Summary
Här presenterar vi ett protokoll till skärmen extracellulära protein microarrays för identifiering av romanen receptor-ligand interaktioner i hög genomströmning. Vi beskriver också en metod för att förbättra identifiering av övergående protein-protein interaktioner med protein-microbead komplex.
Abstract
Utsöndrade faktorer, membran-bundna receptorer och deras samverkande partner är huvudsakliga regulatorer av cellulär kommunikation och inledande av signalering cascades under homeostas och sjukdom, och som sådan utgör främsta terapeutiska mål. Trots deras relevans fortfarande dessa interaktion nätverk kraftigt underrepresenterade i aktuella databaser; Därför har mest extracellulära proteiner ingen dokumenterad bindande partner. Denna skillnad beror främst på de utmaningar som förknippas med studien av de extracellulära proteiner, inklusive uttryck av funktionella proteiner och svag, låg affinitet, proteininteraktioner upprättas vanligtvis mellan surface cellreceptorer. Syftet med denna metod är att beskriva utskrift av ett bibliotek av extracellulära proteiner i en microarray format för screening av protein-protein interaktioner. För att aktivera identifiering av svaga interaktioner, beskrivs en metod baserad på multimerization av proteinet fråga under studien. Kopplat till denna microbead-baserade multimerization strategi för ökad multivalency, kan det protein microarray robust övergående protein-protein interaktioner i hög genomströmning. Denna metod erbjuder en snabb och låg prov konsumerar-metod för identifiering av nya interaktioner tillämpliga på något extracellulära protein. Protein microarray utskrift och screening protokoll beskrivs. Denna teknik kommer att vara användbart för utredare söker en robust metod för upptäckt av proteininteraktioner i det extracellulära utrymmet.
Introduction
Metoden ses här beskrivs utskrift av en samling av extracellulära proteiner i en microarray format, följt av en metod för screening av ett mål av intresse mot detta bibliotek. Vi har identifierat protein multimerization som ett avgörande steg för detektion av interaktioner som kännetecknas av låg bindande samhörighet. För att förbättra identifiering av interaktionerna, beskriver vi ett protokoll baserat på multimerization av proteinet frågan av intresse med mikrokulor.
Utsöndras och cell surface-uttryckta proteiner (kollektivt kallas extracellulära proteiner) tillsammans med sina samverkande partner är viktiga regulatorer av cellulär kommunikation, signalering och interaktion med mikromiljö. De är därför viktiga i regleringen av många fysiologiska och patologiska processer. Ungefär en fjärdedel av det mänskliga genomet (≈5, 000 proteiner) kodar för extracellulära proteiner, som, med tanke på deras betydelse och tillgänglighet till systematiskt levererade droger, representerar viktiga mål för drogen utveckling1. Följaktligen utgör extracellulära proteiner mer än 70 procent av de protein mål med kända farmakologiska verkan för godkända läkemedel på marknaden, känd som det ”druggable proteomet”. Trots sin betydelse och överflöd fortfarande de extracellulära protein-protein interaktioner (ePPI) nätverk anmärkningsvärt underrepresenterade i de tillgängliga databaserna. Detta är i grunden på grund av komplexa biokemiska karaktär av extracellulära proteiner, vilket utesluter deras karakterisering som använder mest tillgängliga teknik2. För det första är membranproteiner svåra att solubilize, en process som ofta innebär hårda tvätt villkor och rengöringsmedel; för det andra saknar extracellulära proteiner ofta relevant post-translationella modifieringar såsom glycosylation som är frånvarande när dessa proteiner uttrycks i vanligen används heterologa system. Slutligen, interaktioner mellan receptorer som samtidig receptorer uttrycks på immunceller, är ofta övergående och kännetecknas av mycket låg affinitet (K-D i den ~ 1 μM till > 100 μM utbud). Alldeles, arten av dessa proteiner och deras bindning partners göra mest utnyttjade teknik, såsom affinitet rening/masspektrometri (AP/MS) eller jäst-två-hybrid, olämpliga för detektion av interaktioner i extracellulära 2 , 3.
I ett försök att övervinna dessa tekniska utmaningar och påskynda upptäckten av nya interaktioner för extracellulära proteiner, har vi utvecklat en hög täckning extracellulära protein microarray4,5. Microarrays fördelen med generera hög densitet ytor med små mängder prov och är allmänt mottagliga för hög genomströmning studier. Protein microarray-baserade studier har tidigare lämnat relevanta insikter proteininteraktioner för flera modellorganismer, om än främst fokusera på cytosoliska interaktioner eller specifikt protein familjer6,7, 8. Däremot har begränsad arbete gjorts för att undersöka extracellulära proteininteraktioner med denna teknik. Vi har utvecklat en protein microarray metod för att möjliggöra studier av ePPIs genom att bygga ett omfattande och mycket olikartade bibliotek av renade proteiner från utsöndras och enda transmembrana (STM) receptorer uttrycks som rekombinant extracellulära domäner (ECD) smält till vanliga taggar för affinitet rening4. Framgången för protein microarray skärmarna är starkt beroende av inrättandet av en hög kvalitet protein library. Uttryck för både bibliotek och fråga protein valdes däggdjursceller eller insekt celler prioriterat som heterologa uttryck system, att säkerställa korrekt tillägg av post-translationella modifieringar som glycosylation eller disulphide obligationer. SDS-PAGE, storlek utslagning kromatografi och flera vinklar laserljus spridning är tekniker som ofta används för att bedöma rekombinant proteinkvalitet. Protein biblioteket sedan fläckig på epoxysilane bilder och lagras vid-20 ° C för långvarig användning. Protein koncentrationer över 0,4 mg/ml rekommenderas för det protokoll som beskrivs nedan. Låg-uttryckande proteiner kan därför kräva en koncentration steg före provet utskrift och lagring. En största fördelen med denna teknik är dock den lilla volymen av protein krävs (50 μg av protein är tillräckligt att utföra > 2.000 skärmar), tillsammans med minimal fråga protein konsumtion (20-25 μg per dubbletter skärm). Med hjälp av protokoll och utrustning som beskrivs här, och förutsatt att biblioteken är tillgängliga, resultat för enskilda fråga proteiner kan genereras inom en arbetsdag.
En stor utmaning i att upptäcka proteininteraktioner i den extracellulära miljön uppstår från deras egenskapt svag eller övergående natur, vilket utesluter identifiering av de vanligaste metoderna. Öka den bindande aviditet kraftigt förbättrar känsligheten för upptäckt av svag protein interaktioner9,10,11. Baserat på denna princip som vi utvecklat en metod att multimerize frågan proteinerna (uttryckt som Fc fusion) använder protein A-belagd pärlor4,5. För att undvika eventuella potentiella inaktivering av proteinet fråga av slumpmässiga märkning, vi istället etikett en irrelevant humant immunglobulin G med Cy5 och Lägg tillsammans med proteinet fråga till protein A pärlorna, vilket eliminerar alla artefakter på grund av den direkta konjugering av en färga till proteinet av intresse. Med tanke på de mikromolära tillhörighet av flera samtidig receptor par, öka de multivalenta komplex kraftigt signal-brus-förhållande, jämfört med Fc-fråga fusionsproteinerna screening som lösliga proteiner4.
Sammanfattningsvis är syftet med detta protokoll att beskriva utarbetandet av microarray bilder som innehåller ett befintligt extracellulära protein bibliotek för identifiering av receptor-ligand interaktioner. Vi granskar stegen för bild utskrift, följt av ett protokoll för screening av ett protein av intresse mot den extracellulära protein library. Dessutom beskriver vi en metod för förbättrad detektion av ePPIs baserat på mikrokulor att uppnå ökade aviditet av protein under studien. Den extracellulära protein Mikroarrayteknik beskrivs här representerar en snabb, robust och effektiv metod för screening och upptäcka nya ePPI med låg falskt positiva förhållanden och genom att utnyttja bara mikrogram kvantiteter av proteinet fråga under utredning. Denna teknik har underblåst flera studier som har gett relevanta insikter om tidigare okända cellfunktioner och signalvägar för en mängd olika receptorer12,13, inklusive viral immunoregulators14, och kan utnyttjas för att de orphanize något extracellulära protein av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generering av ett bibliotek av extracellulära mänskliga proteiner
- Sammanställa en lista över ytan cellreceptorer eller utsöndras proteiner av intresse att bygga protein microarray biblioteket. Specifikt protein familjer (till exempel immunglobulin överfamiljen) eller proteiner uttryckte selektivt i synnerhet cell typer kan väljas för studien.
- För surface cellreceptorer, bestämma extracellulär (ECD) domängränser genom att identifiera de signal peptid och transmembrana regioner med hjälp av mjukvaruverktyg. Några av de relevanta verktyg, fritt tillgängliga online, refereras i Tabellen av material15,16,17,18.
- Syntetisera ECD för generna av intresse och klon i den relevanta vektorn. Utsöndrade proteiner eller ECD av STM receptorerna smält till ett antal gemensamma affinitet taggar kan renas från luftkonditionerade media celler transfekterade med lämpliga vektorn eller från baculoviridae-insekt uttryck cellsystem.
Obs: Däggdjur cell-baserat system (såsom HEK/293 eller CHO-celler) rekommenderas att maximera sannolikheten för korrekt proteinveckning och tillägg av relevanta posttranslationell ändringar, till exempel glycosylation. - Rena proteiner genom standard affinitet reningsmetoder. Tidigare insatser har beskrivit automatiskt eller halvautomatiskt förfaranden som är lämpliga för rening av hundratals proteiner, som kan skalas till generera uppsättningen proteiner av intresse9,19,20, 21.
Obs: SDS-PAGE, storlek utslagning kromatografi (S), eller flera vinklar laser ljus spridning (gallerior) rekommenderas att bedöma eventuella icke-kovalenta aggregering och styra för den övergripande kvaliteten på proteinet förberedelserna. - Justera proteiner till 200 eller 400 μg/mL när så är möjligt och späd bestånd med 80% glycerol för långsiktig lagring i kryogena injektionsflaskor vid-20 ° C. Dessa representerar master bestånd och bör nås bara när det behövs.
- Överför alikvoter av varje protein (100 μL) till 96 brunnar (lager plattor), försegla med självhäftande folie och förvaras vid-20 ° C tills microarray bild förberedelse. Lager plattor genereras för att minimera frysning-tining cykler och säkerställa protein stabilitet.
2. extracellulär Protein Microarray utskrift
- Använda en standard microarrayer för bild utskrift. Instrumentet används för det protokoll som beskrivs här har en kapacitet på 57 bilder/kör och använder ett skrivhuvud som håller 48 tubkikare pins. Dessa stift generera ställen med diametern ~ 100 μm åtskilda av ett plats-till-plats-avstånd av ~ 350 μm och drar 0,25 μl per Last. Under denna konfiguration, kan upp till 8000 ställen per bild rymmas.
- Generera arbetande plattor (384 plattor, 10 μL prov per brunn) från lager plattorna. Utför det här steget manuellt före bild utskrift med microarrayer. Sedan, spot proteiner med quill-typ tubkikare stift på epoxysilane diabilder på 60% luftfuktighet (för att förhindra uttorkning av protein fläckar).
Obs: Cy3-märkt bovint serumalbumin (BSA) kan upptäckas i dubbletter mellan varje protein prov (5 μg/mL i PBS/40% glycerol) för att visualisera matrisen för masktillpassning (se avsnitt 4). Även om rekommenderas är detta steg valfritt. - Efter utskrift, ta bort protein microarray bilderna från den befuktade miljön och blockera dem över natten med 5% mjölk i PBST att inaktivera ytan.
Obs: Den Rekommenderad metoden är att använda ett ultraljud dimmig för att generera en fin dimma av blockering lösning som lägger sig på bild yta. - Lagra bilder på-20 ° C i 50% glycerol att förhindra frysning.
3. beredning av multivalenta bete komplex
Obs: Interaktioner mellan extracellulära proteiner kännetecknas ofta av låg tillhörighet. För att aktivera dessa interaktioner genom att öka bindande aviditet, en multivalenta strategi som bygger på att fånga proteinet fråga, uttryckt som Fc-taggade ECD, var protein A-belagd mikrokulor utvecklade4.
- Etikett transportören IgG som används för att upptäcka med Cy5 monoreactive dye och separata gratis färgämnet hjälp avsaltning kolumner. Bestämma färgen till protein nyckeltal genom mätning ultraviolett absorbansen vid 280 och 650 nm.
Obs: Protein-dye nyckeltal mellan 2.0 och 4.0 används normalt. Det rekommenderas att snurra de Cy5 konjugat vid 100 000 x g i 15 min att ta bort potentiella lösliga aggregat på grund av märkning processen. - Fastställa det optimala microbead-till-protein förhållandet genom titrering av protein A mot en konstant mängd av proteinet fråga. Minimal mättar volymen av pärlor där ingen gratis Fc-taggade protein förblir, används mätt med en konkurrenskraftiga analys bestäms av biolayer interferometri, för screening.
- Bilda de microbead-proteinkomplex genom ruvning Fc-taggade frågan och de Cy5-IgG med protein A mikrokulor och blanda på en tube rotator i PBS i 30 min i rumstemperatur skyddas från ljus.
- För att bilda dessa komplex, använda proteinet fråga med en slutlig koncentration på 20 μg/mL. För att beräkna molar förhållandet i fråga protein och Cy5-IgG, dela den molekylära vikten av proteinet fråga av molekylvikten för IgG (150 000 Da) och multiplicera med 40 μg/mL att bestämma koncentrationen av Cy5-IgG behövs.
- Komplettera prover med lösligt protein en (1 mg/mL) omedelbart före inkubering med microarray glider (avsnitt 4.2 nedan) för att förhindra bindning av någon gratis protein A pärlor till Fc fusionsproteinerna som kan finnas på matrisen.
Obs: Den slutliga reaktionsvolym kan variera beroende på hybridisering station eller inkubation kammaren utnyttjas. Instrumenteringen beskrivs i Tabell av material tillåter prov inkubation med relativt små volymer (~ 200 μL per bild).
4. extracellulär Protein Microarray Screening och behandling.
Obs: Det finns ett antal tillverkare som ger automatisk databehandling plattformar. Om det inte finns en hybridisering station, följande steg kan utföras manuellt, säkerställa att det finns tillräcklig volym buffert att hålla bilderna nedsänkt hela tiden.
- Värma glasen i rumstemperatur och skölj med PBS/0.1% Tween 20 (PBST) att ta bort kvarvarande glycerol före lastning på hybridisering stationen.
- Använd följande screening protokoll:
- Tvätta med PBST för 1 min.
- Ladda 200 μL av 1 mg/mL protein A i PBS/5% mjölk och inkubera i 30 min för att förhindra uncomplexed protein en mikrokulor från att binda till Fc-märkta proteiner som kan finnas i microarray.
- Tvätta fem gånger med PBST för 1 min.
- Ladda 200 μL av den frågan: mikrokulor komplexa i närvaro av 1 mg/mL protein A och inkubera i 30 min.
- Tvätta med PBST för 1 min.
- Efter hybridisering, skölj diabilder med vatten, placera i enskilda 50 mL koniska rör och torka av snurrande vid 900 x g i 5 min.
- Slutligen, skanna bilderna med en microarray scanner lämpligt att upptäcka Cy3 (om BSA-Cy3 har skrivits ut) och Cy5 fluorescens av spännande på 532 och 635 nm, respektive.
- Utföra dataanalyser med hjälp av medföljande microarray dataanalys. Relevanta array listan (som en .gal fil) läses in i programvaran data utvinning. I detta skede utnyttja Cy3-BSA fläckarna för att hitta block och använda alternativen auto-montering i programvaran, följt av manuell justering av funktionerna vid behov. Spara filer som .gpr-filer för ytterligare analys.
5. dataanalys
- Spara data som GPR filer och processen i R med hjälp av limma paketet, ofta används för analys av microarray data4,5.
- För förbearbetning, göra bakgrunden korrigering och inom-slide normalisering. Eftersom varje protein trycks i duplicerade ställen, kombinera båda replikerar mätningar för att skapa en enda Poäng för det proteinet i biblioteket.
- Beräkna poängen för varje bild och analysera resultaten för skärningspunkten mellan höga poäng kandidater mellan bilderna.
- Använd dubbla microarrays från separata print-körningar till kontroll för slide variabilitet och korsningen tomter som representerar data från båda skärmarna för att kalla slutliga träffar.
- Slutligen, utföra en ytterligare nivå av filtrering för att utesluta promiskuösa proteiner i arrayen. Sådana icke-specifik bindemedel identifieras som proteiner som överstiger ett visst tröskelvärde hit frekvens som definieras av användaren över oberoende skärmar.
Obs: Detta protokoll beskrivs i detalj i Tom et al. 20135. I vårt fall icke-specifik bindemedlet ringer grundas på bestämning av den kumulativa offer träffsäkerhet och en data-driven eliminering tröskelnivån på 5% används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk i arbetsflödet för den extracellulära protein Mikroarrayteknik visas i figur 1. När microarray bilder som innehåller den extracellulära protein library är tillgängliga, kan screening av proteinet av intresse och dataanalys slutföras inom en dag. Många fysiologiskt relevanta interaktioner mellan membran-embedded receptorer kännetecknas av mycket svag bindande styrkor (KD i intervallet mikromolära). För att förbättra identifiering av sådana interaktioner, utvecklades en metod baserad på fråga protein (uttryckt som Fc fusion) multimerization på protein A-mikrokulor. Detta protokoll beskrivs i texten, och ett representativt exempel på utförandet av denna strategi för förbättrad detektion av PPI visas i figur 2.
Ett representativt exempel på ett protein microarray skärmen presenteras i figur 3. I exemplet, en föräldralös mänskliga adenovirus immunmodulerande protein är screening för interaktioner mot ett bibliotek som består av mer än 1500 receptor ECD eller utsöndras proteinerna14. Som beskrivits, är direktivet om elektronisk handel av virala protein recombinantly uttryckt som en Fc fusionsprotein, och sedan inkuberas med protein A-belagd mikrokulor för att bilda multivalenta komplex. Proteinkomplex screenades med en hybridisering station för att minimera manuella operationer, liknande skärmar kan dock utföras med en hybridisering kammare eller liknande enheter. Det är rekommenderat att köra dubbla skärmar med bilder tryckta i separata tubkikare körningar för att kontrollera för eventuella variationer under den upplaga. Figuren visar de resulterande korsningen tomterna från dubbla, oberoende skärmar. Positiva interaktioner och övergripande bildbakgrund visualiseras lätt vid skanning av pläterar (Cy5 fluorescens), att underlätta hit ringer. Observera att det rekommenderas att upptäcka varje receptor i biblioteket i dubbletter för att öka träff förtroende. För de flesta fråga proteiner, ingen, observeras en, eller några träffar, visar specificiteten av metoden för detektering av protonpumpshämmare.
Vissa proteiner i fråga visar hög bakgrund som upptäckts genom bindning till ett ovanligt högt antal proteiner inom matrisen eller bilden. Vår erfarenhet observeras sådana icke-specifik bakgrund för endast ett litet antal proteiner. Olika faktorer som avser arten av protein kan påverka icke-specifika interaktioner, såsom erkännande av glycosylation motiv. Figur 3 visar ett exempel på en viral protein avskärmade mot microarray biblioteket som visade hög bakgrund, utgör hinder för identifiering av särskilda träffar. Medan mindre ändringar i protokollet kan anses minska bakgrunden (till exempel ökad salt eller tvättmedel koncentration), i dessa fall är det rekommenderat att utforska alternativa metoder för deorphanization av protein under studien.
Figur 1: extracellulära protein microarrays för snabb och robust identifiering av receptor-ligand interaktioner. (Steg 1) Ett bibliotek av extracellulära proteiner av intresse sammanställs. (Steg 2) De renade proteinerna är tryckt på epoxysilane bilder med hjälp av microarray skrivare och lagras vid-20 ° C. (Steg 3) Proteinet frågan av intresse är multimerized på mikrokulor för ökade aviditet och detektion av övergående protein-protein interaktioner. En fluorescerande IgG är komplex med den frågan: mikrokulor som inert märkt bärare. (Steg 4) Screening för bindande partner av ett protein som fråga. Fluorescerande fråga protein komplex är avskärmade mot den extracellulära protein microarray med en hybridisering station för automatiserad bild bearbetning. (Steg 5) Bilderna visualiseras sedan en microarray skanner. BSA-Cy3 fläckarna kan observeras i 535 nm kanalen och träffar gav från skärmen kan observeras som dubbla fläckar på 635 nm. Dataanalys för träff samtal utförs genom att skapa korsningen tomter av två oberoende experiment. Träffar kallas baserat på ömsesidigt poängrekord ovan bakgrund, som beskrivs i avsnittet protokoll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: förstärkt signal genom bildandet av multivalenta komplex för proteinet fråga. (A) Multimerization av frågan proteiner. Fråga proteiner uttrycks som rekombinant Fc fusioner och kopplat till protein A mikrokulor till formuläret multimerized komplex. (B) hög-aviditet leder till upptäckt av låg affinitet interaktioner. Den aviditet ges av multimerized protein frågeresultaten i stabiliseringen av svaga interaktioner på den protein microarray, leder till högre signal till brus nyckeltal och förbättrad hit ringer. Tomter visar screening resultat för CD200, skärmad som en komplex, microbead eller ett lösligt protein direkt märkt med Cy5 färgämne för att aktivera visualisering av träffar. Multimerization (röda staplar) tillåter robust identifiering av låg affinitet bindande partner CD200R1, förekommer i protein microarray biblioteket, med betydande signal/brus-förhållande i jämförelse med samma protein screening som en vattenlöslig produkt (blå staplar). Grå staplarna visar ospecifika bindemedel. Endast topp 10 interaktioner har varit representerade i observationsområdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Protein microarray teknik för identifiering av romanen receptor-receptor virus-värd-interaktioner. (A) exemplariskt receptor discovery resultat för en föräldralös adenovirala immunmodulerande protein. Bilderna representerar faktiska microarray skanningar, visar träffar från proteiner fläckig i dubbletter (röd). Analyser utförs i dubbletter kontroll någon bild variationer, och resultat som representerade som skärningspunkten tomter. I tomterna representerar röda och blå prickar träffar anropas på en array replikera, svarta prickar utgör korsande träffar från båda oberoende körningar. Hela microarray biblioteket är tryckt på två bilder för enkel användning med tanke på antalet proteiner finns i samlingen, och att säkerställa tillräcklig åtskillnad för varje enskild protein fläckig på matrisen. (B) virala protein skärmen uppvisar hög bakgrund som utesluter hit ringer. Vissa proteiner i fråga kan visa hög bakgrund, som upptäckts genom bindning till flera proteiner eller bilderna, därför poserar utmaningar för identifiering av hög scoring träffar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett betydande antal föräldralösa receptorer kvar i det mänskliga genomet, och romanen samverkande parter fortsätta växa fram för extracellulära proteiner med tidigare kännetecknas ligander. Definiera den receptor-ligand interaktioner i mänskliga och modellorganismer är viktigt att förstå de mekanismer som dikterar cellulär kommunikation under homeostas, liksom dysreglering leder till sjukdom, och därför informera nya eller förbättrade terapeutiska alternativ. Dock har upptäckt av extracellulära proteininteraktioner av allmänt använda tekniker representerade en betydande barriär främst på grund av de tekniska utmaningarna som är associerade till biokemi de cellulära receptorerna och deras samverkande partner. I denna rapport beskriver vi användning av en extracellulär protein microarray för screening av fråga proteiner av intresse, med betoning på utnyttjande av microbead komplex för förbättrad detektion av protonpumpshämmare.
Sondera receptor-receptor interaktioner är särskilt utmanande, eftersom många fysiologiskt relevanta par kännetecknas av mycket svag växelverkan med bindande tillhörighet i mikromolära intervall2,3. Aviditet förbättring genom multimerization har visat sig vara en användbar strategi för att öka känsligheten för upptäckt av låg affinitet protonpumpshämmare. Vi har utvecklat en metod baserad på Fc fusionsproteinerna, för effektiv bildandet av multivalenta microbead-protein frågan komplex4. Multimerization av frågan protein är ett viktigt steg till att upptäcka låg affinitet protonpumpshämmare. I exemplet i figur 2visas denna metod avsevärt förbättrar signal jämfört med samma fråga protein screening som en löslig (icke-komplex) analyt, bibehållen minimal bakgrund. Alternativt, protein microarray skärmarna kan utföras med lösliga Cy5-märkt fråga protein, en strategi som är kompatibel med någon fusion tagg och det kan räcka för identifiering av mer stabil, högre affinitet interaktioner, exempelvis mellan vissa lösliga ligander och deras receptorer. Det bör noteras att eftersom aviditet ökas genom multimerization av frågan på mikrokulor, microarray signalen inte är ett kvantitativt mått av interaktion styrkan. Snarare bör bindande tillhörighet beräknas med monomer versioner av proteiner under utvärdering. Dessutom är det mycket lämpligt att alla träffar som identifieras genom Mikroarrayteknik valideras genom oberoende metoder. Vi använder rutinmässigt ytan plasmon resonans som en guldmyntfot biofysiska metod för PPI studier och mätning av kinetik bindande.
Även om ur tillämpningsområdet för denna rapport, bör det noteras att framgången med någon screening ansträngningar med hjälp av microarray teknik tungt beroende av utbud och tillgänglighet av en hög kvalitet protein library. Relevanta kriterier för urval av extracellulära proteiner har varit tidigare publicerade4,22. Ett antal användbara verktyg för Prediktion av relevanta protein funktioner (såsom transmembrana spiraler eller signal peptider) är fritt tillgängliga online, inklusive följande servrar: SignalP15, TMHMM16, Phobious17och TOPCONS 18. utmärkta metoder tidningar som beskriver affinitet reningsmetoder är tillgängliga någon annanstans. Det bör också nämnas att den microarray protein library generationen bygger på produktion av protein ECDs som löslig rekombinant produkter, och därför detta tillvägagångssätt tillåter studier av typ I, typ II och GPI-förankrade cell yta receptorer och utsöndras proteiner, men är i allmänhet inte lämplig för multitransmembrane som innehåller proteiner som G-proteinkopplade receptorer. Rening av hundratals proteiner som rekombinanta lösliga proteiner kräver betydande logistiska insatser och kan vara mycket resurs - och tidskrävande. Dock med gen syntes minskade kostnader och ökad genomströmning av protein reningssystem är bibliotek generation nu relativt snabbare och billigare. Alternativt erbjuder kommersiella källor renade extracellulära proteiner som kan köpas i mikrogram belopp, som räcker för generering av ett slitstarkt protein microarray bibliotek med tanke på de små kraven för bild utskrift. Dessa begränsningar trots erbjuder Mikroarrayteknik stora fördelar såsom minimal konsumtion av protein reagenser, snabb avläsning (nya protonpumpshämmare kan identifieras inom ett dygn) och prisvärda instrumentering. Dessutom, när de konstruktioner och rening villkor har fastställts, kan småskaliga reningar producera tillräckligt med material för att förbereda tusentals matriser.
Slutligen, i vissa fall relativt hög bakgrund observeras, som visas som bindning till många proteiner på microarray biblioteket. I området i närheten finns det flera faktorer som kan påverka icke-specifik bindning. Till exempel vissa proteiner kan vara laddad, eller interagera med kolhydrater, redovisning av icke-specifika bakgrund via erkännande av gemensamma motiv. På samma sätt, icke-specifik bindning också pågrund av proteinet fråga, såsom till exempel erkännande av sialic acid motiv, finns i flera andra proteiner. Som microarray Bibliotek expandera, det är mer troligt som att en gemensam förteckning över icke-specifik bindemedel kan förekomma. Sådana icke-specifik bindemedel kan identifieras genom att spåra deras beteende på olika skärmar mot orelaterad fråga proteiner. Det är tillrådligt att generera en lista över icke-specifik pärmar över skärmen, att förbättra specifika hit ringer. I vårt fall, har vi funnit att tillämpa en 5%-cutoff (dvs. ett protein är flaggad som icke-specifik om identifieras eftersom bindemedlet är 5% eller mer av orelaterade fråga protein skärmar) är viktigt att minska falska positiva. Det bör noteras att om det huvudsakliga syftet med analyserna är att köra bara några utvalda skärmar, inte kan det vara värt att utveckla en statistisk analys. I det här fallet, det kan inte vara möjligt att upptäcka falska positiva på grund av en begränsad datamängd, och därför rekommenderar vi att särskild vikt läggs vid bekräftelse av träffar med alternativa metoder.
Vi räknar med den extracellulära protein microarrays, särskilt i kombination med multimerization metoder för detektion av transient receptor-ligand interaktioner, kommer att fortsätta att erbjuda en unik plattform för snabb och robust identifiering av romanen PPI i extracellulära.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.H., tbas-R och Norén-M. är Genentech anställda och egna aktier i Genentech Inc./Roche-gruppen.
Acknowledgments
Vi tackar Philamer Calses och Kobe Yuen för att kritiskt läsa manuskriptet. Vi är tacksamma till Randy Yen för utmärkt teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
- Ramani, S. R., et al. A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery. Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).
- Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).
- Kaushansky, A., et al. Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays. Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
- Voulgaraki, D., et al. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).
- Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia. Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).
- Jaworski, A., et al. Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2. Science. 350 (6263), 961-965 (2015).
- Martinez-Martin, N., et al. The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation. Nature Communications. 7, 11473 (2016).
- Nielsen, H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).
- Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).
- Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology. Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).
- Gonzalez, R., et al. Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).
- Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).
- Clark, H. F., et al. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).
