en datastyret eliminering tærskel på 5% er brugt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skematisk af arbejdsgangen for den ekstracellulære protein microarray teknologi er vist i figur 1. Når microarray slides der indeholder biblioteket ekstracellulære protein er tilgængelige, kan screening af protein af interesse og data analyse afsluttes inden for en dag. Mange fysiologisk relevante interaktioner mellem membran-embedded receptorer er karakteriseret ved meget svag bindende styrker (KD i rækken micromolar). For at forbedre afsløring af sådanne interaktioner, blev der udviklet en metode baseret på forespørgslen protein (udtrykt som Fc fusion) multimerization på protein A-microbeads. Denne protokol er beskrevet i teksten, og et repræsentativt eksempel på udførelsen af denne tilgang til forbedret detektion af PPI er vist i figur 2.
Et repræsentativt eksempel på et protein microarray skærmen er præsenteret i figur 3. I det viste eksempel en orphan menneskelige adenovirus immunmodulerende protein er screenet for interaktioner mod et bibliotek bestående af mere end 1.500 receptor ECD eller udskilles proteiner14. Som beskrevet, er ECD af den virale proteiner recombinantly udtrykt som en Fc fusion protein, og derefter inkuberes med protein A-belagt microbeads for at danne multivalent komplekser. Proteinkomplekser blev screenet ved hjælp af en hybridisering station for at minimere manuelle operationer, men lignende skærme kan udføres ved hjælp af en hybridisering kammer eller lignende enheder. Det anbefales at køre dublerede skærme ved hjælp af dias udskrives i separate spotting løber for at kontrollere for eventuelle variabilitet under den oplag. Figuren viser den resulterende skæringspunkt parceller fra dublerede, uafhængige skærme. Positive interaktioner og samlede diasbaggrunden er let visualiseres ved scanning af plader (Cy5 fluorescens), lette hit kald. Bemærk, at det anbefales at spotte hver receptor i biblioteket i dubletter for at øge hit tillid. For de fleste forespørgsel proteiner, ingen, iagttages en eller få hits, demonstrerer specificiteten af metoden til påvisning af ppi.
Visse forespørgsel proteiner vise høj baggrund som opdaget ved at binde sig til et usædvanligt højt antal af proteiner i en matrix og/eller til diaset. Vores erfaring, er sådan uspecifikke baggrund observeret for kun et lille antal proteiner. Forskellige faktorer vedrørende arten af proteinet kunne påvirke uspecifikke interaktioner, såsom anerkendelse af glykosylering motiver. Figur 3 viser et eksempel på en viral protein afskærmet mod microarray biblioteket, der viste høj baggrund, udelukker identifikation af specifikke hits. Mens mindre ændringer i protokollen kan anses for at formindske baggrunden (f.eks. øget salt eller vaskemiddel koncentration), i disse tilfælde anbefales det at undersøge alternative metoder til deorphanization af protein under undersøgelsen.
Figur 1: ekstracellulære protein microarrays for hurtig og robust identifikation af receptor-ligand interaktioner. (Trin 1) Et bibliotek af ekstracellulære proteiner af interesse er kompileret. (Trin 2) De rensede proteiner er trykt på epoxysilane dias ved hjælp af et microarray printer og opbevares ved-20 ° C. (Trin 3) Forespørgsel protein af interesse er multimerized på microbeads for øget aviditet og påvisning af forbigående protein-protein interaktioner. En fluorescerende IgG er kompleksbundet med forespørgsel: microbeads som inert mærket carrier. (Trin 4) Screening for bindende partnere en forespørgsel protein. Fluorescerende forespørgsel protein kompleks er afskærmet mod ekstracellulære protein microarray ved hjælp af en hybridisering station for automatiseret slide behandling. (Trin 5) Dias er derefter visualiseres ved hjælp af et microarray scanner. BSA-Cy3 steder kan observeres i 535 nm kanal og hits givet fra skærmen kan iagttages som dublerede steder på 635 nm. Dataanalyse til hit kald udføres ved at oprette skæringspunktet parceller af to uafhængige forsøg. Hits kaldes baseret på gensidigt høje scores over baggrunden, som beskrevet i afsnittet protokol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: forstærket signal gennem dannelsen af multivalent komplekser for forespørgslen protein. (A) Multimerization af forespørgslen proteiner. Forespørgsel proteiner er udtrykt som rekombinant Fc fusioner og koblet til protein A microbeads til form multimerized komplekser. (B) høj aviditet fører til påvisning af lav affinitet interaktioner. Aviditet ved multimerized forespørgsel protein resultater ved stabilisering af svage interaktioner på protein microarray, fører til højere signal til støj forhold og forstærket ramte kald. Parceller viser screening resultater for CD200, screenet som en kompleks, microbead eller et opløseligt protein direkte mærket med Cy5 farvestoffet til at aktiverer visualisering af hits. Multimerization (røde søjler) giver mulighed for robust påvisning af lav affinitet bindende partner CD200R1, findes i protein microarray bibliotek, med betydelige signal/støjforhold i forhold til den samme protein screenet som en vandopløseligt produkt (blå søjler). Grå barer angive ikke-specifikke bindemidler. De øverste 10 interaktioner har været repræsenteret i plottet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Protein microarray teknologi til identifikation af roman receptor-receptor virus-værtssammenspil. (A) eksemplarisk receptor discovery resultater for en orphan adenoviral immunmodulerende protein. Billeder repræsenterer faktiske microarray scanninger, viser hits fra proteiner spottet i dubletter (rød). Assays udføres i dubletter til kontrol for alle dias variabilitet, og resultater repræsenteret som skæringspunktet parceller. I parceller repræsenterer de røde og blå prikker hits kaldes på en array replikeres, mens sorte prikker repræsenterer krydsende hits fra både uafhængig kører. Hele microarray bibliotekets er trykt på to dias for brugervenlighed betragtning af antallet af proteiner øjeblikket i indsamling og sikre tilstrækkelig adskillelse for hver enkelt protein spottet på arrayet. (B) Viral protein skærmen udstiller høj baggrund, der udelukker ramte kald. Visse forespørgsel proteiner kan vise høj baggrund, som opdages ved binding til flere proteiner og/eller dias, derfor udgør udfordringer for identifikation af høj scoring hits. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et betydeligt antal forældreløse receptorer forblive i det menneskelige genom, og romanen interagerende partnere fortsat opstår for ekstracellulære proteiner med tidligere karakteriseret ligander. Definere receptor-ligand interaktioner i menneske og modelorganismer er vigtigt at forstå de mekanismer, der er bestemmende for cellulære kommunikation under homøostase, samt dysregulering fører til sygdom, og derfor informere nye eller forbedrede terapeutiske valgmuligheder. Ikke desto mindre har påvisning af ekstracellulære protein interaktioner af udbredte teknologier repræsenteret en væsentlig barriere hovedsagelig på grund af de tekniske udfordringer knyttet til biokemi af de cellulære receptorer og deres interagerende partnere. I denne rapport beskriver vi brug af en ekstracellulære protein microarray til screening af forespørgsel proteiner af interesse, med vægt på udnyttelse af microbead komplekser til forbedret detektion af ppi.
Sondering receptor-receptor interaktioner er særligt udfordrende, som mange fysiologisk relevante par er karakteriseret ved meget svag interaktion med bindende tilhørsforhold i micromolar sortiment2,3. Aviditet ekstraudstyr via multimerization har vist sig for at være en nyttig strategi for at øge følsomheden for påvisning af lav affinitet ppi. Vi har udviklet en metode baseret på Fc fusion proteiner, til effektiv dannelsen af multivalent microbead-protein forespørgsel komplekser4. Multimerization af forespørgslen protein er et vigtigt skridt til at afsløre lav affinitet ppi. Som vist i eksemplet i figur 2, forbedrer denne metode væsentligt signal i forhold til den samme forespørgsel protein screenet som en opløselig (ikke-kompleksbundet) analysanden, samtidig bevare minimal baggrund. Alternativt, protein microarray skærme kan udføres med opløselige Cy5-mærket forespørgsel protein, en tilgang, der er kompatibel med alle fusion tag og der kan være tilstrækkeligt til identifikation af mere stabile, højere affinitet interaktioner, som dem mellem nogle opløselige ligander og deres receptorer. Det skal bemærkes, at fordi aviditet øges gennem multimerization af forespørgslen på microbeads, microarray signal ikke er en kvantitativ måling af interaktion styrke. Snarere, bindende tilhørsforhold skal beregnes med de monomere versioner af proteiner under evaluering. Derudover er det yderst tilrådeligt at nogen hits identificeret gennem microarray teknologi er valideret via uafhængige metoder. Vi bruger rutinemæssigt overflade plasmon resonans som en guld standard biofysiske metode til måling af den bindende kinetik og PPI undersøgelser.
Selv om ikke omfattet af denne betænkning, skal det bemærkes, at succesen af enhver screening indsats ved hjælp af microarray teknologi stærkt afhængig af udvælgelse og tilgængeligheden af en høj kvalitet protein bibliotek. Relevante kriterier for udvælgelse af ekstracellulære proteiner har været tidligere udgivne4,22. En række nyttige værktøjer til forudsigelse af relevante protein funktioner (såsom transmembrane helices eller signal peptider) er frit tilgængelige online, herunder følgende servere: SignalP15, TMHMM16, Phobious17, og TOPCONS 18. fremragende metoder papers beskriver affinitet rensning metoder er tilgængelige andre steder. Det bør også nævnes, at microarray protein bibliotek generation bygger på produktion af protein ECDs som opløselige rekombinant produkter, og derfor denne tilgang tillader undersøgelser af type I, type II- og GPI-forankrede celle overfladen receptorer og udskilles proteiner, men er generelt ikke egnet til multitransmembrane-holdige proteiner som G protein koblede receptorer. Rensning af hundredvis af proteiner som rekombinant opløselige proteiner kræver betydelige logistiske indsats og kan være meget ressource - og tidskrævende. Ikke desto mindre med nedsat omkostningerne ved gen syntese og øget produktivitet af protein vandrensningssystemer er bibliotek generation nu relativt hurtigere og mere overkommelig. Alternativt, kommercielle kilder tilbyder renset ekstracellulære proteiner, der kan købes i mikrogram beløb, som er tilstrækkeligt til generering af et holdbart protein microarray bibliotek givet de små krav til dias udskrivning. Disse begrænsninger trods tilbyder microarray teknologi store fordele som minimum forbrug af protein reagenser, hurtig udlæsninger (nye PPI kan blive identificeret inden for en dag) og overkommelige instrumentation. Derudover når konstruktioner og rensning betingelser er blevet etableret, kan små purifications producere nok materiale til at forberede tusindvis af arrays.
Endelig, i nogle tilfælde forholdsvis høje baggrund er observeret, optræder som bindende for mange proteiner på microarray bibliotekets. Der er flere faktorer, der kan påvirke ikke-specifik binding. For eksempel, nogle proteiner kan være stærkt ladede eller interagere med kulhydrater, tegner sig for uspecifik baggrund via anerkendelse af fælles motiver. Tilsvarende, ikke-specifik binding kan også på grund af karakteren af forespørgsel protein, som for eksempel anerkendelse af sialic syre motiver, findes i flere andre proteiner. Da microarray biblioteker udvider, er det mere sandsynligt, at en fælles liste over ikke-specifikke bindemidler kan være til stede. Sådanne ikke-specifikke bindemidler kan identificeres ved at spore deres adfærd på tværs af forskellige skærme mod uafhængige forespørgsel proteiner. Det er tilrådeligt at generere en liste over ikke-specifikke bindemidler på tværs af skærme, at forbedre specifikke hit kald. I vores tilfælde, har vi fundet, at anvende 5% cutoff (dvs. et protein er markeret som ikke-specifikke, hvis opdaget som bindemiddel er 5% eller mere af uafhængige forespørgsel protein skærme) er vigtigt at reducere falske positiver. Det skal bemærkes, at hvis assays hovedformål er at køre kun et par udvalgte skærme, det ikke kan være umagen værd at udvikle en statistisk analyse. I dette tilfælde kan det ikke være muligt at detektere falske positiver på grund af en begrænset datasæt, og derfor anbefaler vi, at der er særlig vægt på bekræftelse af de hits, ved hjælp af alternative metoder.
Vi forventer ekstracellulære protein microarrays, især i kombination med multimerization metoder til påvisning af forbigående receptor-ligand interaktioner, vil fortsætte med at tilbyde en unik platform for hurtig og robust identifikation af roman PPI i det ekstracellulære rum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.H., S.R-R og Katrine Nielsen-M. er Genentech medarbejdere og egne aktier i gruppen Genentech Inc./Roche.
Acknowledgments
Vi takker Philamer Calses og Kobe Yuen for kritisk læsning af manuskript. Vi er taknemmelige for Randy Yen for fremragende teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
- Ramani, S. R., et al. A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery. Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).
- Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).
- Kaushansky, A., et al. Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays. Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
- Voulgaraki, D., et al. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).
- Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia. Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).
- Jaworski, A., et al. Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2. Science. 350 (6263), 961-965 (2015).
- Martinez-Martin, N., et al. The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation. Nature Communications. 7, 11473 (2016).
- Nielsen, H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).
- Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).
- Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology. Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).
- Gonzalez, R., et al. Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).
- Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).
- Clark, H. F., et al. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).
