Summary
Her presenterer vi en protokoll til skjermen ekstracellulære protein microarrays for identifikasjon av romanen reseptor-ligand interaksjoner i høy gjennomstrømning. Vi har også beskriver en metode for å forbedre gjenkjenning av forbigående protein-protein interaksjoner ved hjelp av protein-microbead komplekser.
Abstract
Utskilles faktorer, membran-bundet reseptorer og samarbeidspartnerne samhandlende viktigste regulatorer av mobil kommunikasjon og initiering signalnettverk cascades homeostase og sykdom, og representerer som førsteklasses terapeutiske mål. Til tross for deres relevans fortsatt disse samhandling nettverkene betydelig underrepresentert i gjeldende databaser; Derfor har mest ekstracellulære proteiner ingen dokumentert bindende partner. Dette avviket skyldes hovedsakelig utfordringene knyttet til studiet av de ekstracellulære proteinene, inkludert uttrykk for funksjonell proteiner og svakt, lav affinitet, protein interaksjoner ofte etablert mellom celleoverflaten reseptorer. Formålet med denne metoden er å beskrive utskrift av et bibliotek av ekstracellulære proteiner i et microarray format for screening av protein-protein interaksjoner. For å aktivere gjenkjenning av svake interaksjoner, er en metode basert på multimerization av spørringen protein under studien beskrevet. Koblet til denne microbead-baserte multimerization for økt multivalency, gir den protein microarray robust oppdaging av forbigående protein-protein interaksjoner i høy gjennomstrømning. Denne metoden tilbyr en rask og lav forbruker-tilnærming for identifisering av nye samhandlinger gjelder for alle ekstracellulære protein. Protein microarray utskrift og screening protokoll er beskrevet. Denne teknologien vil være nyttig for etterforskere søker en robust metode for oppdagelse av protein interaksjoner i ekstracellulære plass.
Introduction
Metoden omtalt her beskriver utskrift av en samling av ekstracellulære proteiner i et microarray format, etterfulgt av en metode for screening av et mål av interesse mot dette biblioteket. Vi har identifisert protein multimerization som et viktig skritt for påvisning av interaksjoner preget av lav bindende slektskap. For å forbedre gjenkjenning av disse interaksjoner, beskriver vi en protokoll basert på multimerization av spørringen protein rundt ved hjelp av microbeads.
Skilles ut celle overflaten-uttrykt proteiner (kollektivt kalt ekstracellulære proteiner) sammen med samarbeidspartnerne samhandlende er viktige regulatorer av mobil kommunikasjon, signalisering og samspill med microenvironment. De er derfor viktige i å regulere mange fysiologiske og patologiske prosesser. Omtrent en fjerdedel av det menneskelige genomet (≈5, 000 proteiner) koder for ekstracellulære proteiner, som, gitt deres betydning og tilgjengelighet til systematisk leverte narkotika, representerer viktige mål for narkotika utvikling1. Følgelig representerer ekstracellulære proteiner mer enn 70% av protein mål med kjente farmakologisk handling for godkjente legemidler på markedet, kjent som "druggable proteom". Til tross for deres betydning og overflod forblir den ekstracellulære protein-protein interaksjon (ePPI) nettverk bemerkelsesverdig underrepresentert i tilgjengelige databaser. Dette er fundamentalt komplekse biokjemiske innholdet i de ekstracellulære proteinene, som utelukker sin karakteristikk bruker mest tilgjengelige teknologier2. Først er membran proteiner vanskelig å solubilize, en prosess som involverer ofte harde vask forhold og vaskemidler; Dernest mangler ekstracellulære proteiner ofte relevante post-translasjonell modifikasjoner som glykosylering som er fraværende når disse proteinene er uttrykt i vanligvis brukt heterologous systemer. Til slutt, samspillet mellom reseptorer, som co reseptorer uttrykt på immunceller, er ofte midlertidig og preget av svært lav slektskap (KD i ~ 1 μM til > 100 μM utvalg). Sammen benyttet disse proteinene og deres bindende partnere gjengi mest teknologi, for eksempel rensing/massespektrometri med affinitet (AP/MS) eller gjær-to-hybrid, uegnet for påvisning av interaksjoner i ekstracellulære plass 2 , 3.
I et forsøk på å overvinne disse tekniske utfordringer og akselerere oppdagelsen av romanen samhandlinger for ekstracellulære proteiner, har vi utviklet en høy dekning ekstracellulære protein microarray4,5. Microarrays tilbyr fordelen av generere høy tetthet overflater med små mengder av prøven, og er generelt mottakelig for høy gjennomstrømning studier. Protein microarray-baserte studier har tidligere gitt relevant innsikt i protein interaksjoner for flere modell organismer, men hovedsakelig fokuserer på cytosolic interaksjoner eller bestemt protein familier6,7, 8. Sammenligning har begrenset arbeid blitt gjort for å undersøke ekstracellulære protein interaksjoner ved hjelp av denne teknologien. Vi har utviklet en protein microarray metode for å aktivere studier av ePPIs ved å bygge en omfattende og svært variert bibliotek av renset utskilles proteiner og enkelt transmembrane (STM) reseptorer uttrykt som rekombinant ekstracellulære domener (ECD) del felles koder for affinitet rensing4. Suksessen av protein microarray skjermene stoler tungt på etablering av et høykvalitets protein bibliotek. For uttrykk for både bibliotek og spørring protein, pattedyrceller eller insekt celler var preferentially valgt heterologous uttrykk systemer, å sikre riktig tillegg post-translasjonell modifikasjoner som glykosylering eller disulphide obligasjoner. SDS side, størrelse utelukkelse kromatografi og multivinkel laserlys spredning er teknikker vanligvis benyttes for å vurdere rekombinant protein kvalitet. Protein biblioteket deretter oppdaget på epoxysilane lysbilder og lagret på 20 ° C for langsiktig bruk. Protein konsentrasjoner over 0,4 mg/ml er anbefalt for protokollen beskrevet nedenfor. Derfor krever lav-uttrykke proteiner litt konsentrasjon før eksempel utskrift og lagring. Likevel en viktig nytte av denne teknikken er små volumet av protein kreves (50 μg protein er tilstrekkelig til å utføre > 2000 skjermer), sammen med minimal spørringen protein konsum (20-25 μg per duplikater skjermen). Ved hjelp av protokollen og utstyr beskrevet her, og bibliotekene er tilgjengelig, resultater for individuelle spørringen proteiner kan genereres innen én virkedag.
En stor utfordring i å oppdage protein interaksjoner i ekstracellulære miljøet oppstår fra deres karakteristisk svak eller forbigående Art, som utelukker identifikasjon av mest brukte metoder. Økende bindende avidity sterkt forbedrer følsomhet for gjenkjenning av svak protein interaksjoner9,10,11. Basert på dette prinsippet vi utviklet en metode for å multimerize spørring proteiner (uttrykt som Fc fusion) bruke protein A-belagt perler4,5. For å unngå noen potensielle inaktivering av spørringen protein ved tilfeldig merking, vi i stedet merke en irrelevante menneskelige immunglobulin G med Cy5 og legge den sammen med spørringen protein til protein A perler, dermed eliminere noen gjenstander på grunn av den direkte Bøyning av en fargestoff protein av interesse. Gitt de micromolar slektskap av flere co reseptor, forbedre multivalent komplekser kraftig signal til støyforhold, sammenlignet med Fc-fusion spørringen proteiner vist som løselig proteiner4.
Oppsummert er målet med denne protokollen til å beskrive utarbeidelse av microarray lysbilder som inneholder et eksisterende ekstracellulære protein bibliotek for identifikasjon av reseptor-ligand interaksjoner. Vi går gjennom trinnene for lysbildet utskrift, etterfulgt av en protokoll for screening av et protein av interesse mot ekstracellulære protein biblioteket. Videre beskriver vi en metode for bedre gjenkjenning av ePPIs basert på microbeads å oppnå økt avidity av proteinet under studien. Den ekstracellulære protein microarray teknologien beskrevet her representerer en rask, robust og effektiv tilnærming til screening og oppdage romanen ePPI med lav false-positiv forholdstall, og ved å bruke bare mikrogram mengder spørringen protein under gransking. Denne teknologien har drevet flere studier som har gitt relevant innsikt i tidligere ukjent cellulære funksjoner og signalnettverk trasé for en rekke reseptorer12,13, inkludert viral immunoregulators14, og kan brukes til å orphanize de alle ekstracellulære protein av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generasjon av et bibliotek av ekstracellulære menneskelige proteiner
- Kompilere en liste over celleoverflaten reseptorer eller utskilles proteiner av interesse å bygge protein microarray biblioteket. Bestemt protein familier (for eksempel immunglobulin gruppe) eller proteiner uttrykte selektivt spesielt cellen typer kan bli valgt for studien.
- For celleoverflaten reseptorer, fastslå ekstracellulære domenet (ECD) grensene av identifiserer signal peptid og transmembrane regioner med programvareverktøy. Noen av de relevante verktøy, fritt tilgjengelig online, refereres i Tabellen for materiale15,16,17,18.
- Syntetisere ECD for arvestoffet av interesse og klone til relevante vektoren. Utskilles proteiner eller ECD av STM receptors smeltet til et antall vanlig affinitet tags kan bli renset fra betinget media celler transfekterte med riktige vektoren eller fra baculovirus-insekt celle uttrykk systemer.
Merk: Pattedyr celle-baserte systemer (som HEK/293 eller CHO celler) anbefales å maksimere sannsynligheten for riktig proteinfolding og tillegg av relevante posttranslational modifikasjoner som glykosylering. - Rense proteiner ved standard affinitet rensing metoder. Tidligere har beskrevet automatisk eller halvautomatisk prosedyrer egnet for rensing av hundrevis av proteiner, som kan skaleres til å generere en rekke proteiner av interesse9,19,20, 21.
Merk: SDS-side, størrelse utelukkelse kromatografi (S) eller multi-Angle laser lys spredning (KJØPESENTER) er anbefalt å vurdere eventuelle ikke-kovalente aggregering og å kontrollere for kvaliteten protein forberedelsene. - Justere proteiner til 200 eller 400 μg/mL mulig og fortynne aksjer med 80% glyserol for langtidslagring i Kryogenisk ampuller på 20 ° C. Disse representerer master aksjer og skal åpnes bare når det er nødvendig.
- Overføre dele hver protein (100 μL) til 96-brønns plater (lager plater), tetning med selvklebende folie og lagre på 20 ° C til microarray lysbildet forberedelse. Lager plater genereres for å minimere fryse-Tin sykluser og gir protein stabiliteten.
2. ekstracellulære Protein Microarray utskrift
- Bruk en standard microarrayer for lysbildet utskrift. Apparatet benyttes for protokollen beskrevet her har en kapasitet på 57 lysbilder/kjøre og bruker et skrivehode holder 48 småblødninger pinner. Disse pinnene generere flekker av ~ 100 μm diameter atskilt med en sted å oppdage avstand på ~ 350 μm og trekker 0,25 μL per Last. Under denne konfigurasjonen kan til 8000 flekker per lysbilde innkvarteres.
- Generere arbeider plater (384 bra plater, 10 μL utvalg/vel) fra lager platene. Utføre dette trinnet manuelt før lysbildet utskrift ved hjelp av microarrayer. Deretter spot proteiner med fjærpenn-type småblødninger pins på epoxysilane lysbilder på 60% fukt (for å unngå dehydration protein flekker).
Merk: Cy3-merket Bovine serum albumin (BSA) kan bli sett i duplikater mellom hvert protein utvalg (5 μg/mL i PBS/40% glyserol) for å visualisere matrisen for maske montering (se Seksjon 4). Selv om anbefales er dette trinnet valgfritt. - Etter utskrift, fjerne protein microarray lysbildene fra fuktet miljøet og blokkerer dem over natten med 5% melk i PBST å deaktivere overflaten.
Merk: Den foretrukne tilnærmingen er å bruke en ultrasonisk fogger for å generere en fin tåke av blokkering løsning som bosetter seg på lysbildet overflaten. - Lagre lysbilder på 20 ° C i 50% glycerol å hindre frysing.
3. forberedelse av Multivalent agn komplekser
Merk: Interaksjoner mellom ekstracellulære proteiner er ofte preget av lav slektskap. For å aktivere gjenkjenning av disse interaksjoner ved å øke bindende avidity, en multivalent tilnærming basert på fange spørringen protein, uttrykt som Fc-merket ECD, var protein A-belagt microbeads utviklet4.
- Merk transportøren IgG brukt for påvisning med Cy5 monoreactive fargestoff og skille gratis fargestoff med avsalting kolonner. Avgjør fargen til protein prosenter ved å måle ultrafiolett absorbans ved 280 og 650 nm.
Merk: Protein-dye forhold mellom 2,0 og 4.0 er normalt brukt. Det anbefales å spinne de Cy5 conjugates på 100.000 x g i 15 min fjerne potensielle løselig tilslag på grunn av merking prosessen. - Finne det optimale microbead-til-protein forholdet ved titrering protein A mot en konstant mengde spørringen protein. Minimal mette volumet av perler der ingen gratis Fc-merket protein forblir, brukes målt med en konkurransedyktig analysen bestemmes av biolayer interferometry, for screening.
- Danne microbead-protein komplekser av rugende Fc-merket spørringen og Cy5-IgG med protein A microbeads og bland på et rør rotator i PBS i 30 min ved romtemperatur beskyttet mot lyset.
- Danner disse kompleksene, kan du bruke spørringen protein i en siste konsentrasjon av 20 μg/mL. For å beregne molar forholdet mellom spørringen protein og Cy5-IgG, dele molekylvekt av spørringen protein av molekylvekt av IgG skåret (150.000 Da) og multiplisere med 40 μg/mL å bestemme konsentrasjonen av Cy5-IgG nødvendig.
- Supplere prøver med løselig protein en (1 mg/mL) umiddelbart før inkubasjon med microarray lysbilder (se 4,2 nedenfor) for å hindre binding av noen gratis protein A perler til Fc fusion proteiner som kan finnes på matrisen.
Merk: Siste reaksjon volumet kan variere etter hybridisering stasjon eller inkubasjon kammeret utnyttet. Instrumentering beskrevet i Tabellen for materiale kan inkubasjon bruker relativt små volumer (~ 200 μL per lysbilde).
4. ekstracellulære Protein Microarray Screening og behandling.
Merk: Det finnes en rekke produsenter som gir automatisk behandling plattformer. Hvis en hybridisering stasjon ikke er tilgjengelig, fremgangsmåten kan utføres manuelt, slik at det er tilstrekkelig volum av buffer for å holde lysbildene neddykket hele tiden.
- Varm lysbildene ved romtemperatur og skyll med PBS/0.1% mellom 20 (PBST) til å fjerne gjenværende glyserol før lasting på hybridisering stasjonen.
- Bruk følgende screening protokoll:
- Vask med PBST for 1 min.
- Last 200 μL 1 mg/mL protein A i PBS/5% melk og ruge i 30 min å hindre uncomplexed protein en microbeads fra binding Fc-merket proteiner som kan finnes i microarray.
- Vask 5 ganger med PBST for 1 min.
- Last 200 μL av spørring: microbeads kompleks i nærvær av 1 mg/mL protein A og ruge i 30 min.
- Vask med PBST for 1 min.
- Etter hybridisering, skyll lysbilder med vann, sett i enkelte 50 mL konisk rør og tørke av snurrende 900 x g i 5 min.
- Til slutt, skanne lysbilder med microarray skanner hensiktsmessig å oppdage Cy3 (hvis BSA-Cy3 er skrevet ut) og Cy5 fluorescens av spennende på 532 og 635 nm, henholdsvis.
- Utføre dataanalyse ved hjelp av medfølgende microarray dataanalyse. Listen relevante matrise (som en .gal-fil) er lastet inn data utvinning programvare. På dette stadiet, kan du bruke Cy3-BSA flekker å finne blokker og bruke auto-muligheter i programvaren, etterfulgt av manuell justering av funksjonene når det er nødvendig. Lagre filene som .gpr filer for videre analyse.
5. analyse
- Lagre data som GRP-filer og prosess i R bruke limma pakken, ofte brukt for analyse av microarray data4,5.
- For forbehandling, bakgrunn korreksjon og i lysbilde normalisering. Siden hver protein skrives i duplisert flekker, kombinere begge Repliker målinger for å opprette ett poeng for som protein i biblioteket.
- Beregne score for hvert lysbilde og analysere resultatene for skjæringspunktet mellom high-scoring kandidater lysbilder.
- Bruk like microarrays fra egen print-kjører kontrollen for lysbildet variasjon og skjæringspunktet tomter som representerer data fra begge skjermene for å ringe siste treff.
- Til slutt, utføre et ekstra nivå av filtrering for å utelate promiskuøse proteiner i matrisen. Slike ikke-spesifikk bindemidler identifiseres som proteiner overskrider en bestemt terskel frekvensen som er definert av brukeren over uavhengige skjermer.
Merk: Denne protokollen er beskrevet i detalj i Tom et al. 20135. I vårt tilfelle uspesifisert dokumentordneren ringer er basert på fastsettelse av den kumulative byttedyr treffprosent, og en data-drevet eliminering terskelen på 5% brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk for arbeidsflyten for den ekstracellulære protein microarray teknologien er vist i figur 1. Når microarray lysbildene inneholder ekstracellulære protein biblioteket er tilgjengelig, kan screening av protein av interesse og dataanalyse fullføres innen en dag. Mange fysiologisk relevante interaksjoner mellom membran-embedded reseptorer er preget av svært svak bindende styrker (KD i micromolar området). For å forbedre gjenkjenning av slike samhandlinger, utviklet en metode basert på spørringen protein (uttrykt som Fc fusion) multimerization på protein A-microbeads. Denne protokollen er beskrevet i teksten, og et representativt eksempel på resultatene av denne tilnærmingen for forbedret påvisning av PPT er vist i figur 2.
Et representativt eksempel på en protein microarray skjermen vises i Figur 3. I eksempelet en foreldreløs menneskelig adenovirus immunmodulerende protein er vist for interaksjoner mot et bibliotek består av mer enn 1500 reseptor ECD eller utskilles proteiner14. Som beskrevet, er ECD av viral protein recombinantly uttrykt som en Fc fusion protein, og deretter inkubert med protein A-belagt microbeads for å danne multivalent komplekser. Protein komplekser var vist med en hybridisering stasjon for å minimere manuell operasjoner, men lignende skjermer kan utføres ved hjelp av en hybridisering kammer eller liknende. Det anbefales å kjøre like skjermer med lysbilder i separate småblødninger løp for å kontrollere for alle variasjon under trykkingen. Figuren viser de resulterende skjæringspunkt tomtene fra like, uavhengige skjermer. Positive interaksjoner og generelle lysbildebakgrunnen er lett visualisert ved skanning av platene (Cy5 fluorescens), tilrettelegge hit ringer. Merk at det er anbefalt å oppdage hver reseptor i biblioteket i duplikater for å øke hit tillit. For de fleste spørringen proteiner, ingen, er en eller noen treff observert, demonstrere spesifisiteten av metoden for påvisning av PPIs.
Visse spørringen proteiner viser høye som oppdaget ved binding til et uvanlig stort antall proteiner i matrisen og/eller lysbildet. I vår erfaring, er slik ikke-spesifikke bakgrunnen observert bare et lite antall proteiner. Ulike faktorer knyttet til natur protein kan påvirke uspesifisert interaksjoner, for eksempel anerkjennelse av glykosylering motiver. Figur 3 viser et eksempel på en viral protein vist mot microarray biblioteket som viste høy bakgrunn, slik at identifikasjon av spesifikke treff. Mindre endringer i protokollen kan være som å redusere bakgrunnen (som økt salt eller vaskemiddel konsentrasjon), i slike tilfeller anbefales det å utforske alternative metoder for deorphanization av proteinet under studien.
Figur 1: ekstracellulære protein microarrays for rask og robust identifikasjon av reseptor-ligand interaksjoner. (Trinn 1) Et bibliotek av ekstracellulære proteiner av interesse er kompilert. (Trinn 2) Renset proteiner er trykt på epoxysilane lysbilder microarray skriveren og lagret på 20 ° C. (Trinn 3) Spørringen protein av interesse er multimerized på microbeads for økt avidity og påvisning av forbigående protein-protein interaksjoner. En fluorescerende IgG er kompleksbundet med spørring: microbeads som inert merket transportør. (Trinn 4) Screening for bindingen partnere en spørring protein. Fluorescerende spørringen proteinet er vist mot den ekstracellulære protein microarray bruker en hybridisering stasjon for automatisert lysbildet behandling. (Trinn 5) Lysbilder er deretter visualisere bruker en microarray skanner. BSA-Cy3 flekker kan observeres i 535 nm kanalen og treff gitt fra skjermen kan observeres som like flekker på 635 nm. Dataanalyse for hit ringer utføres ved å opprette veikryss tomter to uavhengige eksperimenter. Treff kalles basert på gjensidig høy score over bakgrunnen, som beskrevet i delen protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: forbedret signalet gjennom dannelsen av multivalent komplekser for spørringen protein. (A) Multimerization spørring proteiner. Spørringen proteiner er uttrykt som rekombinant Fc fusjoner og koblet til protein A microbeads til skjemaet multimerized komplekser. (B) høy-avidity fører til oppdagelsen av lav affinitet interaksjoner. Avidity by av multimerized protein spørringsresultatene i stabilisering av svake samhandling på protein microarray, fører til høyere signal til støy forhold og forbedret hit ringer. Tomter viser screening resultater for CD200, vist som en microbead kompleks, eller en løselig protein direkte merket med Cy5 fargestoff for å aktivere visualisering av treff. Multimerization (rød barer) kan robust oppdaging av lav affinitet bindende partner CD200R1, i protein microarray biblioteket, med betydelig signal/støy-forhold sammenlignet med samme protein vist som et løselig produkt (blå stolper). Grå stolper angir uspesifisert bindemidler. Bare topp 10 samhandlingene har vært representert i plottet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Protein microarray teknologi for identifikasjon av romanen reseptor-reseptor virus vert interaksjoner. (A) eksemplarisk reseptor oppdagelsen resultater for en foreldreløs adenoviral immunmodulerende protein. Bildene representerer faktiske microarray skanner, vise treff fra proteiner oppdaget i duplikater (rød). Analyser utføres duplikater kontroll for lysbildet variasjon, og resultatene som krysset tomter. Tomter representerer rød og blå prikker treff kalt bare på en matrise replikere, mens sorte prikker representerer kryssende treff fra begge uavhengig kjører. Hele microarray biblioteket skrives på to lysbilder for brukervennlighet gitt antall proteiner tilstede i samlingen, og å sikre nok separasjon for hver individuelle protein oppdaget på matrisen. (B) Viral protein skjermen viser høy bakgrunn som utelukker traff ringer. Visse spørringen proteiner kan vise høy bakgrunn, som oppdaget ved binding til flere proteiner og/eller lysbildene derfor posing utfordringer for identifikasjon av høy scoring treff. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et betydelig antall foreldreløs reseptorer beholdes i det menneskelige genomet, og romanen samspill partnere fortsette å dukke opp for ekstracellulære proteiner med tidligere preget ligander. Reseptor-ligand interaksjoner i human og modell organismer er viktig å forstå mekanismene som styrer mobil kommunikasjon homeostase, samt feilregulering fører til sykdom og derfor informere nye eller forbedrede behandlingsalternativer. Likevel har påvisning av ekstracellulære protein interaksjoner av brukte technologies representert en vesentlig barriere skyldes i hovedsak de tekniske utfordringene knyttet til biokjemi mobilnettet receptors og samarbeidspartnerne samhandlende. I denne rapporten beskriver vi bruk av en ekstracellulære protein microarray for screening av spørringen proteiner av interesse, med vekt på utnyttelse av microbead komplekser for forbedret påvisning av PPIs.
Verifiserer reseptor-reseptor interaksjoner er spesielt utfordrende, som mange fysiologisk relevante parene er preget av svært svak kjernekraft med bindende slektskap i micromolar område2,3. Avidity ekstrautstyr gjennom multimerization har vist seg for å være en nyttig strategi å øke følsomhet for påvisning av lavt affinitet PPIs. Vi har utviklet en metode basert på Fc fusion proteiner, for effektiv dannelsen av multivalent microbead-protein spørringen komplekser4. Multimerization av spørringen protein er et viktig skritt for å oppdage lav affinitet PPIs. Som vist i eksemplet i figur 2, forbedrer denne metoden betydelig signal med samme spørring protein vist som en løselig (ikke-kompleksbundet) analytt, stund retaining minimal bakgrunn. Alternativt kan protein microarray skjermene utføres med løselig Cy5-merket spørringen protein, en tilnærming som er kompatibel med alle fusion tag og som kan være tilstrekkelig for identifikasjon av mer stabil, høyere affinitet interaksjoner, for eksempel mellom noen løselig ligander og deres reseptorer. Det bør bemerkes at fordi avidity økes gjennom multimerization av spørringen på microbeads, microarray signalet ikke er et kvantitativt mål for samhandling styrke. Snarere skal bindende slektskap beregnes med monomerisk versjoner av proteiner under evaluering. Dessuten, er det svært anbefales at noen treff identifisert gjennom microarray teknologi valideres uavhengig måter. Vi bruk rutinemessig overflaten plasmon resonans som Biofysiske gullstandarden for PPI studier og måling av bindende kinetics.
Selv om du er ute av omfanget av denne rapporten, bør det bemerkes at suksessen til anstrengele screening bruker microarray teknologi tungt avhengig av valg og tilgjengelighet av et høykvalitets protein bibliotek. Relevante kriterier for valg av ekstracellulære proteiner har vært publisert tidligere4,22. En rekke nyttige verktøy for prediksjon av relevante protein funksjoner (for eksempel transmembrane helikser eller signal peptider) er fritt tilgjengelig online, inkludert følgende servere: SignalP15, TMHMM16, Phobious17og TOPCONS 18. gode metoder papirer som beskriver affinitet rensing metodene er tilgjengelig andre steder. Det bør også nevnes at den microarray protein bibliotek generasjonen er avhengig av produksjon av protein ECDs som løselig rekombinant produkter, og derfor denne tilnærmingen lar studier av type I, type II og GPI-forankret celle overflate reseptorer og utskilles proteiner, men er generelt ikke egnet for multitransmembrane inneholder proteiner som G protein-kombinert reseptorer. Rensing av hundrevis av proteiner som rekombinant løselig proteiner krever betydelig logistisk innsats og kan være svært ressurs - og tidkrevende. Likevel, med reduserte kostnadene ved gen syntese og økt gjennomstrømming av protein rensing systemer, bibliotek generasjon er å nå relativt raskere og rimeligere. Alternativt tilbyr kommersielle kilder renset ekstracellulære proteiner som kan kjøpes i mikrogram mengder, som nok for generering av et holdbart protein microarray bibliotek gitt liten kravene for lysbildet utskrift. Disse begrensningene uansett, gir microarray teknologi store fordeler som minimalt forbruk av protein reagenser, rask readouts (nye PPIs kan identifiseres i en dag) og rimelig instrumentering. I tillegg når konstruksjoner og rensing forhold er etablert, kan småskala renselser produsere nok materiale for å forberede tusenvis av matriser.
Til slutt, i noen tilfeller relativt høye er observert, vises som binding til mange proteiner på microarray biblioteket. Det er flere faktorer som kan påvirke uspesifisert bindende. For eksempel noen proteiner kan lades svært eller samhandle med karbohydrater, regnskap for ikke-spesifikke bakgrunnen via anerkjennelse av felles motiver. Tilsvarende finnes uspesifisert binding på grunn av spørringen protein, som for eksempel anerkjennelse av sialic acid motiver, også i flere andre proteiner. Microarray bibliotekene utvide, er det mer sannsynlig at at en liste over ikke-spesifikk bindemidler kan være tilstede. Slike ikke-spesifikk bindemidler kan identifiseres ved å spore deres atferd over ulike skjermer mot urelaterte spørringen proteiner. Det anbefales å generere en liste over ikke-spesifikk bindemidler over skjermer, forbedre bestemt hit ringer. I vårt tilfelle har vi funnet at bruk av en 5% cutoff (dvs. et protein er flagget som uspesifisert hvis dokumentordneren er 5% eller mer av urelaterte spørringen protein skjermer) er viktig å redusere falske positiver. Det bør bemerkes at hvis Hovedformålet med analyser er å kjøre bare noen utvalgte skjermer, ikke kan det være verdt å utvikle en statistisk analyse. I dette tilfellet kan det ikke være mulig å oppdage falske positiver på grunn av begrenset dataset, og vi anbefaler derfor at spesiell vekt legges på bekreftelse av treff bruke alternative metoder.
Vi forventer den ekstracellulære protein microarrays, spesielt i kombinasjon med multimerization metoder for påvisning av forbigående reseptor-ligand interaksjoner, vil fortsette å tilby en unik plattform for rask og robust identifikasjon av romanen PPT i den ekstracellulære plassen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.H., SR-R og N.M-M. er Genentech ansatte og egne aksjer i gruppen Genentech Inc./Roche.
Acknowledgments
Vi takker Philamer Calses og Kobe Yuen for kritisk lesing manuskriptet. Vi er takknemlige til Randy Yen for gode tekniske råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | Protein storage |
| SeptoMark blocking buffer | Zeptosens | BB1, 90-40 | Blocking buffer microarray slides |
| Bovine serum albumin | Roche | 03-117-957-001 | Slide control for mask fitting (optional) |
| Polypropylene multiwell plates | Greiner Bio One | 82050-678 | Protein storage |
| Polypropylene multiwell plates | Arrayit | MMP384 | Slide printing |
| NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | Slide printing |
| Micro spotting pins | Arrayit | Micro spotting pins | Slide printing |
| ZeptoFOG blocking station | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | Block slides after printing |
| Skim milk powder | Thermo Fisher | LP0031 | Blocking solution |
| Epoxysilane-coated glass slide | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray slides |
| Glass holder and slide rack set | Wheaton | 900303 | Slide storage |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA23031 | Albumin labeling |
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG labeling |
| Pro-spin desalting column | Princeton Separations | CS-800 | Remove free dye |
| Adhesive aluminum foil seal | AlumaSeal | F-384-100 | Seal stock plates |
| Polypropylene cryogenic vials | Corning | 430658 | Master vials for protein library storage |
| Protein A microbeads | Miltenyi | 120-000-396 | Query protein multimerization |
| Human IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Irrelevant IgG for labeling |
| Protein A | Sigma | P7837 | Microarray slide blocking |
| Hybridization station, a-Hyb or similar | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | Automated microarray processing (optional) |
| GenePix 4000B scanner or similar | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | Slide scanning |
| GenePix Pro or equivalent data extraction software | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | Data processing |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites |
| TMHMM 2.0 server | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | online software | Prediction of transmembrane helices in proteins |
| Phobius | Stockholm Bioinformatics Center | online software | A combined transmembrane topology and signal peptide predictor |
| TOPCONS | Stockholm University | online software | Prediction of membrane topology and signal peptides |
References
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
- Ramani, S. R., et al. A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery. Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).
- Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).
- Kaushansky, A., et al. Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays. Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
- Voulgaraki, D., et al. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).
- Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia. Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).
- Jaworski, A., et al. Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2. Science. 350 (6263), 961-965 (2015).
- Martinez-Martin, N., et al. The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation. Nature Communications. 7, 11473 (2016).
- Nielsen, H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).
- Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).
- Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology. Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).
- Gonzalez, R., et al. Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), E9 (2002).
- Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).
- Clark, H. F., et al. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).
